CN112680463B

CN112680463B - 一种野豌豆潜隐病毒的cp基因及其应用

Info

Publication number: CN112680463B
Application number: CN202110066635.1A
Authority: CN
Inventors: 徐小满; 崔晓艳; 秦嘉超; 陈华涛; 张红梅; 刘晓庆; 孙文献; 陈新
Original assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Current assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112680463A

Abstract

本发明公开了一种野豌豆潜隐病毒的CP基因，所述CP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了包括所述CP基因的重组载体、扩增所述的CP基因的特异性引物对，检测野豌豆潜隐病毒的CP基因的引物组，野豌豆潜隐病毒的检测试剂盒以及一种非诊断目的的野豌豆潜隐病毒检测方法。本发明的检测试剂盒及其检测方法不需要PCR仪，成本低廉，操作简单，1 h内就可以高特异性、高效率地将有限数量的DNA扩增至100万份，其灵敏度高于PCR技术，并且反应结果便于识别。

Description

一种野豌豆潜隐病毒的CP基因及其应用

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种野豌豆潜隐病毒的CP基因及其应用。

背景技术

野豌豆潜隐病毒(vicia cryptic virus，VCV)，是一种少见的双链RNA(dsRNA)病毒，属于双分体病毒科(Partitiviridae)，α-潜隐病毒属(Alphacryptovirus)，通常与其他病毒混合侵染加重协生病毒在寄主上的症状。1978年Kenten等首次在蚕豆(Vicia faba)上发现了隐性病毒的出现，被称为野豌豆潜隐病毒(VCV)。2009年陈集双于中国浙江杭州发现了野豌豆潜隐病毒并对序列进行归属和功能分析。2020年张坤等人首次在江苏地区种植的豇豆和蚕豆上发现VCV-M感染，并对其分离物基因组进行分析。但目前人们普遍认为VCV侵染植物不呈现相应症状，并且这种病毒在影响宿主生物学特性方面的作用尚不明确。

目前，检测野豌豆潜隐病毒的方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。其中应用最广的还是RT-PCR技术，但是该扩增技术依赖精密仪器，同时需要高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应，在一定程度上会受到环境与设备的限制，无法满足实验室外的现场诊断。于是科研人员又开发了不需要变温的等温核酸扩增技术，包括核酸序列扩增技术(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)和近年来引人注目的重组酶聚合酶扩增(RPA)等。其中LAMP技术发展较为完善，多应用于动植物病毒检测。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)反应体系由dNTPs、Bst DNA聚合酶、引物及DNA模板等组成，在65℃左右等温条件下，通过DNA聚合酶和一组4个特别设计的引物(包括两个外引物F3、B3和两个内引物FIP和BIP)，1h内就可以高特异性、高效率地将有限数量的DNA扩增至100万份，并且可通过染料进行可视化检测。

目前LAMP技术已用于检测大豆花叶病毒(soybean mosaic virus，SMV)和菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus，BPMV)，尚未有利用LAMP技术检测野豌豆潜隐病毒的报道。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种野豌豆潜隐病毒的CP基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了重组载体。

本发明还要解决的技术问题是提供了扩增所述的CP基因的特异性引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种野豌豆潜隐病毒的检测试剂盒。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种非诊断目的的野豌豆潜隐病毒检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取了如下的技术方案：一种野豌豆潜隐病毒的CP基因，所述CP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明内容还包括重组载体，所述重组载体含有所述的CP基因。

本发明内容还包括扩增所述的CP基因的特异性引物对，所述特异性引物对序列如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示。

本发明内容还包括检测所述的野豌豆潜隐病毒的引物组，所述引物组包括内引物对和外引物对，所述内引物对序列如SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示，所述外引物对序列如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示。

本发明内容还包括一种野豌豆潜隐病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的引物组或特异性引物对。

其中，所述检测试剂盒还包括反应缓冲液、荧光目视检测试剂、Bst DNA聚合酶、阴性对照和阳性对照。

本发明内容还包括一种非诊断目的的野豌豆潜隐病毒检测方法，所述检测方法包括使用权利要求3所述的引物对进行一步法环介导等温扩增反应。

其中，所述检测方法的反应温度为60～65℃，反应时间为15～55min。

其中，所述检测方法的反应体系为2×反应缓冲液12.5μL，内引物对5μM各1μL，外引物对40μM各1μL，荧光目视检测试剂1μL，Bst DNA聚合酶1μL，ddH2O 4.5μL，重组质粒DNA2μL。

有益效果：本发明的检测试剂盒及其检测方法不需要PCR仪，成本低廉，操作简单，1h内就可以高特异性、高效率地将有限数量的DNA扩增至100万份，其灵敏度高于PCR技术，并且反应结果便于识别。

附图说明

图1为本发明VCV RT-LAMP不同引物组扩增结果分析；1、2、3：分别为引物P1组、引物P2组和引物P3组；4、5、6：分别为P1、P2、P3组引物不加阳性质粒，作为空白对照；7：阳性对照(用限制性内切酶Hind III消化λ噬菌体DNA后，取其片段6557bp重组质粒所得)

图2扩增温度对lamp反应的影响；

图3扩增时间对lamp反应的影响；

图4荧光染色RT-LAMP和普通RT-PCR检测灵敏度比较；

图5 LAMP检测特异性验证。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不应仅限于这些实施例。

实施例1

1、供试材料

田间待检测蚕豆样品于2019年9月采集于江苏省南京市溧水区，样品放于装有冰袋的便携保鲜箱中，带回实验室进行RNA抽提，抽提RNA于-80℃冰箱保存备用。样品经普通RT-PCR检测确证含有野豌豆潜隐病毒(Vicia cryptic virus，VCV)，将VCV的CP基因序列连入pClone007载体(购自北京擎科生物科技有限公司)，以构建的pClone007-VCV-CP载体作为实验材料。

2、主要试剂及引物序列的设计

RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒、FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂购于天根生化科技(北京)有限公司，pClone007 Blunt Simple Vector Kit、DNA凝胶回收试剂盒、PCR Master Mix购于北京擎科生物科技有限公司、质粒DNA提取试剂盒购于艾瑞科生物公司、Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒(环介导等温扩增法)、钙黄绿素荧光试剂购于荣研生物科技(中国)有限公司，LAMP-HNB变色扩增试剂盒购于哈尔滨新海基因检测有限公司。

根据NCBI上VCV基因组序列以及实验室样品的测序结果，选取外壳蛋白基因序列进行引物设计，(Gen Bank登录号为EF173391.1)，采用PrimerExplore V5在线软件(http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计LAMP扩增所用引物，引物由上海生物工程股份有限公司合成。所用引物具体信息见表1。

表1野豌豆潜隐病毒RT-LAMP和RT-PCR检测引物序列

引物	序列(5′→3′)
			F3-1	TGAACAGTACGCTATTGCTGC	SEQ ID NO：2
B3-1	GGTGATAGCGAGAAGCGATG	SEQ ID NO：3
			FIP-1	CGGATTGATGGCGGTCCTTTCATCACACCAACATTAGGTGGGC	SEQ ID NO：4
BIP-1	TACTGGAACATGACCCCTTTCCGAGCTGGGCATACTGAGTCTT	SEQ ID NO：5
			F3-2	TGAAGAGTGTATGGTCCCCG	SEQ ID NO：6
B3-2	GACGTAAGTCGCGCAGTAG	SEQ ID NO：7
			FIP-2	GCCTATCCAGTCAAAAGGGCCAGACCACTAGTCCCCTTTTTCC	SEQ ID NO：8
BIP-2	GATGCCACGAATTTCACTCCGCAAGCTGGTCTAGCAAGATGG	SEQ ID NO：9
			F3-3	ACCCAATATCCCCTCCGG	SEQ ID NO：10
B3-3	TGTACATGGGATAAGCAGCAG	SEQ ID NO：11
			FIP-3	TGGGGGCTATTATAGCCTGAGCAGCCAGAAATCGCTCCACA	SEQ ID NO：12
BIP-3	CTCGTAAGCGCACGCCTCAGCAGAGGTGTTGCCAGATG	SEQ ID NO：13
			VCV-CP-F	GATCAAAAGAGTAACAGTCCTTG	SEQ ID NO：14
VCV-CP-R	ACTATTCTGATCAGAATAACTATC	SEQ ID NO：15

3、VCV阳性载体构建

取花叶皱缩症状明显的蚕豆样品100mg，加入带有小钢珠的离心管中，快速放入液氮后利用植物组织研磨仪将样品研磨至粉末状，使用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒提取蚕豆叶片的总RNA。

对蚕豆病叶的总RNA进行提取后，用cDNA第一链合成预混试剂盒进行cDNA第一条链的合成。以cDNA为模板，利用VCV特异性引物VCV-CP-F和VCV-CP-R对cDNA进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包括PCR Master Mix 11μL，上下游引物各1μL，cDNA 2μL，ddH2O 10μL，设定PCR程序为：95℃3min，95℃15s，56℃15s，72℃90s，试验进行34个循环，72℃延伸10min。反应结束后，用琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，扩增得到的PCR片段长度为1600bp左右；将目的条带用DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化，回收产物与pclone-007克隆载体在室温下进行连接1-5min后，转入DH5α菌株的感受态细胞。感受态细胞在LB液体培养基中培养1h后，均匀涂在固体培养基上进行过夜培养12-16h。挑取单菌落，加入10μL的ddH2O后吸打混匀，取1μL菌液为模板进行PCR鉴定。将阳性样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，之后提取重组质粒DNA于-20℃冰箱保存备用。

4、RT-Lamp反应引物特异性实验

参考Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒推荐体系：2×反应缓冲液(Tris-HCL40mM，KCL 20mM，MgSO₄ 16mM，(NH₄)₂SO₄ 20mM，Tween200.2％，Betaine 1.6M，dNTPs 2.8mM)12.5μL，F3/B3(F3-1/B3-1或F3-2/B3-2或F3-3/B3-3)5μM各1μL，FIP/BIP(FIP-1/BIP-1或FIP-2/BIP-2或FIP-3/BIP-3)40μM各1μL，荧光目视检测试剂(钙黄绿素)1μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL，ddH2O 4.5μL，重组质粒DNA 2μL。反应温度为63℃，反应时间为60min，反应结束后80℃、2min灭活Bst DNA聚合酶。

将设计好的3组引物组分别加入反应体系中，反应后观察颜色变化情况和荧光情况，白场时橙色为阴性，绿色为阳性；紫外下无荧光为阴性，出现荧光为阳性。选择颜色变化明显的引物用于后续实验。如图1所示，利用说明书推荐的体系对设计的3组引物组(P1～P3组)进行筛选，P1组包括F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1，P2组包括F3-2、B3-2、FIP-2、BIP-2，P3组包括F3-3、B3-3、FIP-3、BIP-3，反应结果由钙黄绿素进行染色后于紫外下观察荧光情况，发现P1组和P3组溶液变浑浊，白场为绿色，紫外下产生绿色荧光，说明P1组合P3租都可以进行LAMP扩增，但是P1组的空白对照产生微弱反应，故选P3组作为体系优化的引物。

5、RT-Lamp反应体系优化

为了获得最佳的反应结果，对反应温度，扩增时间进行了优化，每个因子设置3个重复试验。反应温度分别设置为60、61、62、63、64和65℃，反应时间分别设置为15、25、35、45和55min，根据试验结果筛选出最佳的反应条件。

扩增温度和时间优化试验结果见图2和图3，设置扩增时间为45min，考虑到BstDNA聚合酶的最佳反应温度为65℃，于是设置6个温度梯度，当扩增温度为60、61、62、63、64和65℃时均可获得条带清晰的梯状扩增条带，但是60℃时条带不清晰，荧光较弱，因此选择61℃作为LAMP反应的最佳反应温度。扩增时间优化试验中，扩增温度均为61℃，发现在25min时反应溶液开始变色，35min时颜色变化明显，随着时间继续延长，溶液在紫外下的亮度并未发生任何变化，故选择35min为最佳反应时间。

6、RT-Lamp与RT-PCR灵敏度比较

利用质粒DNA提取试剂盒提取重组质粒DNA，用超微量分光光度计测定所提取的质粒核酸浓度。取1μL进行10倍梯度稀释：10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8。以各稀释浓度质粒核酸为模板，分别应用RT-LAMP和普通RT-PCR体系检测。

所得质粒模板初始浓度为80.3μg·μL^-1，经过梯度稀释后，在相同的反应条件下，分别使用RT-LAMP和RT-PCR进行扩增，进行灵敏度比较分析，结果如图4所示。当模板稀释至10^-4时，模板浓度为803pg·μL^-1，RT-LAMP扩增条带开始变的微弱，模板稀释至10^-5倍时条带非常微弱，10^-6时未见任何扩增条带。RT-LAMP扩增结果在白场观察时与RT-PCR基本一致，模板稀释至10^-6倍时溶液变为橙色，但是在紫外下出现微弱荧光，证明RT-LAMP技术比RT-PCR更为灵敏。

7、RT-Lamp特异性试验

分别从大豆样品中提取纯化后的大豆花叶病毒(soybean mosaic virus，SMV)，菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus，BCMV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellowmosaic virus，BYMV)。对这三种病毒和VCV进行LAMP检测，以无菌双蒸水为阴性对照，通过观察LAMP产物颜色判定扩增结果。

特异性检测结果显示，在添加P3组引物后，只有VCV显阳性，在钙黄绿素染色下产生荧光，在羟基萘酚蓝染色时溶液由紫色变成蓝色，其他病毒颜色无明显变化呈阴性，说明该引物无法与其他病毒序列结合，本研究建立的LAMP检测方法具特异性，仅能检出野豌豆潜隐病毒。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种野豌豆潜隐病毒的CP基因及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1611

<212> DNA

<213> 野豌豆潜隐病毒的CP基因(Vicia cryptic virus)

<400> 1

gatcaaagag taacagtcct tgtaccaact tttcacaatc aaaatagaac gcgaatcttg 60

actgctctac ctcaactttt tacttacttt aacgttgttt atcaaccgtc cctctcaatg 120

gaagctcata ctcccgctgc tgatgtcaat ggacccaata tcccctccgg tgctgtctct 180

cagccagaaa tcgctccaca caatcaagct gctcccaacg tctctggtgc tgctcaggct 240

ataatagccc ccacccctgc tcgtaagcgc acgcctcacg gacccattcc tgctgccacc 300

tcatctggca acacctctgc tcctgctctc ctggaattag ctgctgctta tcccatgtac 360

accgagcaac gccgttcatt caactttttc atcccagact cccaaatgat gtttcactct 420

ttaggtatct gcgactcaat gatgaactcc actgatcgtt ttcttcgatc ctcacccgct 480

tggctcccca tcgtttcaca actttacatc tctgtactgt ggaatgttat gattatccgc 540

atcctctctc acactggata tgccccttcc ttcaccgatc tactcaatac tctcactact 600

gaccttcaaa ttgaagagtg tatggtcccc ggaccactag tccccttttt ccaatccttg 660

gcctctatca atggcccttt tgactggata ggcgatatca ctcctgccct ccctggattt 720

gattctctct gggatgccac gaatttcact ccgcacgcaa gctacacccg cttcgtcccc 780

attcctgcca tcttgctaga ccagctttac tactgcgcga cttacgtcgg cgttaatcaa 840

ggcgacctct accctacctt cacttggtat agaaacattt tcacccgcac tggtgcaaac 900

actcctgctc tcctccgcat gggcccaaat ctttgtggct cacttttcac cacctctaat 960

caattcgatg ctgcccgtac ttattggcgc gcctgctttg gcactggttt tacccgtgtt 1020

aatgtcaccg ctgctgcctt cactgactac ctacagctgt taggtctccg ttcccaaact 1080

ggagaaccac agactgcctg gttccagaat gtgaccatgg ttatgcaaaa atatgcacaa 1140

cacttcaatg gttccgttcc cctcaagagt atcgacctca ctggcattgg cgccgtcgcc 1200

cttaccggca caccagttaa taacactgct gtccgcgact ggctctaccc tccaaatgcc 1260

aatatcgaac cgttcaccac tggtcgattc aaccctcgtc gtgaaatccc ggcccaactc 1320

cgcgtccgct tttctcactc cgatcatgaa ctcgaactcc aagctgaaca gtacgctatt 1380

gctgcgcaca ccaacattag gtgggctgct aacatagctg cacaacatga aaggaccgcc 1440

atcaatccgg ctcatcttca ccaaggtgac tactggaaca tgaccccttt ccgtcacacc 1500

ggacatctcg gcctcaagac tcagtatgcc cagctcatcg cttctcgcta tcaccaactt 1560

gccgccaacc gtgtcgactg acaacctctg acctagaagt caataactct a 1611

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> F3-1(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaacagtac gctattgctg c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> B3-1(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtgatagcg agaagcgatg 20

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> FIP-1(Artificial Sequence)

<400> 4

cggattgatg gcggtccttt catcacacca acattaggtg ggc 43

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> BIP-1(Artificial Sequence)

<400> 5

tactggaaca tgaccccttt ccgagctggg catactgagt ctt 43

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> F3-2(Artificial Sequence)

<400> 6

tgaagagtgt atggtccccg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> B3-2(Artificial Sequence)

<400> 7

gacgtaagtc gcgcagtag 19

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> FIP-2(Artificial Sequence)

<400> 8

gcctatccag tcaaaagggc cagaccacta gtcccctttt tcc 43

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> BIP-2(Artificial Sequence)

<400> 9

gatgccacga atttcactcc gcaagctggt ctagcaagat gg 42

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> F3-3(Artificial Sequence)

<400> 10

acccaatatc ccctccgg 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> B3-3(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtacatggg ataagcagca g 21

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> FIP-3(Artificial Sequence)

<400> 12

tgggggctat tatagcctga gcagccagaa atcgctccac a 41

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> BIP-3(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcgtaagcg cacgcctcag cagaggtgtt gccagatg 38

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> VCV-CP-F(Artificial Sequence)

<400> 14

gatcaaaaga gtaacagtcc ttg 23

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> VCV-CP-R(Artificial Sequence)

<400> 15

actattctga tcagaataac tatc 24

Claims

1.检测野豌豆潜隐病毒的CP基因的引物组，其特征在于，所述引物组包括内引物对和外引物对，所述内引物对序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示，所述外引物对序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。

2.一种野豌豆潜隐病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括反应缓冲液、荧光目视检测试剂、Bst DNA聚合酶、阴性对照和阳性对照。

4.一种非诊断目的的野豌豆潜隐病毒检测方法，其特征在于，所述检测方法包括使用权利要求1所述的引物组进行一步法环介导等温扩增反应。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的反应温度为60~65℃，反应时间为15~55min。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的反应体系为2×反应缓冲液12.5μL，内引物对5μM各1μL，外引物对40μM 各1μL，荧光目视检测试剂1μL，Bst DNA聚合酶 1μL，ddH2O 4.5μL，重组质粒DNA 2μL。