CN112741078A - 一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于精子冷冻技术领域，具体涉及一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法。在采集精子后将精液和冷冻保护液混合均匀后，置于4℃冰箱预冷5min；然后将麦管放入‑20℃冷冻10min后，将麦管放入麦管套并置于铝制冻存条；冻存条放入液氮罐的提桶中，置于液氮罐液氮面上，在‑160℃—‑180℃条件下降温10min后投入液氮保存；其中，冷冻保存液以煮沸冷却后的灭菌天然海水为稀释液，以终浓度15％(v/v)乙二醇为保护剂制备得到。本发明基于生产需求，提供了一种简易、批量的生产性精子冷冻保存方法，为大泷六线鱼良种选繁育和渔业生产提供技术支撑；该发明方法中的精子抗冻液配比简单，冷冻程序相对便捷，可满足生产性精子冷冻保存的需求。

Description

一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法

技术领域：

本发明属于精子冷冻技术领域，具体涉及一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法。

背景技术：

大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)又名欧式六线鱼，俗称黄鱼、黄棒子等，隶属于鲉形目(Scorpaeniformes)、六线鱼科(Hexagrammidae)、六线鱼属(Hexagrammos)。大泷六线鱼属近海冷温性底层鱼类，在我国黄、渤海以及日本、朝鲜和俄罗斯远东诸海都有分布，其肉味鲜美，有“北方石斑”之称。该鱼具有很强的低温耐性，生长迅速，肉质鲜嫩，可以活鱼上市，适宜在北方进行网箱养殖，具有极高的经济价值。近年来，随着其全人工繁育技术的突破，养殖规模不断扩大，但因其雌鱼怀卵量少，鱼卵极易粘结成团块状，其繁育过程仍严重依赖体外人工授精。因此，对大泷六线鱼精子开展低温冷冻保存研究，延长精子的使用时效和应用范围，不仅对其资种质资源保护具有重要意义，亦已成为人工繁育过程中必须解决的课题。

目前，精子超低温冷冻保存技术在海洋动物种质保存研究主要集中在鱼类和贝类的少数几种海洋生物。影响冷冻效果的因素主要有精子大小、结构、渗透压、生理特性稀释液和防冻液的组成、冷冻和解冻方法的选择等等。不同物种生物精子的大小结构的差异及精浆离子浓度、渗透压的不同，使得他们具有各自适应的最佳抗冻液配比、最优冷冻降温速率和最适激活方法，需要大量的实验才可筛选得出。不同物种的精子冷冻技术不具有通用性。目前针对大泷六线鱼精子冷冻保存在实验室内实验已经获得成功，但需要用到渗透压仪、程序降温仪等高精度仪器设备，在生产一线几乎不能实现。而且，不同物种生物精子的渗透压、细胞液离子浓度不同，具有各自适应的最佳冷冻保存及激活条件，所以也难以借鉴其他生物精子的冷冻技术，所以如何在生产一线对大泷六线鱼的精子进行简单、批量的生产性精子冷冻保存，是目前研究的重点。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是目前针对大泷六线鱼精子冷冻保存在实验室内实验已经获得成功，但需要用到渗透压仪、程序降温仪等高精度仪器设备，在生产一线无法实现。

为解决上述问题，本发明基于生产需求，提供了一种适用于大泷六线鱼精子简易、批量的生产性精子冷冻保存方法，为大泷六线鱼良种选繁育和渔业生产提供技术支撑；该发明方法中的精子抗冻液配比简单，冷冻程序相对便捷，可满足生产性精子冷冻保存的需求。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法，在采集精子后将精液和冷冻保护液混合均匀后，置于4℃冰箱预冷5min，使抗冻保护剂充分渗入细胞中；然后将麦管放入-20℃冷冻10min后，将麦管放入麦管套并置于铝制冻存条；冻存条放入液氮罐的提桶中，置于液氮罐液氮面上，在-160℃—-180℃条件下降温10min后投入液氮保存；降温速率是决定冷冻成功与否的重要因素，冷冻过程中的是否需要平衡因种而异。超低温冷冻保存的原理是生物细胞、组织、器官甚至个体在超低温(-196℃)状态下代谢完全停止，生命以静止的形式得以长期保存。冷冻和解冻过程中必须经历0℃～-60℃冰晶形成温区。期间胞内结冰会造成细胞结构的机械损伤，胞外结冰会导致细胞失水，使细胞破裂死亡，因此必须采用适当的降温速度有效地减少冰晶对精子的损伤。发明人在实验室内开展过针对大泷六线鱼精子超低温冷冻保存程序的实验，使用程序降温仪精密控温(具体见应用实例)，结果表明，0℃～-20℃区间降温速度越快精子冷冻保存效果越好，-20℃-80℃区间降温速度-10℃/min与-20℃/min相差不大。因此在养殖场条件下，进行了本发明冷冻方法(使用麦管，快速降温至-20℃，后快速降温至-180℃，最后置入液氮中长期保存)试验，结果表明精子冷冻保存效果较好，冻精复活率可达87％。因此本申请采用的分步降温方法是针对大泷六线鱼精子结构的特点进行设定的。

其中，冷冻保存液以煮沸冷却后的灭菌天然海水为稀释液，以15％(v/v)乙二醇为保护剂制备得到，置于4℃冰箱备用。不同物种其精子的渗透压、细胞液离子浓度不同，不同物种的精子冷冻技术不具有通用性，因此他们具有各自最佳的抗冻保护剂，来缓解冷冻时细胞过冷引起的脱水皱缩和复活时细胞渗透性肿胀引起的损伤。本申请采用15％(v/v)乙二醇为抗冻保护剂，是在多种抗冻液与稀释液组合筛选的结果，该组合在保持较好渗透性的同时又降低了保护剂毒性，精子冷冻保存效果较好。另外，鱼类产精时间很短，简单易取的稀释液配比更适合养殖场大批量操作。因此，本发明采用煮沸冷却后的天然海水作为为稀释液，相比其他稀释液配置简单，不需在实验室就可操作，按照本发明方法进行低温冷冻保存，冻精复活后运动率达87％。

进一步的，精液与冷冻保护液按照1:4体积比混合。精子从亲鱼体内排出体外后，失去了母体营养物质的供应，所需能量仅来源自精浆。稀释比例小则精液浓度高，精子粘度大、细菌有毒代谢物浓度等也会相应提高，导致精子活力变低；稀释比例过大则精子外环境其理化性质(pH和渗透压)会明显改变，也会影响精子活力，同时也存在精液浪费的问题。因此，适当的稀释比对精子低温冷冻保存十分重要。本申请方案中稀释比例的确定，是在进行了1:1、1:2、1:4、1:8、1:10的稀释比例实验，结果表明1:4、1:8、1:10稀释比实验组冻精激活率均在80％以上，综合考虑此技术应用在生产实践中应最高效地保存更多优质精液，稀释比越小，生产效率越好，故选择了1:4作为最优稀释比。

进一步的，采集精子步骤具体为将成熟雄鱼置于干燥纱布上，用毛巾捂住其头部，蒸馏水冲洗生殖孔至无尿液、黏液残留，纱布擦净，在腹部沿鱼头至鱼尾方向轻轻挤压，用吸管将精液吸入冻存管中，置于冰上保存。

进一步的，冻精解冻步骤为将提桶从液氮中提出，置在空气中平衡2min，将麦管从麦管套中拿出，置于30℃左右的温水中轻轻摇晃解冻，至无冰块时取出。

进一步的，受精步骤为将解冻后的精液置于海水中激活，倒于卵子上使之受精，然后置于孵化池中孵化。

本发明的有益效果在于：

(1)针对大泷六线鱼精子结构的特点设定了分步降温的方式，通过降温速度的控制有效地减少冰晶对精子的损伤。

(2)针对大泷六线鱼精子结构的特点筛选组合了特殊的抗冻保护剂，在保持较好渗透性的同时又降低了保护剂毒性，精子冷冻保存效果较好。

(3)通过试验得到了最适于大泷六线鱼的冷冻保护液稀释比例，有利于在生产实践中高效地保存更多优质精液。

附图说明

图1是大泷六线鱼精子超微结构图。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

2019年11月18日，在大泷六线鱼养殖车间，开展了大泷六线鱼精子冷冻保存实验，包括以下步骤：

(1)精子采集：采取活体挤精的方式获得鲜精，即将成熟雄鱼置于干燥纱布上，用毛巾捂住其头部，蒸馏水冲洗生殖孔至无尿液、黏液残留，纱布擦净，在腹部沿鱼头至鱼尾方向轻轻挤压，用吸管将精液吸入冻存管中，置于冰上保存。选取镜检鲜精活力在85％以上的精液开展冷冻保存试验。

(2)冷冻保存液的配置：其中灭菌天然海水为稀释液，85ml；乙二醇为保护剂，15ml，混合后配置了100ml的冷冻保护液；冷冻保护液置好了置于4℃冰箱备用。

(3)混合预冷：使用0.5ml麦管(更细，降温速度更快)作为冻存管，每管加入100μl精液，400μl的冷冻保护液(稀释比1:4)混合均匀后，置于4℃冰箱预冷5min。

(4)平衡：将麦管放入-20℃(家用冰箱冷冻室)冷冻10min(平衡10min)后，在家用冰箱冷冻室内将麦管放入麦管套，并置于铝制冻存条中。

(5)冻存：用棉布包裹铝制冻存条，然后用镊子将冻存条放入液氮罐的提桶中，置于液氮罐液氮面上(-160℃—-180℃)10min，使提桶内的精子快速降温至-180℃，然后投入液氮保存。

(6)2019年11月19日，将液氮提桶从液氮罐中拿出，置在空气中平衡2min，用镊子将麦管从麦管套中拿出，置于30℃左右的温水槽中摇晃解冻，至无冰块时取出。

(7)镜检冻精复活后的游动率可达87％。

(8)受精：将解冻后的精液置于海水中激活，倒于卵子上使之受精，然后置于孵化池中孵化。

对比实施例：

精子的采集：2018年11月，正值大泷六线鱼生殖期，从青岛沿海捕回40条大泷六线鱼亲鱼。采取活体挤精的方式获得鲜精，经显微镜镜检，选取鲜精活力在85％以上的精液开展冷冻保存试验。

一、稀释比例的筛选

精子稀释液及稀释比例的筛选：分别使用灭菌天然海水、人工海水、HBSS溶液、D-hanks溶液为稀释液，进行了1:1、1:2、1:4、1:8、1:10稀释比例的实验，其他实验条件完全一致。冻精经复活后，灭菌天然海水和HBSS溶液作为精子稀释液效果明显好于人工海水与D-hanks溶液实验组。得到的结果如下：

由上述结果可以看出，在灭菌天然海水和HBSS溶液实验组中，1:4、1:8、1:10的稀释比例激活率更高，均达到了81％以上。综合考虑生产实践上，稀释液获取的便捷性与精子浓度，选定灭菌天然海水作为稀释液，1:4的稀释比作为最优稀释比。

二、精子抗冻保护剂及浓度的筛选

本次实验以灭菌天然海水和HBSS溶液作为稀释液，以二甲基亚砜和乙二醇为抗冻保护剂，配置了24种抗冻液，具体见下表，其中所述5％、10％、15％、20％是指体积浓度为5％、10％、15％、20％，即抗冻液中稀释液与抗冻保护剂的体积比为95％：5％、90％：10％、85％：15％、80％：20％。配好后置于0-4℃冰箱待用，每组抗冻液做3个平行实验。其他实验条件完全一致。

组合	稀释液	抗冻保护剂	冻精复活后运动率(％)
				1	灭菌天然海水	5％(v/v)二甲基亚砜	20.42±1.01
2	灭菌天然海水	10％(v/v)二甲基亚砜	22.67±1.56
				3	灭菌天然海水	15％(v/v)二甲基亚砜	27.09±1.64
4	灭菌天然海水	20％(v/v)二甲基亚砜	30.42±2.03
				5	灭菌天然海水	5％(v/v)乙二醇	25.42±1.43
6	灭菌天然海水	10％(v/v)乙二醇	68.46±2.43
				7	灭菌天然海水	15％(v/v)乙二醇	87.39±1.27
8	灭菌天然海水	20％(v/v)乙二醇	80.42±2.63
				9	HBSS溶液	5％(v/v)二甲基亚砜	22.36±1.13
10	HBSS溶液	10％(v/v)二甲基亚砜	23.45±1.42
				11	HBSS溶液	15％(v/v)二甲基亚砜	32.78±2.34
12	HBSS溶液	20％(v/v)二甲基亚砜	33.37±2.96
				13	HBSS溶液	5％(v/v)乙二醇	28.46±1.37
14	HBSS溶液	10％(v/v)乙二醇	71.53±1.05
				15	HBSS溶液	15％(v/v)乙二醇	88.39±1.55
16	HBSS溶液	20％(v/v)乙二醇	83.09±1.10

上述实验镜检观测冻精复活后的运动率发现，乙二醇为最优抗冻保护剂，其中以15％(v/v)最好，以灭菌后的天然海水和HBSS溶液为稀释液的实验组，运动率均达到了87％以上(实验组7和15)。

三、降温程序的筛选

实验以灭菌天然海水为稀释液，添加15％乙二醇，使用程序降温仪精密控温，采用5组降温程序(见下表)进行精子超低温冷冻。

由实验数据可知，5个降温程序精子冷冻保存效果排序为P-5>P-3>P-2>P-4>P-1。P-2程序优于P-1，差别在于在0℃～-20℃区间降温速度为-10℃/min快于-5℃/min，可见0℃～-20℃区间降温速度快效果好；P-3程序优于P-2，差别在于在-20℃～-80℃区间降温速度为-20℃/min快于-10℃/min，在-20℃～-80℃区间降温速度也是越快越好；P-4程序效果较差，相比P-2程序，在-20℃的时候没有平衡，说明-20℃左右平衡时间十分必要。P-5程序精子冷冻保存效果最好，相对与第二好的P-3程序，差别在于-80℃没有平衡，以更快的降温速度(-40℃/min)从-20℃降到了-180℃，可见-80℃可以不平衡，-20℃～-180℃温区降温速度越快效果越好。

因此可以得出结论，0℃～-20℃温区，降温快的实验组效果好于降温慢的；-20℃时的平衡十分必要；-80℃平衡效果不显著；-20℃～-180℃温区，降温快的实验组效果好于降温慢的实验组。

Claims (5)

1.一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法，其特征在于：在采集精子后将精液和冷冻保护液混合均匀后，置于4℃冰箱预冷5min，；然后将麦管放入-20℃冷冻10min后，将麦管放入麦管套并置于铝制冻存条；冻存条放入液氮罐的提桶中，置于液氮罐液氮面上，在-160℃—-180℃条件下降温10min后投入液氮保存；

其中，冷冻保存液以煮沸冷却后的灭菌天然海水为稀释液，以终浓度体积比为15％乙二醇为保护剂制备得到。

2.如权利要求1所述的大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法，其特征在于：精液与冷冻保护液按照1:4体积比混合。

3.如权利要求1或2所述的大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法，其特征在于：采集精子步骤具体为将成熟雄鱼置于干燥纱布上，用毛巾捂住其头部，蒸馏水冲洗生殖孔至无尿液、黏液残留，纱布擦净，在腹部沿鱼头至鱼尾方向轻轻挤压，用吸管将精液吸入冻存管中，置于冰上保存。

4.如权利要求1或2所述的大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法，其特征在于：冻存后的冻精解冻步骤为将提桶从液氮中提出，置在空气中平衡2min，将麦管从麦管套中拿出，置于30℃左右的温水中轻轻摇晃解冻，至无冰块时取出。

5.如权利要求1或2所述的大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法，其特征在于：解冻后的受精步骤为将解冻后的精液置于海水中激活，倒于卵子上使之受精，然后置于孵化池中孵化。

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