CN113185573B

CN113185573B - 一种构象锁定蜂毒肽Anoplin衍生物的制备方法与抗肿瘤应用

Info

Publication number: CN113185573B
Application number: CN202010035278.8A
Authority: CN
Inventors: 张卫东; 栾鑫; 吴也; 陈红专; 黄睿; 靳金美; 张鹤; 沈逸雯; 陈锦娇; 杨婷; 邓仪卿; 兰海月; 卢露; 王梦鸽
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN113185573A

Abstract

本发明涉及一类构象锁定蜂毒肽Anoplin衍生物，其特征在于，肽链上含有式(I)所示的片段，所述片段位于Anoplin肽链的端部或中间段，各x来源于蜂毒肽Anoplin中的序列，通过在Anoplin肽段侧链形成碳氢支架以稳定多肽的α‑螺旋构象，达到构象锁定的目的。体内外的药理实验均表明，本发明的化合物对黑色素瘤细胞B16F10显示出很强的抑制活性，且具有高效、稳定等优点，在制备抗黑色素瘤药物方面具有重大潜力。

Description

一种构象锁定蜂毒肽Anoplin衍生物的制备方法与抗肿瘤应用

技术领域

本发明涉及药物化合物技术领域，具体地说，是关于一种构象锁定蜂毒肽Anoplin衍生物的制备方法与抗肿瘤应用。

背景技术

黑色素瘤是一种恶性程度极高的实体肿瘤，它具有高侵袭性、高转移和预后差的特点，主要涉及皮肤，是由遗传性基因变异和所处环境的风险导致的，最重要的外源性致病因素是暴露在紫外线的照射中。在全球范围，每年新诊断的原发性恶性肿瘤(不包括非黑色素瘤皮肤癌)中有232100例(占比1.7％)是皮肤黑色素瘤，并导致每年有55500例患者死亡(占所有癌症死亡的0.7％)。黑色素瘤一旦扩散，将直接关乎生命安危。近年来，随着免疫和靶向治疗研究的进展，患者预后得到了极大的改善，但是对于不适合靶向和免疫治疗的，或者这两种治疗都失败的晚期患者来说，化疗成了他们最后的治疗手段，而传统化疗药物存在毒性大和耐药的问题，因此发展高效、低毒、持久的新型抗黑色素瘤药物具有重要的意义。

Anoplin是从黄蜂Anoplius samariensis的毒液旋中提取分离得到的一条具有两亲性、α-螺旋构象的超短多肽，其氨基酸序列为：Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu-Leu-NH₂，化学结构如下所示：

近年来研究表明，Anoplin具有极其广泛的药理活性，包括抗细菌、抗真菌、抗疟疾以及抗肿瘤等。由于其良好的药理活性，极其简单的结构，且无溶血活性，使得众多学者试图通过结构修饰来研究Anoplin的构效关系和作用机制，继而开发新药来应对恶性肿瘤和多药耐药细菌感染等人类重大疾病。但是，研究也发现Anoplin存在一些缺点限制了它的临床应用，例如活性仍待提高和不耐蛋白酶水解等。

订书肽(Stapled peptides)是近年来获得广泛关注的一类稳定性强、透膜性好的多肽模拟物，在天然多肽的修饰以及很多胞内蛋白-蛋白相互作用的调控方面都展示了很好的潜力。其中，Verdine等发展的含有α-甲基非天然氨基酸的订书肽策略能够有效地提高多肽的螺旋性、稳定性和细胞通透性，从而成功实现多肽对体外及体内靶标的有效作用。

因此，通过订书肽的策略将Anoplin进行构象锁定，增加其α-螺旋程度和耐蛋白酶稳定性，同时考察其体内外对抗黑色素瘤活性的提高。目前还未见类似的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对Anoplin现有的缺点，提供一类构象锁定Anoplin衍生物。

本发明的再一的目的是，提供一类构象锁定Anoplin衍生物的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供一类构象锁定Anoplin衍生物的抗肿瘤用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一类构象锁定Anoplin的衍生物，所述的构象锁定Anoplin的衍生物结构通式如下：

其中，n为0～5的整数，m为0～5的整数，各x来源于蜂毒肽Anoplin中连续的氨基酸

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一类构象锁定Anoplin衍生物的制备方法，该方法包括下列步骤：

(a)首先依据固相合成法，以9-芴基甲氧基羰基保护基的天然氨基酸和(2R)-2-N-芴甲氧羰基氨基-2-甲基-6-庚烯酸(Fmoc-S₅-OH)为原料，以Rink Amide MBHA氨基树脂作为载体，O-(1H-6-氯苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/N，N-二异丙基乙胺为缩合体系，合成线性多肽。

(b)在树脂上应用Grubbs第一代催化剂对肽段进行烯烃复分解反应，实现α-螺旋结构的锁定，然后将其从树脂上切下，即可得到构象锁定蜂毒肽Anoplin衍生物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一类构象锁定Anoplin衍生物在制备抗黑色素瘤药物中的应用。

所述的黑色素瘤细胞为B16F10细胞。

本发明的构象锁定Anoplin衍生物是在Anoplin的序列中引入非天然氨基酸，在Anoplin肽段侧链形成碳氢支架以稳定多肽的α-螺旋构象，达到构象锁定的目的。基于订书肽策略的构象锁定Anoplin衍生物首先能够稳定α-螺旋构象，对Anoplin的α-螺旋程度有明显提升。其次，该类构象锁定Anoplin衍生物与Anoplin相比能够在酶稳定性上得到显著改善，进而提高药物的生物利用度。最后，体内外的药理实验均表明该类构象锁定Anoplin衍生物对黑色素瘤细胞B16F10表现出较好的抑制活性，具有高效、稳定等优点，因此可用于制备抗黑色素瘤药物。

附图说明

图1为本发明构象锁定Anoplin衍生物的耐糜蛋白酶稳定性。

图2为本发明构象锁定Anoplin衍生物的体内抗肿瘤作用。(A)为构象锁定Anoplin衍生物治疗后，小鼠的实际肿瘤大小；(B)为小鼠体重的变化曲线

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1本发明构象锁定Anoplin衍生物Ano-1～6的制备

表1本发明构象锁定Anoplin衍生物Ano-1～6的氨基酸序列

表3所示各构象锁定Anoplin衍生物可通过多肽固相合成法制备。

下面以制备构象锁定Anoplin衍生物Ano-1为例进行具体描述，其余构象锁定Anoplin衍生物的制备操作相同。

合成路线：

合成步骤：

称取667mg氨基树脂(取代度0.3mmol/g)放入多肽合成管中，于室温加入5mL g二氯甲烷溶胀20rnin，然后用水泵抽干溶剂。向上述合成管中加入5mL N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂后，向合成管中加入7mL 20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液脱去氨基树脂上的Fmoc保护基，于35℃晃动反应10min，抽干反应液。再向合成管中加入7ml 20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺溶液，于35℃晃动反应10min，抽干反应液。重复上述洗涤树脂，即3次N，N-二甲基甲酰胺、3次二氯甲烷、3次N，N-二甲基甲酰胺，用量及方法如上所述。称取Fmoc-Leu-OH(353mg，1mmol)放入10mL离心管中，再向上述离心管中加入O-(1H-6-氯苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(372mg，0.9mmol)、N，N-二异丙基乙胺(259mg，2mmol)，加入6mL N，N-二甲基甲酰胺混匀活化三分钟。将活化好的氨基酸加入到固相合成管中，于35℃反应1h后洗涤。然后脱去第一个氨基酸Leu的Fmoc保护基，方法同上。我们用上述方法依次接入Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-S₅-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-S₅-OH，脱Fmoc保护。拿到接好线性多肽的树脂之后，用10mL 1，2-二氯乙烷在固相合成管中洗涤树脂，重复三次。加入5mLGrubbs一代催化剂的DCE溶液(10mmol/L)，35℃反应2小时，抽干重复上述反应一次，洗涤树脂，干燥。向多肽合成管中加入15mL切割试剂(95％三氟乙酸，2.5％，水，2.5％三异丙基硅烷)，室温振荡2小时。将切割试剂过滤至50mL离心管中，再用5mL三氟乙酸润洗树脂，用氩气将离心管中的三氟乙酸吹干。然后向该离心管中，加入35mL冰乙醚，振荡沉淀，用3500转/分的离心机离心3min，倾倒出上清溶液，重复上述沉淀过程三次，风干即得粗肽。最后经制备液相纯化后冻干得到构象锁定Anoplin衍生物Ano-1。

实施例中所用试剂均为市售分析纯，制备液相所用溶剂为色谱纯。

实施例2本发明构象锁定Anoplin衍生物Ano-1～6的高分辨质谱和α-螺旋程度数据

本发明构象锁定Anoplin衍生物Ano-1～6的高分辨质谱和α-螺旋程度数据见表2。

表2本发明构象锁定Anoplin衍生物Ano-1～6的高分辨质谱和α-螺旋程度数据表

由上表可见，本发明化合物均增加了Anoplin的α-螺旋程度。

实施例3本发明构象锁定Anoplin衍生物体外抗肿瘤实验

3.1实验方法：采用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒测试构象锁定Anoplin衍生物对黑色素瘤细胞B16F10的抗增殖活性。在96孔板中配置200μL的B16F10细胞悬液，将培养板在37℃，5％CO₂培养箱预培养24小时。向培养板加入10μL不同浓度的构象锁定Anoplin衍生物，并在培养箱孵育24小时。向每孔加入10μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育2小时后用酶标仪测定96孔板在450nm处的吸光度。按如下公式计算药物对B16F10细胞的抑制率：抑制率＝[(Ac-As)]/[(Ac-Ab)]×100％，As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物)，Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物)，Ab：空白孔(不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8)。

3.2实验结果

体外抗肿瘤实验见表3

表3本发明的化合物Ano-1～6体外抗肿瘤实验结果

由上表可见，本发明化合物均对B16F10细胞有较强的抑制活性，极高地提升了Anoplin的抗肿瘤活性。

实施例4本发明构象锁定Anoplin衍生物的耐糜蛋白酶稳定性

优选上述实验α-螺旋程度和体外抗肿瘤活性均较高的Ano-3进行耐糜蛋白酶稳定性的考察。称取适量的药物配制成浓度为1mM的肽储存液。称取一定量的糜蛋白酶溶于含有2mM CaCl₂的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.4)至糜蛋白酶的浓度为0.5ng/μL。在2mL离心管中分别加入1000μL含糜蛋白酶的磷酸盐缓冲液和100μL的药物储存液进行酶消化反应。分别取药物各个时间点的100μL反应液加入20μL 1M的盐酸淬灭糜蛋白酶活性。最后使用高效液相色谱仪分析不同时间点多肽的百分残余量并作图。

图1为多肽对糜蛋白酶稳定性结果，直链肽Anoplin迅速降解，半衰期为11.35分钟，而经过构象锁定能够显著提高Ano-3的稳定性，8小时后依然没有降解。

实施例5本发明构象锁定Anoplin衍生物的体内抗肿瘤作用

5.1模型建立

雌性C57小鼠，右腹股沟皮下接种B16F10细胞(5×10⁵个)，约5天形成肿瘤。

5.2评价构象锁定Anoplin衍生物的体内抗肿瘤作用

实验分组：①空白组；②Anoplin组；③Ano-3组。给药方式：采用瘤内注射的方式，每只1mg药物，水溶液体积50μL，连续给药3天。评价指标为：①以瘤体积2000mm³为终点，解剖出小鼠肿瘤，比较各组肿瘤大小；②跟踪记录实验过程中小鼠一般健康状况，饮食、饮水和体重变化，比较副作用。

图2A为构象锁定Anoplin衍生物Ano-3治疗后，C57小鼠皮下黑色素瘤的实际肿瘤。与空白组和Anoplin组相比，Ano-3能较好抑制肿瘤大小。图2B为C57小鼠实际体重曲线，无明显变化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种构象锁定蜂毒肽Anoplin衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述衍生物具有以下结构式：。

2.如权利要求1所述的一种构象锁定蜂毒肽Anoplin衍生物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)首先依据固相合成法，以9-芴基甲氧基羰基保护基的天然氨基酸和(2R)-2-N-芴甲氧羰基氨基-2-甲基-6-庚烯酸(Fmoc-S₅-OH)为原料，以Rink Amide MBHA氨基树脂作为载体，O-(1H-6-氯苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/N，N-二异丙基乙胺为缩合体系，合成线性多肽；

3.如权利要求1所述的构象锁定蜂毒肽Anoplin衍生物在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的黑色素瘤细胞为B16F10细胞。