CN102787176A - 实时荧光定量rt-pcr定量检测南方水稻黑条矮缩病植株中病毒rna拷贝数 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种水稻植株上南方水稻黑条矮缩病毒的检测及RNA拷贝数的准确定量方法。利用这一方法可以排除水稻黑条矮缩病的干扰，快速得到南方水稻黑条矮缩病毒植株样品中病毒RNA的拷贝数，进而为SRBSDV的致病机制、分子生物学研究等奠定了基础。
Description
技术领域：
本发明涉及水稻植株上南方水稻黑条矮缩病毒的检测及病毒RNA拷贝数的准确定量，属于农业科学技术领域。
背景技术：
南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组的一个建议新种。主要由白背飞虱(Sogatella furcifera)以持久性不经卵的方式传播，可侵染水稻、玉米等引起南方水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病。该病毒粒体球状，基因组由10条双链RNA组成。水稻各生育期均能够受到SRBSDV的浸染，田间症状主要表现为植株矮缩、叶色深绿、叶背及茎秆有初期乳白色、后期褐色的瘤状突起，拔节期病株茎节部数节产生倒生的气生须根及高节位分蘖，寄主除水稻外还包括玉米及多种杂草。对水稻的产量影响很大，重病田甚至可导致无产量。近年来该病在长江下游地区蔓延发生，且呈日渐严重的趋势，2009年南方水稻黑条矮缩病毒全国发生面积达300万亩，2010年迅速上升至1900万亩，仅湖南省就发生近1000万亩，绝收面积8万亩，给水稻生产带来了巨大的损失。迫切需要建立可靠、准确的检测方法。
目前，植物病毒常用的检测方法有：生物学接种实验，血清学检测，电镜观察及分子方法检测。但由于SRBSDV与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)基因组序列同源性高，在田间症状、病毒粒体形态、大小及血清学等多方面特征非常相似，所以给其诊断及鉴定造成了 困难，而且传统方法存在耗时长、操作复杂及成本高等缺陷，PCR等分子方法的敏感性高，但只能进行半定量或得出“有或无”的结论，不能准确定量病毒RNA拷贝数，使得发病机制及SRBSDV的基础研究等受到了一定的限制。
Real time RT-PCR是一种简单有效的检测基因拷贝数的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃，可精确地判断病毒RNA的拷贝数，而且具有耗时少，灵敏性高、操作简便、安全经济等优点。SYBR Green I是一种双链DNA染料，与双链DNA结合后荧光强度明显增强，在扩增体系中加入该染料即可直接实时检测扩增产物。该染料没有特异性，不能识别特定的双链，对不同模板不需特别定制，不需要设计特异性很好的探针，通用性比较好。可以通过测定扩增产物的熔解曲线来正确区分特异性与非特异性。利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线后，只要获得未知样品的循环阈值(threshold cycle，CT值)，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。拥有常规PCR技术无法比拟的优点：特异性强，通过特异性引物或探针与靶标基因的特异性杂交来完成模板的鉴别，准确性很高，不易出现二聚体等非特异性产物；灵敏度更高，用能够产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，极大地提高了检测的灵敏度；精确性好，可以利用指数期的CT值精确定量起始模板量，还可以检测到单拷贝基因；快速、简便，扩增和检测在同一管内完成，不需要开盖进行电泳检测，大大减少了操作、缩短了时间，避免了交叉污染、环境污染，有效地解决了PCR污染问题；自动化程度高，将光谱技术于计算机技术结合使用，扩增和检测是同步完成，通过计算机进行实时检测，而且操作系统封闭。实时荧光定量PCR技术正在越来越广泛的应用到科学研究的各个领域。
发明内容：
本发明提供了一种检测并准确定量水稻病株中南方水稻黑条矮缩病毒的方法，通过该方法可以排除水稻黑条矮缩病毒的干扰，快速诊断出水稻植株中是否携带南方水稻黑条矮缩病毒并得到病毒RNA的拷贝数。
本发明所提供的一种快速检测并定量水稻植株中南方水稻黑条矮缩病毒的方法，是通过以下方法获得的：
1)根据NCBI已报道的南方水稻黑条矮缩病毒S9核苷酸序列，通过软件DNAstar分析后选择相对保守区域(尤其是与RBSDV相比)，利用EU523359.1上的对应区域通过Primer5设计引物，选择最佳的2条引物SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R；
2) 
Reagent(Invitrogen)提取水稻病株总RNA；
3)以提取的水稻病株总RNA为模板，SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R为引物进行RT-PCR获得目的基因，割胶回收SRBSDV S9目的片段(141bp)，将其连接pGEM-T easy构建克隆载体，再将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α，筛选、鉴定获得阳性克隆，提取并纯化重组质粒，经RT-PCR和BlAST分析再次鉴定重组质粒，至此获得含有目的片段的重组质粒。
4)以限制性内切酶Sal I对阳性重组质粒DNA进行单酶切，回收纯化获得线状质粒DNA，以含有目的片段的线状质粒DNA为模板，根据T7Transcription Kit(Fermentas)的说明进行体外转录获得线状RNA，根据体外转录纯化试剂盒EZ-10Spin Column5 Minutes RNA Cleanup&Concentration Kit的说明纯化体外转录的RNA，得到RNA标准品；
5)参照试剂盒iScriptTM One-Step RT-PCR Kit With SYBR Green(BIO-RAD)的要求，以得到RNA标准品为模板，对引物SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R 的浓度以5×5矩阵形式(上、下游引物终浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)进行优化，确定最佳反应体系；在55-65℃范围内对退火-延伸进行优化，确定最佳反应条件，结果数据通过软件IQ5 Optical System Software Version 2.0分析；
6)计算标准品RNA拷贝数，用Nuclease-free water进行10倍梯度稀释(2.5×1010-2.5×104copies/μL)，用优化得到SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR最佳反应体系和条件进行扩增反应，得到各自的CT值，利用随机软件分析得到定量曲线和标准曲线，标准曲线中初始模板拷贝数的对数值为横坐标(x轴)、对应的CT值为纵坐标(y轴)；
7)Real time RT-PCR扩增结束后，从55℃到95℃，每隔0.5℃(80个循环)测定扩增产物的吸光值，利用随机软件分析得到熔解曲线，判断该方法的特异性。
8)与RT-PCR方法进行比较，验证SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR的灵敏性。
本发明提供的引物序列如下：
SRBSDV-S9-F GAGACCCACCTCCACTGATT
SRBSDV-S9-R ACGTTTACCACTGCGCCTTC
SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR反应体系中引物SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R的浓度都为300nM时扩增效果最佳，退火-延伸温度为60.0℃最合适。依据建立的标准曲线可以准确定量田间水稻病株样品中SRBSDV RNA拷贝数，通过分析扩增产物的溶解曲线可以判定该方法的特异性。
一种检测并定量植株中南方水稻黑条矮缩病毒RNA拷贝数方法的应用包 括：在水稻和玉米等疑似病株的快速诊断与定量。
利用这一方法可以快速得到南方水稻黑条矮缩病毒植株样品中SRBSDVRNA拷贝数，为该病毒病的发病机制及SRBSDV的基础研究等提供了支持。
附图说明：
图1引物浓度优化(1，SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R终浓度均为300nM；2，SRBSDV-S9-F终浓度400nM和SRBSDV-S9-R终浓度300nM；3，SRBSDV-S9-F终浓度500nM和SRBSDV-S9-R终浓度300nM)。
图2温度梯度优化(1，56.4℃；2，60.0℃；3，57.9℃；4，55.4℃；5，63.1℃；6，65.3℃)。
图310倍系列稀释RNA标准品荧光定量曲线(由左至右依次为2.5×1010，2.5×109，2.5×108，2.5×107，2.5×106，2.5×105，2.5×104copies/μL的RNA标准品)。
图4以10倍系列梯度稀释RNA标准品获得的标准曲线(2.5×1010copies/μL-2.5×104copies/μL)。
图510倍系列稀释RNA标准品的熔解曲线。
具体实施方法：
实施例1，体外转录与纯化制备RNA标准品
选择合适的限制性内切酶Sal I，按照表1依次加入试剂，37℃8h，对阳性重组质粒DNA进行单酶切。
表1限制性内切酶分析体系
Table1 The system of restriction enzyme analysis
单酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳，按照AxyPrep DNA Gel Extration Kit (Axygen)的回收纯化说明书进行回收获得线状质粒DNA。
以线状质粒DNA为模板，SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R为引物进行PCR鉴定线状质粒DNA，常规PCR体系(25μL)，扩增条件：首先，在95℃预变性5min，接着在以下条件下进行35个循环：95℃变性45s，57-60℃退火45s，72℃延伸30s，在最后一个循环结束后，72℃保温10min，取2μL PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳检测。
以含有目的片段的线状质粒DNA为模板，根据T7 Transcription Kit(Fermentas)的说明进行体外转录获得线状RNA。
(1)按照表2顺序依次加入试剂，完全混匀，稍作离心，37℃2h，即为转录产物；
表2体外转录
Table2 In vitro transcription
(2)向转录产物RNA中加入2μL无RNA酶的DNase I(2U/μL，Fermentas)，混匀，37℃15min，消化转录产物中未被转录的DNA；
(3)加入2μL EDTA(50mM)，混匀，65℃作用10min灭活DNase I的活性。
根据体外转录纯化试剂盒EZ-10 Spin Column5 Minutes RNA Cleanup&Concentration Kit的说明纯化体外转录的RNA，得到RNA标准品。
(1)将500μL Solution A加入体外转录获得的55μL RNA溶液中，混匀；
(2)将混合物转移到RNA制备管(置于2mL离心管上)中，室温下，12,000rpm离心30s，弃上清；
(3)加入700μL RNA Wash Sloution，室温下，12,000rpm离心30s，弃液体；
(4)室温下，10000rpm离心2min，去除残留的RNAWash Sloution；
(5)将制备管转移到新的RNase-free离心管中，加60μL RNA Elution Buffer，室温静置2min；
(6)12,000rpm离心1min，得到的就是RNA标准品，保存在-70℃备用。
用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪测定RNA标准品的浓度和OD值，根据下面的公式计算拷贝数(Santhosh et al.，2007)。将转录获得的标准RNA用0.1％DEPC处理水做10倍梯度稀释，用于灵敏性测定和标准曲线的建立。
实施例2，南方水稻黑条矮缩病毒SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR反应条件的优化
南方水稻黑条矮缩病毒SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR反应体系和反应条件的优化
为了获得最佳反应体系和参数，按照试剂盒iScriptTM One-Step RT-PCR Kit With SYBR Green(BIO-RAD)的要求进行，具体步骤如下：
(1)取荧光定量PCR专用管，加入表3中的试剂，轻轻混匀；
(2)封好透光膜，用刮板将膜压紧；
表3实时荧光定量RT-PCR的反应体系
Table3 The system of real time RT-PCR
(3)在Bio-Rad IQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System上进行扩增反应。首先，50℃10min来合成cDNA，95℃5min灭活反转录酶的活性；接着进行40个PCR循环：95℃10s，60℃10s(此时收集信号)；95℃1min，55℃1min，然后在55-95℃进行80个循环，每间隔0.5℃一个循环，一个循环时间为10s；
(4)反应完成后，通过软件IQ5 Optical System Software Version 2.0分析数据。
对退火-延伸温度进行优化，在55-65℃范围内对退火-延伸进行优化。
对引物浓度进行优化，在相同标准品RNA模板浓度下，对上、下游引物浓度以5×5矩阵形式(上、下游引物终浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM和500nM)进行优化。
引物浓度优化实验的扩增曲线如图1，可以看出上游引物SRBSDV-S9-F的浓度分别为300nM、400nM、500nM，下游引物SRBSDV-S9-R浓度为300nM时定量曲线的CT值以及荧光值较合适，其中引物浓度都为300nM时扩增结果最好。
退火-延伸温度优化实验结果显示(图2)，退火-延伸温度在56.4℃、57.9℃及60.0℃时，定量曲线的CT值基本相同且较小，达到平台期的时间较早而且 荧光值相对较高，鉴于过低的退火温度易产生非特异性扩增产物，所以退火-延伸温度为60.0℃最合适。
通过优化得到的20μL反应体系为：2×SYBR Green RT-PCR reaction mix 10μL，SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R各0.6μL(10μM)，iscript reverse transcriptase for one-step RT-PCR 0.4μL，模板RNA2μL，最终由nuclease-free water补足20μL。最佳反应条件为50℃反转录10min；95℃5min灭活反转录酶；接着进入40个循环：95℃10s，60℃30s；然后95℃1min，55℃1min，接着55-95℃每10s升高0.5℃，获得扩增产物的熔解曲线。
实施例3，南方水稻黑条矮缩病毒SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR标准曲线的建立
按实施例2中计算的拷贝数，将标准品RNA用Nuclease-free water进行10倍梯度稀释(2.5×1010-2.5×104copies/μL)，以这组标准品为模板用实施例2优化得到最佳反应体系和条件进行反应，得到各自的CT值，利用随机软件分析得到扩增曲线和标准曲线，标准曲线中初始模板拷贝数的对数值为横坐标(x轴)、对应的CT值为纵坐标(y轴)。结果显示，各个稀释梯度的RNA标准品在第一个扩增循环结束后测到一个基础吸光值，接下来直到第4个循环环结束时都没有发生明显变化。从第5个循环开始2.5×1010copies/μLRNA标准品的吸光值开始增大，定量曲线开始抬头，第7个循环(CT值)后定量曲线迅速上扬，至第25个循环前后达到峰值，随后进入平台期，一直到反应结束，定量曲线呈典型的S型。2.5×109-2.5×104copies/μL RNA标准品定量曲线的变化趋势与此相同，只是曲线抬头的位置(CT值)随浓度降低而依次错后3到4个循环，它们的CT值依次为7，10.5、14、18、21、24、27，显示为一组斜率相同，间距相等的平行曲线(如图3)。
标准曲线显示(图4)所有RNA标准品的CT值基本在一条直线上，没有任何一个标准品出现大的偏差。本图中标准曲线的扩增效率E＝100.2％；决定系数(R2)大于0.98，为0.996，斜率是-3.317，计算公式为y＝-3.317x+30.659，可以通过这个公式计算获得未知样品中SRBSDV RNA的准确拷贝数。
实施例4，南方水稻黑条矮缩病毒SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR熔解曲线的测定
按实施例2中的条件获得扩增产物的熔解曲线，图5显示扩增产物的熔解温度Tm都在78℃，单峰、峰尖且窄，说明所设引物特异性好，扩增产物单一，没有引物二聚体及非特异性扩增产物的产生。
上述实施不以任何形式限定本发明。
Claims (1)
1.一种准确检测并定量植株上南方水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于：利用SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR反应的特异性引物，以提取的水稻病毒总RNA为模板进行扩增反应，反应完成后通过软件分析数据，该方法可以排除水稻黑条矮缩病的干扰，准确鉴定出南方水稻黑条矮缩病毒植株中的病毒，并同时获得SRBSDV RNA的准确拷贝数。
上述“SYBR Green I-based one-step real time RT-PCR反应的特异性引物”是指以下2条引物：
SRBSDV-S9-F GAGACCCACCTCCACTGATT
SRBSDV-S9-R ACGTTTACCACTGCGCCTTC 。
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