CN109485713A - 具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明设计合成了具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物，其是对天然抗菌肽Anoplin的部分D型替换类似物Anoplin‑D4,7，Anoplin‑D5,7和Anoplin‑D9,10,3进行“C‑C末端”和“C‑N末端”分子间侧链连接，得到的一系列二聚化抗菌肽类似物。体外抑菌实验、PI染色法流式细胞术实验、溶血实验均表明，本发明设计合成的二聚化修饰抗菌肽类似物具有强抗菌活性和低毒性，因此，本发明得到的抗菌肽类似物在临床抗菌药物的开发方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，涉及一类新型结构的二聚化修饰抗菌肽类似物及其合成和应用，特别涉及一类具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物及其合成和应用。
背景技术
大量使用抗生素治疗感染，导致细菌对常规抗生素的耐药性迅速发展(LancetInfectious Diseases，2013，13：1057-1098)。由于不能使用常规抗生素，新的耐药菌株不断出现，已成为一个全世界关注的问题。根据美国传染病协会的研究数据以及医院的监测报告，将这些容易耐药的病原体称为“ESKAPE”(Clinical Infectious Diseases，2009，48：1-12)。“ESKAPE”病原体包括：屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、不动杆菌(Acinetobacter)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌(Enterobacter)。这些细菌群体能够抵抗抗生素的抗菌能力，甚至产生细菌耐药，是全世界医院感染的主要原因，为此，新型抗菌药物的开发迫在眉睫。抗菌肽(AMPs)具有正电荷和两亲性结构，在体外具有较高的抗菌活性，并且由于独特的作用机制，不易诱发细菌耐药，被认为是理想的候选药物(Biological Chemistry，2001，382：597-619)。AMPs是包括动物、植物、昆虫以及微生物在内的生物有机体先天防御系统中的一部分，对细菌、真菌和病毒具有广泛的抗菌活性，此外，部分抗菌肽甚至还被证明具有抗肿瘤活性(PLoS Pathog.2010.6:e1001067；AminoAcids，2011，40：51-59)。一般情况下，AMPs由10至50个氨基酸组成，这些氨基酸包括疏水性和亲水性氨基酸残基，在细菌细胞膜环境中可以形成两亲性的α-螺旋结构，与细菌细胞膜相互作用，使细菌细胞膜被快速破坏以及细菌内容物泄漏，导致细菌死亡，这种作用机制与针对病原体特定分子受体的抗生素作用机制明显不同，因而不易诱发细菌耐药(Antimicrob Agents Chemother，2012，56(6)：3004-3010)。
尽管抗菌肽的出现为克服细菌耐药性提供了机遇，但由于天然抗菌肽易被体内蛋白酶识别、半衰期短、抗菌活性不强、选择性差等缺点，使其在临床的应用和发展受到了限制。研究表明，将抗菌肽进行分子间二聚化修饰，可以显著提高抗菌肽的抗菌活性、稳定性(Journal of Peptide Science，2002，8：570-577)；与此同时，利用氨基酸侧链“叠氮基”官能团和“炔丙基”官能团，经点击化学的1,3-偶极环加成反应形成“三唑环”结构，有助于增强抗菌肽对细菌细胞膜的穿透能力，进而提高抗菌活性(Peptides，2017，88：115-125)；除此之外，将L-氨基酸残基的D型对映体引入抗菌肽，能够避免蛋白酶的识别，明显增加抗菌肽的稳定性(Frontiers in Chemistry，2017，5：40)；并且，含有D型氨基酸残基的多肽不容易被体内抗原呈递细胞识别(Antimicrob Agents Chemother，2004，48(8)：3127-3129)。
发明内容
本发明的目的之一：提供一类具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物。
本发明的目的之二：提供上述具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物在临床抗菌药物开发中的应用。
本发明的目的之三：提供上述具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法。
(一)具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物
本发明具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物，包括“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物和“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物。“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物是在母肽Anoplin的部分D型氨基酸替换类似物Anoplin-D4,7、Anoplin-D9,10,3和Anoplin-D5,7的C-末端分别引入非天然的特殊氨基酸Fmoc-L-Propargylgly-OH或Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH，然后分别对其N-末端进行乙酰化修饰，得到前体肽Ac-D4,7-Pra、Ac-D9,10,3-Pra、Ac-D4,7-Lys(N3)和Ac-D5,7-Lys(N3)，再通过“点击化学”对前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)、JC-AA-(D4,7+D5,7)、JC-AA-(D9,10,3+D5,7)；“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物是在母肽Anoplin的部分D型氨基酸替换类似物Anoplin-D4,7、Anoplin-D9,10,3的C-末端分别引入非天然的特殊氨基酸Fmoc-L-Propargylgly-OH，然后分别对其N-末端进行乙酰化修饰，得到前体肽Ac-D4,7-Pra、Ac-D9,10,3-Pra，在母肽Anoplin的部分D型氨基酸替换类似物Anoplin-D4,7、Anoplin-D5,7的N-末端分别引入非天然的特殊氨基酸Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH，然后分别对其N-末端进行乙酰化修饰，得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7和Ac-Lys(N3)-D5,7，再通过“点击化学”对前体肽分别进行分子间侧链连接，得到“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)、JCN-AA-(D4,7+D5,7)、JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)。
上述二聚化修饰抗菌肽类似物的结构式分别如下所示：
“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物：
(1)JC-AA-(D4,7+D4,7)
(2)JC-AA-(D4,7+D5,7)
(3)JC-AA-(D9,10,3+D5,7)；
“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物：
(4)JCN-AA-(D4,7+D4,7)
(5)JCN-AA-(D4,7+D5,7)
(6)JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)。
本发明二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，包括以下工艺步骤：
1、“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物的合成
a、分别在Anoplin-D4,7和Anoplin-D9,10,3序列的C-末端引入非天然氨基酸Fmoc-L-Propargylgly-OH，得到Anoplin-D4,7-Pra和Anoplin-D9,10,3-Pra；分别以Anoplin-D4,7-Pra和Anoplin-D9,10,3-Pra为基体，采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-Pra-resin与Anoplin-D9,10,3-Pra-resin，然后分别进行N-末端乙酰化修饰，得到Ac-D4,7-Pra-resin和Ac-D9,10,3-Pra-resin，分别经切割、纯化后得到前体肽Ac-D4,7-Pra与Ac-D9,10,3-Pra；
b、分别在Anoplin-D4,7，Anoplin-D5,7序列的C-末端引入非天然氨基酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH，得到Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)和Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)；以Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)和Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)为基体，采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin和Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)-resin，然后分别进行N-末端乙酰化修饰，得到Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin和Ac-D5,7-Lys(Mtt)-resin；分别对Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin与Ac-D5,7-Lys(Mtt)-resin进行侧链叠氮化修饰，切割、纯化后得到前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)与Ac-D5,7-Lys(N3)；
c、利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Ac-D4,7-Pra侧链的“炔基”官能团分别与前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)或Ac-D5,7-Lys(N3)侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)和JC-AA-(D4,7+D5,7)；利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Ac-D9,10,3-Pra侧链的“炔基”官能团与前体肽Ac-D5,7-Lys(N3)侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D9,10,3+D5,7)；
2、“C-N末端”二聚化修饰二聚体抗菌肽类似物的合成
a、采用如“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物的合成步骤a中方法得到前体肽Ac-D4,7-Pra和Ac-D9,10,3-Pra；
b、分别在Anoplin-D4,7，Anoplin-D5,7序列的N-末端引入非天然氨基酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH，得到Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7与Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7；以Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7与Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7为基体，采用经典固相合成方法合成Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7-resin与Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7-resin，然后分别进行N-末端乙酰化修饰，得到Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin与Ac-Lys(Mtt)-D5,7-resin；分别对Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin与Ac-Lys(Mtt)-D5,7-resin进行侧链叠氮化修饰，切割、纯化得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7与Ac-Lys(N3)-D5,7；
c、利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Ac-D4,7-Pra侧链的“炔基”官能团分别与前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7或Ac-Lys(N3)-D5,7侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)与JCN-AA-(D4,7+D5,7)；利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Ac-D9,10,3-Pra侧链的“炔基”官能团与前体肽Ac-Lys(N3)-D5,7侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)。
更具体地，本发明二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，包括以下工艺步骤：
1、“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物的合成
a、Ac-D4,7-Lys(N3)的合成
将Fmoc-Lys(Mtt)-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Lys(Mtt)-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-Lys(Mtt)-resin即为Fmoc-D4,7-Lys(Mtt)-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin进行缩合反应，得到Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin；将Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin用体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰，得到侧链叠氮化合物Ac-D4,7-Lys(N3)-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)；
b、Ac-D5,7-Lys(N3)的合成
将Fmoc-Lys(Mtt)-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Lys(Mtt)-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-Lys-D-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-Lys(Mtt)-resin即为Fmoc-D5,7-Lys(Mtt)-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)-resin进行缩合反应，得到Ac-D5,7-Lys(Mtt)-resin；将Ac-D5,7-Lys(Mtt)-resin用含有1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰，得到侧链叠氮化合物Ac-D5,7-Lys(N3)-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-D5,7-Lys(N3)；
c、二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)、JC-AA-(D4,7+D5,7)、JC-AA-(D9,10,3+D5,7)的合成
将前体肽Ac-D4,7-Pra分别与Ac-D4,7-Lys(N3)或Ac-D5,7-Lys(N3)溶解于H2O中，加入含5％DMF的CuSO4溶液，以抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应24-28h；经RP-HPLC纯化，得到二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)、JC-AA-(D4,7+D5,7)；
将前体肽Ac-D9,10,3-Pra与Ac-D5,7-Lys(N3)溶解于H2O中，加入含5％DMF的CuSO4溶液，以抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应24-28h；经RP-HPLC纯化，得到二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D9,10,3+D5,7)。
2、“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物的合成
a、Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH，得到Fmoc-Lys(Mtt)-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即Fmoc-Lys(Mtt)-D4,7-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7-resin进行缩合反应，得到Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin；将Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin用体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰，得到侧链叠氮化合物Ac-Lys(N3)-D4,7-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7；
b、Ac-Lys(N3)-D5,7的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH，得到Fmoc-Lys(Mtt)-Gly-Leu-Leu-Lys-D-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin即为Fmoc-Lys(Mtt)-D5,7-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7-resin进行缩合反应，得到Ac-Lys(Mtt)-D5,7-resin；将Ac-Lys(Mtt)-D5,7-resin用体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰，得到侧链叠氮化合物Ac-Lys(N3)-D5,7-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-Lys(N3)-D5,7；
c、二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)、JCN-AA-(D4,7+D5,7)、JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)的合成
将前体肽Ac-D4,7-Pra分别与Ac-Lys(N3)-D4,7或Ac-Lys(N3)-D5,7溶解于H2O中，加入含5％DMF的CuSO4溶液，以抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应24-28h；经RP-HPLC纯化，得到二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)、JCN-AA-(D4,7+D5,7)；
将前体肽Ac-D9,10,3-Pra与Ac-Lys(N3)-D5,7溶解于H2O中，加入含5％DMF的CuSO4溶液，以抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应24-28h；经RP-HPLC纯化，得到二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)。
作为本发明技术方案的优选，以上所述前体肽Ac-D4,7-Pra与Ac-D9,10,3-Pra的合成方法具体为：
(1)Ac-D4,7-Pra的合成
将Fmoc-L-Propargylgly-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-L-Propargylgly-resin，即Fmoc-Pra-resin；同法依次缩合反应后续氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-Pra-resin，即Fmoc-Anoplin-D4,7-Pra-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D4,7-Pra-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D4,7-Pra-resin进行缩合反应，得到Ac-D4,7-Pra-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-D4,7-Pra；
(2)Ac-D9,10,3-Pra的合成
将Fmoc-L-Propargylgly-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-L-Propargylgly-resin，即Fmoc-Pra-resin；同法依次缩合反应后续氨基酸Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-D-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-D-Leu-D-Leu-Pra-resin，即Fmoc-Anoplin-D9,10,3-Pra-resin，然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D9,10,3-Pra-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D9,10,3-Pra-resin进行缩合反应，得到Ac-D9,10,3-Pra-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-D9,10,3-Pra。
所述各氨基酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为3:1-4:1，乙酸酐与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为12:1-26:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1。
所述侧链叠氮化方法为：先将NaN3与Tf2O在H2O/DCM混合液中室温反应2-2.5h，反应液经DCM、Na2CO3和Na2SO4除去水分，得到Tf2N3溶液；用含有1％TFA的DCM溶液脱去Mtt保护基的树脂经DCM膨胀和CH3OH压缩，真空抽干后，与CuSO4、K2CO3和CH3OH混合，再与上述得到的Tf2N3溶液室温反应46-48h，得到侧链叠氮化合物，切割、纯化得到侧链叠氮化前体肽；其中H2O与DCM的体积比为1:2，NaN3、Tf2O与脱去Mtt保护基的MBHA树脂的摩尔质量比分别为100:1-200:1、30:1-50:1，CuSO4、K2CO3与脱去Mtt保护基的MBHA树脂摩尔质量比分别为0.1:1-0.3:1、0.2:1-0.5:1。
所述前体肽Ac-D4,7-Pra或Ac-D9,10,3-Pra与侧链叠氮化前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)或Ac-D5,7-Lys(N3)或Ac-Lys(N3)-D4,7或Ac-Lys(N3)-D5,7的摩尔质量比均为1:1-1.3:1，前体肽在水中的浓度均为8-10mg/mL，CuSO4、抗坏血酸钠与侧链叠氮化前体肽的摩尔质量比分别为3:1-8:1、15:1-20:1。
所述切割试剂为体积比为95:2.5:2.5的TFA、TIS和H2O的混合溶液。
所述纯化过程为，先进行RP-HPLC分离，然后冷冻干燥；RP-HPLC纯化条件为，流动相A：0.05％TFA的水溶液，流动相B：0.05％TFA的乙腈溶液；线性梯度洗脱30min，收集主要吸收峰的流出液。
所述脱去MBHA树脂Fmoc保护基所采用的试剂为体积分数20％哌啶的DMF溶液。
经质谱鉴定，本发明方法成功合成了“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)、JC-AA-(D4,7+D5,7)和JC-AA-(D9,10,3+D5,7)，以及“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)、JCN-AA-(D4,7+D5,7)和JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)。
(二)二聚化修饰抗菌肽类似物体外活性研究
1、抑菌实验
采用经典二倍微量稀释法测定上述抗菌肽类似物的最小抑菌浓度，即MIC值。具体方法是：将实验细菌菌株分别接种于MH培养基中过夜培养至对数期，并稀释成1×106CFU/mL浓度的细菌悬浮液；将上述抗菌肽类似物溶解于无菌去离子水中，以二倍稀释法将其配成128-1μmol/L不同浓度的肽溶液，与上述细菌悬浮液等体积混合，于96孔培养板中37℃孵育18h，观察；肉眼可见无细菌生长的最小浓度即为最小抑菌浓度MIC；抗生素Rifampicin作阳性对照药；平行重复上述实验三次，结果如表1。
表1对抗常见菌株的最小抑菌浓度
表1结果表明，本发明设计合成的二聚化修饰抗菌肽类似物对常见细菌具有良好的抗菌活性，其抗菌活性相比于母肽Anoplin有明显提高，并且对部分细菌的抗菌活性优于传统抗生素。
2、流式细胞术实验
采用标准大肠杆菌(ATCC25922)菌株，将其接种于MH培养基中过夜培养至对数期，稀释至10×108CFU/mL，用PBS(10mM，pH7.4)洗涤后，半体积重悬；将上述抗菌肽类似物溶解于PBS，使肽溶液浓度为4×MIC，然后与上述细菌悬浮液等体积混合，37℃共孵育1h，经碘化吡啶(PI)避光染色15min后，PBS洗涤除去剩余PI染料，最后经流式细胞仪检测细菌对PI染料荧光的摄取能力，进而定量分析抗菌肽类似物对细菌细胞膜的破坏能力，Rifampicin作阳性对照，结果如图13。
图13结果表明，本发明设计合成的二聚化修饰抗菌肽类似物具有较好的细菌细胞膜破坏能力，其破坏能力与母肽Anoplin相当，而抗生素Rifampicin无明显的细菌细胞膜破坏能力。
3、溶血实验
取新鲜的健康小鼠血液，1000g离心10min(4℃)，弃去上层血清，保留下层血红细胞，用PBS(10mM，pH7.4)清洗血细胞后，将其配制成含有8％血细胞的悬浮液，加于96孔板中；将上述抗菌肽类似物溶解于PBS中，并用二倍稀释法配制成512-4μmol/L不同浓度的肽溶液，将其等体积加于已加入血细胞悬浮液的96孔板中，37℃孵育1h；共孵物1200g离心15min后，将上清液转移至新的96孔板，酶标仪检测其490nm处的吸光值；PBS空白溶液作阴性对照，1％TritonX-100作阳性对照，根据公式：Hemolysis rate(％)＝[(OD490nm peptides-OD490nm negative control)/(OD490nm positive control-OD490nm negative control)]×100％，计算溶血率，结果如图14。
图14结果表明，本发明设计合成的二聚化修饰抗菌肽类似物均具有极低的溶血活性，其溶血率均低于1％，甚至在最高实验浓度256μmol/L时，仍无明显的溶血活性，即表现出低毒性，具有一定的安全性。
综上，本发明是对天然抗菌肽Anoplin部分D型氨基酸替换类似物Anoplin-D4,7，Anoplin-D5,7和Anoplin-D9,10,3的C-末端或N-末端引入非天然氨基酸Fmoc-L-Propargylgly-OH或Fmoc-Lys(Mtt)-OH，并分别对其N-末端进行乙酰化修饰，得到前体肽Ac-D4,7-Pra、Ac-D9,10,3-Pra、Ac-D4,7-Lys(N3)、Ac-D5,7-Lys(N3)、Ac-Lys(N3)-D4,7和Ac-Lys(N3)-D5,7；然后通过点击化学的1,3-偶极环加成反应，以“C-C末端”和“C-N末端”形式进行分子间侧链连接，得到一类二聚化修饰抗菌肽类似物。体外活性研究结果表明，本发明设计合成的二聚化修饰抗菌肽类似物具有强抗菌活性和低毒性，在临床抗菌药物开发中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为Ac-D4,7-Pra质谱图；
图2为Ac-D4,7-Lys(N3)质谱图；
图3为JC-AA-(D4,7+D4,7)质谱图；
图4为Ac-D5,7-Lys(N3)质谱图；
图5为JC-AA-(D4,7+D5,7)质谱图；
图6为Ac-D9,10,3-Pra质谱图；
图7位JC-AA-(D9,10,3+D5,7)质谱图；
图8为Ac-Lys(N3)-D4,7质谱图；
图9为JCN-AA-(D4,7+D4,7)质谱图；
图10为Ac-Lys(N3)-D5,7质谱图；
图11为JCN-AA-(D4,7+D5,7)质谱图
图12为JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)质谱图
图13为抗菌肽类似物PI流式细胞术实验结果图；图中以左到右，上到下的顺序依次为对照组、Anoplin组、JC-AA-(D4,7+D4,7)组、JC-AA-(D4,7+D5,7)组、JC-AA-(D9,10,3+D5,7)组、JCN-AA-(D4,7+D4,7)组、JCN-AA-(D4,7+D5,7)、JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)组和Rifampicin组。
图14为抗菌肽类似物溶血实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法作进一步说明。
实施例1：二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)的合成
(1)Ac-D4,7-Pra的合成
a)树脂的活化及预处理
准确称取MBHA树脂(0.43mmol/g)1.16g于多肽固相合成仪中，经DCM溶液充分溶胀30min后，茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明树脂正常，可进行后续实验。
b)Fmoc-Anoplin-D4,7-Pra-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基；将Fmoc-L-Propargylgly-OH(503mg)、HOBT(204mg)、HBTU(569mg)、DIEA(0.5mL)于DMF中溶解混匀，并与经过体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应1.5h，茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-L-Propargylgly-resin，即Fmoc-Pra-resin；同法依次缩合反应后续氨基酸Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(597mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Ile-OH(530mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(974mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Gly-OH(447mg)，其反应时间均为1h，HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-Pra-resin，即Fmoc-Anoplin-D4,7-Pra-resin；
c)Ac-D4,7-Pra-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Anoplin-D4,7-Pra-resin用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，加入乙酸酐(1.3mL)和DIEA(0.5mL)，缩合反应1.5h，茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Ac-D4,7-Pra-resin；
d)多肽切割
将Ac-D4,7-Pra-resin进行切割，切割试剂为体积比95:2.5:2.5的TFA、TIS(三异丙基硅烷)与H2O混合溶液15mL，经乙醚和水萃取后，冷冻干燥；
e)多肽纯化
先进行RP-HPLC分离，然后冷冻干燥，经质谱鉴定得前体肽Ac-D4,7-Pra，分子量为1290Da，质谱图见图1；其中，RP-HPLC纯化条件：流动相A:0.05％TFA/水；流动相B:0.05％TFA/乙腈；线性梯度洗脱30min，收集主要吸收峰的流出液。
(2)Ac-D4,7-Lys(N3)的合成
a)树脂的活化及预处理
准确称取MBHA树脂(0.43mmol/g)1.16g于多肽固相合成仪中，经DCM溶液充分溶胀30min后，茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明树脂正常，可进行后续实验；
b)Fmoc-Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基；将Fmoc-Lys(Mtt)-OH(938mg)、HOBT(204mg)、HBTU(569mg)、DIEA(0.5mL)于DMF中溶解混匀，并与经过体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应1.5h，茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Lys(Mtt)-resin；同法依次缩合反应后续氨基酸Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(597mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Ile-OH(530mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(974mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Gly-OH(447mg)，其反应时间均为1h，HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-Lys(Mtt)-resin，即Fmoc-Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin；
c)Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基，加入乙酸酐(1.3mL)和DIEA(0.5mL)，缩合反应1.5h，茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合成功，得到Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin；
d)Ac-D4,7-Lys(N3)-resin的合成
将上述得到的Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰。其中侧链叠氮化的方法为：将6.5g NaN3(叠氮化钠)与2.86mL Tf2O(三氟甲磺酸酐)在17mL H2O和33mL DCM的混合液中室温反应2h，再经DCM、NaCO3和Na2SO4除去水分，得到Tf2N3(三氟叠氮)溶液；Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin用含有1％TFA的DCM溶液脱去Mtt保护基，树脂经DCM膨胀和CH3OH压缩，真空抽干后，与25mg CuSO4、25mg K2CO3、7mL CH3OH混合，再与上述得到的Tf2N3溶液室温反应48h，得到侧链叠氮化合物Ac-D4,7-Lys(N3)-resin。
e)多肽切割
将Ac-D4,7-Lys(N3)-resin进行切割，切割试剂为体积比95:2.5:2.5的TFA、TIS与H2O混合溶液15mL，经乙醚和水萃取后，冷冻干燥；
f)多肽纯化
先进行RP-HPLC分离，然后冷冻干燥，经质谱鉴定得前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)-resin，分子量为1349Da，质谱图见图2；其中，RP-HPLC纯化条件：流动相A:0.05％TFA/水；流动相B:0.05％TFA/乙腈；线性梯度洗脱30min，收集主要吸收峰的流出液。
(3)JC-AA-(D4,7+D4,7)的合成
以前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)为基准，将13.51mgAc-D4,7-Pra和12.65mgAc-D4,7-Lys(N3)溶解于2616μL水溶液中，使肽浓度为10mg/mL，加入1171μL含5％DMF的硫酸铜水溶液，37.15mg抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应26h，经RP-HPLC纯化，最终经质谱鉴定得到二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)，分子量分别为2639Da，质谱图见图3。
实施例2：二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D5,7)的合成
前体肽Ac-D5,7-Lys(N3)的合成：Fmoc-Lys(Mtt)-OH(938mg)、HOBT(204mg)、HBTU(569mg)、DIEA(0.5mL)于DMF中溶解混匀，并与经过体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Lys(Mtt)-resin，然后缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(597mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Ile-OH(530mg)、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(974mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Gly-OH(447mg)；
其他过程同实施例1。经质谱鉴定，分别得到前体肽Ac-D4,7-Pra，分子量为1290Da，质谱图见图1；前体肽Ac-D5,7-Lys(N3)，分子量为1349Da，质谱图见图4；二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D5,7)，分子量分别为2639Da，质谱图见图5。
实施例3：二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D9,10,3+D5,7)的合成
前体肽Ac-D9,10,3-Pra的合成：Fmoc-L-Propargylgly-OH(503mg)、HOBT(204mg)、HBTU(569mg)、DIEA(0.5mL)于DMF中溶解混匀，并与经过体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Pra-resin，然后缩合反应后续氨基酸：Fmoc-D-Leu-OH(530mg)、Fmoc-D-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(597mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Ile-OH(530mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(974mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-D-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Gly-OH(447mg)；
前体肽Ac-D5,7-Lys(N3)的合成同实施例2；
其他过程同实施例1。经质谱鉴定，分别得到前体肽Ac-D9,10,3-Pra，分子量为1290Da，质谱图见图6；前体肽Ac-D5,7-Lys(N3)，分子量为1349Da，质谱图见图4；二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D9,10,3+D5,7)，分子量分别为2639Da，质谱图见图7。
实施例4：二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)的合成
前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7的合成：脱去Fmoc保护基的MBHA树脂，先缩合反应得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应后续氨基酸Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(597mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Ile-OH(530mg)、Fmoc-Arg(pbf)-OH(974mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Gly-OH(447mg)、Fmoc-Lys(Mtt)-OH(938mg)；
其他过程同实施例1。经质谱鉴定，分别得到前体肽Ac-D4,7-Pra，分子量为1290Da，质谱图见图1；前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7，分子量为1349Da，质谱图见图8；二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)，分子量分别为2639Da，质谱图见图9。
实施例5：二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D5,7)的合成
前体肽Ac-Lys(N3)-D5,7的合成：脱去Fmoc保护的MBHA树脂，先缩合反应得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(597mg)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Ile-OH(530mg)、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(974mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(703mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Leu-OH(530mg)、Fmoc-Gly-OH(447mg)、Fmoc-Lys(Mtt)-OH(938mg)；
其他过程同实施例1。经质谱鉴定，分别得到前体肽Ac-D4,7-Pra，分子量为1290Da，质谱图见图1；前体肽Ac-Lys(N3)-D5,7，分子量为1349Da，质谱图见图10；二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D5,7)，分子量分别为2639Da，质谱图见图11。
实施例6：二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)的合成
前体肽Ac-D9,10,3-Pra的合成同实施例3；前体肽Ac-Lys(N3)-D5,7的合成同
实施例5；
其他过程同实施例1。经质谱鉴定，分别得到前体肽Ac-D9,10,3-Pra，分子量为1290Da，质谱图见图6；前体肽Ac-Lys(N3)-D5,7，分子量为1349Da，质谱图见图10；二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)，分子量分别为2639Da，质谱图见图13。
Claims (10)
1.具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物，其特征是，该抗菌肽类似物包括“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物和“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物，其中，“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物包括以下结构：
(1)JC-AA-(D4,7+D4,7)
(2)JC-AA-(D4,7+D5,7)
(3)JC-AA-(D9,10,3+D5,7)；
“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物包括以下结构：
(4)JCN-AA-(D4,7+D4,7)
(5)JCN-AA-(D4,7+D5,7)
(6)JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)。
2.如权利要求1所述的具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物在临床抗菌药物开发中的应用。
3.如权利要求1所述的具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是：
(1)“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物的合成
a、分别在Anoplin-D4,7和Anoplin-D9,10,3序列的C-末端引入非天然氨基酸Fmoc-L-Propargylgly-OH，得到Anoplin-D4,7-Pra和Anoplin-D9,10,3-Pra；分别以Anoplin-D4,7-Pra和Anoplin-D9,10,3-Pra为基体，采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-Pra-resin与Anoplin-D9,10,3-Pra-resin，然后分别进行N-末端乙酰化修饰，得到Ac-D4,7-Pra-resin和Ac-D9,10,3-Pra-resin，分别经切割、纯化后得到前体肽Ac-D4,7-Pra与Ac-D9,10,3-Pra；
b、分别在Anoplin-D4,7，Anoplin-D5,7序列的C-末端引入非天然氨基酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH，得到Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)和Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)；以Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)和Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)为基体，采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin和Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)-resin，然后分别进行N-末端乙酰化修饰，得到Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin和Ac-D5,7-Lys(Mtt)-resin；分别对Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin与Ac-D5,7-Lys(Mtt)-resin进行侧链叠氮化修饰，切割、纯化后得到前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)与Ac-D5,7-Lys(N3)；
c、利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Ac-D4,7-Pra侧链的“炔基”官能团分别与前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)或Ac-D5,7-Lys(N3)侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)和JC-AA-(D4,7+D5,7)；利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Ac-D9,10,3-Pra侧链的“炔基”官能团与前体肽Ac-D5,7-Lys(N3)侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D9,10,3+D5,7)；
(2)“C-N末端”二聚化修饰二聚体抗菌肽类似物的合成
a、采用如(1)“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物的合成步骤a中方法得到前体肽Ac-D4,7-Pra和Ac-D9,10,3-Pra；
b、分别在Anoplin-D4,7，Anoplin-D5,7序列的N-末端引入非天然氨基酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH，得到Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7与Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7；以Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7与Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7为基体，采用经典固相合成方法合成Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7-resin与Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7-resin，然后分别进行N-末端乙酰化修饰，得到Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin与Ac-Lys(Mtt)-D5,7-resin；分别对Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin与Ac-Lys(Mtt)-D5,7-resin进行侧链叠氮化修饰，切割、纯化得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7与Ac-Lys(N3)-D5,7；
c、利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Ac-D4,7-Pra侧链的“炔基”官能团分别与前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7或Ac-Lys(N3)-D5,7侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)与JCN-AA-(D4,7+D5,7)；利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Ac-D9,10,3-Pra侧链的“炔基”官能团与前体肽Ac-Lys(N3)-D5,7侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)。
4.如权利要求3所述的具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述前体肽Ac-D4,7-Pra与Ac-D9,10,3-Pra的合成方法具体为：
(1)Ac-D4,7-Pra的合成
将Fmoc-L-Propargylgly-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-L-Propargylgly-resin，即Fmoc-Pra-resin；同法依次缩合反应后续氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-Pra-resin，即Fmoc-Anoplin-D4,7-Pra-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D4,7-Pra-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D4,7-Pra-resin进行缩合反应，得到Ac-D4,7-Pra-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-D4,7-Pra；
(2)Ac-D9,10,3-Pra的合成
将Fmoc-L-Propargylgly-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-L-Propargylgly-resin，即Fmoc-Pra-resin；同法依次缩合反应后续氨基酸Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-D-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-D-Leu-D-Leu-Pra-resin，即Fmoc-Anoplin-D9,10,3-Pra-resin，然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D9,10,3-Pra-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D9,10,3-Pra-resin进行缩合反应，得到Ac-D9,10,3-Pra-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-D9,10,3-Pra。
5.具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，利用如权利要求4所述的方法合成前体肽Ac-D4,7-Pra与Ac-D9,10,3-Pra，所述二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法具体为：
(1)“C-C末端”二聚化修饰抗菌肽类似物的合成
a、Ac-D4,7-Lys(N3)的合成
将Fmoc-Lys(Mtt)-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Lys(Mtt)-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-Lys(Mtt)-resin即为Fmoc-D4,7-Lys(Mtt)-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D4,7-Lys(Mtt)-resin进行缩合反应，得到Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin；将Ac-D4,7-Lys(Mtt)-resin用体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰，得到侧链叠氮化合物Ac-D4,7-Lys(N3)-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)；
b、Ac-D5,7-Lys(N3)的合成
将Fmoc-Lys(Mtt)-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Lys(Mtt)-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-Lys-D-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-Lys(Mtt)-resin即为Fmoc-D5,7-Lys(Mtt)-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D5,7-Lys(Mtt)-resin进行缩合反应，得到Ac-D5,7-Lys(Mtt)-resin；将Ac-D5,7-Lys(Mtt)-resin用含有1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰，得到侧链叠氮化合物Ac-D5,7-Lys(N3)-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-D5,7-Lys(N3)；
c、二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)、JC-AA-(D4,7+D5,7)、JC-AA-(D9,10,3+D5,7)的合成
将前体肽Ac-D4,7-Pra分别与Ac-D4,7-Lys(N3)或Ac-D5,7-Lys(N3)溶解于H2O中，加入含5％DMF的CuSO4溶液，以抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应24-28h；经RP-HPLC纯化，得到二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D4,7+D4,7)、JC-AA-(D4,7+D5,7)；
将前体肽Ac-D9,10,3-Pra与Ac-D5,7-Lys(N3)溶解于H2O中，加入含5％DMF的CuSO4溶液，以抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应24-28h；经RP-HPLC纯化，得到二聚化修饰抗菌肽类似物JC-AA-(D9,10,3+D5,7)。
(2)“C-N末端”二聚化修饰抗菌肽类似物的合成
a、Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH，得到Fmoc-Lys(Mtt)-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即Fmoc-Lys(Mtt)-D4,7-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-Lys(Mtt)-D4,7-resin进行缩合反应，得到Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin；将Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin用体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰，得到侧链叠氮化合物Ac-Lys(N3)-D4,7-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7；
b、Ac-Lys(N3)-D5,7的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH，得到Fmoc-Lys(Mtt)-Gly-Leu-Leu-Lys-D-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin即为Fmoc-Lys(Mtt)-D5,7-resin；然后用体积分数20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7-resin；将乙酸酐、DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-Lys(Mtt)-D5,7-resin进行缩合反应，得到Ac-Lys(Mtt)-D5,7-resin；将Ac-Lys(Mtt)-D5,7-resin用体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰，得到侧链叠氮化合物Ac-Lys(N3)-D5,7-resin，切割、纯化得到前体肽Ac-Lys(N3)-D5,7；
c、二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)、JCN-AA-(D4,7+D5,7)、JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)的合成
将前体肽Ac-D4,7-Pra分别与Ac-Lys(N3)-D4,7或Ac-Lys(N3)-D5,7溶解于H2O中，加入含5％DMF的CuSO4溶液，以抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应24-28h；经RP-HPLC纯化，得到二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D4,7+D4,7)、JCN-AA-(D4,7+D5,7)；
将前体肽Ac-D9,10,3-Pra与Ac-Lys(N3)-D5,7溶解于H2O中，加入含5％DMF的CuSO4溶液，以抗坏血酸钠作抗氧化剂，氩气保护，室温避光反应24-28h；经RP-HPLC纯化，得到二聚化修饰抗菌肽类似物JCN-AA-(D9,10,3+D5,7)。
6.如权利要求4或5所述的具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是：
(1)所述各氨基酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为3:1-4:1，乙酸酐与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为12:1-26:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1；
(2)所述侧链叠氮化方法为：先将NaN3与Tf2O在H2O/DCM混合液中室温反应2-2.5h，反应液经DCM、Na2CO3和Na2SO4除去水分，得到Tf2N3溶液；用含有1％TFA的DCM溶液脱去Mtt保护基的树脂经DCM膨胀和CH3OH压缩，真空抽干后，与CuSO4、K2CO3和CH3OH混合，再与上述得到的Tf2N3溶液室温反应46-48h，得到侧链叠氮化合物，切割、纯化得到侧链叠氮化前体肽；其中H2O与DCM的体积比为1:2，NaN3、Tf2O与脱去Mtt保护基的MBHA树脂的摩尔质量比分别为100:1-200:1、30:1-50:1，CuSO4、K2CO3与脱去Mtt保护基的MBHA树脂摩尔质量比分别为0.1:1-0.3:1、0.2:1-0.5:1。
7.如权利要求4或5所述的具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述前体肽Ac-D4,7-Pra或Ac-D9,10,3-Pra与侧链叠氮化前体肽Ac-D4,7-Lys(N3)或Ac-D5,7-Lys(N3)或Ac-Lys(N3)-D4,7或Ac-Lys(N3)-D5,7的摩尔质量比均为1:1-1.3:1，前体肽在水中的浓度均为8-10mg/mL，CuSO4、抗坏血酸钠与侧链叠氮化前体肽的摩尔质量比分别为3:1-8:1、15:1-20:1。
8.如权利要求3-5任一项所述的具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述切割试剂为体积比为95:2.5:2.5的TFA、TIS和H2O的混合溶液。
9.如权利要求3-5任一项所述的具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述纯化过程为，先进行RP-HPLC分离，然后冷冻干燥；RP-HPLC纯化条件为，流动相A：0.05％TFA的水溶液，流动相B：0.05％TFA的乙腈溶液；线性梯度洗脱30min，收集主要吸收峰的流出液。
10.如权利要求3-5任一项所述的具有强抗菌活性和低毒性的二聚化修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述脱去MBHA树脂Fmoc保护基所采用的试剂为体积分数20％哌啶的DMF溶液。
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