CN108815535B - 一种抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR‑21的脂质体及其制备方法和应用。所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR‑21的脂质体是通过由DSPE‑PEG修饰的长循环脂质体包载miR‑21后,再在表面偶联抗cTnT蛋白抗体或其片段得到的。本发明通过水合法在脂质体中包载miR‑21,并在脂质体表面修饰抗cTnT蛋白抗体,使得该脂质体具有了靶向缺血性心肌、提高心肌梗死大鼠生存期的作用。经体外细胞试验、体内分布实验、能量代谢实验、药效学评价均证明该脂质体在可以靶向缺血性心肌的同时,也可以使miR‑21不被体内核酶降解而顺利到达缺血性心肌并在缺血性心肌处蓄积,从而实现对缺血性心肌梗死的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种作为药物载体使用的脂质体及其制备方法和应用,特别涉及一种载有miR-21以及靶向心脏的作用,能够实现治疗缺血性心肌梗死的脂质体及其制备方法。本发明属于医药技术领域。
背景技术
急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是内科急危重症,我国发病率0.2‰~0.6‰,且发病率呈上升趋势,死亡率也极高,已然成为了谈其色变的严重社会问题,所以急需快速的治疗方案。目前,国内外公认的传统疗法有药物治疗、介入治疗及外科治疗。然而药物治疗对病变严重的心肌缺血效果有限,而介入治疗和外科治疗又不及时,所以这三种治疗均不能根治急性缺血性心脏病。随着分子生物学理论和技术的发展,特别是在基因载体的构建、靶基因的界定和转基因技术等方面取得了重要进展,使许多因基因结构或表达异常引起的心血管疾病利用基因治疗有望获得根治。
在小分子非编码RNA的研究中最令人振奋的发现之一是哺乳动物细胞内小RNA能执行RNA干扰的功能,特异地沉默目标基因,有效调控机体的生理机能。有文章报道miR-21能够调控心脏的疾病。miR-21对小鼠缺血/再灌注(I/R)而致的心肌损伤有保护作用。心肌梗塞后6-24h,大鼠梗塞心肌区miR-21表达显著下调。用热休克或预处理诱导miR-21等小RNA表达,可明显减少心肌梗塞面积,并进一步证实上调的热休克蛋白70(HSP70)、内皮诱导性一氧化氮合成酶可能参与了这些miRNAs介导的心肌保护作用。
心肌肌钙蛋白T(cTnT)和骨骼肌肌钙蛋白(skeletal troponin,sTn)异构体有各自的编码基因。编码心肌的cTnT的基因只在胚胎期在骨骼肌中有短暂表达。因此,cTnT和sTnT两者在结构和免疫性上有很大差别。更重要的是,cTnT是心肌损伤的唯一标记蛋白,但是在骨骼肌修复中未见表达。缺血患者心肌间质1h,cTnT浓度就高于正常,这种急性缺血性心肌cTnT的特异性表达为我们提供了设计靶向制剂的特异靶点。
PEG修饰的脂质体可以作为良好的载体,载有化合物、多肽和核酸药物的脂质纳米粒可长时间稳定地维持局部药物浓度,减少药量,同时又不致引起机体的不良反应,故具有重要的临床意义。脂质体纳米粒通过表面修饰,达到主动靶向分布于心脏的目的;可改变药物对生物膜的透过性,有利于药物向细胞内靶向给药。而且,通过cTnT抗体修饰的脂质体对生物分子miR-21的包裹可提高药物稳定性、生物渗透性、在靶部位蓄积定位。
本发明根据抗体介导靶向给药系统设计原理,将miR-21包载入由DSPE-PEG修饰的长循环脂质体后把表面经过抗cTnT抗体偶联的Anti-cTnTAb-DSPE-PEG磷脂衍生物嵌入到脂质体中,通过靶向效应达到特异性治疗急性缺血性心脏病的目的;通过脂质体载体改善循环中核苷酸的稳定性,避免机体微环境变化对miR-21的破坏,提高其生物效应。在前期工作中,我们成功地复制了急性缺血性心脏病动物模型。通过免疫组织化学研究,我们证实了cTnT在缺血心肌组织中高表达,为抗体介导的靶向给药系统设计提供了可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载有miR-21以及靶向心脏的作用,能够实现治疗缺血性心肌梗死的脂质体及其制备方法。
为了达到上述目的,本发明采用了以下技术手段:
本发明的一种抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体,所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体是通过由DSPE-PEG修饰的长循环脂质体包载miR-21后,再在表面偶联抗cTnT蛋白抗体(Anti-cTnT Ab)或其片段得到的;其中,优选的,所述的DSPE-PEG为DSPE-PEG-2000。
进一步的,本发明还提出了一种制备所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体的方法,包括以下步骤:
(1)载有miR-21的并由DSPE-PEG修饰的长循环脂质体的制备
将蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;用含有miR-21的DEPC生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理使脂质体溶液分散,并通过聚碳酸酯膜挤出,得到载有miR-21的并由DSPE-PEG修饰的长循环脂质体,命名为miR-21-LIP,将脂质体样品保存在4℃,备用;
(2)含有抗cTnT抗体胶束溶液的制备
将抗cTnT抗体和DSPE-PEG-马来酰亚胺分别溶于HEPES溶液中,然后混合,放入4℃冰箱中孵育12小时以上,得到含有抗cTnT抗体的胶束溶液,命名为Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG,保存在4℃,待用;
(3)抗cTnT抗体修饰的脂质体制备
将步骤(2)制备的Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液与步骤(1)制备的miR-21-LIP脂质体溶液在37℃温育2-4小时,制备得到抗cTnT抗体修饰的miR-21-LIP,命名为Anti-cTnT-PEG/miR-21-LIP,即为抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体。
其中,优选的,步骤(1)中EPC,CHO和DSPE-PEG的摩尔比为(30-50):(10-30):(1-5),优选为36:10:1。
其中,优选的,步骤(1)中所述的DSPE-PEG为DSPE-PEG-2000;步骤(2)中所述的DSPE-PEG-马来酰亚胺为DSPE-PEG2000-马来酰亚胺。
其中,优选的,步骤(3)中Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG与步骤(1)中miR-21-LIP脂质体的体积比为(1-10):(1-10),更优选为1:2。
更进一步的,本发明还提出了所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体在制备药物载体中的应用。
其中,优选的,所述的药物载体为靶向缺血性心肌的药物载体。
更进一步的,本发明还提出了所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体在制备治疗心肌疾病药物中的应用。
其中,优选的,所述的药物具有降低心肌细胞缺氧后线粒体有氧呼吸能力、提高糖酵解能力、提高HSP70表达水平、提高心肌梗死发生后的心脏功能以及延长心肌梗死发生后的生存期的作用。
其中,优选的,所述的药物用于治疗心肌缺血引起的心肌梗死。
相较于现有技术,本发明的有益效果是:
本发明通过水合法在脂质体中包载miR-21,并在脂质体表面修饰抗cTnT蛋白抗体,使得该脂质体具有了靶向缺血性心肌、提高心肌梗死大鼠生存期的作用。经体外细胞试验、体内分布实验、能量代谢实验、药效学评价实验均证明该脂质体在可以靶向缺血性心肌的同时,也可以使miR-21不被体内核酶降解而顺利到达缺血性心肌并在缺血性心肌处蓄积,从而实现对缺血性心肌梗死的治疗。
附图说明
图1为Anti-cTnT-PEG/miR-21-LIP(简称cTnT-21-LIP)的表征。
用Zetasizer Nano ZS 90测定cTnT-21-LIP的平均粒径(A)和Zeta电位(B);用透射电镜观察cTnT-21-LIP脂质体的外观形态(C);
图2为LIP(C)或cTnT-LIP(C+T)与cTnT蛋白的相互作用力;
图3为流式细胞术检测原代心肌细胞对LIP和cTnT-LIP的摄取的荧光位移图(A)以及柱状图(B);
图4为活细胞工作站检测细胞对药物的摄取动态过程图;
图5为能量代谢机理图;
A.线粒体氧气消耗速率,B.细胞外酸化速率;
图6证明心肌梗死造模成功的心电图(A)和TTC染色(B);
图7为小动物活体成像,cTnT-LIP可靶向MI大鼠心脏;
A、A1为急性心肌梗死大鼠心脏的荧光强度及其柱状图;B为急性心肌梗死大鼠离体的心脏的荧光强度;C、C1为急性心肌梗死大鼠离体心脏的切片的荧光强度及其柱状图;
图8A大鼠的心脏超声图;
图8B为大鼠心脏射血分数(LVEF)和短轴缩短率(LVFS)统计图;
图8C为大鼠的生存曲线图;
图9为大鼠心脏中miR-21的表达水平;
图10A为cTnT蛋白表达水平;
图10B为HSP70表达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将更为清楚。但实施例仅用于说明本发明,并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例所用的材料如下:
二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-MAL)从先进载体技术制药有限公司购买(中国,上海)。
蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)和胆固醇(CHO)购自Bio Life Science&Technology Co.,Ltd(中国上海)。
罗丹明B(Rho)和1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基-碘化二碘花青(DiR)得自HEDE生物技术有限公司(北京,中国)。
抗cTnT抗体(Anti-cTnT Ab)购自Immuno way(北京,中国)。
miR-21购自上海吉玛制药技术有限公司(上海,中国)。
miR-21 PCR Master Mix(Power SYBR Green PCR)试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司(上海,中国)。
MST毛细管和吐温20从Quantum Design(北京,中国)购买。
实施例1抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体的制备
(1)载有miR-21的并由DSPE-PEG-2000修饰的长循环脂质体的制备
将蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-2000按照摩尔比为36:10:1用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;用含有miR-21的DEPC生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理使脂质体溶液分散,并通过聚碳酸酯膜挤出,推100nm膜,11次,然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000Da的透析袋中,以生理盐水透析30分钟,以除去未包封的游离药物miR-21,得到载有miR-21的并由DSPE-PEG-2000修饰的长循环脂质体,命名为miR-21-LIP,将脂质体样品保存在4℃,备用;
(2)含有抗cTnT抗体(Anti-cTnT Ab)胶束溶液的制备
准确量取抗cTnT抗体50μL(2mg/mL)溶于1mL HEPES溶液中(10mM,pH 7.4),得到溶液1;称取DSPE-PEG2000-MAL 6.6mg溶于1mL HEPES溶液(10mM,pH 7.4),得到溶液2;将溶液1和溶液2混合后,放入4℃冰箱中孵育12小时以上,置于截留分子量为8000-14000Da的透析袋中,以生理盐水透析2h,以除去未键合上的DSPE-PEG2000-MAL,得Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液,保存在4℃待用。
(3)抗cTnT抗体修饰的脂质体制备
将步骤(2)制备的Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液与步骤(1)制备的miR-21-LIP脂质体溶液按照体积比为1:2在37℃温育4小时,制备得到抗cTnT抗体修饰的miR-21-LIP,命名为Anti-cTnT-PEG/miR-21-LIP(简称cTnT-21-LIP),即为抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体。
实施例2抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体的制备
(1)载有miR-21的并由DSPE-PEG-2000修饰的长循环脂质体的制备
将蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-2000按照摩尔比为50:30:5用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;用含有miR-21的DEPC生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理使脂质体溶液分散,并通过聚碳酸酯膜挤出,推100nm膜,11次,然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000Da的透析袋中,以生理盐水透析30分钟,以除去未包封的游离药物miR-21,得到载有miR-21的并由DSPE-PEG-2000修饰的长循环脂质体,命名为miR-21-LIP,将脂质体样品保存在4℃,备用;
(2)含有抗cTnT抗体(Anti-cTnT Ab)胶束溶液的制备
准确量取抗cTnT抗体50μL(2mg/mL)溶于1mL HEPES溶液中(10mM,pH7.4),得到溶液1;称取DSPE-PEG2000-MAL 6.6mg溶于1mL HEPES溶液(10mM,pH 7.4),得到溶液2;将溶液1和溶液2混合后,放入4℃冰箱中孵育12小时以上,置于截留分子量为8000-14000Da的透析袋中,以生理盐水透析2h,以除去未键合上的DSPE-PEG2000-MAL,得Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液,待用。
(3)抗cTnT抗体修饰的脂质体制备
将步骤(2)制备的Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液与步骤(1)制备的miR-21-LIP脂质体溶液按照体积比为2:5在37℃温育4小时,制备得到抗cTnT抗体修饰的miR-21-LIP,命名为Anti-cTnT-PEG/miR-21-LIP(简称cTnT-21-LIP),即为抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体。
实施例3抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体的制备
(1)载有miR-21的并由DSPE-PEG-2000修饰的长循环脂质体的制备
将蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-2000按照摩尔比为30:10:1用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;用含有miR-21的DEPC生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理使脂质体溶液分散,并通过聚碳酸酯膜挤出,推100nm膜,11次,然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000Da的透析袋中,以生理盐水透析30分钟,以除去未包封的游离药物miR-21,得到载有miR-21的并由DSPE-PEG-2000修饰的长循环脂质体,命名为miR-21-LIP,将脂质体样品保存在4℃,备用;
(2)含有抗cTnT抗体(Anti-cTnT Ab)胶束溶液的制备
准确量取抗cTnT抗体50μL(2mg/mL)溶于1mL HEPES溶液中(10mM,pH 7.4),得到溶液1;称取DSPE-PEG2000-MAL 6.6mg溶于1mL HEPES溶液(10mM,pH 7.4),得到溶液2;将溶液1和溶液2混合后,放入4℃冰箱中孵育12小时以上,置于截留分子量为8000-14000Da的透析袋中,以生理盐水透析2h,以除去未键合上的DSPE-PEG2000-MAL,得Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液,待用。
(3)抗cTnT抗体修饰的脂质体制备
将步骤(2)制备的Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液与步骤(1)制备的miR-21-LIP脂质体溶液按照体积比为1:1在37℃温育2小时,制备得到抗cTnT抗体修饰的miR-21-LIP,命名为Anti-cTnT-PEG/miR-21-LIP(简称cTnT-21-LIP),即为抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体。
实施例4脂质体的性质评价及活性评价
(1)脂质体的表征
室温下,取去离子水1ml,再取制备好的脂质体(实施例1制备)10μl,混匀后注射到动态光散射粒度仪的专用小池子中,使用动态光散射粒度仪测试各脂质体的平均粒径和zeta电位。用原子力显微镜和透射电镜分别拍摄脂质体的形态。
(2)脂质体包封率的测定
分别制备载药cy3-miR-21普通脂质体(21-LIP,按照实施例1步骤(1)制备,不进行抗体修饰,同时包裹使用cy3荧光染料标记的miR-21)和抗体修饰的脂质体(cTnT-21-LIP,实施例1制备,区别在于miR-21使用荧光染料cy3标记),分别取2mL,以20000×g,离心30分钟,将上清液保留,以空白脂质体(LIP,不含有cy3-miR-21)的上清液为对照,利用荧光分光分度计检测cy3-miR-21的吸光度值,并绘制标准吸收曲线,根据公式包封率(%)=(cy3-miR-21总的加入量-上清液中cy3-miR-21的量)/cy3-miR-21总的加入量×100%,求算载药脂质体中cy3-miR-21的包封率。
(3)脂质体的体外释放实验
制备21-LIP和cTnT-21-LIP各1mL,放入分子截留量为30kDa的透析袋中,然后将其放于100mL用DEPC水处理过的PBS透析液(pH=7.4)中,在37℃磁力搅拌下透析,分别在透析后1,2,4,6,18,24和48小时取2mL透析外液,同上方法检测荧光值,进而求得其浓度值,根据公式得出各时间点释放度。
结果:cTnT-21-LIP脂质体的粒径、zeta电位,包封率,释放率的结果见表1以及图1所示。显示制备的脂质体的粒径都在120-160nm范围内,cTnT抗体修饰后,粒径增大,但是在所需范围内;带负电性,电荷量都在-25mV以下,见图1A、B;制备的21-LIP和cTnT-21-LIP包封率都高于70-80%,48小时释放率达50%,有很好的缓释效果;脂质体的形态学特征见图1C中。
表1脂质体的特性
注:数据表示为平均值±标准差(S.D。)(n=3)。
实施例5分子相互作用研究
通过MicroScale Thermophoresis(MST)(Quantum Design China)来确定各修饰后脂质体与抗原结合能力大大增强,该技术可以定量测定生物分子的相互作用。具体步骤如下:
1、DiR标记的脂质体的制备
(1)将蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-2000按照摩尔比为36:10:1用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;将第一次成膜的脂质体加入无水乙醇复溶;向溶于乙醇的脂质体中加入DiR(6.57mM甲醇);用旋蒸使其再次成膜;在避光条件下用含有miR-21的DEPC生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理使脂质体溶液分散,并通过聚碳酸酯膜挤出,推100nm膜,11次,然后将脂质体混合溶液置于截留分子量为3000Da的透析袋中,以生理盐水透析30分钟,以除去未包封的游离药物miR-21以及DiR,得到DiR标记的载有miR-21的并由DSPE-PEG-2000修饰的长循环脂质体(miR-21-LIP),将脂质体样品保存在4℃,备用;
(2)含有抗cTnT抗体(Anti-cTnT Ab)胶束溶液的制备
准确量取抗cTnT抗体50μL(2mg/mL)溶于1mL HEPES溶液中(10mM,pH 7.4),得到溶液1;称取DSPE-PEG2000-MAL 6.6mg溶于1mL HEPES溶液(10mM,pH 7.4),得到溶液2;将溶液1和溶液2混合后,放入4℃冰箱中孵育12小时以上,置于截留分子量为8000-14000的透析袋中,以生理盐水透析2h,以除去未键合上的DSPE-PEG2000-MAL,得Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液,待用。
(3)抗cTnT抗体修饰的脂质体制备
将步骤(2)制备的Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液与步骤(1)制备的DiR标记的miR-21-LIP脂质体溶液按照体积比为1:2在37℃温育4小时,制备得到DiR标记的抗cTnT抗体修饰的miR-21-LIP,命名为DiR标记的Anti-cTnT-PEG/miR-21-LIP,简称DiR标记的cTnT-21-LIP。
同时制备DiR标记的不含抗cTnT抗体修饰的脂质体(简称21-LIP)。
2、分子相互作用研究
将EP管编号,加生理盐水,然后将cTnT蛋白与吐温20混合,然后将DiR标记的脂质体加入每个管中。孵育10分钟后,毛细管吸取管中的混合物并依次放置托盘。通过MST检测DiR标记的脂质体与cTnT蛋白的结合力,数据处理用Manual_MO.Affinity Analysis_V04软件。
结果:通过微量热泳仪(MST)测量DiR标记的21-LIP(C)或cTnT-21-LIP(C+T)结合cTnT蛋白的能力(图2),DiR标记的21-LIP(C)或cTnT-21-LIP(C+T)浓度保持不变而cTnT蛋白浓度变化。测试结果,LIP结合常数KD=2903nM,cTnT-21-LIP结合常数为528nM,结合常数越大说明分子间的亲和力越小,结果表明与普通脂质体相比,表面修饰cTnT抗体后,与抗原的结合能力明显增强。
实施例6心肌细胞对脂质体的摄取情况
1、罗丹明B(Rho)标记的脂质体的制备
方法同实施例5中DiR标记的脂质体的制备,区别在于将DiR替换为Rho。
2、原代心肌细胞的提取和培养
原代心肌细胞的培养:取1-3天龄的Wistar大鼠的乳鼠,置于75%酒精中消毒片刻,用眼科剪剖开胸部,取出幼鼠心脏,在超净工作台内,用PBS溶液快速清洗心脏,剔除心脏周边的血凝及纤维组织,然后将其放入无血清的DMEM中,将乳鼠心脏剪碎,剪成1mm3左右大小的组织块,然后将组织块溶液移入15mL的离心管中,待组织块沉于管底,吸出DMEM溶液,加入组织量两倍体积的胰酶消化液,于37℃水浴锅中慢慢振摇消化1-3分钟,待胰酶变浑浊时弃去酶液。反复消化3-4次,收集酶液,与培养液的体积比为1:1,放于4℃冰箱中终止消化。将收集的消化液过200目的滤网,然后将滤液以2500rpm,离心3min。去掉上清液,收集细胞沉淀,用含有血清的DMEM培养液使细胞沉淀重悬,吹打细胞至细胞分散开,将细胞悬液移到一次性细胞培养瓶中,于37℃培养箱中培养2小时,去除贴壁较快的成纤维细胞,纯化心肌细胞,收集细胞瓶中的培养液,转移到新细胞培养瓶中,于37℃培养箱中培养48小时,待用。
3、流式细胞术检测不同脂质体的细胞摄取情况
将原代心肌细胞接种到六孔板中,并使细胞培养过夜,然后用DMEM/低糖替代DMEM/高糖,继续培养12小时,之后分别加游离miR-21、NaCl、21-LIP、cTnT-21-LIP在37℃、5%CO2下孵育细胞(脂质体用Rho标记)。空白对照组为DMEM/低糖培养基。孵育4小时后,对细胞进行胰酶消化,离心,再用PBS重悬,收集细胞,进行检测。流式细胞仪检测细胞内Rho的荧光强度。Rho的发射波长为560nm,用FL2-A滤光片检测荧光强度,并利用FlowJo 7.6软件对数据进行分析。
结果:用流式细胞仪观察心肌细胞摄取试验结果见图3,加入罗丹明B标记的21-LIP的荧光强度为15015.6,加入罗丹明B标记的cTnT-21-LIP的荧光强度为17326.0,空白对照组为9216.8。与空白对照组相比,加入21-LIP、cTnT-21-LIP的心肌细胞摄取增加至162.9%和187.9%。结果证实:修饰后的脂质体能够更容易被原代心肌细胞摄取,可以更多的递送药物到心肌细胞。
4、活细胞工作站
活细胞工作站检测细胞对药物的摄取动态过程:将刚分离出的原代心肌细胞接种于活细胞工作站专用小皿中,培养48小时,将小皿置于缺氧培养箱中培养120min,更换新的培养液,加入核染料Hochest33258 50μL(10μg/mL),膜染料DiO 20μL(6μg/mL),静止1.5min,倒掉培养液,PBS清洗3遍,然后加入罗丹明标记的脂质体21-LIP和cTnT-21-LIP,以PBS缓冲液为空白对照组。连续拍摄30min,拍摄时间间隔为15s。观察细胞对药物的摄取过程。
结果:活细胞工作站检测细胞对药物的摄取情况。结果见图4,显示心肌细胞在缺养120min后,cTnT-21-LIP能够增强染料在细胞中的积累,修饰后脂质体增加miR-21的利用并改善治疗效果,抗cTnT抗体修饰的脂质体(cTnT-21-LIP)的摄取量,远高于没有用抗体修饰的脂质体(21-LIP)。
实施例7 cTnT-21-LIP在降低心肌细胞线粒体有氧呼吸能力中的应用
按每孔1×104细胞铺于seahorse8孔细胞培养板,每孔细胞添加50μl培养液过夜培养;37℃培养箱水化探针12h以上,线粒体分析培养基:葡萄糖10mM、丙酮酸钠1mM、谷氨酰胺2mM,按比例加入基础培养基中;37℃调PH 7.3-7.4低氧盒(湿度>80%,CO 25%,O21%,氮气为补充气体)平衡后,细胞板低氧环境培养4h,复氧后换为加有21-LIP或cTnT-21-LIP的培养基培养4h,FCCP(0.5μM),Oligomycin(1μM),Rotenone and antimycinA(0.5mM)上机检测。
结果:通过能量代谢仪,进行机理的研究,结果见图5,与21-LIP相比,cTnT-21-LIP干预后,原代心肌细胞线粒体有氧呼吸能力显著下降,猜测在缺氧时给予cTnT-21-LIP可以保护心肌细胞,避免进一步受到损伤。
实施例8 cTnT-21-LIP在靶向并治疗急性心肌梗死中的应用
1、大鼠急性心肌梗死模型的建立:
200-240g雄性大鼠,10%水合氯醛按0.3mL/100g麻醉,将大鼠放到动物板上,胸部去毛,连接好心电图电极(白色电极连接右前肢,红色连接左后肢,黑色连接右后肢)。在心脏上方沿胸大肌方向剪开约3-4cm的切口,剥离出胸膜,找到心脏的位置,用止血钳刺破胸膜,撑开,挤出心脏,找到左心耳与肺动脉椎交界下方2-3mm处用5/0带线缝合针穿过心脏(进针深度约为2mm左右)并结扎,然后立刻将心脏放回胸腔,注意防止空气进入胸腔,立刻用4/0线手术线将伤口缝合,用碘伏消毒,其中假手术组,只开胸不结扎,待用。
结果:大鼠经冠脉结扎后心电图显示ST段比未结扎前明显抬高,说明大鼠心肌梗死模型已成功建立(图6A);将心肌组织切成薄片后采用TTC染色法,识别存活心肌,结果显示(图6B),在结扎处,组织变白,进一步证明造模成功
2、小动物活体成像:
将正常大鼠和AMI大鼠用10%水合氯醛麻醉后,分别尾静脉注射等量的DiR染料标记的cTnT-21-LIP,21-LIP,DiR,同时设置假手术组。将大鼠放于活体成像动物仓中分别拍摄X-光成像和激发波长为790nm,发射波长为720nm的荧光成像。各实验组分别于给药后1h,3h,6h,9h,12h拍摄,之后各时间点取离体心脏,荧光拍摄,取6小时心脏切片,拍荧光。
结果:用小动物活体成像仪检测药物在大鼠体内的靶向性。图7A、A1、B的结果显示DiR标记的cTnT-21-LIP在急性心肌梗死大鼠心脏中累积量(荧光强度)明显高于其他组,而且在给药6h后心脏中cTnT-21-LIP的累积量达到最大值。图7B、C结果说明离体的心脏中药物的累积量cTnT-21-LIP组荧光强度也最高,其他脏器荧光值很低。通过比较各实验组左心室,cTnT-21-LIP组的药物累积量最高(图7C、C1)。进一步研究证实cTnT-21-LIP组进入心脏中的药物基本都蓄积在左心室梗死区。
3、心功测试及绘制生存曲线:
将30只AMI大鼠随机分为3组,一组缝合后立即尾静脉注射生理盐水作为对照,二组注射21-LIP,三组注射cTnT-21-LIP。AMI后第1、3、7天给予药物。采用高频超声系统Vevo2100(Visualsonics),30-MHz探头(Acuson MS250)的超声心动图评估心脏功能,并使用版本1.7.0的Vevo 2100软件进行分析,记录大鼠的生存情况,绘制生存曲线。
结果:心功评价:正如我们所预测,心肌梗死后心脏功能严重下降,包括舒张末期和收缩末期容积增加导致心功能不全(表2和图8A),本实验主要通过心脏左心室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(LVFS)评估大鼠心脏功能。如图8B在MI后第3天,与对照组相比21-LIP和cTnT-21-LIP显著改善了LVEF和LVFS(LVEF:21-LIP为66.64±9.56,cTnT-21-LIP为75.41±4.33,对照组为25.00±5.61),(LVFS:21-LIP为37.82±7.73,cTnT-21-LIP为44.72±3.87,对照组48.61±8.97)。21-LIP和cTnT-21-LIP均能一定程度的改善AMI大鼠射血分数和心脏收缩性,但cTnT-21-LIP能使心功恢复到正常范围内,此外,在用cTnT-21-LIP处理的大鼠中,短轴缩短率也明显改善,这些结果表明长循环脂质体可以通过静脉内注射输送miR-21到梗死去,并可以有效地减少心肌梗塞面积,提高了AMI大鼠的心脏功能。之前已有文献报道,miR-21在心肌梗塞大鼠和MI动物模型或缺血再灌注损伤中显示出较好的治疗效果。然而,在实际中,直接心脏注射和腺病毒包裹miR-21的给药方式存在风险,采用尾静脉注射的方式较为合理,所以可以继续开发cTnT-21-LIP治疗急性心肌梗死。
如图8C,生存曲线结果可以看出,对照组在第18天,AMI大鼠全部死亡,而21-LIP组死亡率降低至33.33%,cTnT-21-LIP组的死亡率仅仅16.7%,至今56天生存状况还很好,结果表明,21-LIP和cTnT-21-LIP能很显著的延长心肌梗死大鼠的生存期。
表2心功数据
4、定量检测miR-21的表达:
AMI大鼠三天,给药24小时,取50-100mg心肌组织提取总RNA,按照高通量cDNA逆转录试剂盒的操作说明将提取的总RNA逆转录为cDNA,根据PCR Master Mix(Power SYBRGreen PCR)试剂盒说明,进行PCR实时定量检测miR-21的水平,U6为内参。
结果:实时定量PCR显示(图9),心肌梗死大鼠的左心miR-21的表达水平比正常低,而用21-LIP,cTnT-21-LIP治疗后miR-21的表达水平比梗死后未治疗组明显提高,且cTnT-21-LIP治疗后miR-21表达水平提高的比较多,而经cTnT-NC-LIP(包载单链RNA,其碱基数量与miR-21相同,差异在于序列不同),Free-21(游离miR-21)治疗后miR-21的表达水平并没有比未治疗组提高。以上结果说明,cTnT-21-LIP可以更好提高心肌梗死大鼠心脏中miR-21的表达水平。
5、免疫组化实验:
造模AMI大鼠,分别在心肌梗死1,2,3,4,5,6,7天给药后,每组各杀死2只。用4%多聚甲醛灌注10min,取心,挤出残余的血,4%多聚甲醛中浸泡过夜,然后将固定的心脏组织浸泡在30%蔗糖溶液中48小时。取出心脏,分别覆盖冷冻包埋剂,冷冻后切片,每片的厚度为5μm。然后将切片储存在-80℃。实验时,待切片恢复至室温后,使用PBS工作液清洗3次,每次3min,接着用3%H2O2阻断,室温放置5min,使用PBS工作液清洗3次,每次3min,然后用0.5%BSA封闭,在37℃温箱孵育15min,切勿清洗,随后加一抗,4℃孵育过夜,清洗后滴加二抗,在37℃温箱孵育15min,清洗后滴加辣根酶标记链霉素工作液,37℃温箱孵育15min,清洗后用DAB显色,苏木素复染,经过脱水透明后用中性树胶封片。AMI大鼠给药21-LIP和cTnT-21-LIP,3天,给药24h后取心,操作步骤与不给药相同。
结果:在心肌缺血不同程度的大鼠中检测cTnT及HSP70蛋白表达水平,如图10结果显示,心肌梗死大鼠心肌中cTnT及HSP70蛋白的表达量比正常大鼠心肌中的表达量高,而且急性心肌梗死发生第三天和第四天后cTnT及HSP70蛋白的表达水平较高(图10A、B)。
Claims (6)
1.一种抗心肌肌钙蛋白(cTnT)抗体修饰并载有miR-21的脂质体,其特征在于,所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体是通过由DSPE-PEG修饰的长循环脂质体包载miR-21后,再在表面偶联抗cTnT抗体得到的;
所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体是通过以下步骤制备得到:
(1)载有miR-21的并由DSPE-PEG修饰的长循环脂质体的制备
将蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG按照摩尔比为(30-50):(10-30):(1-5)用无水乙醇溶解在蒸发烧瓶中,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;用含有miR-21的DEPC生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理使脂质体溶液分散,并通过聚碳酸酯膜挤出,得到载有miR-21的并由DSPE-PEG修饰的长循环脂质体,命名为miR-21-LIP,将脂质体样品保存在4℃,备用;
(2)含有抗cTnT抗体胶束溶液的制备
将抗cTnT抗体和DSPE-PEG-马来酰亚胺分别溶于HEPES溶液中,然后混合,放入4℃冰箱中孵育,得到含有抗cTnT抗体的胶束溶液,命名为Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG,保存在4℃,待用;
(3)抗cTnT抗体修饰的脂质体制备
将步骤(2)制备的Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG胶束溶液与步骤(1)制备的miR-21-LIP脂质体溶液在37℃温育2-4小时,制备得到抗cTnT抗体修饰的miR-21-LIP,命名为Anti-cTnT-PEG/miR-21-LIP,即为抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体。
2.如权利要求1所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体,其特征在于,步骤(1)中EPC,CHO和DSPE-PEG的摩尔比为36:10:1。
3.如权利要求1所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体,其特征在于,步骤(1)中所述的DSPE-PEG为DSPE-PEG-2000;步骤(2)中所述的DSPE-PEG-马来酰亚胺为DSPE-PEG2000-马来酰亚胺。
4.如权利要求1所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体,其特征在于,步骤(3)中Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG与步骤(1)中miR-21-LIP脂质体的体积比为(1-10):(1-10)。
5.如权利要求4所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体,其特征在于,步骤(3)中Anti-cTnT Ab-DSPE-PEG与步骤(1)中miR-21-LIP脂质体的体积比为1:2。
6.权利要求1-5任一项所述的抗心肌肌钙蛋白抗体修饰并载有miR-21的脂质体在制备治疗由心肌缺血引起的心肌梗死的药物中的应用。
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CN102065894A (zh) * | 2008-04-17 | 2011-05-18 | 班扬生物标记公司 | 一种含有活性剂分子的抗体结合的合成囊泡 |
CN102743325A (zh) * | 2010-12-21 | 2012-10-24 | 陈致融 | 靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体 |
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MX2011008190A (es) * | 2009-02-04 | 2011-10-06 | Univ Texas | Direccionamiento dual de mir-208 y mir-499 en el tratamiento de trastornos cardiacos. |
CN102188382B (zh) * | 2011-05-04 | 2014-01-15 | 李红霞 | 磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸修饰的纳米紫杉醇脂质体及其制备方法 |
EP2792742A1 (en) * | 2013-04-17 | 2014-10-22 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) | Gene-therapy vectors for treating cardiomyopathy |
CN105983102B (zh) * | 2015-02-09 | 2020-04-17 | 北京和理咨询有限公司 | 基于小核酸药物的破骨细胞靶向递送系统及其制备方法 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102065894A (zh) * | 2008-04-17 | 2011-05-18 | 班扬生物标记公司 | 一种含有活性剂分子的抗体结合的合成囊泡 |
CN102743325A (zh) * | 2010-12-21 | 2012-10-24 | 陈致融 | 靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体 |
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