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CN112805306B - 可交联聚合物、水凝胶及其制备方法 - Google Patents

可交联聚合物、水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可交联聚合物，其包含含有官能团的基础聚合物，官能团中的至少一些官能团已经与包含可交联单元的第一有机分子和能够与有机基质和/或无机基质键合的第二有机分子反应。本发明还涉及水凝胶，其包含含有可交联聚合物链的可交联聚合物，其中不同的可交联聚合物链的至少一些可交联单元已经发生反应并形成共价键，从而形成共价连接网络。本发明还涉及制备该水凝胶的方法以及该水凝胶的用途。

Description

可交联聚合物、水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及包含基础聚合物的可交联聚合物、包含该可交联聚合物的水凝胶、该水凝胶的制备方法以及该水凝胶的用途。
背景技术
水凝胶在诸如治疗软骨损伤之类的生物医学应用中越来越重要。对于生物医学应用，水凝胶理想地示出了良好的粘合性，特别是对生物表面的良好粘合性。
双网络水凝胶通常由两种具有不同化学组成的网络形成。这两种网络可以各自为共价交联网络，或者其中一种网络为共价交联网络，并且另一种可为物理交联网络。例如，聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和海藻酸盐的混合物形成双网络，其中聚乙二醇二甲基丙烯酸酯在交联后形成共价连接的网络，并且海藻酸盐形成物理交联的网络。
迄今为止，大多数研究工作已经提出了不同的策略以增加粘合性，这主要是通过改善界面相互作用来实现(参见Xu J等人，Langmuir 28,14010-14017(2012)；Liu,Y等人，ACS Applied Materials&Interfaces 6,16982-16992(2014)；Strehin,I等人，Biomaterials 31,2788-2797(2010)；Guvendiren,M等人，Biomacromolecules9,122-128(2008)；Tamesue,Sh等人，ACS Macro Lett5,704-708(2016))。然而，通过这种方法，所获得的粘合性改善通常是相当微不足道的(Abbott,S，Adhesion Science:Principles andPractice,DEStech Publications,(2015))。
除了这些策略之外，最近基于调节水凝胶的耗散性能，已经提出了具有有趣的高粘合性能的几个水凝胶体系(Yuk,H等人，Nature Materials 15,190-196,(2016))。然而，这些体系的良好粘合性不容易实现，这是因为使这些水凝胶体系牢固键合需要固体的表面改性(Li,J等人，Science 357,378-381(2016))、多孔表面结构(Kurokawa,T等人，ActaBiomaterialia 6,1353-1359(2010))或需要无机固体表面，这显然不适合生物表面和临床应用。
虽然将耗散网络与诸如水凝胶之类的软组织表面一体化示出了将粘合强度提高到了前所未有的值，但是作为生物材料，水凝胶的性能仍然存在一些局限。首先，组织表面是水凝胶与组织粘附的主要部分。这意味着界面的质量主要取决于组织表面的化学和形态。因此，在许多生物表面上不可能获得足够的粘合性。第二，水凝胶的溶胀比可以非常高，这对许多生物医学应用以及水凝胶性能的保持造成了严格的限制。第三，从实用的观点出发，为了将水凝胶用于应用中，应当大幅改善水凝胶的加工性。第四，在所提出的水凝胶设计中没有有效地包括界面设计。
已经表明与具有长链网络的水凝胶相比，短链网络通常使水凝胶具有更高的刚度。然而，短链网络可能断裂，或者交联可能在变形时破裂。另一方面，较长的链可以改善体系的移动性，这有助于高能量传递(Zhao,X，Soft Matter 10,672(2014))。需要使水凝胶具备上述两种相反的作用。特别地，需要使水溶胶在刚度(特别是由短链网络提供的刚度)和移动性(特别是由长链网络提供的移动性)之间达到平衡。此外，韧性水凝胶可能需要这两个参数，由此韧性界面需要这两个参数。
双网络水凝胶的粘合性分析表明，与锚定物理交联的耗散网络相比，通过将共价交联网络与表面锚定，通常会得到更高的界面韧性，除非在共价交联网络和物理交联网络之间存在强相互作用(Yuk,H等人，Nature Materials 15,190-196,(2016))。其结果是，似乎水凝胶与表面的有效粘合需要局部变形以及诸如变形能量之类的能量转移并远离水凝胶和表面之间的粘附接触点的可能性。虽然耗散机制有助于通过第一网络在更大程度上促进界面周围的能量转移，但是粘附链对能量转移的贡献应当更加显著，特别是对于网络之间没有强的相互作用的双网络水凝胶而言更是如此。
海洋贻贝的粘合性能已经为湿表面上的粘合现象提供了重要的化学和物理认识。水可以通过削弱界面键合、溶胀等引起粘合失效，尤其是在生物环境中而不是在干燥表面上。然而，海洋贻贝的粘合机制使得能够对潮湿环境中的不同表面进行强的粘附(Bruce,P等人，Annual Review of Materials Research 41,99-132(2011))。
在贻贝的足丝盘(byssal plaque)中存在几种蛋白质。这些蛋白质全部都包含翻译后修饰的氨基酸3,4-二羟基苯基-L-丙氨酸(下文中为“多巴酸(Dopaacid)”)并具有广泛不同的序列。已经充分讨论了该氨基酸的存在是贻贝粘附(特别是与各种表面粘附)能力的原因。这种修饰的氨基酸的关键部分似乎是儿茶酚侧链，该侧链由具有两个羟基的苯环构成，认为该侧链能够与不同的表面形成键(Lee,H等人，PNAS 103,12999-13003(2006))。
贻贝与表面的主要粘合相互作用通常是由于存在贻贝足丝蛋白-3(下文中称为Mfp-3)和贻贝足丝蛋白-5(下文中称为Mfp-5)。这两种蛋白质中的多巴酸含量比其他蛋白质高得多(Lee,H等人，Annu Rev Mater Res 41,99-132(2011))。
多巴酸界面行为的分子水平研究揭示了多巴酸和无机表面之间可逆的强相互作用。根据这些研究，由于多巴酸在碱性pH下自动氧化成它的醌形式(下文中也为“多巴醌”)，因此在高pH下，多巴酸和氧化物表面之间的相互作用的强度导致拉脱力(pull-off force)降低。与醌形式相比，多巴酸为儿茶酚形式时与无机表面的相互作用更强。然而，多巴酸醌可以通过醌和有机表面上的亲核物质之间的共价反应来促进与有机表面的界面键合。例如，在高pH下，多巴酸和伯胺之间可以形成共价键(Lee,H，PNAS 103,12999-13003(2006))。
对于生物医学应用而言，水凝胶应当对生物表面具有足够的粘合性能。还需要水凝胶呈现可调节的溶胀比。水凝胶还应当具有生物相容性，从而使它们可用于生物系统。此外，水凝胶应当是可加工的，使得它们的使用可以容易地实施。对于许多应用而言，还需要水凝胶具有可控的生物可降解性。此外，对于许多应用而言，还需要具有高含水量。此外，水凝胶还有其他应用，对于这些应用而言，需要诸如细胞包封、细胞递送、诸如生长因子/细胞因子之类的蛋白质或药物的递送以及细胞粘合性之类的性能。
上述性能对现有技术中已知的粘合性水凝胶施加了严格的限制。例如，细胞内含物不应当影响水凝胶力学。因此，本发明的目的是提供一种水凝胶，特别是粘合性水凝胶，其能够满足至少一些上述的应用需求和规格。特别地，需要具有可调体积和可调粘合性能的水凝胶。
发明内容
本发明的一个具体的目的是提供一种含粘合剂的刚性聚合结构，其能够以强共价键进行交联并能够牢固地粘附至生物表面。
其他目的和更具体的目的将部分地显而易见，并且将部分地在下文中呈现。
通过权利要求1所述的可交联聚合物、权利要求13所述的水凝胶、权利要求19所述的方法、权利要求28所述的水凝胶、权利要求29所述的用途以及根据权利要求30所述的水凝胶的用途，从而实现了这些目的中的部分或全部目的。
在从属权利要求中描述了进一步的实施方案，并且将在下面进行讨论。
本发明提供了可交联聚合物，其包含含有官能团的基础聚合物，这些官能团中的至少一些官能团已经与包含可交联单元的第一有机分子以及能够与有机和/或无机基质键合的第二有机分子反应。
在根据本发明的可交联聚合物中，基础聚合物与第一有机分子和第二有机分子反应。优选地，在根据本发明的可交联聚合物中，首先使基础聚合物与第一有机分子发生反应，然后使所得聚合物与第二有机分子反应。
令人惊奇的是，发现通过使用包含这样的基础聚合物的可交联聚合物，可以获得具有低溶胀比和良好的弹性模量的水凝胶，其中基础聚合物所包含的官能团中的至少一些官能团已经与包含可交联单元的第一有机分子以及能够与有机和/或无机基质键合的第二有机分子发生反应。其结果是，这些水凝胶显示出了良好的粘合性，特别是对生物表面、特别是对诸如关节软骨或半月板之类的生物组织的良好的粘合性。
不希望受科学理论的束缚，认为用本发明的可交联聚合物形成的水凝胶通过形成耗散交联网络，从而能够实现良好的能量转移。此外，据信水凝胶的低溶胀比进一步有助于良好的粘合，特别是对生物表面的良好的粘合。进一步据信，锚定至生物组织表面的水凝胶的链可以保持水凝胶的高刚度。能量可从界面接触点转移至水凝胶网络。据信这些因素是水凝胶结构中的主要原因，以使得水凝胶产生高强度界面并粘合到范围广泛的生物表面上。
在本发明中，术语“水凝胶”涵盖这样的凝胶，其包含水、诸如hepes缓冲液或磷酸盐缓冲盐水之类的缓冲液、醇或者它们的混合物，特别是包含水、诸如hepes缓冲液或磷酸盐缓冲盐水之类的缓冲液或者它们的混合物。
除非另有说明，磷酸盐缓冲盐水为这样的水溶液，其包含0.130mol/L至0.160mol/L、特别是0.135mol/L至0.155mol/L、更特别是0.137mol/L的氯化钠，0mol/L至0.0029mol/L、特别是0.0027mol/L的氯化钾，以及0.0004mol/L至0.012mol/L、特别是0.010mol/L至0.012mol/L、更特别是0.012mol/L的磷酸盐(包括HPO4 2-和H2PO4 -)，pH为5.5至9.5、特别是7至8、更特别是7.4。除非另有说明，否则hepes缓冲液是这样的水溶液，其包含0.1mol/L至1mol/L、特别是1mol/L的hepes，其中hepes特别是2-(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-基)-乙磺酸。
可交联聚合物包含含有官能团的基础聚合物。基础聚合物的官能团中的一些官能团或全部官能团可以与有机分子进行反应。以这种方式，至少一些官能团可以通过共价连接有机残基而转化。其结果是，基础聚合物可以被官能化。官能团可以经由非共价相互作用而相互作用。非共价相互作用也可以是分子间相互作用。其结果是，在不同的聚合物链之间可以形成非共价键，这有助于通过非共价键进行网络形成。
第一有机分子和第二有机分子优选与基础聚合物共价连接，特别是通过基础聚合物的官能团与基础聚合物共价连接。可将源自第一有机分子的有机残基与基础聚合物共价连接。也可将源自第二有机分子的有机残基与基础聚合物共价连接。例如，当使用甲基丙烯酰氯作为第一有机分子时，有机残基甲基丙烯酰基与基础聚合物的官能团共价连接。类似地，当使用(2-氯羧乙基)膦酸二乙酯作为第二有机分子时，有机残基3-二乙氧基磷酰基丙酰基与基础聚合物的官能团共价连接。
基础聚合物可以包含各种官能团。特别地，基础聚合物可以包含多于一种官能团。优选地，基础聚合物包含羟基、胺基、羧酸基、酰胺基和硫醇基中的至少一者。这些官能团能够进行良好的官能化或者能够形成强的非共价相互作用。更优选地，基础聚合物包含羟基、酰胺基和羧酸基。
可将不同的聚合物用作基础聚合物。有利地，基础聚合物具有亲水性。优选地，基础聚合物或其盐是水溶性的。如果1g的基础聚合物或其盐在25℃溶解于200mL或更少的水中，那么(特别是)认为基础聚合物或其盐是水溶性的。也可将聚合物的混合物用作基础聚合物。优选地，基础聚合物选自由透明质酸、海藻酸盐、壳聚糖、果胶、聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚丙烯酰胺、纤维蛋白、蚕丝、胶原以及它们的混合物组成的组。通过这些聚合物，通过使至少一些官能团与本文所述的第一有机分子和第二有机分子反应，可以获得具有良好的刚性和低溶胀性的水凝胶。更优选地，基础聚合物为透明质酸。
根据本发明的可交联聚合物包含含有官能团的基础聚合物，官能团中的至少一些官能团已经与包含可交联单元的第一有机分子反应。借助于可交联单元，可以在根据本发明的水凝胶中形成共价网络。根据本发明可以使用不同的可交联单元。例如，可以使用能够与诸如自由基引发剂之类的引发剂进行反应的可交联单元。在与自由基引发剂反应之后，可交联单元随后可以与其他可交联单元反应。此外，可以使用在用诸如UV照射或X射线照射之类的外部刺激活化时能够进行反应的可交联单元。此外，可交联单元还可以与诸如二胺之类的交联剂分子进行反应。优选地，第一有机分子的可交联单元包含碳-碳双键(-C＝C-)、硫醇基团(-SH)、环氧基团和酸酐基团中的至少一者。更优选地，可交联单元由这些基团中的一种基团组成。通过这些可交联单元，已经实现了共价网络的可靠形成。更优选地，第一有机分子的可交联单元包含碳-碳双键或由碳-碳双键组成。
第一有机分子可以包含多于一个、特别是两个或三个可交联单元。此外，由于基础聚合物与第一有机分子发生的反应而与基础聚合物共价连接的有机残基可以包含多于一个、特别是两个或三个可交联单元。优选地，由于基础聚合物与第一有机分子发生的反应而与基础聚合物共价连接的有机残基包含一个可交联单元。
有利地，第一有机分子包含连接单元。连接单元尤其使得第一有机分子连接至基础聚合物的官能团。在第一有机分子与基础聚合物的官能团反应之后，连接单元可以转化成不同的基团。例如，第一有机分子可以包含氯化酰基作为连接单元，其可以在与作为基础聚合物的官能团的羟基或胺基反应时转化为酯或酰胺基。优选地，第一有机分子的连接单元选自由醛基、氯化酰基、酸酐基、羧酸基、胺基、儿茶酚基和羟基组成的组。已表明这些单元能够使第一有机分子可靠地连接至基础聚合物的官能团。更优选地，连接单元为酸酐基或氯化酰基，特别是酸酐基。
第一有机分子与基础聚合物的官能团的反应优选以使可交联单元保持不变的同时，连接单元与官能团发生反应的方式进行。
可以将各种有机分子用作第一有机分子。有利地，第一有机分子是通式为X-Y或X-R-Y的分子，其中各通式中的X包含醛基、氯化酰基或酸酐基，R为具有2个至10个碳原子的可任选被取代的烃部分，并且各通式中的Y包含碳-碳双键、环氧基或酸酐基。烃部分的实例为诸如-C6H4-之类的衍生自苯的芳族部分，以及诸如-CnH2n-之类的脂族部分。可任选的取代基包括卤素、直链或支链C1至C5烷基残基和羟基。
优选地，第一有机分子选自由丙烯酸酐、丙烯酰氯、戊-4-烯醛、2,3-环氧丙酸乙酯、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、巯基丙酸和马来酸酐组成的组。在甲基丙烯酸酐中，例如，X为H3C-C(＝CH2)-C(＝O)-O-C(＝O)-，并且Y为-C(＝CH2)-CH3。上述有机分子能够与基础聚合物连接，从而提供可交联单元。
根据本发明的可交联聚合物包含含有官能团的基础聚合物，官能团中的至少一些官能团已经与能够键合至有机和/或无机基质的第二有机分子反应。有利地，第二有机分子包含键合单元。键合单元尤其使第二有机分子具有键合至有机和/或无机基质的能力。优选地，键合单元包含如下基团中的至少一种：儿茶酚基；醌基；通式为-SiX1X2X3的基团，其中X1、X2和X3独立地选自由卤素(特别是氯)、甲氧基、乙氧基、异丙氧基和乙酰氧基组成的组；硫醇基；膦酰基或其衍生物；磷酸基或其衍生物；以及二羧基。发现这些基团尤其对有机和/或无机基质具有良好的粘合性。键合单元也可由上述基团组成。更优选地，键合单元为儿茶酚基。发现儿茶酚是特别通用的。
有利地，第二有机分子包含连接单元。连接单元尤其使得第二有机分子通过共价连接的方式与基础聚合物的官能团的连接。在第二有机分子与基础聚合物的官能团反应之后，连接单元可以转化成不同的基团。例如，第二有机分子可以包含氯化酰基作为连接单元，其可以在与作为基础聚合物的官能团的羟基或胺基反应时转化为酯基或酰胺基。优选地，第二有机分子的连接单元选自由醛基、氯化酰基、酸酐基、羧酸基、胺基和羟基组成的组。已表明这些单元能够使第二有机分子稳定地连接至基础聚合物的官能团。更优选地，连接单元为胺基或酸酐基，特别是胺基。
胺基也可以作为其共轭酸的形式存在于第二有机分子中。
第二有机分子与基础聚合物的官能团的反应优选以使键合单元保持不变的同时，连接单元与官能团发生反应的方式进行。
可以将各种有机分子用作第二有机分子。有利地，第二有机分子是通式为X'-R'-Y'的分子，其中X'为醛基、氯化酰基、酸酐基、羧酸基、胺基或羟基，R'为具有2个至10个碳原子的可任选被取代的烃部分，并且Y'为：儿茶酚基；醌基；通式为-SiX1X2X3的基团，其中X1、X2和X3独立地选自由卤素(特别是氯)、甲氧基、乙氧基、异丙氧基和乙酰氧基组成的组；硫醇基；膦酰基或其衍生物；磷酸基或其衍生物；或二羧基。优选地，第二有机分子选自由3,4-二羟基苯乙胺、氨丙基三乙氧基硅烷和(2-氨基乙基)膦酸，更优选为3,4-二羟基苯乙胺。
可交联聚合物的分子量特别为500kDa以下，优选为750kDa至约500kDa，更优选为10kDa至500kDa。可以通过凝胶渗透色谱法与多角度激光光散射仪器联用，使用NaCl浓度为0.15mol/L的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)作为溶剂来确定分子量。有利地，可交联聚合物是水溶性的。
可交联聚合物包含含有官能团的基础聚合物，该官能团中的至少一些官能团已经与第一有机分子和第二有机分子反应。通过使基础聚合物的至少一些官能团与第一有机分子反应，基础聚合物的官能团尤其被第一有机分子官能化。官能化程度可能不同。原则上，0.1％至99％的基础聚合物的官能团可以与第一有机分子反应。优选地，1％至50％、更优选10％至30％的基础聚合物的官能团已经与第一有机分子反应。因此，被第一有机分子官能化的基础聚合物的官能化程度可为0.1％至99％，优选为1％至50％，更优选为10％至30％。通过利用第一有机分子的官能化程度，可以调节水凝胶的刚度和溶胀比。因此，较高的官能化程度可使交联后的刚度增加。由于在具有不同官能团的基础聚合物中，并非基础聚合物的全部官能团都可对第一有机分子具有反应性，因此可尤其仅根据对第一有机分子具有反应性的官能团或官能团类型来确定官能化程度。例如，在透明质酸中，仅认为伯醇官能团对诸如甲基丙烯酸酐之类的酸酐具有反应性。在这种情况下，将根据伯醇官能团确定基础聚合物的官能化程度。
通过使基础聚合物的至少一些官能团与第二有机分子反应，基础聚合物的官能团尤其被第二有机分子官能化。官能化程度可能不同。原则上，1％至30％、更优选为10％至30％的基础聚合物的官能团已经与第二有机分子发生反应。因此，被第二有机分子官能化的基础聚合物的官能化程度可为0.1％至70％，优选为1％至30％，更优选为10％至30％。通过利用第二有机分子的官能化程度，可以调节能够与有机和/或无机基质键合的基团的数量。因此，官能化程度越高，使得能够与有机和/或无机基质键合的基团的数量越大。由于在具有不同官能团的基础聚合物中，并非基础聚合物的全部官能团都可对第二有机分子具有反应性，因此可尤其仅根据对第二有机分子具有反应性的官能团或官能团类型来确定官能化程度。例如，在透明质酸中，仅认为羧酸官能团对诸如3,4-二羟基苯乙胺之类的胺具有反应性。在这种情况下，将根据羧酸官能团确定基础聚合物的官能化程度。
根据一个实施方案，本发明提供了包含含有官能团的基础聚合物的可交联聚合物，官能团中的至少一些官能团已经与包含可交联单元的第一有机分子和能够与有机和/或无机基质键合的第二有机分子发生反应，其中基础聚合物为透明质酸，第一有机分子是通式为X-Y或X-R-Y的分子，其中各通式中的X包含醛基、氯化酰基或酸酐基，R为具有2个至10个碳原子的可任选被取代的烃部分，并且各通式中的Y包含碳-碳双键、环氧基或酸酐基，特别地，其中第一有机分子为甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酰氯，并且第二有机分子为式X'-R'-Y'的分子，其中X'为醛基、氯化酰基、酸酐基、羧酸基、胺基或羟基，R'为具有2个至10个碳原子的可任选取代的烃部分，并且Y'为：儿茶酚基；醌基；通式为-SiX1X2X3的基团，其中X1、X2和X3独立地选自由卤素(特别是氯)、甲氧基、乙氧基、异丙氧基和乙酰氧基组成的组；硫醇基；膦酰基或其衍生物；磷酸基或其衍生物；或二羧基，特别地，其中第二有机分子为3,4-二羟基苯乙胺。优选地，透明质酸的羟基已经与第一有机分子反应，特别是与甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酰氯反应。优选地，透明质酸的羧基已经与第二有机分子、特别是与3,4-二羟基苯乙胺发生反应。
可交联聚合物特别地包含可交联聚合物链。更特别地，可交联聚合物链是可交联聚合物中的单个聚合物分子。特别地，可交联聚合物链特别提供至少一个衍生自第一有机分子的可交联单元。
有机基质优选为生物表面，特别是人或动物组织，例如软骨组织、半月板组织、眼组织、角膜组织、皮肤、髓核组织和心血管组织。无机基质优选为生物表面，特别是人或动物组织，例如骨组织。
根据本发明的可交联聚合物特别适合于形成水凝胶。因此，本发明还提供了包含根据本发明的可交联聚合物的水凝胶，其中根据本发明的可交联聚合物含有可交联聚合物链，其中不同的可交联聚合物链的至少一些可交联单元已经发生反应以形成共价键，从而形成共价连接网络。
根据本发明的水凝胶可以包含一种或多种添加剂。优选地，水凝胶包含特别选自以下添加剂组成的组中的至少一种添加剂：有机填料，无机填料，芳族聚酰胺纤维，纤维素纤维，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，胶原纤维，蚕丝纤维，甲壳质，壳聚糖，淀粉，纳米颗粒特别是二氧化硅，磷酸钙，纳米金刚石，以及它们的混合物。通过添加填料，可在水凝胶中形成复合网络。
有利地，在水凝胶中形成了共价键，特别是通过第一有机分子的至少一些可交联单元的反应形成共价键。通过共价链接，可以在水凝胶中形成共价网络。
对于通过第二有机分子的反应与基础聚合物的官能团共价连接的有机残基，其可以在水凝胶中形成非共价键，特别是与衍生自第二有机分子的其他有机残基、或与基础聚合物的官能团或与水凝胶中存在的任何添加剂形成非共价键。以这种方式，可以形成非共价网络。优选地，衍生自第二有机分子的有机残基的第一部分与基础聚合物的官能团和/或衍生自第二有机分子的有机残基的第二部分和/或至少一种添加剂形成非共价键。这些非共价键可通过可交联单元的交联从而支持网络的形成。特别地，衍生自第二有机分子的不同有机残基可以与不同部分形成非共价键。例如，衍生自第二有机分子的有机残基的第一部分可以与衍生自第二有机分子的有机残基的第二部分形成非共价键，衍生自第二有机分子的有机残基的第三部分可以与基础聚合物的官能团形成非共价键，并且衍生自第二有机分子的有机残基的第四部分可以与至少一种添加剂(如果存在)形成非共价键。技术人员将理解，键合配偶基团(bonding partners)的不同组合是可能的。
有利地，水凝胶包含液体。液体的实例为水、缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、hepes缓冲液或醇。优选地，水凝胶包含水或缓冲液。在各种情况下，基于水凝胶的总重量，水凝胶可以包含70重量％至99重量％、优选为75重量％至99重量％、更优选为80重量％至99重量％的液体。优选的是，在各种情况下，基于水凝胶的总重量，水凝胶特别地包含70重量％至99重量％或75重量％至99重量％或80重量％至99重量％的水、缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、hepes缓冲液或醇，更优选包含水。
水凝胶优选具有良好的机械性能。优选地，水凝胶的机械性能是可调节的。有利地，水凝胶的弹性模量为约2kPa至约4MPa。在上述范围内的弹性模量使得能够调整水凝胶的性能以满足特定应用的要求。
在暴露于液体、特别是暴露于水或缓冲液时，根据本发明的水凝胶可溶胀。通过下式计算溶胀比：
溶胀比[％]＝100*{(溶胀后的水凝胶的体积)-(溶胀前的水凝胶的体积)}/(溶胀前的水凝胶的体积)。
水凝胶的溶胀比优选为-20％至150％。尤其可在上述范围内调节溶胀比。以这种方式，溶胀比可以适应于特定应用的要求。
有利地，根据本发明的水凝胶与各种表面粘合，特别是与有机表面粘合，更特别是与生物表面粘合。优选地，水凝胶与不同的人或动物组织粘合，特别是与软骨组织、半月板组织、眼组织(特别是角膜组织)、皮肤、髓核组织、纤维环组织、心血管组织和骨组织中的至少一者粘合。因此，根据本发明的水凝胶可用于(例如)治疗上述组织的损伤或用作种植体。
本发明还提供了制备水凝胶、特别是根据本发明的水凝胶的方法，包括以下步骤：
a.提供根据本发明的可交联聚合物，
b.将可交联聚合物溶解在溶剂中以获得溶液，
c.任选地，将交联剂添加到溶液中，
d.通过外部刺激使可交联聚合物交联以获得水凝胶。
在根据本发明的方法中可以使用不同的交联剂。优选地，交联剂具有生物相容性。这可以使所得水凝胶在生物医学应用中使用。
交联剂优选选自由自由基引发剂、氧化剂和二胺组成的组。更优选地，交联剂是自由基引发剂。交联剂尤其可与存在于根据本发明的可交联聚合物中的可交联单元反应，其中特别地，可交联基团是由于基础聚合物的官能团与第一有机分子发生反应而得到的。可能需要将交联剂活化以与可交联单元反应。例如，可以将由UV光活化的自由基引发剂用作交联剂。可以直接添加交联剂，或者可以以溶液的形式添加交联剂。特别地，交联剂可以溶解在包含可交联聚合物的溶液中。为此，可以以溶液的形式添加交联剂。
有利地，其中溶解有根据本发明的可交联聚合物的溶剂优选为随后包含在水凝胶中的溶剂。因此，溶剂优选选自水、缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、hepes缓冲液和醇。基于溶液的总重量，溶液中可交联聚合物的浓度优选为1重量％至30重量％，更优选为1重量％至25重量％，甚至更优选为1重量％至20重量％。通过改变溶液中可交联聚合物的浓度，可以调节水凝胶的机械性能和粘合性能。
在根据本发明的方法中，特别地，可交联聚合物的交联受到外部刺激的影响，从而获得水凝胶。外部刺激可以直接交联可交联聚合物，或者其可以活化可任选的交联剂。然后，通过存在于根据本发明的可交联聚合物中的可交联单元发生交联，其中特别地，可交联基团是由于基础聚合物的官能团与第一有机分子发生反应而得到的。优选地，外部刺激选自由UV照射、X射线照射、红外照射和加热组成的组。
可以进一步改性可交联聚合物的溶液。例如，已经发现在步骤d之前的步骤中对溶液进行脱气可能是有益的。通过这种方式，可抑制副反应。此外，可以在步骤d之前将添加剂添加到溶液中。因此，根据本发明的水凝胶的添加剂的细节适用于根据本发明方法的添加剂的细节。优选地，添加剂溶解在溶液中。还可在步骤d之前将多于一种的添加剂添加到溶液中。
本发明还提供了可根据本发明的方法获得的水凝胶。
本发明还提供了根据本发明的可交联聚合物用于制备水凝胶的用途。
根据本发明的水凝胶可以用于若干种目的。例如，水凝胶可用于治疗软骨损伤、半月板损伤、角膜损伤、髓核或纤维环损伤、心脏组织损伤、骨组织损伤、牙组织损伤。特别地，水凝胶可以用作种植体。因此，本发明提供了根据本发明的水凝胶在治疗软骨损伤、半月板损伤、角膜损伤、髓核或纤维环损伤、心脏组织损伤、骨组织损伤、牙齿组织损伤和/或作为种植体方面的用途，特别是在外科手术中的用途。
附图说明
图1示出了如实施例部分所述的与甲基丙烯酸酐反应的透明质酸的NMR光谱。
图2示出了如实施例部分所述的与甲基丙烯酸酐并与盐酸多巴胺发生反应的透明质酸的NMR光谱。
图3示出了不同水凝胶的溶胀比。
图4示出了不同水凝胶的弹性模量。
图5示出了不同水凝胶的粘合强度。
具体实施方式
实施例
材料
三种不同分子量(15kDa至30kDa、50kDa至90kDa和300kDa至500kDa)的透明质酸钠(下文中称为HA)购自Contiproa.s.(CZ)。甲基丙烯酸酐、氢氧化钠、透析袋(截留分子量为6000Da至8000Da)和盐酸购自Sigma-Aldrich。盐酸多巴胺(多巴或多巴胺)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，纯度(purum)，≥98.0％)和氧化氘(D2O)购自Sigma-Aldrich。对于自由基聚合，将Irgacure 2959(BASF)用作光引发剂。纳米原纤化纤维素(NFC)由EMPA(Swiss Federal Laboratories for Materials Science andTechnology,Dübendorf，瑞士)提供。磷酸盐缓冲盐水“10010PBS”购自Thermo FisherScientific，其中氯化钠的浓度为0.155mol/L，磷酸盐的浓度为0.0041mol/L(以Na2HPO4和KH2PO4的形式添加)，并且pH为7.4。
通用合成过程
用甲基丙烯酸酐和多巴胺对透明质酸的官能化以作为可交联聚合物(下文称为 MeCHa)
MeCHa的合成分两步进行，方案1示意性地示出了MeCHa的合成。首先，在碱性pH的水溶液中进行HA的甲基丙烯酰化，随后通过在酸性条件下与多巴胺反应，从而使儿茶酚基与反应产物连接。由于合成pH条件的原因并且为了避免多巴胺粘合性能的劣化，官能化步骤的顺序至关重要。
方案1：MeCHa的合成路径
通用甲基丙烯酰化过程
在装配有磁力搅拌棒的玻璃烧瓶中，将0.5g的HA溶解在50ml(100ml)的去离子水中，并在室温剧烈搅拌30分钟。然后将烧瓶置于冰容器中，并且在通风橱中将温度保持在约4℃。在搅拌的同时，使用1.0M NaOH将HA溶液的pH调节至8.5。
执行两种不同的方案(a和b)，以获得两种不同的甲基丙烯酰化程度：
a)甲基丙烯酰化程度低。向溶液中滴加一个剂量的甲基丙烯酸酐(1.963mL)，并且用5N NaOH将pH调节至8±0.5。每5分钟对pH进行调节，持续3小时(应当注意，pH将不会保持稳定，这是因为其将会具有相当迅速的酸化趋势)。此后，添加第二剂量的1.963mL的甲基丙烯酸酐，并将pH调节至8±0.5。在用石蜡膜覆盖烧瓶口的同时，在4℃的冷室中搅拌溶液过夜。然后，将pH调节至7.5±0.5，并且将反应溶液转移到50mL锥形管中，并且以1200g旋转5min。通过透析三天并且每天更换三次透析水来除去未反应的化学品。
b)甲基丙烯酰化程度高。向溶液中滴加1.4mL的甲基丙烯酸酐(1.035g/mL)，并且在MA添加过程中反复调节pH至8.5。在将pH保持在8.5至9.5的同时，使反应在冰上进行4小时。在反应过程中连续进行pH调节，因此使得pH不低于8.5。还应当注意，由于不充分的搅拌会导致相分离，因此为了在官能化过程中产生乳化液，充分搅拌是必要的。然后，在反应之后，第二次添加1.4ml的甲基丙烯酸酐，持续4小时。然后，当在8小时的改性后pH稳定时，在室温剧烈搅拌该溶液过夜。通过透析(6kDa至8kDa透析膜管)三天并且每天两次更换透析水从而除去未反应的化学品。
在透析之后，将溶液以25ml至30ml等量转移至50ml管中，并在-80℃冰箱中冷冻过夜。然后，将样品冻干三天。将管转移到干冰中，并在冻干之前用Kimwipe覆盖。
通用多巴胺官能化过程
使用N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)作为透明质酸的羧基的活化剂，从而进行透明质酸与多巴的反应。在室温和氮气氛下进行反应，并控制pH，以避免多巴胺分子的不可逆氧化。简而言之，在装配有磁力搅拌棒的三颈圆底烧瓶中，将0.5g的甲基丙烯酰化的HA溶解在50ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，并使用盐酸(HCl)将pH调节至5.5。然后用氮吹扫溶液一小时。然后，将175mg的EDC和240mg的盐酸多巴胺添加到反应混合物中，并将反应溶液的pH保持在5.5，持续150分钟。在氮气氛下进行官能化过程。然后使用透析管(6kDa至8kDa透析膜管)，用pH为约5.5的酸性水对反应混合物进行透析三天，直到除去全部未反应的化学品为止。每天更换两次透析水。应当注意，也可以通过在去离子水中进行另一次透析从而进行进一步的纯化。最后将样品在-80℃的冷冻器中冷冻过夜，用kimwipe覆盖并冻干三天。将改性的MeCHa在真空下于4℃储存并避光。
通用水凝胶合成过程
通过使作为水凝胶前体的冻干MeCHa聚合物溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)(浓度为4.8重量％)中，然后使Irgacure 2959(0.1％，w/v)溶解在所得溶液中，从而合成MeCHa水凝胶。使用涡流将水凝胶前体均化，然后将经过脱气的混合物倒入由聚四氟乙烯制成的模具中，并且用显微镜载玻片覆盖。用波长为365nm、光强度为5mW·cm-2的紫外线照射模具中包含MeCHa分子的混合物10分钟，以使MeCHa聚合物链交联。
通过将4.8重量％的冻干的甲基丙烯酰化的透明质酸作为水凝胶前体溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中，然后将Irgacure 2959(0.1％，w/v)溶解在所得溶液中，从而由甲基丙烯酰化的透明质酸合成水凝胶(用作比较例)。使用涡流将水凝胶前体均化，然后将经过脱气的混合物倒入由聚四氟乙烯制成的模具中，并用显微镜载玻片覆盖。如上所述用紫外线照射来照射前体。
也使用相同的方法制备聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(下文中为“PEGDMA”)和纳米原纤化纤维素(NFC)-增强的双网络PEGDMA-海藻酸盐水凝胶(用作比较例)。合成含水量为95.2重量％且PEGDMA含量为4.8重量％的水凝胶，以作为PEGDMA水凝胶。合成具有4.8重量％的PEGDMA、0.55重量％海藻酸钠和0.5体积％的NFC的复合水凝胶，其含水量为94重量％。通过在蒸馏水中混合PEGDMA、硫酸钙、NFC(0.5体积％)和Irgacure 2959(0.1％，w/v)来合成复合水凝胶前体。使用Ultra-Turrax以12000rpm将水凝胶前体均化20分钟，并添加海藻酸钠。通过用波长为365nm、光强度为5mW·cm-2的紫外线照射来照射30分钟，以使PEGDMA分子交联。
表征
核磁共振(NMR)分析。使用1H NMR光谱法，使用400MHz Bruker Avance NEO并以D2O为溶剂，对甲基丙烯酰化的聚合物和MeCHa聚合物的官能化程度进行分析。简而言之，在室温下将10mg的改性聚合物溶于600μl的D2O中。然后将溶液转移到NMR管中并用盖子密封。也将同样的方法用于甲基丙烯酰化的透明质酸(对照样品)。
溶胀比和含水量研究。在室温下，在PBS和蒸馏水这两种溶剂中评价MeCHa-凝胶和具有高甲基丙烯酰化程度和低甲基丙烯酰化程度的甲基丙烯酰化HA、以及包含单网络和复合双网络水凝胶的基于PEGDMA的水凝胶的溶胀比。按照通用水凝胶合成过程，使用直径为4.6mm且深度为2.4mm的模具获得圆形水凝胶样品。照射后，将水凝胶从模具中取出，并分别浸入到蒸馏水或PBS溶液中，持续24小时。用下列公式计算溶胀比(SR)：SR(％)＝(Vs-V0)/V0×100，其中V0为样品溶胀前的体积，并且Vs为样品溶胀后的体积。
组织制备。对于粘合试验，由股骨-髌骨沟上的牛关节软骨制备直径为6.6mm且高度为10mm的圆柱形的组织样品。
机械特性-无侧限压缩和水凝胶-组织粘合测定。在将组织样品置于两件式模具中之后，将水凝胶前体倒在模具中所制备的样品上，并在组织表面的顶部进行光聚合。聚合后将两件式模具移除，并快速夹住粘附的组织以进行粘合试验。使用Instron E3000线性机械试验机(位于美国马萨诸塞州，Norwood市)，以50N负载传感器和0.15mm·s-1的恒定速度进行粘合测定。通过将最大粘合力除以水凝胶-组织的接触表面积来确定粘合强度。
为了评价改性聚合物的合成，通过1H NMR光谱法分析MeCHa的化学结构。图1示出了透明质酸的分子量为50kDa至90kDa的甲基丙烯酰化的HA的光谱，作为甲基丙烯酰化的HA的代表性1H NMR光谱。羟基峰位于化学位移为4.4ppm至4.6ppm处。通过相对于δ＝3.2ppm至4.2ppm处的透明质酸主链中的碳水化合物甲基质子，对化学位移为δ＝5.8ppm和δ＝6.25ppm处的乙烯基中的质子的峰面积进行积分，来确定甲基丙烯酰化程度。各乙烯基峰对应于一个质子，并且对应于透明质酸主链的峰对应于10个质子。图2示出了透明质酸的分子量为50kDa至90kDa的MeCHa的1H NMR光谱，作为MeCHa的代表性1H NMR光谱。MeCHa光谱中位于化学位移为δ＝6.7ppm至7ppm处的多重谱线对应于多巴的苯环的邻位和间位偶合位置处的质子，并且在δ＝2.87ppm和δ＝3.22ppm处的多重谱线信号对应于脂族亚乙基的质子。通过比较6.7ppm至7.5ppm的化学位移处的多巴的芳族质子相对于在δ＝3.2ppm至4.2ppm处的透明质酸主链中的碳水化合物甲基质子的积分峰面积，来评价每单位透明质酸的多巴的接枝程度。NMR光谱中化学位移为4.79ppm处的尖峰与D2O有关。
由1H NMR分析，可以观察到聚合物主链的成功的甲基丙烯酰化并且与多巴共轭，并且可以确定26％的甲基丙烯酰化程度。如方案1所示，透明质酸中的伯醇被甲基丙烯酸酐官能化。由于认为仅伯醇对甲基丙烯酸酐具有反应性，因此仅针对透明质酸的伯醇官能团确定官能化程度。对甲基丙烯酰化程度高(接近99％，分子量为50kDa至90kDa，下文中称为“～100％MeCHa 50-90kDa”)的合成的MeCHa聚合物进行同样的方法。多巴的官能化程度为约15％。由于认为仅羧酸基对多巴具有反应性，因此仅针对透明质酸的羧酸官能团确定官能化程度。
因此，使用水凝胶并利用PEGDMA、NFC-PEGDMA-海藻酸盐来合成如下水凝胶，并且仅将经过甲基丙烯酰化的透明质酸作为比较例：
表1：制备的水凝胶
*＝比较例；NA＝不适用
溶胀比和含水量
除了NFC-PEGDMA-海藻酸盐水凝胶的缓冲液含量为94％之外，其余合成的全部水凝胶的PBS缓冲液含量均为95.2％。图3示出了水凝胶在PBS和蒸馏水这两者中的溶胀行为。基于PEG-二甲基丙烯酸酯的水凝胶呈现高溶胀比。应当注意，具有较高分子量的基于PEGDMA的水凝胶显示出较高的溶胀比(未示出)，这可能是因为较低的交联密度和网络结构使得链移动性较高。
甲基丙烯酰化的HA水凝胶通常示出了低于基于PEGDMA的水凝胶的溶胀比。然而，对于基于PEGDMA的HA水凝胶和甲基丙烯酰化的HA水凝胶这两者，在蒸馏水中的溶胀明显高于在PBS中的溶胀。MeCHa-凝胶表现出比其他水凝胶体系低得多的溶胀比。对于甲基丙烯酰化程度高的MeCHa，溶胀比是完全可忽略的。
合成的水凝胶的溶胀范围较宽，并且在甲基丙烯酰化程度较高的甲基丙烯酰化的HA水凝胶中也观察到轻微的收缩。这意味着可以通过改变改性度、交联密度和网络结构来调节MeCHa-凝胶的溶胀比。
机械刚度
为了研究水凝胶设计对于可调弹性性能方面的潜力，评价并比较了合成的水凝胶的机械刚度。对于基于官能化的透明质酸的水凝胶，仅研究了透明质酸的分子量为50kDa至90kDa的样品。记录了水凝胶在溶胀状态(在PBS和去离子水中)的值。以0.15mm·s-1的恒定速率将水凝胶压缩至20％应变。
与PEGDMA水凝胶和复合PEGDMA水凝胶相比，MeCHa-凝胶具有显著更高的压缩模量。据发现，即使与干燥的基于PEGDMA的水凝胶相比，溶胀的MeCHa也示出了远远更高的刚度。据信，弹性模量的显著增加是通过可控的交联密度和链构造实现的。图4示出了甲基丙烯酰化程度和多巴共轭对合成的水凝胶的机械刚度的影响。可以观察到，对于主链的甲基丙烯酰化程度高的水凝胶，其弹性模量显著增加(～1MPa)。此外，虽然与基于PEGDMA的水凝胶相比，甲基丙烯酰化程度低(26％)的改性水凝胶具有更高的刚度，但是它们所表现出的弹性模量远低于甲基丙烯酰化程度高的水凝胶。尽管甲基丙烯酰化程度高的水凝胶样品～100％MeCHa 50-90kDa具有相对非常高的刚度，但是其所示出的值低于未经多巴改性的甲基丙烯酰化的HA水凝胶的值。另一方面，在经过/未经过多巴改性的低甲基丙烯酰化的HA水凝胶(26％)(样品26％甲基丙烯酰化的HA 50-90kDa和26％MeCHa 50-90kDa)的弹性模量之间存在轻微差异。此外，观察到所有溶胀的水凝胶在蒸馏水中的刚度均高于在PBS中的刚度(PH＝7.4)，同时它们在蒸馏水中呈现出甚至更高的溶胀。
软骨-MeCHa-凝胶的粘合性
为了评价合成的水凝胶的粘合性能，对具有95.2重量％的高含水量的各种水凝胶进行组织-水凝胶粘合性试验。对于基于官能化的透明质酸的水凝胶，仅研究了透明质酸的分子量为50kDa至90kDa的样品。图5示出了合成的基于PEGDMA的水凝胶、甲基丙烯酰化的HA和MeCHa-凝胶在牛关节软骨上的粘合强度。具有刚性和粘合性的MeCHa-凝胶(样品～100％MeCHa 50-90kDa)的粘合强度显著增加。据信，这是由于在聚合物主链上连接了包含共价交联键和粘合性成分这两者的聚合网络，这使得水凝胶能够共价连接至组织表面接，而不进行任何表面改性，并且还通过共价交联形成了刚性网络。作为单网络水凝胶，与具有相同含水量的其他单网络水凝胶(例如，试样PEGDMA或试样26％甲基丙烯酰化的HA 50-90kDa)相比，MeCHa-凝胶表现出更高的粘合性。此外，与复合双网络水凝胶(样品NFC-PEGDMA-海藻酸盐)相比，MeCHa-凝胶对组织的粘合性显著更高。
界面键和水凝胶的本体性能这两者似乎是实现高粘合接触的重要贡献因素。通过比较样品26％甲基丙烯酰化的HA 50-90kDa和26％MeCHa 50-90kDa之间的粘合性，可以看出粘合性成分(多巴)的关键作用。这示出了粘合性成分在产生强的界面相互作用方面的潜力。另一方面，对于具有低机械刚度的水凝胶，这些相互作用不能呈现高粘合强度(比较样品26％MeCHa 50-90kDa和～100％MeCHa 50-90kDa)。实际上，对于粘合性水凝胶体系，要求界面相互作用和本体机械性能这两者起到协同作用。
根据本发明的水凝胶具有几个优点：溶胀非常低且可调节、刚度非常高且具有前所未有的高粘合性能、全部具有高含水量(95.2重量％)。此外，根据本发明的水凝胶在具有单网络结构的同时示出了高粘合性。在无需进行表面改性的条件下获得了高粘合性。
通过本发明，可以制备出具有良好粘合性能和可调节的本体性能的水凝胶。根据本发明的水凝胶使高刚度和良好的粘合性与独特的本体性能和粘合性能(包括在高含水量下的粘合性)、高刚度和可调节的溶胀行为相组合。

Claims (43)

1.一种可交联聚合物，其包含含有官能团的基础聚合物，所述官能团中的至少一些官能团已经与包含可交联单元的第一有机分子和能够与有机基质和/或无机基质键合的第二有机分子反应，其中
其中所述第一有机分子选自由丙烯酸酐、丙烯酰氯、甲基丙烯酸酐和甲基丙烯酰氯组成的组，
所述第二有机分子是通式为X'-R'-Y'的分子，其中X'为醛基、氯化酰基、酸酐基、羧酸基、胺基或羟基，R'为具有2个至10个碳原子的烃部分，并且Y'为：儿茶酚基；膦酰基或其衍生物；或者磷酸基或其衍生物；
其中所述基础聚合物选自由透明质酸、海藻酸盐、壳聚糖、果胶、聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚丙烯酰胺、纤维蛋白、蚕丝、胶原以及它们的混合物组成的组。
2.根据权利要求1所述的可交联聚合物，其特征在于，所述基础聚合物的所述官能团包括羟基、胺基、羧酸基、酰胺基和硫醇基中的至少一者。
3.根据权利要求1所述的可交联聚合物，其特征在于，所述第二有机分子为3,4-二羟基苯乙胺。
4.根据权利要求1所述的可交联聚合物，其特征在于，所述可交联聚合物的分子量小于500kDa，并且/或者所述可交联聚合物是水溶性的。
5.根据权利要求1所述的可交联聚合物，其特征在于，0.1％至99％的所述基础聚合物的所述官能团已经与所述第一有机分子发生反应。
6.根据权利要求1所述的可交联聚合物，其特征在于，0.1％至70％的所述基础聚合物的所述官能团已经与所述第二有机分子发生反应。
7.一种水凝胶，其包含含有可交联聚合物链的根据权利要求1至6中任一项所述的可交联聚合物，其中不同的可交联聚合物链的所述可交联单元中的至少一些可交联单元已经发生反应并形成共价键，从而形成共价连接网络。
8.根据权利要求7所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含至少一种添加剂。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含水、缓冲液或醇。
10.根据权利要求7或8中任一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的弹性模量为2kPa至4MPa。
11.根据权利要求7或8中任一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的溶胀比为-20％至150％。
12.根据权利要求7或8中任一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶与不同的人或动物组织粘合。
13.一种制备水凝胶的方法，包括以下步骤：
a.提供根据权利要求1至6中任一项所述的可交联聚合物，
b.将所述可交联聚合物溶解在溶剂中以获得溶液，
c.任选地，将交联剂添加到所述溶液中，
d.通过外部刺激使所述可交联聚合物交联以获得水凝胶。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述交联剂具有生物相容性。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述交联剂选自由自由基引发剂、氧化剂和二胺组成的组。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自水、缓冲液和醇。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述外部刺激选自由UV照射、X射线照射、红外照射和加热组成的组。
18.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，在步骤d之前的步骤中对所述溶液进行脱气。
19.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，在步骤d之前将添加剂添加到所述溶液中。
20.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，以溶液的形式添加可任选的交联剂。
21.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，基于所述溶液的总重量，所述可交联聚合物的浓度为1重量％至30重量％。
22.一种可根据权利要求13至21所述的方法获得的水凝胶。
23.根据权利要求1至6中任一项所述的可交联聚合物用于制备水凝胶的用途。
24.根据权利要求7至12或22中任一项所述的水凝胶在制造用于治疗软骨损伤、半月板损伤、角膜损伤、髓核或纤维环损伤、心脏组织损伤、骨组织损伤、牙齿组织损伤的种植体中的用途、以及/或者在制造用于外科手术的种植体中的用途。
25.根据权利要求4所述的可交联聚合物，其特征在于，所述可交联聚合物的分子量为750Da至约500kDa，并且/或者所述可交联聚合物是水溶性的。
26.根据权利要求5所述的可交联聚合物，其特征在于，1％至50％的所述基础聚合物的所述官能团已经与所述第一有机分子发生反应。
27.根据权利要求5所述的可交联聚合物，其特征在于，10％至30％的所述基础聚合物的所述官能团已经与所述第一有机分子发生反应。
28.根据权利要求4所述的可交联聚合物，其特征在于，所述可交联聚合物的分子量为10kDa至500kDa并且/或者所述可交联聚合物是水溶性的。
29.根据权利要求6所述的可交联聚合物，其特征在于，0.1％至30％的所述基础聚合物的所述官能团已经与所述第二有机分子发生反应。
30.根据权利要求6所述的可交联聚合物，其特征在于，10％至30％的所述基础聚合物的所述官能团已经与所述第二有机分子发生反应。
31.根据权利要求8所述的可交联聚合物，其特征在于，所述添加剂选自由有机填料和/或无机填料以及其混合物构成的组。
32.根据权利要求8所述的水凝胶，其特征在于，所述添加剂选自由芳族聚酰胺纤维，纤维素纤维，聚(甲基)丙烯酸酯，胶原纤维，蚕丝纤维，甲壳质，壳聚糖，淀粉，纳米颗粒以及它们的混合物构成的组。
33.根据权利要求8所述的水凝胶，其特征在于，所述添加剂选自由二氧化硅、磷酸钙、纳米金刚石、以及它们的混合物构成的组中。
34.根据权利要求9所述的水凝胶，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)或hepes缓冲液。
35.根据权利要求7或8中任意一项所述的水凝胶，其特征在于，在各种情况下，基于所述水凝胶的总重量，所述水凝胶包含70重量％至99重量％或75重量％至99重量％或80重量％至99重量％的水、缓冲液或醇。
36.根据权利要求7或8中任意一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶与软骨组织、半月板组织、眼组织、皮肤、髓核组织、纤维环组织、心血管组织和骨组织中的至少一者粘合。
37.根据权利要求7或8中任意一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶与角膜组织粘合。
38.根据权利要求13或14中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤d之前将选自由有机填料和/或无机填料以及其混合物构成的组中的添加剂添加到所述溶液中。
39.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，在步骤d之前将添加剂添加到所述溶液中，所述添加剂选自由芳族聚酰胺纤维，纤维素纤维，聚(甲基)丙烯酸酯，胶原纤维，蚕丝纤维，甲壳质，壳聚糖，淀粉，纳米颗粒以及它们的混合物构成的组。
40.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，在步骤d之前将添加剂添加到所述溶液中，所述添加剂选自由二氧化硅、磷酸钙、纳米金刚石、以及它们的混合物构成的组中。
41.根据权利要求13或14中任意一项所述的方法，其特征在于，基于所述溶液的总重量，所述可交联聚合物的浓度为1重量％至25重量％。
42.根据权利要求13或14中任意一项所述的方法，其特征在于，基于所述溶液的总重量，所述可交联聚合物的浓度为1重量％至20重量％。
43.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自磷酸盐缓冲盐水(PBS)和hepes缓冲液。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021222974A1 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 University Of Wollongong An implantable device
CN112316219B (zh) * 2020-09-29 2022-05-10 浙江大学 一种防粘连水凝胶-蚕丝支架复合膜及其制备与应用
CN113201152B (zh) * 2021-04-29 2022-03-25 哈尔滨工业大学 一种多重响应性自愈合自粘附水凝胶的制备方法
CN113817232B (zh) * 2021-09-24 2023-03-24 广东省科学院健康医学研究所 一种水凝胶及其制备方法与应用
CN115970060B (zh) * 2021-11-17 2024-04-30 四川大学 一种双键后交联提高生物瓣膜材料抗钙化及抗凝血性的方法
CN114133594A (zh) * 2021-11-30 2022-03-04 华南农业大学 丝素蛋白基粘附性抗冻导电水凝胶及其制备方法
CN114874455B (zh) * 2022-02-28 2023-10-27 中国科学院沈阳自动化研究所 一种中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原和凝胶的构建方法
CN114949331B (zh) * 2022-06-08 2023-03-10 中山大学 一种双仿生干型快速止血镇痛组织粘合剂贴片及其制备方法
CN116355572A (zh) * 2023-03-31 2023-06-30 广州市垠瀚能源科技有限公司 导热凝胶组合物、导热凝胶及其制备方法、发热元器件

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014046415A1 (ko) * 2012-09-19 2014-03-27 아주대학교산학협력단 효소 고정화 지지체를 이용한 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도
CN105358675A (zh) * 2013-05-08 2016-02-24 洛桑联邦理工学院 离散的细胞培养微环境的阵列、制备该阵列的方法及其用途
CN107011609A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 中国科学院化学研究所 一种具有自恢复能力的高强化学-物理双网络水凝胶及其制备方法与应用
CN108264611A (zh) * 2018-01-30 2018-07-10 江汉大学 一种自粘附超强水凝胶的制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020120333A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-29 Keogh James R. Method for coating medical device surfaces
US8273373B2 (en) * 2008-12-30 2012-09-25 Case Western Reserve University Photocrosslinked biodegradable hydrogel
SG11201700292WA (en) * 2014-07-16 2017-02-27 Univ Nanyang Tech Biological tissue adhesive composition and method of preparation thereof
WO2017130162A1 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 Ourotech, Inc. Shear-thinning hydrogel, kit and method of preparation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014046415A1 (ko) * 2012-09-19 2014-03-27 아주대학교산학협력단 효소 고정화 지지체를 이용한 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도
CN105358675A (zh) * 2013-05-08 2016-02-24 洛桑联邦理工学院 离散的细胞培养微环境的阵列、制备该阵列的方法及其用途
CN107011609A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 中国科学院化学研究所 一种具有自恢复能力的高强化学-物理双网络水凝胶及其制备方法与应用
CN108264611A (zh) * 2018-01-30 2018-07-10 江汉大学 一种自粘附超强水凝胶的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Catechol-Functionalized Hyaluronic Acid Hydrogels Enhance Angiogenesis and Osteogenesis of Human Adipose-Derived Stem Cells in Critical Tissue Defects;Hyun-Ji Park 等;《Biomacromolecules》;20160425;第17卷(第6期);第1939-1948页 *
Nanostructured Polymeric Coatings Based on Chitosan and Dopamine-Modified Hyaluronic Acid for Biomedical Applications;Neto, Ana I.等;《SMALL》;20141231;第10卷(第12期);第2459-2469页 *
Synthesis of 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) containing monomers and their co-polymerization with PEG-diacrylate to form hydrogels;Lee, BP 等;《JOURNAL OF BIOMATERIALS SCIENCE-POLYMER EDITION 》;20041231;第15卷(第4期);第449-464页 *
透明质酸—胶原共聚水凝胶作为中枢神经组织工程框架材料研究;鹿敏;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20050228(第2期);第A006-28页 *

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