CN117898229A - 一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 - Google Patents
一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117898229A CN117898229A CN202410309280.8A CN202410309280A CN117898229A CN 117898229 A CN117898229 A CN 117898229A CN 202410309280 A CN202410309280 A CN 202410309280A CN 117898229 A CN117898229 A CN 117898229A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sperm
- sperms
- temperature
- chlamys nobilis
- mixture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 241001526679 Mimachlamys nobilis Species 0.000 title claims abstract description 36
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 34
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 16
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 12
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims description 9
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013535 sea water Substances 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000009027 insemination Effects 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 4
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 claims description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims 1
- 235000020637 scallop Nutrition 0.000 abstract description 11
- 241000237509 Patinopecten sp. Species 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 6
- 241000237503 Pectinidae Species 0.000 abstract description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 abstract description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 37
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 16
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 7
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 6
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000003879 sperm preservation Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000009612 semen analysis Methods 0.000 description 3
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 3
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 2
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 2
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 241000237505 Chlamys Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K61/00—Culture of aquatic animals
- A01K61/50—Culture of aquatic animals of shellfish
- A01K61/54—Culture of aquatic animals of shellfish of bivalves, e.g. oysters or mussels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明涉及人工受精领域，其具体是一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，通过采用整体性腺的冷冻保存方法，与传统的单独精子冷冻保存方法相比，这种方法能够更有效地保持精子的生物活性和自然状态，因为它保留了精子在扇贝体内的自然环境，这种整体性腺的冷冻方式减少了精子在冷冻和解冻过程中的损伤，显著提高了解冻后精子的存活率和质量；本发明使用的冷冻保护液含有特定比例的渗透性和非渗透性抗冻剂，如DMSO和海藻糖，这种独特配方能更有效地保护精子免受冷冻伤害，同时模拟精子在扇贝体内的自然环境，提高其在解冻后的活性和存活率。
Description
技术领域
本发明涉及精子保存领域，其具体是一种华贵栉孔扇贝人工受精方法。
背景技术
华贵栉孔扇贝，属于软体动物门(Mollusca)，腹足纲(Gastropoda)，扇贝科(Pectinidae)，栉孔扇贝(Chlamys), 原产于世界各地热带、亚热带海域均有分布，亚洲分布于中国、日本、印尼等地，除少数分布在深海外，多数野生于潮线下300m以内的浅海底。华贵栉孔扇贝是世界知名度最高的双壳贝类之一，我国主要的扇贝养殖品种，养殖年产量达120万多吨，居世界首位，具有生长快、产量高、周期短、效益高的特点。这种贝类不仅具有较高的经济价值，而且在海洋生态系统中发挥着重要作用。近年来，由于环境污染、科学引导不足、近亲繁殖等问题，导致华贵栉孔扇贝等海洋生物的种质资源出现退化，进而影响了海洋生物多样性和养殖产量。
在这种背景下，精子保存技术的发展对于水产动物的养殖、种质资源保护以及生物学研究具有重要意义。特别是对于华贵栉孔扇贝这样的物种，由于其特有的生殖特性和繁殖周期，需要一种有效的精子保存方法以保证长途运输和人工授精的成功率。此外，由于环境因素和人为操作可能导致的精子活力下降，研发一种能够在超低温条件下长期保持精子活力的保存方法显得尤为重要。
目前，国内外在精子保存技术方面的研究主要集中在低温保存和超低温冻存。然而，对于海洋贝类精子，特别是华贵栉孔扇贝精子的保存研究，尚未形成一套标准化的操作流程。保藏精子的基本原则是尽可能保持其原始状态和形态，延长寿命。在此过程中，稀释液的类型、保存液的配方、环境温度等因素都会对保存效果产生影响。因此，针对华贵栉孔扇贝精子的特性，开发一种适用的保存方法，不仅对于保护其种质资源具有重要意义，对于促进华贵栉孔扇贝良种繁育和养殖业的发展也具有极大的应用价值。
传统的保存方法往往无法充分防止冷冻过程中的细胞损伤，尤其是在长期保存和运输过程中。这些限制不仅影响了精子的质量，也降低了人工繁殖的成功率。此外，大多数现有技术主要集中于单独精子水平的保存，而忽视了整个性腺组织的完整性和功能。性腺作为包含和保护精子的自然环境，其整体保存可能提供更有效的保护机制，维持精子在更接近自然状态下的活力和功能。
因此，开发一种针对华贵栉孔扇贝的性腺整体冷冻保存方法，既能有效保护精子免受冷冻过程中的损伤，又能提高解冻后的精子存活率和活力，对于提升扇贝养殖的效率和遗传多样性保护具有重要意义。这种创新方法的开发对于海洋生物学研究和水产养殖业的可持续发展将提供重要的技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，采用整体性腺的冷冻保存方法，这种方法能够更有效地保持精子的生物活性和自然状态，且辅以使用一种特殊配制的冷冻保护液，其配比经过优化以适应华贵栉孔扇贝精子的特殊需要，这种独特的配方旨在模拟精子的自然生存环境，可以进一步地减少冷冻过程中的细胞损伤。
一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，包括：
精子和性腺的收集与处理：从处于繁殖盛期的华贵栉孔扇贝中，选择性腺饱满的个体，通过精细的外科手术方法，切开扇贝的一侧闭壳肌，暴露其内脏团，从中提取性腺，并用吸水纸吸干海水及组织液混合物；
这一步骤的创新之处在于采用无菌技术以及精确的解剖方法，确保性腺的完整性和清洁度，为后续的保存和分析提供了良好的基础。
性腺细胞类型的确认：在无菌载玻片上滴一滴海水，使用解剖针从性腺中挑取少量物质放置于载玻片上在显微镜下观察该物质在海水中的扩散情况，以确定是精子还是卵子，若细胞呈颗粒状迅速散开则为卵子，若细胞呈烟雾状散开则为精子；
冷冻保护液的配置：按重量比计包括，HBSS溶液80-90%、 DMSO 4-8%和0.25mol/L海藻糖5-10%，充分混合，其中HBSS溶液中不含钙离子和镁离子，不含酚红；
这种保护液包含渗透性抗冻剂DMSO和非渗透性抗冻剂海藻糖，其配比经过优化以适应华贵栉孔扇贝精子的特殊需要，这种独特的配方旨在模拟精子的自然生存环境，减少冷冻过程中的细胞损伤，提高其在解冻后的活性和存活率。
性腺的称重与冷冻：将提取的性腺称重，确保精确测量，将性腺按照1：20的比例与预先准备好的冷冻保护液混合，将混合后的样本放入冻存管中，置于4℃条件下平衡30分钟；
冷冻过程：使用程序降温仪将混合物样本以3-6℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3-6min，再以7-12℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡3-6 min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存。
发明中采用的程序降温仪可以精确控制冷冻过程中的温度变化，从而最大限度地减少温度波动对精子的负面影响，这种精确的温度控制技术是传统冷冻保存方法所缺乏的，它可以显著提高精子在冷冻后的复苏能力。
解冻及精子激活：将冻存管从液氮罐中取出，放入30-60℃的恒温水浴锅中轻轻晃动使其均匀解冻，并观察样本的溶解情况至其完全溶解为止；
解冻后，将性腺用干净吸水纸充分吸干、剪碎并放置在500目筛绢网上，使用0.25μm筛绢网过滤的天然海水进行冲洗过滤，去除多余组织碎片，获得激活的20倍稀释的较干净的精子。通过精子质量分析仪检测精子的活力，确保其活力达到60%以上。
在解冻过程中，本发明采用了特定的快速温度恢复技术，这不仅快速恢复精子的活力，而且减少了解冻过程中可能发生的细胞损伤，经过优化的性腺剪碎和过滤过程进一步提高了精子的活性和纯净度。
人工受精操作：准备好处于适宜受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将解冻并激活的精子与卵子混合，保持适宜的温度、pH值和盐度条件，促进受精。
具体地，控制的环境条件包括温度为25-30℃，PH为7.8-8.5，盐度为30-35。
使用显微镜监控受精过程，确保受精率达到或超过40%。
本发明的有益效果是：
本发明采用整体性腺的冷冻保存方法，与传统的单独精子冷冻保存方法相比，这种方法能够更有效地保持精子的生物活性和自然状态，因为它保留了精子在扇贝体内的自然环境，这种整体性腺的冷冻方式减少了精子在冷冻和解冻过程中的损伤，显著提高了解冻后精子的存活率和质量。
本发明使用的冷冻保护液含有特定比例的渗透性和非渗透性抗冻剂，如DMSO和海藻糖，这种独特配方能更有效地保护精子免受冷冻伤害，同时模拟精子在扇贝体内的自然环境，提高其在解冻后的活性和存活率。
本发明采用的程序降温仪可以精确控制冷冻过程中的温度变化，从而最大限度地减少温度波动对精子的负面影响，这种精确的温度控制技术是传统冷冻保存方法所缺乏的，它可以显著提高精子在冷冻后的复苏能力。
在解冻过程中，本发明采用了特定的快速温度恢复技术，这不仅快速恢复精子的活力，而且减少了解冻过程中可能发生的细胞损伤；此外，经过优化的性腺剪碎和过滤过程进一步提高了精子的活性和纯净度。
综上，通过使用本发明的高活力精子，可以显著提高华贵栉孔扇贝的人工受精成功率，这对于其养殖和种质资源的保护具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1冷冻精子电镜扫描图；
图2为实施例2冷冻精子电镜扫描图；
图3为实施例3冷冻精子电镜扫描图；
图4为实施例1的精液分析报告图；
图5为实施例2的精液分析报告图；
图6为实施例3的精液分析报告图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，包括：
S1，挑选处于繁殖盛期、性腺饱满的华贵栉孔扇贝个体，用刀片切开贝壳，用无菌手术刀切开一侧闭壳肌，暴露内脏团；
S2，将性腺剥离取下，并用吸水纸吸干海水及组织液混合物；
S3，在无菌载玻片上滴海水，挑取性腺中的乳白色物质进行观察，以确定生殖细胞类型；
S4，制备冷冻保护液，冷冻液包括重量占比85%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、5% 的DMSO和10%的0.25mol/L海藻糖；
S5，将性腺按1：20的重量比例与冷冻保护液混合，然后在4℃下平衡30分钟；
S6，使用程序降温仪对混合物以3℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3min，再以7℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡3 min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存；
S7，从液氮罐中取出样本，并在40℃恒温水浴中解冻；
S8，对解冻后的性腺进行处理，包括吸干、剪碎、冲洗过滤，最终获得激活的20倍稀释的精子；
S9，随机采取5ml稀释后的精子，使用精子质量分析仪记录精子存活率；
S10，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度25℃、PH7.8、盐度30的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
实施例2
实施例2与实施例1相同，不同之处在于：
S4中，冷冻液包括重量占比82%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、8% 的DMSO和10%的0.25mol/L海藻糖。
S6中，使用程序降温仪对混合物以4℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡5min，再以9℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡5 min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存；
S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度28℃、PH8.0、盐度32的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
实施例3
实施例3与实施例1相同，不同之处在于：
S4中，冷冻液包括重量占比90%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、4% 的DMSO和6%的0.25mol/L海藻糖。
S6中，使用程序降温仪对混合物以6℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡5min，再以12℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡6 min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存；
S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度30℃、PH8.5、盐度35的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
对比例1
对比例1与实施例1相同，不同之处在于，在S5中，将采集的精子与冷冻液按1:20的重量比例混合，然后在4℃下平衡30分钟。
对比例2
对比例2与实施例1相同，不同之处在于，在S4中，冷冻液包括重量占比80%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、10% 的DMSO和10%的0.25mol/L海藻糖。
对比例3
对比例2与实施例1相同，不同之处在于，在S4中，冷冻液包括重量占比70%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、15% 的DMSO和15%的0.25mol/L海藻糖。
对比例4
对比例4与实施例1相同，不同之处在于，在S6中，使用程序降温仪对混合物以8℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3min，再以15℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡3min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存。
对比例5
对比例5与实施例1相同，不同之处在于，在S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度35℃、PH8.0、盐度32的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
对比例6
对比例6与实施例2相同，不同之处在于，在S4中，冷冻液包括重量占比75%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、15% 的DMSO和10%的0.25mol/L海藻糖。
对比例7
对比例7与实施例2相同，不同之处在于，在S4中，冷冻液包括重量占比95%的HBSS溶液(不含钙镁、不含酚红)、3% 的DMSO和2%的0.25mol/L海藻糖。
对比例8
对比例8与实施例2相同，不同之处在于，在S6中，使用程序降温仪对混合物以8℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3min，再以15℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡6min，将样本快速转移到液氮罐中进行保存。
对比例9
对比例9与实施例2相同，不同之处在于，在S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度28℃、PH9.0、盐度32的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
对比例10
对比例10与实施例2相同，不同之处在于，在S10中，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在温度35℃、PH8.0、盐度32的环境下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育，使用显微镜监控受精率。
实施例1-3和对比例1-10的实验数据如表1所示，为了便于记录，精子质量分析仪中的其他数据（例如精子总数、精子浓度、PR、NP、IM等等）不予记录，仅记录总活力（PR+NP）值和受精率。
| 总活力值（PR+NP）% | 受精率% | |
| 实施例1 | 72.4 | 45.2 |
| 实施例2 | 74.6 | 45.8 |
| 实施例3 | 71.8 | 42.4 |
| 对比例1 | 66.6 | 38.2 |
| 对比例2 | 58.4 | 26.3 |
| 对比例3 | 54.7 | 24.6 |
| 对比例4 | 56.8 | 25.7 |
| 对比例5 | 52.6 | 23.8 |
| 对比例6 | 57.7 | 25.8 |
| 对比例7 | 48.4 | 20.6 |
| 对比例8 | 62.2 | 29.6 |
| 对比例9 | 58.6 | 27.4 |
| 对比例10 | 56.4 | 26.2 |
表1
由表1数据可知，采用实施例1-3的冷冻保存和人工受精方法，其精子总活力值均超过70%，受精率在40以上，其冷冻精子后存活率和受精率均较为理想。
其中，对比例1与实施例1相比，直接将采集的精子与冷冻液混合，精子总活力值和受精率均有下降，这说明采用整体性腺的冷冻保存方法，与传统的单独精子冷冻保存方法相比，这种方法能够更有效地保持精子的生物活性和自然状态，因为它保留了精子在扇贝体内的自然环境，这种整体性腺的冷冻方式减少了精子在冷冻和解冻过程中的损伤，显著提高了解冻后精子的存活率和质量。
对比例2、3与实施例1相比，对比例6、7与实施例2相比，调整了冷冻液的配比，本发明中使用了一种特殊配制的冷冻保护液，其配比经过优化以适应华贵栉孔扇贝精子的特殊需要，这种独特的配方旨在模拟精子的自然生存环境，减少冷冻过程中的细胞损伤。
对比例4与实施例1相比，对比例8与实施例2相比，调整了降温速率，精子总活力值与受精率有下降，但下降程度优于调整受精环境的改变（对比例5与对比例9、10），这说明冷冻过程中较小的温度波动可以减少对精子的负面影响。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，其特征在于，包括：
S1，挑选处于繁殖盛期、性腺饱满的华贵栉孔扇贝个体，用刀片切开贝壳，用无菌手术刀切开一侧闭壳肌，暴露内脏团；
S2，将性腺剥离取下，并用吸水纸吸干海水及组织液混合物；
S3，在无菌载玻片上滴海水，挑取性腺中的乳白色物质进行观察，以确定生殖细胞类型；
S4，制备冷冻保护液，冷冻保护液按重量比计包括：HBSS溶液80-90%、 DMSO 4-8%和0.25mol/L海藻糖5-10%，其中HBSS溶液中不含钙离子和镁离子，不含酚红；
S5，将性腺按1：20的重量比例冷冻保护液混合，然后在4℃下平衡30分钟；
S6，使用程序降温仪对混合物进行冷冻处理，包括从4℃降至﹣25℃，平衡后再降至﹣80℃，最后快速转移到液氮罐中保存；
S7，从液氮罐中取出样本，并在30-60℃恒温水浴中解冻；
S8，对解冻后的性腺进行处理，包括吸干、剪碎、冲洗过滤，最终获得激活的20倍稀释的精子；
S9，使用精子质量分析仪记录精子存活率，确保精子活力达60%以上；
S10，准备处于适合受精状态的华贵栉孔扇贝卵子，将激活的精子与卵子混合，在控制的环境条件下促使混合物进行受精，观察和确认受精的成功，表现为受精卵的形成和发育。
2.根据权利要求1所述的一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，其特征在于，S6中，使用程序降温仪将混合物以3-6℃/min的速率降至﹣25℃，在﹣25℃平衡3-6min，再以7-12℃/min的速率降至﹣80℃，在﹣80℃平衡3-6 min，将混合物快速转移到液氮罐中进行保存。
3.根据权利要求1所述的一种华贵栉孔扇贝人工受精方法，其特征在于，在S10中，控制的环境条件包括温度为25-30℃，PH为7.8-8.5，盐度为30-35。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410309280.8A CN117898229B (zh) | 2024-03-19 | 2024-03-19 | 一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410309280.8A CN117898229B (zh) | 2024-03-19 | 2024-03-19 | 一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117898229A true CN117898229A (zh) | 2024-04-19 |
| CN117898229B CN117898229B (zh) | 2024-07-09 |
Family
ID=90682359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410309280.8A Active CN117898229B (zh) | 2024-03-19 | 2024-03-19 | 一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117898229B (zh) |
Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006037263A1 (fr) * | 2004-10-10 | 2006-04-13 | Institute Of Oceanology Chinese Academy Of Sciences | Procede de creation d'une lignee endogame de coquillages gonochores |
| CN101133977A (zh) * | 2007-09-30 | 2008-03-05 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 采集扇贝高浓度精液的方法 |
| CN101836615A (zh) * | 2010-05-27 | 2010-09-22 | 中国长江三峡集团公司中华鲟研究所 | 中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法 |
| CN102771471A (zh) * | 2012-08-22 | 2012-11-14 | 宁夏医科大学 | 卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及冷冻方法 |
| CN104336004A (zh) * | 2013-07-24 | 2015-02-11 | 中国科学院海洋研究所 | 一种优质太平洋牡蛎精子的采集及超低温冷冻保存的方法 |
| JP2019154329A (ja) * | 2018-03-14 | 2019-09-19 | 旭化成株式会社 | 幹細胞の凍結保存液 |
| CN111149730A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-05-15 | 湖南师范大学 | 一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法 |
| CN111567515A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-25 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法 |
| CN112741078A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-05-04 | 山东省海洋生物研究院 | 一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法 |
| CN112931491A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-11 | 山东省海洋生物研究院 | 一种大泷六线鱼精子低温保存液 |
| CN113273567A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-20 | 大连海洋大学 | 虾夷扇贝精子的低温保存液及保存和使用方法 |
| CN115708506A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-02-24 | 海南大学 | 一种马氏珠母贝精子低温保存方法 |
| CN116076485A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-05-09 | 中国海洋大学 | 一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保护液及超低温冷冻保存的方法 |
| JP2023159041A (ja) * | 2022-04-19 | 2023-10-31 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 始原生殖細胞の保存方法 |
-
2024
- 2024-03-19 CN CN202410309280.8A patent/CN117898229B/zh active Active
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006037263A1 (fr) * | 2004-10-10 | 2006-04-13 | Institute Of Oceanology Chinese Academy Of Sciences | Procede de creation d'une lignee endogame de coquillages gonochores |
| CN101133977A (zh) * | 2007-09-30 | 2008-03-05 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 采集扇贝高浓度精液的方法 |
| CN101836615A (zh) * | 2010-05-27 | 2010-09-22 | 中国长江三峡集团公司中华鲟研究所 | 中华鲟超低温冷冻精液人工授精方法 |
| CN102771471A (zh) * | 2012-08-22 | 2012-11-14 | 宁夏医科大学 | 卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及冷冻方法 |
| CN104336004A (zh) * | 2013-07-24 | 2015-02-11 | 中国科学院海洋研究所 | 一种优质太平洋牡蛎精子的采集及超低温冷冻保存的方法 |
| JP2019154329A (ja) * | 2018-03-14 | 2019-09-19 | 旭化成株式会社 | 幹細胞の凍結保存液 |
| CN111149730A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-05-15 | 湖南师范大学 | 一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法 |
| CN111567515A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-25 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种鲟鱼性腺组织的冷冻保存液和冷冻保存及复苏的方法 |
| CN112741078A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-05-04 | 山东省海洋生物研究院 | 一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法 |
| CN112931491A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-06-11 | 山东省海洋生物研究院 | 一种大泷六线鱼精子低温保存液 |
| CN113273567A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-20 | 大连海洋大学 | 虾夷扇贝精子的低温保存液及保存和使用方法 |
| JP2023159041A (ja) * | 2022-04-19 | 2023-10-31 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 始原生殖細胞の保存方法 |
| CN115708506A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-02-24 | 海南大学 | 一种马氏珠母贝精子低温保存方法 |
| CN116076485A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-05-09 | 中国海洋大学 | 一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保护液及超低温冷冻保存的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张文昌;李明;庄益芬;邹长连;马群;祁喜柯;张丽;: "鹌鹑原始生殖细胞的分离及冷冻", 福建畜牧兽医, vol. 33, no. 01, 20 January 2011 (2011-01-20), pages 1 - 3 * |
| 肖小, 秦洁, 蔡琳琳, 李碧春: "鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存和体外培养", 中国兽医学报, vol. 25, no. 03, 15 May 2005 (2005-05-15), pages 316 - 319 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117898229B (zh) | 2024-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chao et al. | Cryopreservation of finfish and shellfish gametes and embryos | |
| CN112741078B (zh) | 一种大泷六线鱼精子生产性冷冻保存方法 | |
| Glogowski et al. | Activity of aspartate aminotransferase and acid phosphatase in cryopreserved trout sperm | |
| US20230276790A1 (en) | Hypothermic preserving diluent, hypothermic preserving method of plectropomus leopardus semen and application thereof | |
| Babiak et al. | Refrigeration of rainbow trout gametes and embryos | |
| CN115708506B (zh) | 一种马氏珠母贝精子低温保存方法 | |
| CN103097544B (zh) | 藻类细胞的制备方法以及化学物质的毒性评价用试剂盒 | |
| Coser et al. | Cryogenic preservation of spermatozoa from Prochilodus scrofa and Salminus maxillosus | |
| CN117898229B (zh) | 一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 | |
| Bozkurt et al. | Effect of freezing techniques, extenders and cryoprotectants on the fertilization rate of frozen rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) sperm | |
| CN111869656A (zh) | 一种绿鳍马面鲀精子的超低温冷冻保存方法 | |
| WO2021238039A1 (zh) | 中间球海胆胚胎的快速玻璃化冷冻保存与复苏方法 | |
| CN110012901B (zh) | 一种用于猪精液常温保存的稀释制剂 | |
| Larsen et al. | Semen extenders for artificial insemination in the American alligator | |
| CN112075415B (zh) | 一种冷冻保护液及刺参精子超低温冷冻保存方法 | |
| KR20170122867A (ko) | 전복 정액 냉동 보존을 이용한 전복 인공종묘 생산방법 | |
| CN116076485A (zh) | 一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保护液及超低温冷冻保存的方法 | |
| Widyaningsih et al. | Effect of various concentrations of palm date (Phoenix dactylifera L.) on spermatozoa motility of giant grouper (Epinephelus lanceolatus) | |
| Avlar et al. | Protective effects of different egg yolk sources on cryopreservation of scaly carp (Cyprinus carpio) sperm | |
| EP3516959B1 (en) | Protocol for the cryopreservation of shrimp spermatophores/sperm mass | |
| Jianzhong et al. | Methods and effects of Hongshan cock spermatozoa cryopreservation | |
| Viveiros et al. | Semen cryopreservation of the African catfish, Clarias gariepinus | |
| CN114451404B (zh) | 一种白斑狗鱼精液冷冻保存液及其制备方法 | |
| Viveiros et al. | Semen cryopreservation of piracanjuba (Brycon orbignyanus), an endangered Brazilian species | |
| Alvarez et al. | Use of post-thaw silver carp (Hypophtalmichthys molitrix) spermatozoa to increase hatchery productions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |