CN112661715A

CN112661715A - 一类柞蚕空胴病防治化合物及使用方法

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Publication number: CN112661715A
Application number: CN202011516922.XA
Authority: CN
Inventors: 牛雄雷; 杨金琛; 刘铁成; 陈有嗣; 赫英姿; 刘洪丽; 王立石; 曾航
Original assignee: Liaoning Fenghuang Silkworm Drug Factory; SERICULTURAL RESEARCH INSTITUTE OF LIAONING
Current assignee: Liaoning Fenghuang Silkworm Drug Factory; SERICULTURAL RESEARCH INSTITUTE OF LIAONING
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112661715B

Abstract

本发明提供了一类基于苯并异噻唑啉酮衍生物结构的柞蚕空胴病防治化合物及其使用方法。本发明所述的苯并异噻唑啉酮衍生物既具有体外抑菌活性，又具有蚕体内治疗活性，对柞蚕相对安全，可用于蚕业生产。

Description

一类柞蚕空胴病防治化合物及使用方法

技术领域

本发明涉及兽药领域，具体涉及柞蚕空胴病的防治领域。

背景技术

柞蚕空胴病是又称软化病，俗称“稀屎腚”，是危害柞蚕的主要细菌性病害之一。该病害由柞蚕链球菌(Streptocouccus pernyi sp.Nov.)感染而寄生柞蚕中肠引起。文献表明，除了感染柞蚕，柞蚕链球菌可感染天幕毛虫、栎粉舟蛾、黄二星舟蛾等21种柞园昆虫的幼虫，其被感染的幼虫排泄物及死亡幼虫尸体均携带柞蚕链球菌，均可感染柞蚕。因此，该病害分布广泛，在我国柞蚕产区均有发生，其中辽宁省蚕区每年一般发病率为30％～40％，重者可达70％，甚至造成绝收。

对于柞蚕链球菌的防治，现行方法主要通过消毒剂来预防细菌性病害的卵面传染，而柞蚕幼虫期在柞园经口食下传染一直未得到有效控制，缺乏相应的治疗药剂。近年，柞蚕空胴病发生频繁，日趋严重，蚕业生产亟待开发一种具有兼具预防和治疗意义的柞蚕链球菌防治用药。

有报道表明，异噻唑啉酮(MIT，CMIT)对家蚕体内细菌具有一定防治作用，但尚未生产应用。有资料显示，异噻唑啉酮(MIT，CMIT)在pH介于3-8.5时结构稳定。资料表明，家蚕中肠内呈碱性，pH低于9；而资料表明，柞蚕中肠内碱性更强，pH达到9以上，因此我们选择在较强碱性下仍能稳定存在的苯并异噻唑啉酮(Benzisothiazolinone以下简称BIT，其在pH介于3～12结构稳定)进行柞蚕空胴病防治研究，结果表明，BIT直接应用于蚕体内防治柞蚕链球菌效果并不理想(防效<80％)(见实施例7，表5)，尽管其柞蚕体外柞蚕链球菌防治活性可达99％以上(见实施例5，表3)。以BIT为母药，进行多类衍生物设计合成和柞蚕链球菌防治活性筛选，发现本发明权利要求1通式化合物中的部分化合物表现出优异的柞蚕体内链球菌防治活性，以下将阐述本发明相关结果。

发明内容

本发明的目的是提供一类基于BIT羟甲基酯化衍生物结构的柞蚕饰空胴病防治化合物及其使用方法。

本发明采用衍生合成方法制备BIT羟甲基酯化衍生物衍生物，然后将其制成分散剂，测定其对柞蚕链球菌的离体抑菌活性(预防效果高于95％)，然后测定其对柞蚕体内的柞蚕链球菌防治活性，筛选出体内治疗活性高(防效不低于80％)的化合物。

一类柞蚕空胴病防治化合物，为具有如下结构通式化合物中的一种或二种以上：

式中：R代表下述中的一种：

烷基：1～7个碳原子的直链或支链烷烃；

苯环上有取代的芳烃基：苯环的2-和/或4-位分别存在CH₃或F或Cl或CH₃O或NO₂。

所述化合物优选为：R为1～5个碳原子的直链或支链烷烃基所对应的化合物中的一种或二种以上。

所述化合物在预防和/或治疗柞蚕空胴病中的应用。

所述化合物中的一种或二种以上制备成分散剂，加水稀释至化合物有效含量为50～2000mg/L，以叶面添食方式给药防治柞蚕体内柞蚕链球菌。

所述化合物中的一种或二种以上的有效含量为100～1000mg/L水稀释液喷施于柞树叶面，柞树叶作为柞蚕食物，保证柞蚕取食含药树叶2天以上。

本发明的主要优点是：

1、本发明所述柞蚕链球菌防治化合物不仅可对柞蚕体外的柞蚕链球菌起到杀灭作用，离体杀菌防效≥95％，还可对柞蚕体内的柞蚕链球菌起到杀灭作用，体内防效≥80％，具有蚕业生产应用价值。

2、本发明所述柞蚕链球菌防治化合物对柞蚕安全，对柞蚕生长发育无不良影响。

3、该药剂性质温和，使用过程相对传统药剂甲醛或者有机氯氧化剂对人体更加友好，对施药器械无腐蚀作用。

4、该药剂作为BIT衍生物，具有与BIT相似的绿色环保属性，易于生物降解，环境友好。

本发明所述的BIT羟甲基酯化衍生物对柞蚕链球菌兼具预防与治疗效果，而且对柞蚕相对安全，可应用于柞蚕生产。

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但应当理解为并非进一步限制本发明。所述的化合物合成收率均未进行合成优化；熔点检测所用温度计未进行温度校正。

具体实施方式

实施例1化合物的制备方法

化合物BZ1的合成：

(1)BIT羟甲基化中间体制备：将BIT 0.050mol，0.055mol多聚甲醛(以甲醛计)，0.15mL三乙胺，HCCl₃ 50mL加入带冷凝管和磁力搅拌的100mL三口烧瓶中，油浴加热升温至70℃回流反应5h，停止反应，旋转蒸发脱除溶剂，固体用乙醇重结晶后置于红外灯下干燥，得到7.2g BIT羟甲基化中间体，收率79％，熔点145～148℃。

(2)将BIT羟甲基化中间体0.010mol,干燥处理过的丙酮45mL,三乙胺0.011mol置于带冷凝管和磁力搅拌的100mL三口烧瓶中，冰水浴搅拌下，用恒压漏斗滴加5mL丙酮稀释的0.011mol的乙酰氯于三口瓶中，待体系中烟雾消失，换油浴升温至65℃回流反应过夜，停止反应，反应液体吸附于活化硅胶，除去丙酮，采用干法装柱，经柱层析(V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝4：1)得到1.65g产品，收率74％，熔点122～129℃，采用Bruker AvanceⅢ400进行¹HNMR测试，确认其结构(化合物编号BZ1，¹H-NMR数据见表2)。

按照上述实施例1相似方法(过程和条件相同)，可制备表1中其它所有化合物；与实施例1不同的是：反应时将原料乙酰氯分别替换为丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、苯甲酰氯、4-氟苯甲酰氯、2-氟苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯，依次编号为BZ2～11。

表1供试BIT羟甲基酯化衍生物(BZ1～11)

实施例2化合物的乳油分散剂制备

以化合物BZ1为例制备化合物的乳油分散剂，用于柞蚕体内抑菌活性(或者说，柞蚕空胴病治疗活性)测定。

按照计算配比，将5.05g化合物Z1(纯度以99％计算)溶解于89.95g溶剂甲基异丁酮(MIK)，再加入5.00g吐温-80，高速搅拌0.5h，制成化合物BZ1质量浓度为5.00％的均匀乳油，使用时加无菌水稀释至所需浓度。

其余化合物分别采用上述相同过程制备成化合物的乳油分散剂。

实施例3化合物的DMSO溶液剂制备

以化合物BZ1为例制备化合物的DMSO溶液剂，用于离体柞蚕链球菌抑菌活性测定(或者说，柞蚕体外抑菌活性测定)。

称取50.00mg BZ1，转移至10mL容量瓶，加入DMSO溶剂，定容至10mL，得到5000mg/L的母液。采用5mL移液管，量取母液2mL，加入10mL容量瓶，DMSO定容至10mL得到1000mg/L的溶液，如此逐级稀释，得到BZ1使用浓度为1000mg/L、500mg/L、250mg/L、125mg/L、62.5mg/L、31.25mg/L的DMSO溶液，置于冰箱中冷藏备用。

其余化合物分别采用上述相同过程制备成化合物的DMSO溶液剂。

实施例4BIT酰胺衍生物的制备、乳油制备与DMSO溶液制备

以XA1为例，制备BIT乙酰化产物。

称取10.08g BIT(0.067mol)，置于配备搅拌磁子、温度计和冷凝器的100mL三口瓶，向三口瓶中加入45mL二氯甲烷、9.0g无水吡啶，冰水浴搅拌下，用恒压滴加器滴加7.13g乙酰氯(0.090mol)与5mL的二氯甲烷混合溶液，半小时滴加完毕，然后室温反应1h。反应结束将反应混合液倒入分液漏斗中，采用60mL蒸馏水洗涤3次，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏脱除溶剂，得到白色固体，测定熔点，采用¹H NMR测试，化合物编号为XA1，数据见表2。

按照上述实施例4相似方法(过程和条件相同)，可制备表2中所有化合物；与实施例4不同的是：反应时将原料乙酰氯分别替换为丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、苯甲酰氯、4-氟苯甲酰氯、2-氟苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯，依次编号为XA2～11。

表2供试BIT酰胺衍生物(XA1～11)

XA1～11化合物的乳油与DMSO溶液分别采用实施例2与实施例3所述方法制备。

实施例5：化合物柞蚕体外抑菌活性——涂平板数菌落法测定法

取5ml离心管，将3200μL液体培养基(组成以1000ml为例，蔗糖20g、蛋白胨20g、氯化钠5g、牛肉粉5g，加蒸馏水至1000ml，用氢氧化钠调节PH＝9，121℃湿热灭菌30min)中加入400μL菌液、400μL不同浓度(500mg/L、250mg/L、125mg/L、62.50mg/L、31.25mg/L、15.625mg/L)的化合物(见表1，表2)DMSO溶液，在漩涡混匀仪上混合均匀，柞蚕链球菌的终浓度为1.8×10⁷CFU/ml；加样操作在2h内完成，以上混合液在振荡培养箱中37℃、130r/min条件下培养24h。培养结束后将混合液分别逐级稀释至1000倍(V/V)，用移液器取1000倍稀释液100μL涂平板(固体培养基组成以1000ml为例，蔗糖20g、蛋白胨20g、氯化钠5g、牛肉粉5g，加蒸馏水至1000ml，用氢氧化钠调节PH＝9，琼脂20g，121℃湿热灭菌30min。较液体培养基比其中含有终质量浓度2％琼脂)，涂菌平板置于培养箱中37℃下培养24h后取出查数菌落个数。空白对照CK即将药液(培养后混合液的1000倍稀释液)替换为无菌水进行涂平板操作。药剂处理抑菌率计算公式：

测定结果表明，化合物使用浓度不低于62.5mg/L时，BZ1～11及XA1～11的抑菌效果均超过99％，无明显差异。当化合物浓度为31.25mg/L时，测定结果如表3所示，BZ1～11抑菌活性仍可达到96％以上，而XA1～4，XA6～8抑菌活性可达到96％以上，XA5，XA9～11四个化合物不能达到95％。结果说明：两类化合物在较高使用浓度(如62.5mg/L以上)时均有良好的抑菌活性；而使用浓度较低时，酯类衍生物抑菌活性总体表现好于相应的酰胺衍生物。

表3化合物使用浓度为31.25mg/L时酯类衍生物与酰胺衍生物的抑菌活性比较-涂平板法

注：空白对照菌落为3.0×10⁵个。ND：表明统计菌落>1500个后停止计数，活性未计算。

实施例6：化合物柞蚕体外抑菌活性——抑菌圈测定法

制备含菌平板(固体培养基组成以1000ml为例，蔗糖20g、蛋白胨20g、氯化钠5g、牛肉粉5g，加蒸馏水至1000ml，用氢氧化钠调节PH＝9，琼脂15g加热溶解)将培养基趁热分装到试管中，每试管12.5ml，封口后121℃湿热灭菌30min。灭菌后待培养基温度降至55℃时，每试管加入浓度为6.5×10⁶CFU/ml柞蚕链球菌液125μL，迅速震荡均匀后倒入90mm培养皿(每皿一次同时倒2只试管)冷却后制成含菌平板，于-4℃中冷藏备用。用无菌打孔器在每个含菌平板上均匀打9个孔：每孔加入5μL指定浓度的化合物DMSO溶液，平行测定3孔；按不同浓度，每个化合物设1000mg/L、500mg/L、250mg/L三个处理。加药后在室温下扩散2h，之后于37℃培养24h。培养结束后用游标卡尺测量抑菌圈直径。空白对照CK即将药液替换为DMSO。

由表4-1可知，化合物使用浓度为1000mg/L时，BIT抑菌圈直径达到12.56mm，酯类化合物BZ1～3抑菌圈直径略高于BIT，BZ4～6，BZ9的抑菌圈直径接近12mm，而酰胺类抑菌圈直径除了XA1(12.2mm)外，均低于10mm。

当化合物使用浓度降至500mg/L时(表4-2)，酯类衍生物抑菌圈仍然可测得，其中BZ1～4抑菌圈直径与BIT相当；而酰胺衍生物则有6个化合物抑菌圈消失。

以上说明表中化合物，酯类衍生物抑菌活性能力总体上高于酰胺类衍生物。

表4-1化合物使用浓度为1000mg/L时酯类衍生物与酰胺衍生物的抑菌活性比较-抑菌圈法

表4-2化合物使用浓度为500mg/L时酯类衍生物与酰胺衍生物的抑菌活性比较-抑菌圈法

实施例7：化合物柞蚕体内空胴病治疗效果测定-添食饲养试验方法

5月于辽宁凤城市室外，将柞蚕品种9906的无菌种卵置于柞树孵化，得到蚁蚕试虫，记作试虫A。室内，将新采摘的带叶树枝置于含水的海绵底座，将新培养分离提纯的链球菌加无菌水稀释至1×10⁸CFU/ml后，喷施上述柞叶，待叶面菌液晾干后将1～2日龄的蚁蚕分散于树叶，待柞蚕取食含菌树叶48h后得到添食柞蚕链球菌的蚁蚕试虫，记作试虫B。

药剂处理：每处理随机挑选试虫B 30头，置于单个养虫盒中；在喷壶中将实施例2或实施例4中制备的化合物乳油加无菌水稀释至相应浓度，喷施于柞树叶面至布满雾滴，0.5h内晾干后采摘加入养虫盒，由试虫取食48h以上，每处理设3次重复；每个化合物分别设置3个处理浓度(1000mg/L、500mg/L、250mg/L)。养虫盒中试虫经过一次药剂处理之后，放置不经药物处理的新鲜柞树叶饲养至四龄期。期间，跟踪标记，清除蚕沙和杂物，适时添食新鲜柞树叶，及时剔除发病或死亡试蚕，调查各处理剩余蚕数，累计空胴病发病或死亡蚕总数N，计算发病率。

对照处理：在单个养虫盒放置试虫B 30头，采用不经药剂处理的新鲜柞树叶喂养，设3次重复，作为空胴病毒对照CK-D；在养虫盒正常饲养试虫A 30头，采用不经药剂处理的新鲜柞树叶喂养，3次重复，作为空胴病空白对照CK-0。跟踪标记，清除蚕沙和杂物，适时添食新鲜柞树叶，及时剔除发病或死亡试蚕，饲养至四龄期，调查各处理剩余蚕数，累计空胴病发病或死亡蚕总数N。

空胴病发病率、防效计算公式如下：

空胴病发病率％＝N/30×100

由表5数据可知，化合物使用浓度为1000mg/L时，酯类衍生物BZ1～6，BZ9-11治疗活性不亚于对照BIT，其中BZ1～5活性达到80％以上，最高达到92％；而酰胺类衍生物的治疗活性较低，均低于20％。为避免冗余数据的显示，防效低于75％的化合物在低一级浓度试验结果中不再列出(对照药BIT除外)。

由表6可知，化合物使用浓度为500mg/L时，化合物BZ1～5仍高于75％，其中BZ1与BZ2高于80％，防效优于BIT(67.9％)。

由表7可知，化合物使用浓度为250mg/L时，化合物BZ1～5防效达到60％以上，防效优于BIT(50％)。

表5化合物使用浓度为1000mg/L时酯类衍生物与酰胺衍生物的柞蚕体内空胴病治疗效果比较

注：CK-0空胴病发病率＝10.0％；CK-D空胴病发病率＝93.3％。表6，表7同。

表6使用浓度为500mg/L时酯类衍生物的柞蚕体内空胴病治疗效果

化合物	抑菌活性/％
		BZ1	85.7
BZ2	82.1
		BZ3	78.6
BZ4	78.6
		BZ5	77.8
BZ6	64.3
		BZ9	50.0
BZ10	53.6
		BZ11	53.6
CKY(BIT)	67.9

表7使用浓度为250mg/L时酯类衍生物柞蚕体内空胴病治疗效果

实施例8蚕体生长发育调查

在实施例7中，采用药剂BZ1，BZ2，BZ3，BZ4，BZ5的1000mg/L处理和空白处理所得试蚕，依次记作1000mg/L-BZ1～5、试虫A，每个处理机挑选25头四龄蚕,采用0.01g精度的天平称量其体重，统计分析，结果如下(表8)。各用药处理平均蚕体质量与空白处理没有显著差异(p<0.05)，说明该使用浓度下，药剂对蚕体生长无不良影响。

表8 1000mg/L药剂处理后蚕体质量统计表(n＝25)

试虫组别	平均质量
		1000mg/L-BZ1	3.67±0.086a
1000mg/L-BZ2	3.62±0.067a
		1000mg/L-BZ3	3.64±0.089a
1000mg/L-BZ4	3.61±0.076a
		1000mg/L-BZ5	3.63±0.068a
CK(试虫A)	3.61±0.062a

注：在p<0.05水平，相同字母代表差异不显著，不同字母代表差异显著。

Claims

1.一类柞蚕空胴病防治化合物，其特征在于，所述化合物为具有如下结构通式化合物中的一种或二种以上：

式中：R代表下述中的一种：

烷基：1～7个碳原子的直链或支链烷烃；

2.按照权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物优选为：

R为1～5个碳原子的直链或支链烷烃基所对应的化合物中的一种或二种以上。

3.一类预防和/或治疗柞蚕空胴病的药物，其以权利要求1或2所述化合物中的一种或二种以上为活性成份。

4.一类权利要求1或2所述化合物在预防和/或治疗柞蚕空胴病中的应用。

5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：其以权利要求1-2任一所述化合物中的一种或二种以上为活性成份，用于柞蚕空胴病的预防和/或治疗。

6.按照权利要求4或5所述的应用，其特征在于，将权利要求1-2任一所述化合物中的一种或二种以上制备成分散剂，加水稀释至化合物有效含量为50～2000mg/L，以叶面添食方式给药防治柞蚕体内柞蚕链球菌。

7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求1-2任一所述化合物中的一种或二种以上的有效含量为100～1000mg/L水稀释液喷施于柞树叶面，柞树叶作为柞蚕食物，保证柞蚕取食含药树叶2天以上。