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CN112957470A - 一种治疗结肠癌的复合物及其应用 - Google Patents

一种治疗结肠癌的复合物及其应用 Download PDF

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CN112957470A CN202110239648.4A CN202110239648A CN112957470A CN 112957470 A CN112957470 A CN 112957470A CN 202110239648 A CN202110239648 A CN 202110239648A CN 112957470 A CN112957470 A CN 112957470A
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梁欣
张旭东
梅林�
张錦勰
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Sun Yat Sen University Shenzhen Campus
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Abstract

本发明公开一种治疗结肠癌的复合物及其应用，所述所述组合物包括黑磷量子点、脂质体、Adpgk肽和F127凝胶；所述Adpgk肽与黑磷量子点被脂质体包裹形成Adpgk肽黑磷量子点脂质体；所述Adpgk肽黑磷量子点脂质体被包埋于F127凝胶中；本发明通过利用脂质体有效负载具有良好光热效应的黑磷量子点(BPQDs)及Adpgk多肽，实现了光热法和免疫法的联合应用；同时，我们发现载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体(Adpgk peptide/BPQDs/Liposome的应用在抗瘤效果上较载黑磷量子点复合脂质体更有优势，表明热治疗和免疫治疗联合应用可以有效增强抗肿瘤效果。

Description

一种治疗结肠癌的复合物及其应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种治疗结肠癌的复合物及其应用。
背景技术
结肠癌是由遗传和环境因素相互作用引起的疾病，发生在结肠部位，是常见的胃肠道恶性肿瘤。统计数据显示，在2017年，预计美国有近14万人被诊断为结肠癌，约有5万人因此而死亡；近年来，结肠癌在我国的发病率显著上升，死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位。
目前，结肠癌常规治疗手段主要有手术、放疗、化疗、基因治疗及中医药治疗等。化疗即化学药物治疗，一般手术后患者需要接受1年～1年半的化疗，大概是2～3个疗程。化疗期间，患者可能会出现比较剧烈的副作用反应，如恶心、没有食欲、乏力、白细胞和血小板的计数下降等，这时候可以适当减少用量，同时配合使用能减少副作用的药物。假如患者的情况较差，副作用显著，反而会导致病情加重，这时候不宜进行化疗。免疫治疗能帮助患者提高抗肿瘤的能力，包括干扰素、白细胞介素、转移因子、肿瘤坏死因子等，目前已逐渐广泛应用。免疫治疗方法不仅可以提高患者自身的免疫能力，而且可以配合化疗的进行。
早期癌内镜下可以根治的病变可以采取内镜微创治疗，中晚期癌治疗方法是以手术为主、辅以化疗、免疫治疗、中药以及其他支持治疗的综合方案，以提高手术切除率，降低复发率，提高生存率。由于早期肠癌在临床诊断上较困难，大多数患者被确诊为肠癌时，已发展至中晚期。多年来，这些常规治疗手段对结肠癌的疗效一直低于预期，且对于众多患者产生较多毒副作用。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种可用于制备治疗结肠癌的药物复合物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种复合物，所述组合物包括黑磷量子点、脂质体、Adpgk肽和F127凝胶；所述Adpgk肽与黑磷量子点被脂质体包裹形成Adpgk肽黑磷量子点脂质体；所述Adpgk肽黑磷量子点脂质体、被包埋于F127凝胶中。
Adpgk抗原多肽可以看成是一种治疗性多肽疫苗，通过给机体注射适宜量的Adpgk抗原多肽可有效增强机体自身的免疫原性，激活荷瘤小鼠自身的免疫系统，诱导小鼠的免疫应答，达到控制结肠癌细胞的增殖，减弱结肠癌的恶化程度。
P luronic F127胶具有一定的支持和药物缓释功，可作为纳米载药系统的基质，在生物学应用领域中已得到广泛认可。
作为本发明的优选实施方式，所述脂质体由溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、胆固醇-peg 600组成；按质量比为，溶血卵磷脂：磷脂酰乙醇胺：胆固醇：胆固醇-peg 600＝2.5：2.5：1：2。
进一步地，本发明还提供了所述复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)运用薄膜分散法制备脂质体；
(2)运用机械超声法和液相法制备黑磷量子点；
(3)通过机械挤压法、超声法制备载黑磷量子点复合脂质体；
(4)通过机械挤压法、超声法制备载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体；
(5)将所述载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体充分溶于F127胶中，冷冻干燥后即制备得到本发明所述复合物；所述载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体与所述25％F127胶的体积比为1：2。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中所述脂质体的制备过程为：脂质体的制备：称取2.5mg溶血卵磷脂、2.5mg磷脂酰乙醇胺、1mg胆固醇、2mg胆固醇-peg 600，在4mL的无水乙醇中充分溶解，40℃水浴,180rpm真空旋转蒸发至无水乙醇全部蒸发，在真空烤箱中干燥过夜；次日加入4mL去离子水，60℃恒温水浴中水化5～6小时；冰水浴中300W超声15～20分钟,用0.45μm滤器过滤1～3次，收集滤液即所述脂质体。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中所述黑磷量子点的制备过程为：取黑磷晶体，每次取2mL的NMP溶液于研钵中研磨，收集上清，重复至剩余沉淀物研磨完为止；以30％功率超声12小时，间歇和工作时间均为5秒；冰水浴中300W超声10小时，取上清在氩气保护下150℃油浴，1000r/min液相剥离2～3小时至液体清澈透明；7000r/min离心30分钟，上清以20000r/min离心2小时；去上清，沉淀即所述黑磷量子点。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中所述黑磷量子点复合脂质体的制备过程为：取脂质体混匀，将黑磷量子点溶于水溶液中，将脂质体和黑磷量子点水溶液按体积比为＝1：1匀质，用匀浆器用力杵250个来回以上；13000r/min高速冷冻离心12h，收集沉淀即所述黑磷量子点复合脂质体。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(4)中所述载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体的制备过程为：取500μL黑磷量子点重悬于1mL去离子水，加入10μLCy5.5染液重复混匀，避光以600r/min转速磁力搅拌过夜；次日13000r/min、4℃离心1小时，弃上清；用1mL去离子水洗沉淀2～3次，收集沉淀即带Cy5.5标签的载黑磷量子点样品；取1mL脂质体、1mg Adpgk肽与所述带Cy5.5标签的载黑磷量子点样品混匀，避光以600r/min转速磁力搅拌过夜；次日13000r/min、4℃离心1小时，弃上清，并用去离子水洗沉淀2～3次，收集沉淀即所述载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体。
本发明还要求保护所述复合物在制备治疗结肠癌的药物中的应用。
本发明还要求保护一种用于治疗结肠癌的药物，所述药物包括所述复合物。
作为本发明的优选实施方式，所述药物还包括GM-CSF、IL-2和PD-1抗体。
作为本发明的优选实施方式，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
作为本发明的优选实施方式，所述药物的剂型为注射剂。
本发明通过利用脂质体有效负载具有良好光热效应的黑磷量子点(BPQDs)及Adpgk多肽，实现了光热法和免疫法的联合应用；同时，我们发现载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体(Adpgk peptide/BPQDs/Liposome的应用在抗瘤效果上较载黑磷量子点复合脂质体更有优势，表明热治疗和免疫治疗联合应用可以有效增强抗肿瘤效果。
附图说明
图1为实验原理图。
图2为载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体扫描电镜结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1本发明所述复合物的制备
1、脂质体的制备：
1)预冷低温冷却液循环泵，使冷却温度达10℃以下；
2)取2.5mgL-α-溶血卵磷脂、2.5mgL-α-磷脂酰乙醇胺、1mg胆固醇、2mg胆固醇-peg600，加入4mL无水乙醇充分溶解，转移至25mL圆底烧瓶；
(后续制备红色荧光脂质体，则需在此步骤中再加入10μLAtto 532DOPE染料，原液浓度：5mg/mL)
3)接通旋转装置，接通大气，打开真空泵开关，接头处用胶脂密封；
4)水浴锅温度设40℃，转速调至150～180r/min，抽真空旋转1h，直至看到烧瓶底部被一层薄膜覆盖且瓶内无水乙醇几乎全部挥发；
5)关闭旋转、加热按钮，缓慢通大气，关闭真空泵开关；将烧瓶取下,封口膜封口，扎些许小孔，置真空干燥箱中过夜干燥；
6)次日向烧瓶内加4mL ddH2O后置于60℃恒温水浴中水化5～6h；
7)收取样品液，300W功率冰水浴超声15～20min；
8)用0.45μm滤器过滤原液1～3次，收集所得过滤液置4℃冰箱保存。
2、黑磷量子点的制备及浓度测定
制备方法：
1)称20mg黑磷晶体，用45～50mL的NMP溶液研磨，每次取2mL于研钵中缓慢研磨，吸取上清置50mL离心管中，直至剩余的沉淀物研磨完为止；
2)封口膜封口，暂放4℃冰箱保存；
3)采用探头持续超声12h(30％功率，间歇和工作时间均为5s)；
4)冰水浴(功率300W)持续超声10h或者此步骤以5000r/min离心上述3)中所得样品，取上清置于250mL特定烧瓶中在持续氩气的保护下，抽真空反复3次，后持续通氩气的状态下，油浴锅温度设定150℃，1000r/min液相剥离23h，直至瓶内液体变清澈透明；
5)将样品以7000r/min转速离心30min,分离上清和沉淀，沉淀可加入新鲜的NMP溶液继续进行机械超声，上清以20000r/min转速离心2h；
6)去除上清，得到少量的沉淀，即为制备所得的黑磷量子点(BPQDs)，可封口暂放4℃冰箱保存。
浓度测定：
7)取500μL的BPQDs样品液，13000r/min高速冷冻离心机离心1h，向所得BPQDs沉淀加入500μL ddH2O重悬，吸取重悬液至5mL耐热透明玻璃瓶中；
8)吸取2mL浓硝酸加入玻璃瓶内，通风橱内，半旋盖子，过夜放置；
9)打开恒温电热套升温至100℃，取下样品瓶盖，放置于电热套内加热蒸发；当瓶内液体蒸发至500μL时,补加2mL的ddH2O继续蒸发；
10)再次达到500μL时，取出样品置于15mL离心管中；
11)吸取9.5mL的ddH2O加入其中并定容至10mL；
12)送样检测，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICPICP)测定各样品对应磷元素的浓度；
14)根据20倍稀释比计算原样品中BPQDs的浓度。
3、载黑磷量子点复合脂质体的制备及包封率测定
制备方法：
1)取1.5mL EP管，加入1mL上述所制备的BPQDs样品液；
2)用4℃，13000r/min转速离心1h，去上清，得BPQDs样品沉淀；
3)吸取1mL脂质体与所述BPQDs样品沉淀混匀，用匀浆器用力杵250个来回以上；
4)13000r/min高速冷冻离心12h，少许沉淀即为载黑磷量子点复合脂质体(BPQDs/Liposome)；
5)冰水浴(功率300W)超声15～20min；
6)通过0.45μm过滤器过滤1～3次可得不同粒径大小的纳米粒；过滤次数增多，粒径总体平均值减少；收集过滤液至4℃冰箱保存；
包封率测定：
1)制备出对应BPQDs终浓度为10、50、100、150、200、250、300、350p.p.m(μg/mL)的BPQDs/Liposome样品各200μL。
2)做好浓度标记，用1.5mL EP管分别取相对应原液量，每个浓度重复3组；
3)所有样品13000r/min高速离心1h；
4)各组沉淀分别加入200μL脂质体混匀，并加入800μLddH2O混匀；用匀浆器分别杵300次，
5)4℃条件13000r/min离心1h，弃上清，得到沉淀；用ddH2O洗沉淀2次；
6)各样品分别用200μLddH2O重悬，以200μL空白脂质体作对照组，对照组和各实验组分别转移到2mL耐热透明玻璃瓶内，分别加入2mL浓硝酸，过夜消化。样品蒸发、制样测定处理程序同上述黑磷量子点浓度测定。
7)计算出对应样品的包封率，计算公式如下：
EE％＝(1-C0/Cn)×100％，其中C0为空白脂质体中所含游离磷元素总量，Cn为其他实验组对应磷元素总量(n取10、50、100、150、200、250、300、350)。
4、载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体的制备
1)取500μLBPQDs样品液所得沉淀加1mL ddH2O重悬后，加Cy5.5染液10μL，充分混合后置于15mL离心管中，用锡箔纸包裹，以600r/min转速置于磁力搅拌器上过夜搅拌；
2)次日，4℃，13000r/min离心1h，弃上清，得到沉淀重复用1mLddH2O洗2～3次，收集沉淀即带Cy5.5标签BPQDs样品Cy5.5-BPQDs，4℃保存；
3)取1mL前面所述制备的红色荧光脂质体1mL加入上述2)所得Cy5.5-BPQDs样品中，充分混匀；
4)裹上锡箔纸，常温600r/min转速过夜搅拌；
5)次日取出，13000r/min离心1h,所得沉淀用ddH2O洗2次后收集沉淀即为荧光BPQDs/Liposome纳米粒，4℃避光保存，为后续细胞摄取实验作准备；
6)在上述3)步骤中，充分混匀前，加入1mg Adpgk-FITC，后进行第4)和5)步骤，可以得到荧光多肽BPQDs/Liposome纳米粒，置4℃冰箱避光保存；如果不需要用到荧光，则多肽的加入可以直接加不带荧光的Adpgk；为方便后续扫描样品，可通过冷冻干燥2h制备得到Adpgk-peptide/BPQDs/Liposome样品，用封口膜封口，阴暗低温处保存；
5、Adpgk-peptide/BPQDs/Liposome/F127 gel样品制备
用200μL的25％F127胶充分溶解多肽BPQDs/Liposome，然后冷冻干燥4小时，即制备得到Adpgk-peptide/BPQDs/Liposome/F127 gel样品，用封口膜封口，阴暗低温处保存。
实施例2载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体的表征
为了检验所制备的载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体是否符合载药纳米系统的粒径要求，对其形貌在扫描电镜下进行了表征，如图2(A表示Adpgk多肽形貌图，B表示载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体形貌，C和D为25％浓度的F127胶形貌图。)所示。
多肽抗原经冷冻干燥后在扫描电镜下看到的碎片化散乱状态，而被脂质体包裹后，经冷冻干燥后，扫描电镜下所观察到的是近似脂质体的球状或椭球状形态，而且粒径大小显示在200nm左右，这与前述扫描电镜下脂质体的粒径大小150nm左右比较接近，说明该载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体对于黑磷量子点和Adpgk多肽的包被是成功的，符合实验所需脂质体粒径要求。同时，对于25％浓度的F127胶经冷冻干燥后扫描电镜观测结果显示了其结构特征，作为一种聚合物凝胶大分子，如果将其应用作为载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体的基质体系，不仅可以对该体系起到一定的固定作用，还能减缓该体系药物的释放，提高药物的利用率。
实施例3细胞实验
一、细胞摄取实验
1)接种合适密度的对数期HeLa或DC2.4细胞到12孔板(预先放有细胞爬片)，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
2)待次日贴壁细胞密度到达70～80％时，吸去旧培养基；
3)加入750μL不含胎牛血清的对应细胞所需培养液，再每孔加入250μL相应脂质体样品，继续培养4h；
4)吸去各孔旧培养液，分别用1mL 1×PBS缓冲液洗2次；
5)制片，通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察相应的细胞对载黑磷量子点脂质体的摄取效果。
二、细胞毒性实验——CCK 8法
(一)检测载黑磷量子点脂质体的细胞毒性
1)按1×104/孔的密度接种对数期HeLa或MC38细胞到96孔板，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
2)分别用100μL新鲜培养液与0、10、20、30、50、80、100p.p.m浓度的BPQDs、对应BPQDs浓度的BPQDs/Liposome样品或对应BPQDs浓度的BPQDs/Liposome/F127 gel混合制备得到测试培养液；
3)待次日贴壁细胞密度到达80％时，替换旧培养液为相应的各测试培养液，每种培养液分别测试6个复孔；
4)培养箱继续培养，分别在培养24h、48h和72h时相应时间后，取出，置于无菌操作台内每孔再分别加入10μLCCK 8溶液CCK8溶液；
5)继续培养3h后使用酶标仪在450nm处测定各孔OD值，以6个复孔的均值计算细胞存活率大小。
细胞存活率＝(ODX-ODB)/(OD0-ODB)×100％；其中，ODX表示各浓度培养液分别对应的OD值，X＝0、10、20、30、50、80、100；OD0值对应没有加入任何样品的孔所测得OD值，规定对应存活率为100％ODB为单纯加入培养基而不含细胞的孔对应的OD值，规定其存活率为0。
(二)检测光热载黑磷量子点脂质体的细胞毒性
与检测载黑磷量子点脂质体的细胞毒性过程相似，测试培养液分别含有0、1、5、10、20、30p.p.m浓度的BPQDs、对应BPQDs浓度的BPQDs/Liposome样品或对应BPQDs浓度的BPQDs/Liposome/F127 gel，更换测试培养液4小时后用808nm近红外光(P＝1.5W/cm2)照10分钟，继续培养12h、24h后，取出，置于无菌操作台内每孔再分别加入10μLCCK 8溶液；继续培养3h后使用酶标仪在450nm处测定各孔OD值，并计算细胞存活率大小(计算方法与前述相同)。
三、细胞凋亡实验
1)按1×106/孔的密度接种对数期HeLa或MC38细胞到6孔板(预先放有细胞爬片)，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
2)次日待细胞密度为80％左右，更换测试培养液；测试培养液含有750μL无血清培养基、250μL脂质体制备的含有BPQDs浓度为0、5、10、20、30、40p.p.m浓度的BPQDs/Liposome样品，每个浓度重复3个孔；
3)继续培养3小时，取出，用808nm近红外光(P＝1.5W/cm2)照10分钟；
4)每孔加入3μL染液(每1mL培养基含有1.5μLAM和1.5μLPI配制而成)，静置5min；
5)继续培养3h，去培养基，并用1×PBS缓冲液洗3次；
6)制片，荧光倒置显微镜镜检。
四、实验结果
从对人宫颈癌细胞(HeLa细胞)、小鼠结肠癌(MC38细胞)及小鼠树突状细胞(DC2.4细胞)的培养，不同的细胞呈现出不同的形态。为了探究细胞对载黑磷量子点脂质体的摄取，我们将两种新构建的脂质体体系分别用HeLa细胞和DC2.4细胞进行摄取实验，结果一致表明所构建的载黑磷量子点复合脂质体(BPQDs/Liposome)及载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体(Adpgk-peptide/BPQDs/Liposome)都能够较好地被细胞所摄取。
对于细胞的毒性实验，我们采用了不辐照和近红外激光辐照的两种处理方式对不同的细胞进行了实验探讨。不辐照条件下，一定BPQDs浓度范围内，BPQDs和BPQDs/Liposome对HeLa细胞及MC38细胞均表现出没有毒害作用，辐照条件下，因BPQDs和BPQDs/Liposome具有的良好的光热效果，使得细胞的相对存活率逐步减小。
辐照后细胞的凋亡情况，结果同样表现出随着载BPQDs浓度的增加，细胞死亡率逐渐增高，当到达一定的浓度时，细胞几乎全部凋亡，这说明细胞死亡率的大小不仅受到辐照因素的影响，也受这一载药体系浓度的影响，表现出剂量依赖效应，这为后续动物水平上的实验探究提供了浓度依据。
实施例4动物实验
(一)小鼠肿瘤模型及用药
45周龄的C57BL/6雌鼠购于广东医学实验动物中心。待小鼠适应生长1周左右，体重到达18g左右时，先脱去背部毛发，用胰岛素注射器分别将200μL含2×106个MC38细胞的细胞悬液(细胞消化离心得细胞沉淀后，用1×PBS缓冲液重悬而得)皮下注射入每只小鼠背部靠右侧部位，之后每天观测小鼠成瘤大小情况，用游标卡尺测量瘤最窄处长度(a)和最宽处的长度值(b)，长度单位：mm。再根据公式计算肿瘤的体积V，单位为mm3。关系式为：V＝a2×b/2。等待肿瘤体积增长至120mm3左右开始后续实验研究。
将所准备的实验小鼠分为7组，并编号为第1-7组(#1-#7),每组中各小鼠背部左侧近瘤区域均皮下注射100μL的GM-CSF(100ng/mL)和100μL的IL-2(10ng/mL)，然后再在背部左侧近瘤部位进行下列不同处理方式：
第1组(#1)：背部皮下注射200μL 1×PBS缓冲液；
第2组(#2)：背部皮下注射200μL 25％浓度的F127 gel；
第3组(#3)：背部皮下注射200μL 25％浓度的F127 gel+BPQDs/Liposome+Adpgkpeptide(liposome用量200μL，BPQDs终浓度30μg/mL，Adpgk peptide用量150μg/只)；
第4组(#4)：注射同第3组，并加用808nm近红外激光(P＝1.5W·cm-2)光照8min；
第5组(#5)：先进行皮下注射200μL的1×PBS缓冲液，再通过尾静脉注射100μLanti-PD-1，间隔两天后，需要再次进行尾静脉注射100μL体积的anti-PD-1；
第6组(#6)：皮下注射200μL 25％浓度的F127gel+BPQDs/Liposome(其中liposome用量200μL，BPQDs终浓度30μg/mL)，并且需尾静脉注射100μL anti-PD-1，加用808nm近红外激光仪(P＝1.5W/cm2)光照8min，间隔两天后再次尾静脉注射100μL anti-PD-1；
第7组(#7)：注射同第4组，另外，在光照处理前，每只小鼠需要尾静脉注射100μLanti-PD-1，间隔两天后再次尾静脉注射anti-PD-1，体积为100μL；
当天记为第0天，称量各组小鼠的体重大小，并测量瘤最窄处及最宽处值，做好记录，计算瘤体积大小；分别在第2、4、6、8、10、12、14天称量各小鼠体重及测量瘤体积，同时在第4天时，所有实验动物再次进行同第0天的处理。
第16天处死小鼠，分离瘤组织，记录其肿瘤。
(二)流式检测
1)随机每组7个样品中抽取4个样品，对应分别剪切一半的瘤组织及肺组织，剩余的一半瘤组织，用适量OCT包埋冻存在-80℃冰箱用于后续做冰冻切片；
2)将用于流式实验的一半的瘤组织加入1.5mL的staining buffer进行剪切，充分研磨后，过滤，收集对应各组织样品过滤液；
3)调转速为1200r·min-1，离心5min，收集细胞沉淀，若沉淀颜色偏暗红，再加入1mL红细胞裂解液，1200r·min-1离心5min,收集沉淀，直至红细胞尽量得以清除，最后收集淋巴细胞沉淀；
4)每管加入500μLstaining buffer重悬；
5)每管样品分别加入1μLanti-CD3-FITC，anti-CD4-PE，anti-CD8-APC流式抗体，冰水浴上孵育至少30min；
6)以1200r/min转速离心5min，并收集细胞沉淀；
7)加入500μL staining buffer重悬，取其中100μL用于流式检测对应的CD4+及CD8+淋巴细胞含量。
8)检测瘤组织和肺组织中T细胞内部Ki67，用FIX&PERM Kit固定破膜剂试剂盒，前期样品处理方法同上述1)至6)步骤，然后加入2mL cell staining buffer，转速250g，离心5min，弃上清；
9)根据样品数量用1×PBS缓冲液稀释处理FIX&PERM Kit固定破膜剂，现配现用，分别标记为A液(True NuclearTM 1×Fix Concentration)和B液(True NuclearTM 1×Perm)；
10)每管样品加入1mL A液重悬，充分混匀后，室温放置，避光孵育20min,设定250g转速，离心5min，吸去上清；
11)每样加入2mL cell staining buffer，离心参数同9)；
12)加1mL B液重悬，室温避光孵育15min，转速为250g，离心5min，弃上清；
13)每个样品沉淀分别加入100μLB液重悬；
14)分别向每个样品液中加入1μLKi67抗体，室温下避光孵育30min；
15)重复12)离心操作；
16)向每个样品细胞沉淀中加入500μLcell staining buffer，充分混匀，置冰盒内；
17)取100μL样品待做流式检测。
(三)组织切片观察
制备组织切片：切片厚度10μm，孵育抗体RbmAb to CD4(一抗)和Rat mAb to CD8(一抗)，将组织切片置于激光共聚焦显微镜下观测，对比各组织样品中CD4+T细胞和CD8+T细胞含量的差异。
(四)实验结果
通过给机体注射适宜量的Adpgk抗原多肽可有效增强机体自身的免疫原性，激活荷瘤小鼠自身的免疫系统，诱导小鼠的免疫应答，达到控制结肠癌细胞的增殖，减弱结肠癌的恶化程度。由于选用的脂质体所具有的保护和支持功能，不仅可以提高多肽抗原免疫原性及自身稳定性，还可以使得肿瘤疫苗获得靶向递送及缓慢释放性能，促使与癌细胞的作用时间延长。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种复合物，其特征在于，所述组合物包括黑磷量子点、脂质体、Adpgk肽和F127凝胶；所述Adpgk肽与黑磷量子点被脂质体包裹形成Adpgk肽黑磷量子点脂质体；所述Adpgk肽黑磷量子点脂质体被包埋于F127凝胶中。
2.如权利要求1所述的复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)运用薄膜分散法制备脂质体；
(2)运用机械超声法和液相法制备黑磷量子点；
(3)通过机械挤压法、超声法制备载黑磷量子点复合脂质体；
(4)通过机械挤压法、超声法制备载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体；
(5)将所述载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体充分溶于F127胶中，冷冻干燥后即制备得到本发明所述复合物；所述载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体与所述25％F127胶的体积比为1：2。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述脂质体的制备过程为：脂质体的制备：称取2.5mg溶血卵磷脂、2.5mg磷脂酰乙醇胺、1mg胆固醇、2mg胆固醇-peg600，在4mL的无水乙醇中充分溶解，40℃水浴,180rpm真空旋转蒸发至无水乙醇全部蒸发，在真空烤箱中干燥过夜；次日加入4mL去离子水，60℃恒温水浴中水化5～6小时；冰水浴中300W超声15～20分钟,用0.45μm滤器过滤1～3次，收集滤液即所述脂质体。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述黑磷量子点的制备过程为：取黑磷晶体，每次取2mL的NMP溶液于研钵中研磨，收集上清，重复至剩余沉淀物研磨完为止；以30％功率超声12小时，间歇和工作时间均为5秒；冰水浴中300W超声10小时，取上清在氩气保护下150℃油浴，1000r/min液相剥离2～3小时至液体清澈透明；7000r/min离心30分钟，上清以20000r/min离心2小时；去上清，沉淀即所述黑磷量子点。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述黑磷量子点复合脂质体的制备过程为：取脂质体混匀，将黑磷量子点溶于水溶液中，将脂质体和黑磷量子点水溶液按体积比为＝1：1匀质，用匀浆器用力杵250个来回以上；13000r/min高速冷冻离心12h，收集沉淀即所述黑磷量子点复合脂质体。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体的制备过程为：取500μL黑磷量子点重悬于1mL去离子水，加入10μLCy5.5染液重复混匀，避光以600r/min转速磁力搅拌过夜；次日13000r/min、4℃离心1小时，弃上清；用1mL去离子水洗沉淀2～3次，收集沉淀即带Cy5.5标签的载黑磷量子点样品；取1mL脂质体、1mgAdpgk肽与所述带Cy5.5标签的载黑磷量子点样品混匀，避光以600r/min转速磁力搅拌过夜；次日13000r/min、4℃离心1小时，弃上清，并用去离子水洗沉淀2～3次，收集沉淀即所述载黑磷量子点Adpgk多肽脂质体。
7.如权利要求1所述的复合物在制备治疗结肠癌的药物中的应用。
8.一种用于治疗结肠癌的药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1所述的复合物。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还包括GM-CSF、IL-2和PD-1抗体。
10.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
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