CN112321711B - 抗体 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及抗CSF‑1R抗体及其结合片段，编码抗CSF‑1R抗体及其结合片段的DNA，包含所述DNA的宿主细胞以及在宿主细胞中表达所述抗体或结合片段的方法。本公开内容还扩展至包含所述抗体或其结合片段的药物组合物，以及所述抗体、结合片段和包含所述抗体、结合片段的组合物在治疗中的用途。

Description

抗体

本申请是CN201480057403.8的分案申请。

技术领域

本发明涉及抗CSF-1R抗体及其结合片段，编码抗CSF-1R抗体及其结合片段的DNA，包含所述DNA的宿主细胞以及在宿主细胞中表达所述抗体或结合片段的方法。本发明还扩展至包含所述抗体或其结合片段的药物组合物，以及所述抗体、结合片段和包含所述抗体、结合片段的组合物在治疗中的用途。

背景技术

集落刺激因子1(CSF-1)(也被称为巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF))是由各种细胞(包括巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞)产生的细胞因子。CSF-1包含两个“单体”多肽，这两个“单体”多肽形成生物学活性的二聚体CSF-1蛋白。由于RNA选择性剪接，CSF-1至少以三种成熟形式存在(参见Cerretti等人,1988,Molecular Immunology,25:761)。这三种形式的CSF-1翻译自不同rnRNA前体，其编码256至554个氨基酸的多肽单体，具有氨基端的32个氨基酸的信号序列和近羧基端的大约23个氨基酸的推定跨膜区。随后，前体肽通过氨基端和羧基端蛋白水解切割进行加工以释放成熟CSF-1。所有三种成熟形式的CSF-1的残基1-149是相同的且据信包含对于CSF-1的生物活性必需的序列。在体内，CSF-1单体是糖基化的，并通过二硫键发生二聚化。CSF-1属于一组生物学激动剂，其促进血细胞的产生。具体地，它用作单核吞噬细胞谱系的骨髓祖细胞的生长和分化因子。此外，CSF-1通过应答细胞上的特异性受体刺激巨噬细胞的存活、增殖和功能。

CSF-1受体(CSF-1R)也被称为c-fms基因产物或CD115。CSF-1R是165kDa的1型TM糖蛋白，其属于III型受体酪氨酸激酶家族。还已经显示，除了CSF-1之外，结构上相似但序列不相关的分子IL-34也是针对CSF-1R的配体(Lin等人，2008,Science 320:807-811)。CSF-1R的表达局限于单核细胞-巨噬细胞谱系(循环和驻留组织的群体)的细胞以及破骨细胞。此外，它表达于雌性生殖系统的许多细胞，包括卵母细胞、蜕膜细胞和滋养层细胞。

配体CSF-1与CSF-1受体的结合通过酪氨酸激酶结构域的作用导致受体在一个或多个酪氨酸残基上发生磷酸化。因为可以获得只结合磷酸化之后的受体的抗体，所以可以检测到这种磷酸化(例如来自Cell Signaling Technology的Phospho-M-CSF-Receptor(Tyr546)抗体#3083)。

CSF-1和CSF-1R的表达与许多癌症类型中的肿瘤进展和不良诊断相关联。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可以是肿瘤基质的主要组分并且CSF-1和CSF-1R的高水平与许多肿瘤类型中的高TAM浸润和不良预后相关。

抗CSF-1R的抗体是本领域已知的。Sherr,C.J.等人,1989,Blood 73:1786-1793描述了抑制CSF-1活性的抗CSF-1R的抗体(Sherr,C.J.等人,1989,Blood 73:1786-1793)。WO2009/026303公开了结合人CSF-1R的抗CSF-1R抗体和使用抗鼠CSF-1R抗体的体内小鼠肿瘤模型。WO2011/123381公开了内化CSF-1R并具有ADCC活性的抗CSF-1R抗体。WO2011/123381还公开了使用抗鼠CSF-1R抗体的体内小鼠肿瘤模型。WO2011/140249公开了阻断CSF-1与CSF-1R的结合的抗CSF-1R抗体，其被认为在治疗癌症中是有用的。WO2009/112245公开了抑制CSF-1结合CSF-1R的抗CSF-1R IgG1抗体，其被认为在治疗癌症、炎性肠病和类风湿性关节炎中是有用的。WO2011/131407公开了抑制CSF-1结合CSF-1R的抗CSF-1R抗体，其被认为在治疗骨丢失和癌症中是有用的。WO2011/107553公开了抑制CSF-1结合CSF-1R的抗CSF-1R抗体，其被认为在治疗骨丢失和癌症中是有用的。WO2011/070024公开了结合人CSF-1R片段delD4的抗CSF-1R抗体。

在本领域中存在提供适合用于治疗应用的新型抗CSF-1R抗体的需要。虽然先前已描述了抗CSF-1R抗体在治疗某些癌症中的治疗应用，但仍然存在提供这样的抗体的新型治疗应用的需要。

术语“纤维化疾病”是指异常伤口愈合反应，其中在器官或组织中形成过量的纤维结缔组织。过量的细胞外基质成分(诸如胶原和纤连蛋白)的沉积和累积导致组织的硬化和结疤，这最终可导致器官衰竭。

纤维化疾病的实例包括肺纤维化诸如特发性肺纤维化和囊性纤维化、肾纤维化、肝纤维化、肝硬化、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后腔纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、瘢痕疙瘩、心肌梗死、系统性硬化病、硬皮病以及关节纤维化。

创伤导致随着临时细胞外基质(ECM)的发展立即的凝固和凝血反应。血小板聚集和活化帮助促进特征在于血管舒张和血管通透性增加的炎性反应，从而募集各种免疫细胞(包括中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)。中性粒细胞和巨噬细胞对伤口进行清创，从而降低感染风险，并与活化的淋巴细胞一起分泌用于进一步放大炎性反应的各种生长因子和细胞因子。诸如TGFβ、PDGF、IL-13的分子活化巨噬细胞并导致成纤维细胞在伤口部位的募集、增殖和活化。活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞的特征在于表达α-平滑肌肌动蛋白和分泌胶原以及其它ECM成分。活化的成纤维细胞收缩胶原晶格(collagenlattice)，从而将伤口的边缘拉向中心。表皮和内皮细胞增殖并在临时基质上迁移以再生损伤的组织，从而完成伤口修复。

持续的组织伤害或损伤，或者修复途径的失调导致不适当的伤口反应。胶原和ECM的过量沉积和高度交联发生，从而导致代替正常组织结构的瘢痕组织的过度形成和硬化。

纤维化疾病的病因可以取决于所涉及的器官或组织并且在一些疾病(诸如特发性肺纤维化(IPF))中是未知的。肝纤维化和最终的肝硬化源自通过暴露于各种因素包括环境因素和饮食因素或感染原的持续慢性肝损伤。长期乙型肝炎或丙型肝炎感染可以导致肝纤维化。持续过度食用酒精或高脂/糖饮食也可以导致肝脏的硬化。类似地，糖尿病可能损伤肾脏并留下疤痕，导致功能丧失。

IPF为病因未知的七种间质性肺疾病之一。环境因素诸如辐射暴露或粒子可能发挥着作用。吸烟的受试者也处于患该疾病的较高风险。在诊断后，患者的寿命极短，平均存活率为2-5年。

纤维化疾病的治疗通常包括抗炎和免疫抑制剂，但是这些对患者益处较少。这些治疗的效力的缺乏使得通常将IPF和纤维化疾病重新考虑为对伤口愈合的异常应答而不是炎性病况。吡非尼酮是2008年在日本和2011年在欧洲被批准用于治疗IPF的小分子药物，其可能通过多重作用机制起作用。迄今为止，还没有靶向疗法和抗体疗法被批准用于纤维化适应证。

因此，目前存在未满足的对于纤维化疾病的改善治疗的医学需要。例如，对于IPF，3年存活率为50％而5年存活率仅为20％，并且在大约20％的病例中需要移植。

发明概述

在一个方面，提供了一种包含重链的抗CSF-1R抗体或其结合片段，其中重链的可变域包含具有针对于CDR-H1以SEQ ID NO：4所示的序列的CDR、具有针对于CDR-H2以SEQ IDNO：5所示的序列的CDR和具有针对于CDR-H3以SEQ ID NO：6所示的序列的CDR中的至少一种，例如，其中CDR-H1为SEQ ID NO：4，CDR-H2为SEQ ID NO：5以及CDR-H3为SEQ ID NO：6。

在一个方面，根据本公开内容的抗体或结合片段包含轻链，其中轻链的可变域包含具有针对于CDR-L1以SEQ ID NO：1所示的序列的CDR、具有针对于CDR-L2以SEQ ID NO：2所示的序列的CDR和具有针对于CDR-L3以SEQ ID NO：3所示的序列的CDR中的至少一种，例如，其中CDR-L1为SEQ ID NO：1，CDR-L2为SEQ ID NO：2以及CDR-L3为SEQ ID NO：3。

本公开内容的抗体对CSF-1R具有高亲和力、能够阻断配体与CSF-1R的结合、不活化CSF-1R并且不导致CSF-1R的内化。

本公开内容还扩展至编码如本文所述的抗体或片段的多核苷酸(诸如DNA)。

还提供了一种包含所述多核苷酸的宿主细胞。

本文还提供了表达抗体或其结合片段的方法。

本公开内容还涉及包含所述抗体或其结合片段的药物组合物。

在一个实施方案中，提供了一种治疗方法，其包括施用治疗有效量的如本文所述的抗体、片段或组合物。

本公开内容还扩展至将本公开内容的抗体、结合片段或组合物用于治疗，特别是用于治疗癌症和/或纤维化疾病。

发明详述

在一个实施方案中，由本发明提供的抗体能够阻断配体与CSF-1R结合。如本文中所用，阻断是指物理阻断，诸如堵塞受体，但还会包括其中抗体或片段结合表位的情况，这引起例如构象变化，从而意味着受体的天然配体不再结合(在本文中称为变构阻断或变构抑制)。在一个实施方案中，本公开内容的抗体与CSF-1R的所有同种型结合，例如，在ECD结构域中具有改变(诸如V23G、A245S、H247P、V279M以及所述改变的两种、三种或四种的组合)的那些。

本文实施例中描述了适合用于测定抗体阻断CSF-1R的能力的测定法。CSF-1和IL-34均是CSF-1R的配体并且本发明的抗体优选在功能性细胞筛选中抑制CSF-1和IL-34两者的活性。本发明的抗体还优选不导致CSF-1R活化和/或CSF-1R内化。本发明的抗体还优选选择性地体内耗尽单核细胞的非典型群体。

非典型的单核细胞一般是指具有低CD14表达和高CD16表达的单核细胞。此单核细胞群体被认为是肿瘤相关巨噬细胞的前体。

本发明的抗体分子适当地具有高结合亲和力。如本文实施例中所述，可利用本领域中已知的任何适当方法(包括诸如表面等离子体共振(例如BIAcore)的技术)，使用分离的天然或重组CSF-1R或适当的融合蛋白质/多肽来测量亲和力。在一个实例中，如本文实施例中所述，使用重组人CSF-1R胞外域来测量亲和力。在一个实例中，使用的重组人CSF-1R胞外域为单体。适当地，本发明的抗体分子针对于分离的人CSF-1R具有约1nM或小于1nM的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约500pM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约250pM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约200pM或更小的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明提供了一种具有约100pM或更小结合亲和力的抗CSF-1R抗体。在一个实施方案中，本发明提供了一种具有约100pM或更小(优选约10pM或更小，更优选约5pM或更小)的结合亲和力的人源化抗CSF-1R抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种具有约100pM或更小(优选约10pM或更小，更优选约5pM或更小)的结合亲和力的人源化抗CSF-1R抗体。

亲和力的数值越小，抗体或片段对抗原的亲和力越大。

如本文中所用，人CSF-1R是指名为CSF-1R的人蛋白质或其生物活性片段，例如，如以SEQ ID NO：39所示或在UniProt中以编号P07333所登记的。当然，经表达的成熟蛋白质不包含信号序列，因为信号序列在翻译后被切割。

本发明人已提供了新型抗CSF-1R抗体，包括人源化抗体。从具有用表达CSF-1R胞外域的载体转染的大鼠成纤维细胞的大鼠的免疫接种来产生抗体。针对抗体的人CSF-1R结合来对上清液的初级筛选鉴定出约1000个包含具有抗CSF-1R活性的抗体的孔。针对能够阻止人CSF-1与人CSF-1R结合的抗体的次级筛选鉴定出88个阳性孔。针对能够阻止原代人单核细胞的CSF-1依赖性存活的抗体的三级筛选鉴定出18个阳性孔。将这18个阳性孔的可变区进行克隆，这导致成功地克隆14种抗体，并且随后的表达提供了以足够水平表达并能够抑制CSF-1结合的9种嵌合抗CSF-1R抗体。将这9种抗体测序并发现全都具有独特的序列，并且用于进一步研究。

评估这9种抗CSF-1R嵌合抗体的配体阻断活性以及抑制CSF-1和IL-34介导的单核细胞存活的能力。将抗体中的四种优先用于进一步研究，因为其证实CSF-1结合的完全抑制和高水平的单核细胞存活抑制。在许多体外测定法中测试这4种抗CSF-1R嵌合抗体的活性以评估亲和力、CSF-1结合的抑制、与恒河猴(rhesus monkey)、食蟹猴(cynomolgusmonkey)和犬CSF-1R的交叉反应性、CSF-1R内化以及CSF-1R活化。还将这四种抗CSF-1R抗体进行人源化并测量人源化移植物的亲和力。抗CSF-1R抗体中的两种的人源化产生了具有与亲本嵌合抗体相等的亲和力(K_D)和指示抗体具有适当热稳定性的Tm的完全人源化抗体(不存在大鼠供体残基)。相对地，其它两种人源化抗CSF-1R抗体相对嵌合抗体而言具有针对CSF-1R的降低的亲和力，并且Tm更小。因为这些原因，仅将抗体中的两种的保留亲和力的完全人源化移植物以较大规模表达来用于进一步的分析。

进行这两种抗体的完全人源化移植物的进一步分析并进行MCP-1抑制测定，其中通过阻断CSF-1结合的抗体抑制CSF-1R信号传导导致MCP-1分泌水平降低。此测定令人惊讶地显示完全人源化移植物展现相较于嵌合抗体减小的活性。对一种优选抗体(称为Ab969)进行一系列实验以揭示完全人源化移植物展现该减小活性的原因。产生了Ab969的许多中间人源化移植物并在MCP-1抑制测定中进行测试。发现包含可变轻链供体残基Y71的移植物在MCP-1抑制测定中通常显示与嵌合Ab969相当的活性。已假设MCP-1抑制测定中各种抗体移植物的活性差异归因于在抗体缔合速率上相较于嵌合Ab969的改变(减小的K_a)。

Ab969与其它抗CSF-1R抗体(例如抗CSF-1R抗体Ab970)的热稳定性分析的比较显示Ab969可能更为稳定。

Ab969的人源化移植物的进一步的生物物理分析显示一些移植物在浓缩抗体时沉淀。已显示轻链中位置38处的赖氨酸残基的置换(例如谷氨酰胺)导致改善的物理稳定性。

因此，选择Ab969的一种抗体移植物Ab969.g2(也称为Ab969)用于进一步的体外表征研究。除了有利的高CSF-1R结合亲和力、高热稳定性以及高物理稳定性以外，抗体还展现IL-34依赖性单核细胞活化的良好抑制并且还发现能够与CSF-1R的SNP变体结合。Ab969.g2还用于食蟹猴中的药效学标记分析，其中显示Ab969.g2与CSF-1R结合、阻断CSF-1结合并且选择性地体内耗尽食蟹猴单核细胞的非典型群体，其是肿瘤相关巨噬细胞的前体细胞。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种包含重链和/或轻链的抗体，其中重链和/或轻链包含至少一个衍生自抗CSF-1R抗体969.2的CDR。

Ab969.2为全长人源化IgG4分子；轻链包含人κ链恒定区(Km3同种异型)并且重链包含具有铰链稳定突变S241P(Angal等人，1993)的人γ-4重链恒定区。潜在的DG异构化基序存在于轻链可变区中CDR-L2与框架的接合处。Ab969.2完全抗体重链和轻链的序列以SEQID NO：27和19显示。

抗体可变域中的残基依照Kabat等人，1987所设计的系统进行常规编号。该系统示于Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDepartment of Health and Human Services,NIH,USA(此后称为“Kabat等人(同上)”)中。除非另外指明，否则本说明书中使用此编号系统。

Kabat残基命名法并不始终与氨基酸残基的线性编号直接对应。实际的线性氨基酸序列可包含相较于严格Kabat编号中更少或额外的氨基酸，这对应于基础可变域结构的结构组分(不论框架或互补决定区(CDR))的缩短或插入。可通过抗体序列中具同源性的残基与“标准”Kabat编号序列之间的比对来确定给定抗体的正确残基Kabat编号。

根据Kabat编号系统，重链可变域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)以及残基95-102(CDR-H3)。然而，根据Chothia(Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等价于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另外指明，否则如本文中所用的“CDR-H1”意指残基26至35，如通过组合Kabat编号系统和Chothia拓扑环定义所描述的。

根据Kabat编号系统，轻链可变域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)以及残基89-97(CDR-L3)。

用于本公开内容中的抗体可使用本领域中已知的任何适当方法来获得。CSF-1R多肽/蛋白质(包括融合蛋白质)、(重组或天然地)表达多肽的细胞可用于产生特异性识别CSF-1R的抗体。多肽可以是“成熟”多肽或其生物活性片段或衍生物。人蛋白质在UniProt中以编号P07333登记。

用于免疫接种宿主的多肽可由本领域中熟知的方法从包括表达系统的经遗传改造的宿主细胞制得，或它们可以从天然生物来源回收获得。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另外指明，否则这些词可互换使用。在一些情况下，CSF-1R多肽可以是更大的蛋白质(诸如融合蛋白，例如融合至亲和标签等)的一部分。

在免疫接种动物是必需的情况下，针对CSF-1R多肽产生的抗体可以通过使用众所周知和常规的方案将多肽施用于动物(优选非人动物)来获得，参见例如Handbook ofExperimental Immunology,D.M.Weir(ed.),Vol 4,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986。许多温血动物(诸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、骆驼或猪)可以被免疫。但是，一般最适宜的是小鼠、兔、猪和大鼠。

可以通过本领域已知的任何方法制备单克隆抗体，这样的方法为例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983,Immunology Today,4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,pp77-96,Alan R Liss,Inc.)。

抗体还可以使用单淋巴细胞抗体方法，例如通过Babcook,J.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-7848、WO92/02551、WO04/051268和国际专利申请号WO2004/106377所述的方法，通过克隆和表达从被选择用于特异性抗体生产的单淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生。

可利用测量与人CSF-1R的结合的测定法和/或测量阻断配体与受体结合的能力的测定法来进行抗体的筛选。适当测定法的实例在本文实施例中描述。

本文中采用的“特异性”是指仅识别其特异性针对的抗原的抗体或者相较于与其非特异性针对的抗原的结合，具有对其特异性针对的抗原的显著更高的结合亲和力，例如至少5、6、7、8、9、10倍更高的结合亲和力。

本公开内容的某些抗体的氨基酸序列和多核苷酸序列提供于图1和2中。

在本发明的一个方面中，抗体是包含重链的抗CSF-1R抗体或其结合片段，其中重链的可变域包含具有针对于CDR-H1以SEQ ID NO：4所示的序列的CDR、具有针对于CDR-H2以SEQ ID NO：5所示的序列的CDR以及具有针对于CDR-H3以SEQ ID NO：6所示的序列的CDR中的至少一种。优选地，重链的可变域包含针对于CDR-H1以SEQ ID NO：4所示的序列、针对于CDR-H2以SEQ ID NO：5所示的序列以及针对于CDR-H3以SEQ ID NO：6所示的序列。

在本发明的第二方面中，抗体是包含轻链的抗CSF-1R抗体或其结合片段，其中轻链的可变域包含具有针对于CDR-L1以SEQ ID NO：1所示的序列的CDR、具有针对于CDR-L2以SEQ ID NO：2所示的序列的CDR以及具有针对于CDR-L3以SEQ ID NO：3所示的序列的CDR中的至少一种。优选地，轻链的可变域包含针对于CDR-H1以SEQ ID NO：1所示的序列、针对于CDR-H2以SEQ ID NO：2所示的序列以及针对于CDR-H3以SEQ ID NO.3所示的序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体是包含如上所定义的重链且另外包含轻链的抗CSF-1R抗体或其结合片段，其中轻链的可变域包含具有针对于CDR-L1以SEQ ID NO：1所示的序列的CDR、具有针对于CDR-L2以SEQ ID NO：2所示的序列的CDR以及具有针对于CDR-L3以SEQ ID NO：3所示的序列的CDR中的至少一种。轻链的可变域优选包含针对于CDR-L1以SEQ ID NO：1所示的序列、针对于CDR-L2以SEQ ID NO：2所示的序列以及针对于CDR-L3以SEQ ID NO：3所示的序列。

在一个实施方案中，在选自独立地由下述组成的组的一种或多种CDR中的至少一个氨基酸被保守性置换替换：

CDR-H1,CDR-H2,CDR-H3,CDR-L1,CDR-L2,CDR-L3中的任一种；

组合CDR-H1和H2,CDR-H1和H3,CDR-H1和L1,CDR-H1和L2,CDR-H1和L3,CDR-H2和H3,CDR-H2和L1,CDR-H2和L2,CDR-H2和L3,CDR-H3和L1,CDR-H3和L2,CDR-H3和L3,CDR-L1和L2,CDR-L1和L3,CDR-L2和L3中的任一种；

CDR-H1,H2和H3,CDR-H1,H2和L1,CDR-H1,H2和L2,CDR-H1,H2和L3,CDR-H2,H3和L1,CDR-H2,H3和L2,CDR-H2,H3和L3,CDR-H3,L1和L2,CDR-H3,L1和L3,CDR-L1,L2,L3；

组合CDR-H1,H2,H3和L1,CDR-H1,H2,H3和L2,CDR-H1,H2,H3和L3,CDR-H2,H3,L1和L2,CDR-H2,H3,L2和L3,CDR-H3,L1,L2和L3,CDR-L1,L2,L3和H1,CDR-L1,L2,L3和H2,CDR-L1,L2,L3和H3,CDR-L2,L3,H1和H2中的任一种；

CDR-H1,H2,H3,L1和L2,CDR-H1,H2,H3,L1和L3,CDR-H1,H2,H3,L2和L3,CDR-L1,L2,L3,H1和H2,CDR-L1,L2,L3,H1和H3,CDR-L1,L2,L3,H2和H3；以及

组合CDR-H1,H2,H3,L1,L2和L3。

在一个实施方案中，本文中公开的重链的结构域包含具有1、2、3或4个保守氨基酸置换的序列，例如，其中置换在框架中。

在一个实施方案中，重链可变区的框架包含已被插入、删除、置换或其组合的1、2、3、或4个氨基酸。在一个实施方案中，经置换的氨基酸为来自供体抗体的对应氨基酸。

在一个实施方案中，本文中公开的轻链可变区包含具有1、2、3或4个保守氨基酸置换的序列，例如，其中置换在框架中。

在一个实施方案中，轻链可变区的框架包含已被插入、删除、置换或其组合的1、2、3或4个氨基酸。在一个实施方案中，经置换的氨基酸为来自供体抗体的对应氨基酸。

在本发明的一个方面中，提供了一种抗CSF-1R抗体或其结合片段，其中重链的可变域包含三种CDR并且CDR-H1的序列与SEQ ID NO：4所示的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同一性或相似性，CDR-H2的序列与SEQ ID NO：5所示的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同一性或相似性以及CDR-H-3的序列与SEQ ID NO：6所示的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同一性或相似性。优选地，抗CSF-1R抗体或其结合片段另外包含轻链，其中轻链的可变域包含三种CDR并且CDR-L1的序列与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同一性或相似性，CDR-L2的序列与SEQ IDNO：2所示的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同一性或相似性以及CDR-L3的序列与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少60％的同一性或相似性。

在一个实施方案中，所提供的可变区与本文中公开的可变区序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同一性或相似性。在另一个实施方案中，提供了一种与本发明的抗体或片段竞争结合至CSF-1R受体(优选CSF-1R受体的胞外域)、更具体地结合至具有SEQID NO：35、36、37、38和/或39或UniProt数据库条目P07333的序列的CSF-1R受体、具体地结合至具有SEQ ID NO：36的CSF-1R受体的胞外域或在UniProt数据库条目P07333中公开的胞外域的498个氨基酸(P07333的氨基酸20至517)的抗CSF-1R抗体。

在一个实施方案中，提供了一种交叉阻断包含针对于CDR-L1以序列SEQ ID NO：1、针对于CDR-L2以SEQ ID NO：2、针对于CDR-L3以SEQ ID NO：3、针对于CDR-H1以SEQ ID NO：4、针对于CDR-H2以SEQ ID NO：5以及针对于CDR-H3以SEQ ID NO：6所示的6种CDR的抗体的例如具有100pM或更小的亲和力结合的抗CSF-1R抗体，特别地，其中所述交叉阻断是变构性的。

在另一个实施方案中，提供了一种抗CSF-1R-抗体或其结合片段，其抑制CSF-1和/或IL-34与CSF-1R受体的胞外域的结合或与CSF-1和/或IL-34与CSF-1R受体的胞外域的结合重叠。

在一个实施方案中，提供了一种交叉阻断包含针对于CDR-L1以SEQ ID NO：1、针对于CDR-L2以SEQ ID NO：2、针对于CDR-L3以SEQ ID NO：3、针对于CDR-H1以SEQ ID NO：4、针对于CDR-H2以SEQ ID NO：5以及针对于CDR-H3以SEQ ID NO：6所示的6种CDR的抗体的例如具有100pM或更小亲和力结合的抗CSF-1R抗体，特别地，其中所述抗体通过结合与其所阻断的抗体相同的表位来交叉阻断结合。

在一个实施方案中，提供了抗体或其结合片段，其中抗体序列的C-端残基(例如，重链序列的C-端残基，例如，末端赖氨酸)是经切割的。在一个实施方案中，将该氨基酸从本文中公开的序列切割。一般而言，切割由表达的抗体或结合片段的翻译后修饰所导致。

在另一个实施方案中，提供了上述或下述任何实施方案的抗CSF-1R抗体，其中以SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29所示的重链序列的C-端赖氨酸是缺失或删除的。缺失或删除的C-端赖氨酸(例如，SEQ ID NO：27的位置453或SEQ ID NO：30的位置472)可例如通过在表达系统中在不编码末端赖氨酸的情况下表达抗CSF-1R抗体来实现。或者，C-端残基(诸如赖氨酸)的删除可以作为翻译后修饰来实现。

在一个实施方案中，本发明的抗体或结合片段是经人源化的。

本文中使用的术语“人源化的抗体”是指这样的抗体或抗体分子，其中重链和/或轻链含有来自供体抗体(例如鼠单克隆抗体)的被移植入受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中的一个或多个CDR(如果需要，包括一个或多个经修饰的CDR)(参见例如US 5,585,089；WO91/09967)。对于综述，参见Vaughan等人，Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，仅将来自本文上述的任一CDR的一个或多个特异性决定残基而不是整个的CDR转移至人抗体框架(参见例如Kashmiri等人，2005,Methods,36:25-34)。在一个实施方案中，仅将来自本文上述的一个或多个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。在另一个实施方案中，仅将来自本文上述的每一个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。当移植CDR或特异性决定残基时，在考虑了衍生CDR的供体抗体的种类/类型后，可以使用任何适当的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。

合适地，本发明的人源化的抗体具有包含人受体框架区以及本文具体提供的一个或多个CDR的可变域。因此，在一个实施方案中，提供了人源化的抗体，其结合人CSF-1R，其中可变域包含人受体框架区和非人供体CDR。

可以用于本发明的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链以及EU、LAY和POM可用于重链和轻链。备选地，可使用人种系序列；这些可获得于http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/。

在本发明的人源化的抗体中，受体重链和轻链不必需地衍生自同一抗体并且如果需要可以包含具有衍生自不同链的框架区的复合链。

在一个实施方案中，人框架包含1、2、3、或4个氨基酸置换、添加或删除，例如，供体残基的1、2、3或4个保守置换。

在一个实施方案中，用作人框架的序列与本文所公开的序列具有80％、85％、90％、95％或更大的相似性或同一性。

用于本发明的人源化抗体的重链的一个这样的合适框架区衍生自人亚群VH2序列3-1 2-70加上JH3 J-区(SEQ ID NO：33)。

因此，在一个实例中，提供了一种包含针对于CDR-H1以SEQ ID NO：4所示的序列、针对于CDR-H2以SEQ ID NO：5所示的序列以及针对于CDR-H3以SEQ ID NO：6所示的序列的人源化抗体，其中重链框架区衍生自人亚群VH3序列1-3 3-07加上JH4。

在一个实例中，抗体的重链可变域包含以SEQ ID NO：23所示的序列。

用于本发明的人源化抗体的轻链的合适框架区衍生自人种系亚群VK1 2-1-(1)O12加上JK4 J-区(SEQ ID NO：31)。

因此，在一个实例中，提供了一种包含针对于CDR-L1以SEQ ID N0：1所示的序列、针对于CDR-L2以SEQ ID NO：2所示的序列以及针对于CDR-L3以SEQ ID NO：3所示的序列的人源化抗体，其中轻链框架区衍生自人亚群VK1 2-1-(1)O12加上JK4 J-区。

在一个实例中，抗体的轻链可变域包含以SEQ ID NO：15所示的序列。

在本发明的人源化抗体中，框架区不需要具有与受体抗体的框架区完全相同的序列。例如，可将不常见的残基改变成对于该受体链种类或类型更常见的残基。备选地，可改变在受体框架区中的选定残基以使得它们对应于供体抗体中相同位置处所发现的残基(参见Reichmann等人，1998,Nature,332:323-324)。应当将这样的改变保持在恢复供体抗体的亲和力所需的最小程度。用于选择受体框架区中可能需要被改变的残基的方案示于WO91/09967中。

因此，在一个实例中，提供了一种人源化抗体，其中至少重链可变域的位置78处(Kabat编号)的残基为供体残基。在一个实施方案中，重链可变域的残基78被丙氨酸置换。

如本文中所用的供体残基是指来自提供了CDR的非人抗体(例如，鼠抗体)的残基。

在一个实施方案中，提供了一种人源化抗体，其中重链可变域不包含任何供体残基。

因此，在一个实例中，提供了一种人源化抗体，其中轻链可变域的位置38、71以及87处(Kabat编号)的残基中的至少一个为供体残基。在一个实施方案中，选自轻链可变域的位置38、71以及87处(Kabat编号)的残基的残基中的一个为供体残基。在一个实施方案中，选自轻链可变域的位置38、71以及87处(Kabat编号)的残基的残基中的两个(例如38以及71；或38以及87；或71以及87)为供体残基。在一个实施方案中，轻链可变域的位置38、71以及87处(Kabat编号)的三个残基为供体残基。

在一个实施方案中，轻链可变域的残基38被赖氨酸置换。在替代实施方案中，轻链可变域的残基38被谷氨酰胺置换。

在一个实施方案中，轻链可变域的残基71被酪氨酸置换。

在一个实施方案中，轻链可变域的残基87被苯丙氨酸置换。

在一个实施方案中，提供了一种人源化抗体，其中轻链可变区中仅残基71为供体残基，优选是酪氨酸。

在特定的实施方案中，本发明提供了一种抗CSF-1R抗体或其结合片段，其具有包含以SEQ ID NO：23所示的重链可变域序列的重链和包含以SEQ ID NO：15所示的轻链可变域序列的轻链。

在本公开内容的其它方面中，提供了一种抗CSF-1R抗体或其结合片段，其结合CSF-1R(优选CSF-1R的胞外域，最优选人CSF-1R的胞外域)，其中抗体或结合片段包含SEQID NO：15的轻链可变域以及SEQ ID NO：23的重链可变域，优选地，其中抗体或其结合片段为单克隆抗体、IgG1-IgG2-,IgG4-类型的抗体、Fab、经修饰的Fab、Fab’、经修饰的Fab’、F(ab’)₂、Fv、单结构域抗体(例如，VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、双特异性-scFv、双抗体、三抗体或四抗体。

在一个实施方案中，本公开内容提供了一种与本文所公开序列80％相似或相同(例如在部分或整个相关序列上85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同)的抗体序列。在一个实施方案中，相关序列为SEQ ID NO：15。在一个实施方案中，相关序列为SEQ ID NO：23。

如本文所用，“同一性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用，“相似性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基为相似类型。例如，亮氨酸可被置换成异亮氨酸或缬氨酸。可通常彼此置换的其它氨基酸包括(但不限于)：

-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；

-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；

-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；

-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及

-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。可容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991,BLAST^TM软件可获自NCBI(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656)。

本发明的抗体分子可包括具有全长重链和轻链的完全抗体分子或其结合片段并且可以是但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab’、经修饰的Fab’、F(ab’)₂、Fv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、双特异性-scFv、双抗体、三抗体、四抗体和以上任何抗体的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。创建和制造这些抗体片段的方法是本领域众所周知的(参见例如Verma等人，1998,Journalof Immunological Methods,216:165-181)。用于本发明的其它抗体片段包括在国际专利申请WO05/003169、WO05/003170和WO05/003171中所述的Fab和Fab’片段。多价抗体可以包含多种特异性例如双特异性或可以是单特异性的(参见例如WO 92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。

如本文所用的抗体的结合片段是指能够以将片段表征为对抗原具特异性的亲和力结合抗原的片段。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体被提供为CSF-1R结合抗体融合蛋白，其包含免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab’片段)和直接或间接与其连接的一个或两个单结构域抗体(dAb)，例如如WO2009/040562、WO2010/035012、WO2011/030107、WO2011/061492和WO2011/086091中所述的，所有均通过引用并入本文。

在一个实施方案中，融合蛋白包含两个结构域抗体，例如作为任选通过二硫键连接的可变重链(VH)和可变轻链(VL)配对。

在一个实施方案中，融合蛋白的Fab或Fab’元件具有与单结构域抗体相同或类似的特异性。在一个实施方案中，Fab或Fab’具有与单结构域抗体不同的特异性，换句话说融合蛋白是多价的。在一个实施方案中，根据本发明的多价融合蛋白具有白蛋白结合位点，例如，其中的VH/VL对提供白蛋白结合位点。

在一个实施方案中，融合蛋白质的Fab或Fab’成员对或这单域抗体具有相同或类似的特异性。在一个实施方案中，Fab或Fab’对或这单域抗体具有不同的特异性，换言的，融合蛋白质为多价。在一个实施方案中，本公开内容的多价融合蛋白质具有白蛋白结合位点，例如，其中的VH/VL对提供了白蛋白结合位点。

可基于所提出的抗体分子功能和特别地可能需要的效应子功能来选择本发明的抗体分子的恒定区结构域(若存在)。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。具体地，在抗体分子意欲用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型的人IgG恒定区结构域。或者，在抗体分子意欲用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。

在具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG2或IgG4抗体。

将理解，还可使用这恒定区结构域的序列变体。例如，可使用如Angal等人，1993，Molecular Immunology，1993，30：105-108中所述的其中位置241处的丝氨酸已被改变为脯氨酸的IgG4分子。因此，在其中抗体是IgG4抗体的实施方案中，抗体可包括突变S241P。

本领域技术人员还将理解的是，抗体可以进行各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这样的修饰可以包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化中的变化。常见修饰是由于羧肽酶的作用导致的羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)的缺失(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所述)。因此，抗体重链的C-末端赖氨酸可以是不存在的。

在一个实施方案中，抗体重链包含CH1域，并且抗体轻链包含CL域(κ或λ)。

在一个实施方案中，抗体重链包含CH1域、CH2域和CH3域，并且抗体轻链包含CL域(κ或λ)。

本发明提供的抗体具有包含以SEQ ID NO：27所示的序列的重链和包含以SEQ IDNO：19所示的序列的轻链。还提供了一种抗CSF-1R抗体或其结合片段，其中重链和轻链与包含以SEQ ID NO：27所示的序列的重链和包含以SEQ ID NO.19所示的序列的轻链至少80％(优选85％、90％、95％或98％)相同或相似。在一个实施方案中，轻链具有以SEQ ID NO：19所示的序列或由其组成并且重链具有以SEQ ID NO：27所示的序列或由其组成。在另一个实施方案中，轻链具有SEQ ID NO：19的序列或由其组成并且重链具有SEQ ID NO：27的序列或由其组成，其中在SEQ ID NO：27的位置453处的氨基酸赖氨酸是缺失或删除的。

本公开内容还提供了由本发明提供的抗体(具体地包含重链序列gH2(SEQ ID NO：27)和/或轻链序列gL7(SEQ ID NO：19)的抗体969.g2)结合的人CSF-1R的特异性区域或表位。

人CSF-1R多肽的该特异性区域或表位可以通过本领域已知的任何合适的表位作图方法结合本发明提供的任一抗体进行鉴定。这样的方法的实例包括筛选从用于结合本发明的抗体的CSF-1R衍生的具有不同长度的肽(例如长度为约5至10个(优选约7个)氨基酸范围内的肽)，其中能够特异性结合所述抗体的最小片段含有被所述抗体识别的表位的序列。可以合成地或通过CSF-1R多肽的蛋白水解消化来生产CSF-1R肽。结合抗体的肽可以通过例如质谱分析进行鉴定。在另一个实例中，NMR光谱术或X射线晶体学可以被用于鉴定由本发明的抗体结合的表位。经鉴定后，如果需要，结合本发明的抗体的表位片段可以被用作免疫原以获得结合相同表位的另外的抗体。

生物分子(诸如抗体或片段)含有酸性和/或碱性官能团，从而给予该分子净正电荷或净负电荷。“观察到的”总电荷的量将取决于该实体的绝对氨基酸序列、3D结构中带电基团的局部环境和该分子的环境条件。等电点(pI)是pH，在该pH，特定分子或其溶剂可接近表面不带净电荷。在一个实例中，本发明的CSF-1R抗体及片段可以被工程化为具有适当的等电点。这可能导致抗体和/或片段具有更强有力的性质，特别是合适的溶解度和/或稳定性特征和/或改善的纯化特性。

因此，在一方面，本发明提供被工程化为其等电点不同于原始鉴定抗体的等电点的人源化的CSF-1R抗体。可以例如通过取代氨基酸残基对抗体进行工程化，诸如以一个或多个碱性氨基酸残基取代酸性氨基酸残基。备选地，可以引入碱性氨基酸残基或者可以去除酸性氨基酸残基。备选地，根据需要，如果分子具有不可接受的高pI值，则可以引入酸性残基以降低pI。重要的是，当操作pI时，必须小心以保留抗体或片段的期望活性。因此，在一个实施方案中，工程化的抗体或片段与“未修饰的”抗体或片段具有相同或基本上相同的活性。

诸如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html和http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html的程序可以被用于预测抗体或片段的等电点。

将理解的是，可以使用本领域已知的任何合适的方法改变由本发明所提供的抗体的亲和力。因此，本发明还涉及本发明的抗体分子的变体，其具有改善的针对CSF-1R的亲和力。这样的变体可以通过许多亲和力成熟方案获得，包括突变CDR(Yang等人,1995,J.Mol.Biol.,254:392-403)、链改组(Marks等人,1992,Bio/Technology,10:779-783)、使用大肠杆菌的突变菌株(Low等人,1996,J.Mol.Biol.,250:359-368)、DNA改组(Patten等人,1997,Curr.Opin.Biotechnol.,8:724-733)、噬菌体展示(Thompson等人,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(sexual PCR)(Crameri等人,1998,Nature,391:288-291)。Vaughan等人(同上)讨论了这些亲和力成熟方法。

如果需要，可以将用于本发明的抗体缀合至一个或多个效应分子。将理解的是，效应分子可以包含单个效应分子或者两个或更多个这样的分子(其经连接以形成可以附接至本发明的抗体的单个部分)。当期望获得连接至效应分子的抗体片段时，这可以通过标准化学或重组DNA程序进行制备，其中抗体片段直接地或经由偶联剂连接至效应分子。用于将这样的效应分子缀合至抗体的技术是本领域众所周知的(参见Hellstrom等人，ControlledDrug Delivery,2nd Ed.,Robinson et al.,eds.,1987,pp.623-53；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。具体的化学方法包括例如在WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476和WO 03/031581中描述的那些。备选地，在效应分子是蛋白质或多肽的情况下，可以使用重组DNA程序(例如在WO 86/01533和EP0392745中所述的)实现连接。

本文中使用的术语“效应分子”包括例如抗肿瘤剂，药物，毒素，生物学活性蛋白质，例如酶，其它抗体或抗体片段，合成的或天然存在的聚合物，核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段，放射性核素，特别是放射性碘化物，放射性同位素，螯合金属，纳米颗粒和报告基团诸如荧光化合物或者可以通过NMR或ESR光谱术检测的化合物。

效应分子的实例可以包括细胞毒素或细胞毒性剂，其包括对细胞有害(例如杀死)的任何药剂。实例包括combrestatin、尾海兔素(dolastatin)、埃博霉素、星形孢菌素、美登木素生物碱、spongistatin、根霉素(rhizoxin)、软海绵素、杆孢菌素、hemiasterlins、紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。

效应分子还包括但不限于抗代谢药物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、噻替哌、thioepa chlorambucil、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(以前为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、氨茴霉素(AMC)、卡奇霉素或duocarmycins)和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。

其它效应分子可以包括螯合放射性核素诸如¹¹¹In和⁹⁰Y、Lu¹⁷⁷、铋²¹³、锎²⁵²、铱¹⁹²和钨¹⁸⁸/铼¹⁸⁸；或药物诸如但不限于烷基磷酰胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和苏拉明。

其它效应分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括、但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素诸如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质诸如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤溶酶原激活物、血栓形成剂或抗血管生成剂例如血管抑素或内皮抑素、或生物应答调节剂诸如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。

其它效应分子可以包括例如在诊断中有用的可检测的物质。可检测的物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、发射正电子的金属(用于正电子发射断层摄影术)、以及非放射性顺磁性金属离子。对于可被缀合至抗体用作诊断剂的金属离子，一般性参见美国专利号4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；以及合适的放射性核素包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In和⁹⁹Tc。

在另一个实例中，效应分子可以增加抗体的体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨上皮细胞屏障至免疫系统的递送。合适的这种类型的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，诸如在WO05/117984中描述的那些。

在一个实施方案中，由独立于CSF-1R的效应分子提供的半衰期是有利的。

一般而言，在效应分子是聚合物的情况下，它可以是合成的或者天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化亚烷基聚合物或者带支链或不带支链的多糖，例如同多糖或杂多糖。

可能存在于上述的合成聚合物上的特定任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。

合成的聚合物的具体实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任选取代的聚(乙二醇)诸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、右旋糖酐、糖原或其衍生物。

在一个实施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，诸如人血清白蛋白或其片段。

本文中使用的“衍生物”旨在包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应性基团诸如马来酰亚胺等。可以将反应性基团直接连接至聚合物或者通过接头区段连接至聚合物。将理解的是，这样的基团的残基会在一些情况下形成产物的一部分，作为抗体片段和聚合物之间的连接基团。

聚合物的大小可以根据需要而改变，但是一般将在平均分子量500Da至50000Da的范围内，例如5000至40000Da诸如20000至40000Da。可以特别地基于产品的预期用途(例如定位至某些组织(诸如肿瘤)或延长循环半衰期的能力)选择聚合物的大小(对于综述，参见Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，当产品旨在离开循环并渗透组织时(例如用于肿瘤的治疗)，使用小分子量的聚合物(例如具有大约5000Da的分子量)可以是有利的。对于产品保持于循环中的应用，使用更高分子量的聚合物(例如具有20000Da至40000Da范围内的分子量)可以是有利的。

合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物，诸如聚(乙二醇)，或者特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且特别是具有大约15000Da至大约40000Da范围内的分子量。

在一个实例中，将用于本发明的抗体附接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个具体实例中，抗体是抗体片段并且PEG分子可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离的氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基)进行附接。这样的氨基酸可以天然存在于抗体片段中或者可以通过使用重组DNA方法被工程化至片段中(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971，WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子是修饰的Fab片段，其中所述修饰是向其重链的C-末端添加一个或多个氨基酸以允许效应分子的附接。合适地，额外的氨基酸形成含有一个或多个半胱氨酸残基的修饰的铰链区，效应分子可以附接至所述半胱氨酸残基。可以使用多个位点来附接两个或更多个PEG分子。

合适地，PEG分子通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基进行共价连接。被附接至修饰的抗体片段的每个聚合物分子可以共价连接至位于该片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价连接一般会是二硫键或者特别是硫-碳键。在巯基被用作附接点的情况下，可以使用适当活化的效应分子，例如巯基选择性衍生物诸如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化的聚合物可以在制备如上所述的聚合物修饰的抗体片段的过程中用作起始材料。活化的聚合物可以是任何含有巯基反应性基团(诸如α-卤代羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺，例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物)的聚合物。这样的起始材料可以通过市售获得(例如来自Nektar(以前是Shearwater Polymers Inc.),Huntsville,AL,USA)或者可以使用常规化学方法从市售可得的起始材料进行制备。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可从Nektar，以前是Shearwater；Rapp Polymere；和SunBio获得)和M-PEG-SPA(可从Nektar，以前是Shearwater获得)。

在一个实施方案中，抗体是修饰的Fab片段、Fab’片段或diFab，其为PEG化的，即具有共价附接至其的PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP 0948544或EP1090037中所公开的方法(还参见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and BiomedicalApplications",1992,J.Milton Harris(ed),Plenum Press,New York,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications",1997,J.Milton Harrisand S.Zalipsky(eds),American Chemical Society,Washington DC和"BioconjugationProtein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences",1998,M.Aslam andA.Dent,Grove Publishers,New York；Chapman,A.2002,Advanced Drug DeliveryReviews 2002,54:531-545)。在一个实例中，将PEG附接至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接至修饰的铰链区中的单个巯基的马来酰亚胺基团。可以将赖氨酸残基共价连接至马来酰亚胺基团并且可以将具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物附接至赖氨酸残基上每个胺基。因此，附接至Fab片段的PEG的总分子量可以为约40,000Da。

具体的PEG分子包括N,N’-双(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修饰的赖氨酸的2-[3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙酰胺，也被称为PEG2MAL40K(可从Nektar，以前是Shearwater获得)。

PEG接头的备选来源包括NOF，其供应GL2-400MA3(其中下述结构中的m是5)和GL2-400MA(其中m是2)并且n是约450：

也就是说，每个PEG为大约20,000Da。

因此，在一个实施方案中PEG是2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧)-1-{[3-(6-马来酰亚胺基-1-氧己基)氨基]丙氧基}己烷(2臂分支的PEG,-CH₂)₃NHCO(CH₂)₅-MAL，Mw 40,000，称为SUNBRIGHT GL2-400MA3。

下列类型的进一步可选的PEG效应分子：

在一个实施方案中，本发明提供抗体，诸如全长抗体，其是PEG化的(例如具有本文中所述的PEG)，通过在或者大约在链的第226位氨基酸(例如重链的第226位氨基酸(通过连续编号))上的半胱氨酸氨基酸残基附接。

在一个实施方案中，本公开内容提供包含一个或多个PEG聚合物的Fab’PEG分子，例如1或2个聚合物诸如40kDa聚合物。

根据本公开内容的Fab-PEG分子可以是特别有利的，因为它们具有独立于Fc片段的半衰期。

在一个实施方案中，本发明提供了缀合至聚合物诸如PEG分子、淀粉分子或白蛋白分子的scFv。

在一个实施方案中，将抗体或片段缀合至淀粉分子，例如以提高半衰期。在US 8,017,739中描述了将淀粉缀合于蛋白质的方法，其通过引用并入本文。

如本文中所用的报告分子是能够被检测的分子，例如，荧光染料、放射性标记或其它可检测实体。

本发明还提供了编码本发明的抗体分子的重链和/或轻链的分离的DNA序列。适当地，DNA序列编码本发明的抗体分子的重链或轻链。本发明的DNA序列可包括例如通过化学处理产生的合成DNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。

编码本发明的抗体分子的DNA序列可由本领域技术人员熟知的方法来获得。例如，编码部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列可按需要从确定的DNA序列或基于对应的氨基酸序列来合成。

编码受体框架序列的DNA对于本领域技术人员是广泛可得的并且可基于其已知的氨基酸序列来容易地合成。

分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体分子的DNA序列。所需DNA序列可完全或部分地利用寡核苷酸合成技术合成。可适当地采用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。

适当DNA序列的实例提供于图1中。

本发明还涉及包含本发明的一种或多种DNA序列的克隆或表达载体。因此，提供了包含一种或多种编码本发明的抗体的DNA序列的克隆或表达载体。在一个实施方案中，载体包含以SEQ ID NO：28和/或SEQ ID NO：20所示的序列。适当地，克隆或表达载体包含分别编码本发明的抗体分子的轻链和重链的两种DNA序列(优选分别是SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：20)以及适当的信号序列。在一个实例中，载体包含在重链和轻链之间的基因间序列(参见WO03/048208)。

构建载体的一般方法、转染方法以及培养方法是本领域技术人员熟知的。关于此方面，参考由Cold Spring Harbor Publishing出版的“Current Protocols in MolecularBiology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York and the ManiatisManual。

还提供了包含一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，所述克隆或表达载体包含一种或多种编码本发明的抗体的DNA序列。任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。可使用细菌(例如大肠杆菌)及其它微生物系统，或还可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。适当的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。

本发明还提供了制备本发明的抗体分子的方法，其包括在适合于引起从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包含本发明的载体的宿主细胞，以及分离抗体分子。

抗体分子可仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需将重链或轻链多肽编码序列用于转染宿主细胞。对于产生包含重链和轻链的产物，可使用两种载体(编码轻链多肽的第一载体以及编码重链多肽的第二载体)转染细胞系。或者，可使用单一载体，载体包括编码重链和轻链多肽的序列。

本公开内容的抗体和片段从宿主细胞以良好水平表达。因此，抗体和/或结合片段的性质适合用于商业规模的表达。

因此，提供了培养宿主细胞和表达抗体或其片段、分离抗体或其片段以及任选将其纯化以提供分离的抗体或片段的方法。在一个实施方案中，方法进一步包括将效应分子缀合至分离的抗体或片段的步骤，例如，缀合至特别地如本文所述的PEG聚合物。

在一个实施方案中，提供了纯化抗体(特别是本发明的抗体或片段)的方法，其包括以非结合模式进行阴离子交换层析以使得杂质滞留在柱上而洗脱出抗体。

在一个实施方案中，纯化利用在CSF-1R柱上的亲和捕获。

在一个实施方案中，纯化利用汽巴蓝(cibacron blue)或类似物来用于纯化白蛋白融合或缀合分子。

用于该方法中的适当离子交换树脂包括Q.FF树脂(由GE-Healthcare供应)。步骤可以例如在约8的pH下进行。

方法可进一步包括使用阳离子交换层析的初始捕获步骤，例如在约4至5(诸如4.5)的pH下进行。阳离子交换层析可例如使用树脂诸如CaptoS树脂或SP琼脂糖凝胶FF(由GE-Healthcare供应)。可随后使用例如在200mM浓度下的离子盐溶液(诸如氯化钠)从树脂洗脱抗体或片段。

因此，层析步骤可适当地包括一个或多个洗涤步骤。

纯化方法还可包括一个或多个过滤步骤，诸如渗滤步骤。

因此在一个实施方案中，提供了纯化的抗CSF-1R抗体或片段，例如，人源化抗体或片段，特别是本发明的抗体或片段，其呈基本上纯化的形式，特别是不含或基本上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA。

如前述使用的纯化的形式意指至少90％纯度，诸如，91、92、93、94、95、96、97、98、99％w/w或更高的纯度。

基本上不含内毒素一般意指1EU/mg抗体产物或更少(诸如0.5或0.1EU/mg产物)的内毒素含量。

基本上不含宿主细胞蛋白质或DNA一般意指适当地400μg/mg抗体产物或更少(诸如100μg/mg或更少，特别是20μg/mg)的宿主细胞蛋白质和/或DNA含量。

本发明还提供了用作药剂的本公开内容的抗CSF-1R抗体(或包含其的药物组合物)。

本发明容还提供了用于治疗癌症的本公开内容的抗CSF-1R抗体(或包含其的药物组合物)。

本发明还提供了本公开内容的抗CSF-1R抗体(或包含其的药物组合物)在制备用于治疗或预防癌症的药剂中的用途。

本发明还提供了治疗患有癌症或处于癌症风险的人受试者的方法，方法包括给受试者施用有效量的本公开内容的抗CSF-1R抗体。

本公开内容的抗体可用于治疗选自以下的癌症：乳腺癌、前列腺癌、骨癌、骨髓瘤、结肠直肠癌、白血病、淋巴瘤、皮肤癌(诸如黑素瘤)、食道癌、胃癌、星形细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、头颈癌、胰腺癌以及卵巢癌。

在一个实施方案中，癌症为来自任何以上所列原发性癌症(特别是骨癌)的转移性癌症。

出人意料地，我们已能够证实抑制CSF-1R活性的抗CSF-1R抗体在治疗纤维化疾病中具有活性。具体地，我们已能够证实抗CSF-1R抗体在肺纤维化体内动物模型中具有活性。

本发明还提供了用于治疗纤维化疾病的本公开内容的抗CSF-1R抗体(或包含其的药物组合物)。

本发明还提供了本公开内容的抗CSF-1R抗体(或包含其的药物组合物)在制备用于治疗或预防纤维化疾病的药物中的用途。

本发明还提供了用于治疗患有纤维化疾病或处于纤维化疾病风险的人受试者的方法，方法包括对受试者施用有效量的本公开内容的抗CSF-1R抗体。

在本申请中，术语“纤维化疾病”包括特征为对伤口愈合的异常应答的疾病，其中在器官或组织中形成过量纤维结缔组织。示例性的纤维化疾病包括但不限于肺纤维化诸如特发性肺纤维化和囊性纤维化、肾纤维化包括肾小管萎缩以及间质纤维化、肝纤维化、肝硬化、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后腔纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、瘢痕疙瘩、心肌梗死、硬皮病、系统性硬化病以及关节纤维化。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体或片段用于治疗或预防癌症或纤维化疾病。

本公开内容的抗体可用于治疗炎性疾病，例如炎性关节炎、动脉粥样硬化、多发性硬化症、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类类风湿性脊柱炎、强直性关节炎、关节炎、银屑病关节炎、类风湿关节炎、骨关节炎、湿疹、接触性皮肤炎、银屑病、中毒性休克症候群、败血症、败血性休克、内毒素性休克、哮喘、慢性肺炎性疾病、硅肺病、肺结节病、骨质疏松症、再狭窄症(restenosis)、心脏及肾脏再灌注损伤、血栓症、肾小球肾炎、糖尿病、移植物抗宿主反应、同种异体移植排斥、多发性硬化症、肌肉退化、肌营养不良、阿兹海默氏症以及中风。

本公开内容的抗体和片段可用于治疗或预防。

本发明的抗体分子还可用于诊断，例如用于牵涉CSF-1R的疾病状态的体内诊断和成像。

因本发明的抗体可用于治疗和/或预防病理病况，故本发明还提供了包含与药学可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中一种或多种组合的本发明的抗体分子的医药或诊断组合物。因此，提供了本发明的抗体用于制备药物的用途。组合物通常将被提供为通常将包含药学可接受载剂的灭菌药物组合物的一部分。本发明的药物组合物可另外包含药学可接受的佐剂。

本发明还提供了制备药学或诊断组合物的方法，方法包括添加并混合本发明的抗体分子以及药学可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中之的一种或多种。

抗体分子可以是药学或诊断组合物中的唯一活性成分。或者，抗体可与一种或多种其它治疗活性成分组合(例如同时、连续或分开地)施用。据此，在药学或诊断组合物中的抗体分子可由其它活性成分伴随，所述其它活性成分包括其它抗体成分，例如，表皮生长因子受体家族(EGFR、HER-2)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板源生长因子受体(PDGFR)抗体，或非抗体成分，诸如伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nioltinib)、巴苏替尼(basutinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、坦西莫司(temsirolimus)、凡德他尼(vandetanib)、维拉非尼(vemurafenib)、克唑替尼(crizotinib)、伏立诺他(vorinostat)、罗咪醒肽(romidepsin)、硼替佐米(bortezomib)、索拉非尼(sorafenib)、苏尼替尼(sunitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格菲尼(regorafenib)、卡博替尼(cabozantinib)、吡非尼酮(Perfenidone)、类固醇或其它药物分子(特别是其半衰期独立于CSF-1R结合的药物分子)。

如本文中所用的活性成分是指在相关剂量下具有药理学效应(诸如治疗效应)的成分。

药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的抗体。如本文中所用的术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶疾病或病况、或展现可检测的治疗、药理或预防效应所需的治疗剂的量。对于任何抗体，治疗有效量可首先在细胞培养测定或在动物模型通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中进行估计。动物模型还可用于确定适当的浓度范围和施用途径。这样的信息可随后用于确定在人中的有用剂量和施用途径。

用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状况的严重度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受性/反应。这样的量可通过常规试验来确定并且在医师的判断范围内。一般而言，治疗有效量将为0.01mg/kg至500mg/kg，例如，0.1mg/kg至200mg/kg，诸如100mg/kg。

药物组合物可便利地以每剂量含有预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式呈现。

本公开内容的抗体的治疗剂量未显示表观或有限体内毒理学效应。

组合物可单独地施用至患者或可以与其它药剂、药物或激素组合(例如同时、连续或分开地)施用。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体或结合片段与一种或多种其它癌症治疗选项(例如化学疗法、放射治疗或手术)一起使用。如果与化学治疗剂施用，则可在化学治疗剂之前或之后或同时施用抗体。可与所提供的抗原结合蛋白组合使用的化学疗法治疗包括但不限于烷基化/DNA破坏剂(例如卡铂、顺铂)、抗代谢物(例如卡培他滨、吉西他滨、5-氟尿嘧啶)、有丝分裂抑制剂(例如紫衫醇、长春新碱)。

待用于治疗各种炎性疾病的抗体可单独地或与各种其它抗炎剂组合使用。

待用于治疗各种纤维化疾病的抗体可单独地或与各种其它抗纤维化剂组合使用。这样的药剂的实例为普菲酮(Perfedidone)。

本发明的抗体分子的施用剂量取决于待治疗的病况的性质、所呈现病况的严重度以及取决于抗体分子是预防性使用还是用于治疗现有病况。

给药频率将取决于抗体分子的半衰期及其效应的持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，则可需要每天给药一次或多次。或者，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2至15天)和/或持久的药效学(PD)性质，则其可能仅需要每天给药一次、每周一次或甚至每1或2个月一次。

如本文中所用的半衰期意指分子在循环例如血清/血浆中的持续时间。

如本文中所用的药效学是指根据本公开内容的分子的生物学作用的特征谱和特别是持续时间。

药学可接受的载剂本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体并且不应具有毒性。适当的载剂可以是大的缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物以及无活性病毒颗粒。

可使用药学可接受的盐，例如，矿物酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐以及硫酸盐，或有机酸的盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐以及苯甲酸盐。

在治疗性组合物中的药学可接受的载剂可另外包含液体诸如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质诸如润湿或乳化剂或pH缓冲物质可存在于这样的组合物中。这样的载剂使得药物组合物能够被配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液以及悬浮液以供患者摄取。

用于施用的适当形式包括适合用于胃肠外施用(例如，通过注射或输注，例如通过快速注射或连续输注)的形式。在产品用于注射或输注的情况下，其可采用在油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且其可包含调配剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体分子可呈干燥形式，用于在使用前用适当的无菌液体重建。

在配制后，本发明的组合物可直接施用至受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，组合物适应于施用至人受试者。

适当地，在本公开内容的制剂中，最终制剂的pH不与抗体或片段的等电点的值相似，例如，如果制剂的pH为7，则8-9或以上的pI可以是适当的。虽然不希望受理论约束，但认为这可最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如，抗体或片段保持在溶液中。

在一个实例中，在4.0至7.0范围的pH下的药物制剂包含：1至200mg/mL的本公开内容的抗体、1至100mM的缓冲剂、0.001至1％的表面活性剂，a)10至500mM的稳定剂、b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张度剂、或c)5至500mM的张度剂。

本发明的药物组合物可通过任何数量的途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。还可使用皮下注射器来施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可制备成注射物，作为液体溶液或悬浮液。还可制备适合用于在注射之前在液体媒介物中溶解或悬浮的固体形式。

这样的组合物的直接递送通常将通过注射皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内地实现或被递送至组织间质空间。组合物还可被施用至病灶中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。

将理解在组合物中的活性成分将为抗体分子。因此，其将容易在胃肠道中降解。因此，如果组合物将通过胃肠道的途径施用，则组合物将需要包含可保护抗体免遭降解但在其已从胃肠道吸收后释放抗体的试剂。

药学可接受的载剂的详尽论述可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中获得。

在一个实施方案中，制剂被提供为用于局部施用包括吸入的制剂。

适当的可吸入制剂包括可吸入粉末、包含推进剂气体的计量气雾剂或不含推进剂气体的可吸入溶液。本公开内容的包含活性物质的可吸入粉末可仅由上述活性物质组成或由上述活性物质与生理可接受赋形剂的混合物组成。

这些可吸入粉末可包括单醣(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二醣(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡醣和多醣(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或者这些彼此的混合物。适当地使用单醣或二醣，使用乳糖或葡萄糖，具体地但非唯一地以其水合物形式。

用于沉积在肺中的颗粒需要具有小于10微米(诸如1至9微米，例如0.1至5μm，具体地1至5μm)的粒度。活性成分(诸如抗体或片段)的粒度是首要重要的。

可用于制备可吸入气雾剂的推进剂气体是本领域中已知。适当的推进剂气体选自烃类诸如正丙烷、正丁烷或异丁烷以及卤代烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推进剂气体可独立地或以其混合物形式使用。

特别合适的推进剂气体为选自TG 11、TG 12、TG 134a以及TG227的卤化烷烃衍生物。在上述卤化烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别合适的。

含推进剂气体的可吸入气雾剂还可包含其它成分，诸如共溶剂、稳定剂、表面活性试剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂以及用于调整pH的装置。所有这些成分是本领域中已知的。

本发明的含推进剂气体的可吸入气雾剂可包含高至5重量％的活性物质。本发明的气雾剂包含例如0.002至5重量％、0.01至3重量％、0.015至2重量％、0.1至2重量％、0.5至2重量％或0.5至1重量％的活性成分。

或者，至肺的局部施用还可通过例如使用装置诸如喷雾器(例如，连接至压缩机的喷雾器(例如，连接至由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的PariMaster(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器))来施用液体溶液或悬浮液制剂。

本发明的抗体可分散在溶剂中例如以溶液或悬浮液的形式递送。可使其悬浮在合适的生理溶液(例如，盐水)或其它药理可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域中已知的缓冲溶液可以是每1ml水包含0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸、以及0.45mg至0.55mg柠檬酸钠以实现约4.0至5.0的pH。悬浮液可使用例如冻干抗体。

治疗性悬浮液或溶液制剂还可包含一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域熟知的并且包括缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液以及碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨糖醇和甘油。溶液或悬浮液可包封在脂质体或生物可降解的微球体中。制剂通常将利用灭菌制备工艺以基本上无菌的形式提供。

这可包括通过以下步骤的制备和灭菌：过滤用于制剂的经缓冲的溶剂/溶液、使抗体无菌悬浮在无菌的经缓冲的溶剂溶液中、以及通过本领域技术人员熟知的方法将制剂分配至无菌容器中。

本公开内容的可喷雾制剂可被提供为例如封装在箔封装袋中的单剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)。各小瓶包含在溶剂/溶液缓冲液体积(例如2mL)中的单位剂量。

本文中公开的抗体可适于通过喷雾递送。

还设想本发明的抗体可通过使用基因疗法来施用。为了实现此，将在合适DNA组分控制下编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列引入患者中使得抗体链从DNA序列表达并原位组装。

在一个实施方案中，本公开内容包括将抗体或其片段用作试剂或诊断剂，例如缀合至报告分子。因此提供了经标记的本公开内容的抗体或片段。在一个方面，提供了包含本公开内容的抗体或片段的柱子。

因此，提供了用作试剂的抗CSF-1R抗体或片段，其用于以下的用途：

1)纯化CSF-1R蛋白质(或其结合片段)-其与基质缀合并用作亲和柱或(以抗CSF-1R的修饰形式)用作沉淀剂(例如，以利用通过另一分子(其可以是经修饰的)识别的结构域修饰的形式)，其任选通过抗Fc试剂沉淀

2)检测和/或定量在活的或经固定的细胞(在体外或在组织或细胞切片中的细胞)上或中的CSF-1R。对于此的使用可包括将CSF-1R作为生物标志物定量以随访抗CSF-1R治疗的效应。对于这些目的，候选物可以以经修饰的形式使用(例如，通过添加另一部分，作为基因融合蛋白或化学缀合物，诸如添加报告分子，例如，用于检测目的的荧光标签)。

3)纯化或分选通过结合至由(1)和(2)中所示例方式修饰的候选物来标记的带有CSF-1R的细胞。

本说明书上下文中的包含意指包括。

在技术上适当的情况下，可将本发明的实施方案组合。

实施方案在本文中描述为包括某些特征/元素。本公开内容还扩展至由所述特征/元素组成或基本上由其组成的单独的实施方案。

技术参考文献诸如专利和申请以引用方式并入本文。

具体且明确地描述在本文中的任何实施方案可单独地或与一种或多种其它实施方案组合地构成弃权声明书的基础。

附图说明

在下列实施例中仅通过举例说明的方式进一步描述本发明，所述实施例参考下列附图：

图1A至1F显示某些氨基酸和多核苷酸序列。

图2A至2B显示某些序列的比对。

图3显示通过用于转染细胞且在细胞表面上表达蛋白质的多核苷酸编码的人CSF-1R胞外域的序列。这些细胞随后用于使宿主动物免疫。

图4显示通过抗体Ab969抑制CSF-1与THP-1细胞结合。

图5a显示通过抗体Ab969抑制原代人单核细胞的CSF-1驱动的存活和增殖。

图5b显示通过抗体Ab969抑制原代人单核细胞的IL-34驱动的存活和增殖。

图6显示通过抗体Ab535抑制原代鼠单核细胞的CSF-1驱动的存活和增殖。

图7显示用Ab969、人CSF-1和同种型对照物温育的THP-1细胞上的细胞表面CSF-1R的水平。

图8显示相较于同种型对照物而言用Ab969处理的THP-1细胞上的细胞表面CSF-1R的相对水平。

图9显示用Ab535、CSF-1和同种型对照物温育的RAW264.7细胞上的细胞表面CSF-1R的水平。

图10显示相较于同种型对照物而言用Ab535处理的RAW264.7细胞上的细胞表面CSF-1R的相对水平。

图11显示在用CSF-1刺激或用Ab969处理后用CSF-1R转染的HEK293F细胞上CSF-1R磷酸化的水平。

图12显示原代人单核细胞在用Ab969和用CSF-1温育时的MCP-1分泌水平。

图13显示相较于嵌合Ab969.g0通过人源化抗体969.g5抑制CSF-1介导的单核细胞存活的效应。

图14显示通过Ab969的多种人源化抗体移植物抑制CSF-1介导的单核细胞存活的效应。

图15a显示从用单一静脉内剂量的7mg/kg Ab969.g2处理的食蟹猴采集的血清样本中CSF-1的浓度。

图15b显示从用单一静脉内剂量的1.5mg/kg Ab969.g2处理的食蟹猴采集的血清样本中CSF-1的浓度。

图15c显示以7mg/kg和1.5mg/kg剂量对食蟹猴施用抗体Ab969.g2在不同时间点对循环的非典型单核细胞的效应。

图16显示具有人乳腺癌异种移植物MCF-7的皮下移植物的免疫缺陷裸小鼠中抗体Ab535相对于对照抗体、阳性对照和媒介物对照的抗肿瘤效应。

图17显示原位前列腺癌模型PC-3中抗体Ab535相对于对照抗体、阳性对照和媒介物对照的抗肿瘤疗效。

图18a显示相较于同种型对照，Ab535对博来霉素诱导的肺纤维化的处理对BALF胶原浓度的作用。

图18b显示相较于同种型对照，Ab535对博来霉素诱导的肺纤维化的处理对通过艾氏评分测量的肺样品纤维化病理学的作用。

图18c显示相较于同种型对照，Ab535对博来霉素诱导的肺纤维化的处理对血清中白蛋白浓度的作用。

图18d为来自博来霉素诱导的肺纤维化研究的小鼠的BAL流体中巨噬细胞的数目并且显示相较于同种型对照处理的动物，Ab535对博来霉素诱导的肺纤维化的处理使得BAL流体中的巨噬细胞数减少。数据以平均值±SEM显示；*表示与盐水同种型显著不同；#表示与用同种型对照抗体给药的博来霉素处理的小鼠显著不同(p<0.05)

图19显示来自盐水对照、博来霉素+同种型对照以及博来霉素+Ab535处理的动物的肺的组织病理分析的代表性影像。

图20a显示相较于用同种型对照的处理，Ab535对患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠的处理对BALF胶原浓度的作用。

图20b显示相较于用同种型对照的处理，Ab535对患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠的处理对通过艾氏评分测量的肺样品纤维化病理学的作用。

图20c显示相较于用同种型对照的处理，Ab535对患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠的处理对BALF胶原浓度的作用。

图20d显示来自肺纤维化的ADA缺陷模型的小鼠的BAL流体中巨噬细胞的数目并且显示Ab535对患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠的处理使得BAL流体中的巨噬细胞数减少。

图21显示来自用同种型对照或者Ab535处理的正常小鼠(ADA+)和患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠(ADA-)鼠的肺的组织病理学分析的代表图像。

实施例

实施例1-抗CSF-1R抗体的生成

免疫接种：

使用已用表达连接至糖基化磷脂酰-肌醇(GPI)锚状物的人CSF-1R胞外域的载体瞬时转染的同基因RFL6大鼠成纤维细胞免疫接种雌性Sprague Dawley大鼠。图3显示SEQID NO:39，其为用于大鼠的免疫接种的人CSF-1R胞外域序列。

大鼠以三周时间间隔接受每只动物3-9×10⁶个经转染的细胞的五次皮下免疫接种。在与第一次细胞免疫接种相邻的部位注射弗氏完全佐剂(在PBS中50％)。最后一次免疫后两周，收获外周血单核细胞(PBMC)和脾脏。

抗体上清液的初级筛选

抗体上清液首先针对它们与表达在经转染的HEK293细胞上的人CSF-1R结合的能力通过荧光微量检测技术(FMAT)进行筛选。

在600×96孔板的初级FMAT筛选中鉴定出约1000个具有抗CSF-1R反应性的孔。通过FMAT针对CSF-1R结合抗体的产生筛选出总计约3×10⁸个B细胞(大鼠脾细胞)。

抗体上清液的次级筛选

已设计了中等通量测定法来鉴定包含中和抗CSF-1R活性(即，具有防止人CSF-1与人CSF-1R受体结合的能力的抗体)的FMAT-阳性孔。在利用人CSF-1温育之前将抗体上清液用表达CSF-1R的THP-1细胞温育。与THP-1细胞结合的CSF-1的水平通过流式细胞术使用抗CSF-1多克隆抗体来测量。使用无关抗体上清液作为阴性对照。

对来自779个抗体孔的上清液施加次级筛选并且这些孔中有88个孔展现可检测的CSF-1阻断活性。

抗体上清液的三级筛选

对已在次级筛选中显示中和活性的抗体上清液测试其阻止原代人单核细胞的CSF-1依赖性存活的能力。从人体血液纯化单核细胞并且在20ng/ml人CSF-1的存在下用各抗体上清液温育1×10⁴个细胞。在72小时的温育之后，通过CellTiter Glo测定法测量有活力单核细胞的数量。

对来自在次级筛选中鉴定出的抗体孔中的59个抗体孔的上清液施加三级筛选并且18个孔展现减少CSF-1-介导的单核细胞存活的能力。

抗体可变区的克隆以及阻断活性的再分析

从这18个抗体孔尝试可变区(V-区)克隆，从而证实CSF-1中和活性。重链和轻链免疫球蛋白V-区通过RT-PCR使用对大鼠抗体恒定区特异的引物和退火至编码大鼠免疫球蛋白前导肽的序列的冗余引物组来扩增。从14种抗体回收V-区基因并克隆至重链和轻链人IgG4表达载体中。

将抗体载体对瞬时转染至HEK293F细胞中并针对THP-1细胞上的CSF-1中和活性测试条件培养基(如上所述)。抗体中有九种抗体相较于对照条件培养基具有部分或完全抑制CSF-1结合的能力。

九种中和抗CSF-1R抗体的序列分析

将九种中和抗体测序以评估序列多样性。所有这九种抗体是独特的。将这些抗体克隆并表达，用于进一步的特征研究。

实施例2-抗人CSF-1R嵌合Ab969和抗鼠CSF-1R Ab535的体外性质

i)嵌合Ab969的表达

在实施例1中鉴定的九种中和抗体的可变区被克隆至单独的重链和轻链表达载体中并被表达为全长人IgG4抗体。

VH基因被克隆至包含编码天然前导序列和具有铰链稳定突变S241P的人γ-4重链恒定区的DNA的载体pVhg4FL(V19H)中。VL基因(κ)被克隆至包含编码天然前导序列和人κ链恒定区(Km3同种异型)的DNA的载体pKH10.1(V4L)中。

抗体通过将重链和轻链载体对匹配至CHO-K1细胞中的瞬时共转染来表达。进行抗体在PBS pH 7.4中的纯化，使得最终制剂中聚集体的浓度小于1％。

这九种抗体的组包含被命名为抗体969的抗体。包含大鼠可变区和人γ-4重链恒定区以及人κ链恒定区的嵌合抗体在以下实施例中称为抗体969或抗体969cHcL或抗体969.g0。

ii)配体阻断测定

由流式细胞术来评估这九种抗体的每一种抑制CSF-1与THP-1细胞结合的能力。将THP-1细胞与0.5、0.125、0.031、0.0078以及0.00195μg/ml的各抗体一起温育30分钟。无关IgG4抗体充当同种型对照。在洗涤之后，将细胞与0.5μg/ml人CSF-1一起温育30分钟。在进一步洗涤之后，通过与生物素化的抗CSF-1抗体和Alexa488缀合的抗生蛋白链菌素的连续温育来检测结合的CSF-1。通过流式细胞术来测量与受体结合的配体并绘制中位荧光强度(MFI)。

此测定鉴定出比所测试的剩余抗体优异的四种抗体(包括Ab969)，证实在浓度31.3ng/ml下完全抑制CSF-1结合。关于Ab969的结果显示在图4中。

iii)CSF-1-和IL-34-介导的单核细胞存活的抑制

抗人CSF-1R：

对经纯化的抗人CSF-1R抗体测试其抑制原代人单核细胞的CSF-1和IL-34驱动的存活和增殖的能力。在各测定中，丝裂原(CSF-1或IL-34)以提供单核细胞的最大刺激的浓度使用。

在Ficoll梯度上从新鲜人全血制备人PBMC并且通过阴性选择来纯化单核细胞。将单核细胞与0.25μg/ml抗体以及20ng/mlCSF-1一起温育72小时并且利用CellTiter Glo分析来确定有活力细胞的相对数量。发光读出值与有活力细胞的数量相关联。结果显示在图5a中。

基在Ficoll梯度上从新鲜人全血制备人PBMC并且通过阴性选择来纯化单核细胞。将单核细胞与0.25μg/ml抗体以及20ng/ml IL-34一起温育72小时并且利用CellTiter Glo分析来确定有活力细胞的相对数量。发光读出值与有活力细胞的数量相关联。结果显示在图5b中。

该四种抗体(包括Ab969)显示出相较于剩余抗体就CSF-1(图5a)和IL-34(图5b)刺激而言单核细胞存活的优良抑制，与其配体阻断活性一致。

抗小鼠CSF-1R：

从小鼠脾脏纯化原代鼠CD11b⁺单核细胞。将单核细胞随后在鼠CSF-1(mCSF-1)的滴定下温育24小时。通过ELISA测量MCP-1至细胞培养基中的释放并且证实MCP-1通过mCSF-1的剂量依赖性释放。在本研究的单独组中，伴随mCSF-1滴定添加10μg/ml抗鼠CSF-1RAb535。在所测试的CSF-1的所有浓度下Ab535完全地抑制MCP-1的释放(图6)。

使用原代鼠单核细胞以100ng/ml的恒定CSF-1浓度以及Ab535的滴定来进行MCP-1释放测定。证实了MCP-1释放的剂量依赖性抑制并且计算了IC₅₀。两个独立实验的Ab535的平均IC₅₀被测定为8.08ng/ml。

结论：使用CSF-1对鼠单核细胞的处理导致MCP-1的剂量依赖性释放，其通过使用10μg/ml Ab535的处理完全抑制。Ab535以剂量依赖性方式抑制从鼠单核细胞的CSF-1驱动的MCP-1释放，平均IC₅₀为8.08ng/ml(n＝2)。该IC₅₀值与由抗人CSF-1R抗体所展现的IC₅₀值相似。

iv)亲和力

在BIAcore测定中通过测量针对纯化的重组CSF-1R/Fc融合蛋白的结合动力学测试抗体结合CSF-1R的能力。

测定形式是通过固定化的抗人IgG,F(ab’)₂捕获抗CSF-1R抗体然后滴定在捕获表面上的hCSF-1R/Fc。使用BIAcore 3000(GE Healthcare Bio-Sciences AB)进行BIA(生物分子相互作用分析(Biamolecular Interaction Analysis))。在25℃进行所有实验。将特异性的Affinipure F(ab’)₂片段山羊抗人IgG,F(ab’)₂片段(Jackson ImmunoResearch)经由胺偶联化学固定在CM5 Sensor Chip(GE Healthcare Bio-Sciences AB)上至～5000应答单位(RU)的水平。将HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,GE Healthcare Bio-Sciences AB)用作运行缓冲液，流速为10μl/min。进行抗CSF-1R抗体的注射以在固定化的抗人IgG,F(ab)₂上产生约100RU的捕获水平。

重组人CSF-1R/Fc(R&D Systems)在5nM下以30ul/min流速在捕获的抗CSF-1R抗体上通过，持续5min，随后在解离阶段使流速增加至100ul/min，持续30min。在5nM下的注射连同相应的缓冲液对照进行两次。这些传感图用于生成解离速率。从2.5nM以30ul/min流速将重组人CSF-1R/Fc在捕获的抗CSF-1R抗体上滴定5min，随后进行10min的解离阶段。这些传感图用于生成缔合速率。通过40mM HCl的10ul注射液随后10mM NaOH的5ul注射液以10ul/min的流速使表面再生。使用BIA评估软件(版本4.1)按照标准程序分析双重参考背景扣除结合曲线。从拟合算法确定动力学参数。

四种测试抗体中的三种展现小于10pM的亲和力(K_D)。有利地，将此与抗鼠CSF-1R平行试剂Ab535比较。关于Ab969和Ab553的结果显示在表1中。

表1：

还通过基于细胞的测定法使用THP-1细胞来测量抗体的亲和力。使用Alexa-488荧光染料直接标记抗体并且通过定量流式细胞术来测量亲和力。另外的BIAcore分析证实抗体的荧光缀合不改变针对重组CSF-1R蛋白质的亲和力。结果显示在表2中。

通过这两种方法获得的绝对亲和力值是不同的，并且此差异通常在比较这两种系统时观察到。然而，基于细胞的方法证实抗体以高亲和力与CSF-1R结合。

表2

v)CSF-1结合的抑制(IC₅₀)

四种抗体通过测量其抑制CSF-1与THP-1细胞的结合的相对效力来分析。所有四种抗体在该测定形式中展现CSF-1结合的有效抑制，IC₅₀值小于5ng/ml(～30pM)。

表3

抗体	平均IC50±S.D.(ng/ml)
		Ab969	2.89±1.22

vi)抗体交叉反应性

测试四种抗体与恒河猴、食蟹猴以及犬全长CSF-1R的交叉反应性。除了人CSF-1R以外，所有四种抗体还与恒河猴和食蟹猴CSF-1R结合，显示出显著地在同种型对照水平以上的明显结合。

表4

vii)CSF-1R内化

Ab969：

将THP-1细胞与Ab969一起温育0、0.5、2、4、24以及48小时。还使用分别充当阳性和阴性对照的人CSF-1和同种型对照处理细胞。在各时间点，通过流式细胞术来测量细胞表面CSF-1R的水平(图7)。计算用Ab969处理的细胞上的细胞表面CSF-1R相对于同种型对照的相对水平并显示在图8中。

使用重组CSF-1处理THP-1细胞导致细胞表面CSF-1R水平的快速且持续的降低；天然配体与其同源受体结合并驱动配体-受体复合物的内化。

用Ab969处理的THP-1细胞在整个48小时时程中相较于未经处理的和用同种型对照处理的THP-1细胞展现出更高水平的细胞表面CSF-1R表达。此数据强烈提示Ab969对THP-1细胞的处理在处理后长达48小时不导致细胞表面表达的hCSF-1R的内化。

随着时间的发展，在未经处理的和经处理的THP-1细胞上细胞表面表达的CSF-1R显著增加，除用CSF-1处理的细胞外。这可能是归因于在实验的48小时时期上在细胞生长期间的表达改变并且可潜在地是应激反应。

为了提供了Ab969不增强受体内化的进一步的证据，以及还为了排除THP-1细胞系不是生理相关的可能性，还在内化对此中使用原代人单核细胞。来自此测定的数据也证实Ab969不导致健康原代人单核细胞上细胞表面CSF-1R的快速内化。

Ab535：

小鼠白血病单核细胞/巨噬细胞细胞系RAW264.7表达高水平的鼠CSF-1R(mCSF-1R)，并且代表用于测试抗鼠CSF-1R抗体Ab535是否可引起受体内化的适当的基于细胞的系统。

将RAW264.7细胞与Ab535一起温育0、0.5、2、4、24以及48小时。还使用分别作为阳性和阴性对照的人CSF-1和同种型对照处理细胞。在各时间点，通过流式细胞术来测量细胞表面CSF-1R的水平(图9)。计算细胞表面CSF-1R相对于同种型对照的相对水平，并显示在图10中。

数据显示，使用重组CSF-1对THP-1细胞的处理导致细胞表面CSF-1R水平的快速且持续的降低。

在用人CSF-1处理2小时的RAW264.7细胞上观察到细胞表面mCSF-1R水平相对于未经处理的和用同种型对照处理的细胞的明显减少。此减少在整个48小时的研究中维持。这证实人CSF-1引起mCSF-1R内化，并验证了用于监测受体内化的实验系统。

与未经处理和用同种型对照处理的细胞相比，用Ab535处理的RAW264.7细胞在整个48小时时程中展现相似水平的细胞表面mCSF-1R。因为预期抗体介导的受体内化在此时间范围内会发生，故此数据强烈地提示Ab535不触发mCSF-1R内化。

为了提供Ab535不增强受体内化的进一步的证据，在内化测定中使用原代鼠CD11b⁺单核细胞-巨噬细胞。这些结果也证实使用Ab535对小鼠单核细胞-巨噬细胞的处理在处理后长达24小时未导致细胞表面表达的mCSF-1R的内化。

viii)CSF1-R活化

CSF-1与CSF-1R结合，导致形成受体二聚物，这通过使激酶结构域亲密接近在一起而触发快速受体磷酸化。这随后导致受体内化以及几个良好表征的信号传导通路(包括Ras-MAPK通路)的活化。可能的是抗CSF-1R抗体可引起受体簇集并触发下游信号传导级联。这可能是应当抑制受体信号传导的抗体所不期望的性质，因此，使用两个独立的体外测定形式来测试Ab969的受体激动作用。

在第一测定形式中，将抗体与用人全长CSF-1R转染的细胞一起温育并且通过蛋白质印迹来监测下游信号传导分子以及受体的磷酸化。

THP-1细胞系代表监测CSF-1R的活化状态的起始点。然而，此细胞系中CSF-1R的表达水平相当低而难以进行生物化学分析。因此，实验系统被设计成可稳健地检测CSF-1R磷酸化的水平。可在两个酪氨酸残基Y723和Y809上检测到CSF-1R的磷酸化。此外，p44/42MAPK(Erk1/2)在T202和Y204上的磷酸化被测量为CSF-1R活性的独立读出。在所有实验中，包括使用CSF-1的刺激作为阳性对照。

使用表达全长CSF-1R的质粒载体转染HEK293F细胞。在无血清条件下温育24小时之后，使用Ab969.g0的100μg/ml至0.001μg/ml滴定来刺激细胞，持续5分钟。还使用500ng/ml重组CSF-1处理细胞以提供阳性对照。包括未经处理的细胞作为阴性对照。来自经处理和未经处理的细胞的蛋白质裂解物通过SDS-聚丙烯酰胺电泳分离并印迹至硝酸纤维素上。使用针对磷酸化-Y723 CSF-1R(Cell Signaling Technology#3151)、磷酸化-Y809(CellSignaling Technology#3154)、总CSF-1R(Cell Signaling Technology#3152)和磷酸化-ERK 1/2(p44/42MAPK)(Cell Signaling Technology#5301)的抗体进行Western免疫印迹。

未受刺激的CSF-1R转染的HEK293F细胞展现低基础水平的CSF-1R磷酸化。使用CSF-1刺激细胞导致残基Y723和Y809上的CSF-1R磷酸化水平，其可由蛋白质印迹分析容易地观察到(图11)。在CSF-1处理后还存在明显的ERK 1/2磷酸化的刺激。使用抗体Ab969.g0处理经转染的HEK293F细胞并不刺激CSF-1R的磷酸化或增强ERK1/2活化。

在第二测定中，将抗体Ab969(单体和交联的)与原代人单核细胞一起温育并且使用MCP-1分泌作为CSF-1R活化的标志物。人单核细胞的CSF-1处理导致其释放单核细胞化学吸引蛋白-1(MCP-1)。如果抗CSF-1R抗体具有活化单核细胞上的CSF-1R受体的能力，则会预期发生MCP-1的释放。

先前描述的生物化学测定仅使用单体抗CSF-1R抗体。然而，可能的是交联的IgG1会具有增强的使CSF-1R分子亲密接近并触发酪氨酸磷酸化和下游信号传导的能力。为了评估此，还使用已与抗人Fc抗体交联的Ab969.g0来进行MCP-1测定。

可如下从人全血制备人单核细胞：采集60至100ml人全血在BD Vacutainer 10mlLithium Heparin 171IU管中。将血液分配至3-4个Leucosep Ficoll管(Greiner Bio-One)中并用PBS加满。将管在1000g、20℃下无中断地离心10分钟，收集PBMC层。将细胞沉淀，且随后使用阳性选择人CD14珠粒(Miltenyi Biotec 130-050-201)依照制备商的方案分离单核细胞。通过添加山羊抗人IgG Fc抗体(R&D Systems G-102-C)以2:1的Ab969.g0:Fc比率使抗体Ab969.g0交联。在存在抗体Ab969.g0或交联的Ab969.g0的剂量滴定(半对数连续稀释，包括16个浓度，最大浓度为10μg/ml)下，将单核细胞以20,000个细胞/孔接种在培养基中。在存在和不存在100ng/ml CSF-1、以及在存在和不存在抗人Fc抗体(与以抗体Ab969.g0的最高浓度(5μg/ml)存在的相同的浓度)的情况下，对照孔不包含抗体。将细胞温育24小时，将板离心以沉淀细胞，收集上清液。通过MSD(K151AYB-2)依照制备商的方案测量分泌的MCP-1。

来自实验的结果显示在图12中。无论是单体或交联的形式，针对任何Ab969.g0处理均未检测到MCP-1水平的增加；经处理的细胞的培养基中MCP-1的浓度与未经处理的细胞相同。如所预期的，用CSF-1处理的细胞使得MCP-1水平显著且可重复地增加。

实施例3-抗体969的人源化和人源化移植物的选择

对四种抗CSF-1R抗体基于其在实施例2中测量的亲和力和性质来选择用于人源化。

i)人源化移植物的生成

抗体969和970通过将来自大鼠抗体V区的CDR移植到人种系抗体V区框架上而人源化。

从供体移植至受体序列的CDR是如Kabat(Kabat等人，1987)所定义的，除了其中使用组合的Chothia/Kabat定义的CDR-H1(参见Adair等人，1991Humanisedantibodies.WO91/09967)以外。

人V区2-1-(1)O12+JK4 J-区(V BASE,http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)被选择作为用于轻链CDR的受体。人V区VH2 3-1 2-70+JH3 J区(V BASE,http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)被选择作为用于重链CDR的受体。

来自大鼠V区的许多框架残基保留在人源化序列中，如表1中所示。

自动化合成方法来设计和构建编码初始人源化轻链和重链V区序列的基因(分别命名为gL1和gH1)。轻链和重链V区的其它变体通过以寡核苷酸定点突变修饰gL1和gH1基因来创建。

VK基因(gL1至gL9)被克隆至包含编码人κ链恒定区(Km3同种异型)的DNA的人轻链表达载体pKH10.1中。VH基因(gH1和gH2)被克隆至包含编码具有铰链稳定突变S241P的人γ-4重链恒定区的DNA的人γ-4重链表达载体pVhγ4P FL中(Angal等人，1993，Mol Immunol.30：105-8)。将编码变体轻链和重链的质粒的不同组合共转染至HEK293F中，导致人源化的重组969抗体的表达。

其它三种抗CSF-1R抗体还通过提供在重链和轻链中包含预测具重要意义的许多个供体残基的保守移植物以及不包含供体残基的完全人源化移植物来人源化。

ii)人源化抗体的亲和力

评估各人源化移植物的相对于亲本嵌合抗体而言的(i)通过BIAcore测量的针对人CSF-1R的结合亲和力以及(ii)通过ThermoFluor分析测量的熔化温度(Tm)。据信熔化温度提供了抗体分子稳定性的早期指示，其中不稳定的抗体通常展现小于75.0℃的Tm。

代表Ab969的人源化阶段的移植物显示在表5中。表5还显示Ab696的嵌合抗体(969cHcL)。保守移植物(969gH1gL1)展现2.4pM的亲和力常数(K_D)，因此，相较于嵌合大鼠抗体(969cHcL)，亲和力没有显著损失。969gH1gL1保守移植物的Tm为78.8℃并因此高于75.0℃的阈值。在重链中A78供体残基置换V78以产生969gH2gL1不会减小抗体亲和力(K_D＝2.3pM)。在K38、Y71和F87供体残基分别逐步置换至Q38、F71和Y87后，未观察到亲和力改变。不包含供体残基的最终人源化移植物969gH2gL8展现与亲本嵌合抗体相似的亲和力(4.1PM)。

表5

Ab969在CDR-L2与框架的接合处上具有潜在的DG异构化基序。969gH2gL7和969gH2gL8移植物中的该DG位点天冬氨酸残基被突变为丝氨酸以提供情性SG序列。通过BIAcore测量针对CSF-1R的亲和力并且未检测到亲和力的表观损失(表6)。此外，最终的969H2gL7(SG)和969gH2gL8(SG)移植物分别保留80.5℃和79.9℃的高Tm。

表6

Ab969he一种其它抗CSF-1R抗体Ab970的人源化产生具有与亲本嵌合抗体相当的亲和力(K_D)和给出分子稳定性的初始预测的Tm的完全人源化抗体(不存在大鼠供体残基)。Ab969的完全人源化形式(969gH2gL8 SG)被重命名为Ab969.g5。此后，Ab969的嵌合形式将称为Ab969.g0。

再次利用BIAcore分析来测量Ab969抗体的经纯化的嵌合和人源化移植物针对重组CSF-1R的亲和力。之前的在人源化过程期间进行的BIAcore实验使用粗制细胞上清液替代经纯化的抗体来进行。检测到亲和力略微减小，K_D值从约4pM增加至5pM。

表7

iii)通过Ab969.g0和Ab969.g5抑制CSF-1介导的单核细胞存活CSF-1对于培养的单核细胞的活化和存活是必需的；如果移除CSF-1，则单核细胞快速经历细胞凋亡。设计了一种测定法，使用MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1；还称为CCL2，趋化因子C-C基序配体2)作为读出。在CSF-1刺激后，人单核细胞分泌MCP-1，MCP-1可通常在刺激后第24小时在细胞上清液中由ELISA检测到。通过阻断CSF-1-结合的抗体抑制CSF-1R信号传导导致MCP-1分泌的减少。

在Ficoll梯度上从新鲜人全血制备人PBMC并且通过阳性选择来纯化CD14⁺单核细胞。总计2×10⁴个单核细胞用10μg/ml至0.35pg/ml抗体的半对数系列稀释在100ng/ml人CSF-1的存在下温育24小时。包括包含“无抗体，无CSF-1”以及“无抗体，具有CSF-1”的对照以提供最小和最大MCP-1释放值。在24小时的温育之后，通过离心沉淀细胞并收集上清液。使用人CCL2/MCP-1DuoSet ELISA(R&D Systems DY279)遵循制备商的说明来测量MCP-1的浓度。

在此后，该测定被称为“MCP-1抑制测定”。

MCP-1抑制测定用于比较人源化969.g5与嵌合Ab969.g0的活性。使用单核细胞的四种不同供体来进行五个独立测定。在所有测定中，Ab969.g5人源化移植物展现相较于亲本嵌合抗体969.g0的出人意料地显著较低的活性。单个代表性实验显示在图13中。相较于969.g5的333.0ng/ml，单核细胞测定中969.g0的平均IC₅₀为24.6ng/ml。这指示在使用该测定形式来比较两种抗体时抗体效力降低13.5倍。

使用Ab969进行一系列实验以显示人源化抗体在MCP-1抑制测定中展现降低的活性的原因。数据显示在MCP-1抑制测定中所观察到Ab969.g5活性的损失归因于将抗体和配体添加至靶细胞的顺序。Ab969.g0和Ab969.g5两者的活性在施加竞争性测定形式时减少，但更重要地，检测到其阻断活性的较大差异。为了分析人源化Ab969的较低“缔合速率”是否可负责效力的减少，进行了BIAcore分析。这些数据已鉴定，虽然Ab969.g0和Ab969.g5的K_D是相似的，但相对于969.g0的2.16x10⁶ M^-1s^-1，Ab969.g5的Ka更低，为1.57x10⁶ M^-1s^-1(参见表5)。在竞争性测定中，在CSF-1和抗CSF-1R抗体竞争结合相同受体时，如果针对配体的缔合速率也是高的并且配体以高浓度存在，则较慢的抗体缔合速率可导致降低的阻断活性。已知人CSF-1具有与抗体相类似的特别高的缔合速率22.19×10⁶M^-1s^-1，并且测定以高CSF-1浓度(250ng/ml)进行。

为进一步证实969.g5的阻断活性的减少归因于抗体的固有性质，开发了测量CSF-1与CSF-1R的结合的ELISA。此方法此后称为“ELISA配体-阻断测定”。此测定利用竞争性结合来进行，其中CSF-1和抗体在施加至板结合的CSF-1R之前预混合。还进行测定以评估CSF-1浓度对抗体活性的影响。

在配体阻断ELISA中使用1ng/ml的CSF-1浓度来测量969.g0和969.g5的IC₅₀时，两种抗体看起来分别具有12.83ng/ml相对19.65ng/ml的IC₅₀的相似活性。在测定中使用10ng/ml CSF-1的浓度时，Ab969.g0和Ab969.g5两者的IC₅₀增加，但更重要地，两者之间的差异分别进一步增加至79.29ng/ml相对268.10ng/ml。该趋势在使用100ng/ml CSF-1的测定中持续，其中Ab969.g0和Ab969.g5给出分别为828.70ng/ml和3947.00ng/ml的IC₅₀值。竞争性测定证实Ab969.g5在阻断CSF-1与CSF-1R的结合上的活性比Ab969.g0更小。效力的这种减少随着CSF-1浓度的增加变得更为显著。

iv)在MCP-1抑制测定中鉴定Ab 969的具有与嵌合Ab 969相当的活性的人源化移植物

通过瞬时表达制备Ab969人源化中间移植物组以使得可比较体外活性(表8)。对应的嵌合抗体(Ab969.g0)和完全人源化移植物(Ab969.g5)也包含在瞬时表达中以使得可在相同批次中进行抗体特征的直接比较。

表8：

在MCP-1抑制测定中测试各抗体的体外活性。选择使用利用抗体单一浓度的CSF-1滴定的测定形式，因为该形式使得能够快速筛选大抗体组并突显任何差异化CSF-1R阻断活性。在该测定中，检测到MCP-1从原代人单核细胞的剂量依赖性释放并且各抗体阻断CSF-1R活性的相对能力通过释放MCP-1时CSF-1的浓度测量。在存在重组人CSF-1的滴定(2倍系列稀释，包括18个浓度，最大浓度为500ng/ml)的情况下，将单核细胞以20,000个细胞/孔接种在培养基中。添加1μg/ml单一剂量的抗体。将细胞温育24h并收集上清液。通过ELISA测量分泌的MCP-1。MCP-1抑制测定显示抗体Ab969.g2和Ab969.g7保有高CSF-1R阻断活性，其中这两种实体在CSF-1以大于100ng/ml的浓度添加至单核细胞时能够完全抑制MCP-1分泌(图14)。在此测定中，对于Ab969.g5检测到活性的显著损失，其仅可抑制至多10ng/ml CSF-1浓度的MCP-1分泌。类似地，抗体Ab969.g9相较于Ab969.g2和Ab969.g7展现降低的CSF-1R阻断活性。

在MCP-1测定中测量选定的Ab969人源化移植物的IC₅₀以更为彻底地评估其抑制CSF-1介导的单核细胞活化的相对能力。使用几种不同供体在不混合来自混合来源的单核细胞的情况下评估抗体活性被认为是重要的。表9显示从使用6种不同供体对Ab969进行的测定累积的抗体的IC₅₀值。

Ab969.g2和Ab969.g7人源化移植物均显示与嵌合Ab969.g0抗体可比较的相对IC₅₀。明显对比地，Ab969.g5在测定中展现小得多的效力(平均嵌合/移植物IC₅₀比值为19.6)。

表9：

v)人源化Ab696抗体组的亲和力

通过BIAcore测量各Ab969人源化抗体移植物和亲本嵌合抗体的亲和力(表10)，其中进行三个独立实验并计算平均值。数据显示在从嵌合分子(Ab969.g0)至“完全人源化”抗体Ab969.g5的人源化过程中亲和力(K_D)似乎没有改变。然而，抗体“缔合速率”在人源化进行超过Ab969.g2移植物时减小；Ab969.g4和Ab969.g5均具有比之前的移植物更低的K_a值。此外，针对Ab969.g5的K_a比Ab969.g4低，潜在地表明DG异构化位点突变为SG又进一步地使抗体缔合速率减小。

表10：

结论：

在几个测定中对Ab969人源化移植物组的测试显示在轻链中位置71所的酪氨酸残基(例如Y71)改善抗体的活性。由Y71置换例如苯丙氨酸导致抗体缔合速率相对于亲本嵌合分子减小(降低的K_a)。在监测CSF-1R在原代人单核细胞中的活性的测定(MCP-1抑制测定)中显示，这导致抗体阻断CSF-1与CSF-1R结合的能力减小。

实施例4-人源化Ab696组的分子稳定性

i)热稳定性

通过两种独立方法来测定热稳定性(测量为熔化温度，Tm)；一种方法通过使荧光染料结合至暴露的疏水性表面来监测解折叠(Thermofluor方法)，另一种方法通过量热分析(DSC)进行，其是正交技术。

通过Thermofluor针对抗体969(在PBS pH7.4中)的各种移植物测量的T_m概述在表11中。

表11

总体上，如通过Thermofluor测量的Fab’T_m显示大多数969移植物相较于IgG4对照更具热稳定性。

ii)样品浓度对聚集倾向的效应

最为在储存期间样品稳定性的预测，研究抗体浓度在PBS pH 7.4中对稳定性的效应。

实验1：

将抗体浓缩至>10mg/ml并在室温下温育5天。在浓缩后立即地(T₀)，969.g7显示浑浊并且969.g8显示略为乳白。相对地，根据目测检查判断969.g5样品为澄清的。在室温下温育5天之后，965.g5样品保持澄清，而969.g7和969.g8的聚集已进一步发展，各显示大量沉淀。

从本研究可将样品按照在这些条件下抵抗聚集的顺序排序为如下：969.g5>969.g8>969g7。

实验2：

在浓缩之前，根据目测检查观察到所有三种抗体样品为澄清的，除了显示乳白的969.g6(4.68mg/ml)以外。在浓缩至16mg/ml后，在室温以及4℃下储存24小时后均观察到969.g6的沉淀。然而，969.g1和969.g4两者保持目测澄清。在5天的进一步温育之后，样品969.g1在室温以及4℃下均观察到明显的大颗粒。如根据目测检查判断的，在室温或4℃下未观察到样品969.g4的聚集。

由本研究可显示969.g6在以低浓度(4.68mg/ml)储存在PBS pH7.4中时具有一些聚集不稳定性。此外，此沉淀通过进一步的抗体浓缩而加剧。经浓缩的969.g1显示较缓慢的聚集速率，而经浓缩的969.g4在任一种储存温度下均维持稳定长达5天。针对聚集的稳定性的顺序因此为：969.g4>969.g1>969.g6。

实验3：抗体969.g2、969.g5、969.g7以及969.g9

在浓缩后立即地(T₀)、在过夜温育之后以及在浓缩后5天时，对样品进行分析。在浓缩之前根据目测检查观察到所有样品为澄清的并且不存在颗粒形成的证据。在浓缩至23.07mg/ml后立即地，如先前在实验1中所观察到的，969.g7样品显示沉淀。对969.g9观察到存在轻微乳白，这在室温或4℃下储存24小时之后变得更为显著。其它所有969移植物在浓缩后立即地根据目测检查观察到显示澄清。

在21天的温育之后，相较于室温下过夜温育之后所观察到的无进一步的可见改变；969.g7和969.g9移植物均因样品的浓缩而聚集，然而，其它样品未出现明显可见聚集。

总言之，969.g2样品显示因浓度增加的最小聚集倾向。这还与如通过Thermofluor测量的最高T_m相关联。

结论：在人源化Ab969组的表达以及纯化期间，清楚的是提高抗体浓度到10mg/ml以上会导致一些人源化抗体移植物的快速沉淀。具体地，Ab969.g1、Ab969.g6以及Ab969.g7形成沉淀，而Ab969.g2、Ab969.g4以及Ab969.g5不形成沉淀。此数据显示由轻链中位置38上的赖氨酸残基(K38)置换谷氨酰胺在被浓缩到10mg/ml以上的情况下改善抗体稳定性。

实施例5-Ab969.g2的体外分析

i)Ab969.g2的序列

Ab969.g2包含gL7轻链移植物以及gH2重链移植物。大鼠抗体(供体)V区序列与人种系(受体)V区序列之间的比对以及用于轻链移植物gL7和重链移植物gH2的最终人源化序列显示在图2A和2B中。

在移植物gH2中的重链框架残基均来自人种系基因。在人重链框架的位置1上的谷氨酰胺残基被替换为谷氨酸(E1)以例如通过在抗体和抗体片段的N-端将谷氨酰胺转化为焦谷氨酸来改善均质产物的表达和纯化。

除了残基71(Kabat编号)以外，移植物gL7中的轻链框架残基均来自人种系基因，其中供体残基酪氨酸得到保留。残基的保留提供了人源化抗体的改善的效力，如实施例3中所显示。

ii)IL-34依赖性人单核细胞活化的抑制

在IL-34依赖性人单核细胞测定中评估Ab969.g2相较于969.g0的活性。使用两种单独的单核细胞供体来进行实验并且计算IL-34介导的单核细胞剌激的抑制的平均IC₅₀(表12)。Ab969.g2与Ab969.g0之间的IC₅₀无显著差异。

在存在100ng/ml重组人IL-34以及抗CSF-1R抗体的剂量滴定(半对数系列稀释，包括16个浓度，最大浓度为μg/ml)的情况下，将原代人单核细胞以20,000个细胞/孔接种。将这细胞温育24小时并收集上清液。通过ELISA(R&D systems DY279)测量分泌的MCP-1。图表显示MCP-1产生相较于仅CSF-1对照的百分比抑制。

表12

iii)Ab969.g2与人CSF-1R的SNP的结合

已报告在人群体中存在位于人CSF-1R基因的配体结合域中的四种非同义单核苷酸多态性(SNP)。这些SNP为V32G、A245S、H247P和V279M(图1F)。产生了人CSF-1R的各SNP变体并稳定表达在细胞系中。通过流式细胞术确认Ab969.g2与各SNP的结合。

实施例6-在食蟹猴中的药效学标志物分析

进行使用人源化单克隆抗CSF-1R抗体969.g2的药代动力学/药效学(PK/PD)研究以证实抗体在非人灵长类动物(食蟹猴)中的药理学活性。对三只食蟹猴的群组静脉内施用7mg/kg(组1)或1.5mg/kg(组2)单一剂量的969.g2抗体。抗体为良好耐受的，无不良临床体征。在25天研究期间的多个时间点采集血清样品。

通过ELISA测量969.g2的血清浓度并进行药代动力学分析(表13)。利用WinNonlin软件计算PK参数。

t_1/2为抗体在血清中的半衰期。

C_max为抗体在血清中的峰值浓度。

AUC为曲线下面积(浓度-时间曲线的积分)并提供对药物的总暴露的指示。

清除率为每单位时间清除药物的血浆的体积。

Vol.Dist.为分布体积，其是药物分布的表观体积。

在观察值和预测值之间存在良好关联性(动物2例外并视为离群值)。C_max与剂量成比例；AUC大于剂量比例，指示在较高剂量下清除率较低。在血清中检测到大部分969.g2。

表13

用于清除CSF-1的主要途径是通过结合至其同源受体CSF-1R。预期CSF-1与CSF-1R结合的阻断通过防止受体介导的清除来增加CSF-1的血清浓度；其是已在鼠模型中观察到的现象。因此，血清CSF-1浓度的增加是CSF-1R结合和抑制的药效学标志物。

969.g2的两种剂量均促使血清CSF-1快速且显著地累积。效应是剂量依赖性的，其中7mg/kg剂量提供比1.5mg/kg剂量高约10倍的峰值CSF-1浓度。通过CSF-1水平的标准化观察到药代动力学/药效学关系遵循抗体清除率。对于两个处理组，CSF-1水平在研究结束时返回至基线。结果显示在图15a以及15b中。

图15a显示从使用单一静脉内剂量的7mg/kg Ab969.g2处理的食蟹猴采集的血清样品中CSF-1的浓度。在两个独立测定中测量CSF-1的血清浓度。该图显示组1(7mg/kg)中三只动物的CSF-1的平均浓度与标准误差(正方形)。还显示Ab969.g2的平均血清浓度(圆形)。

图15b显示从使用单一静脉内剂量的1.5mg/kg Ab969.g2处理的食蟹猴采集的血清样品中CSF-1的浓度。在两个独立检测中测量CSF-1的血清浓度。该图显示组2(1.5mg/kg)中三只动物的CSF-1的平均浓度以及标准误差(正方形)。还显示Ab969.g2的平均血清浓度(圆形)。

循环人和食蟹猴单核细胞有两个主要群体；(i)CD14+CD16-“典型”单核细胞以及(ii)CD14+CD16+“非典型”或“常驻(resident)”单核细胞。鼠模型已证实常驻组织巨噬细胞(包括TAM)衍生自非典型单核细胞群体。此外，非典型单核细胞衍生自典型单核细胞群体的进一步的分化。通过全血的四色流式细胞术监测在以969.g2给药的食蟹猴中的循环单核细胞群体。使用抗食蟹猴-CD45-PerCP、抗人-HLA-DR-APC、抗人-CD14-FITC(My4克隆)以及抗人-CD16-PE(3G8克隆)抗体进行流式细胞术。针对各抗体使用适当的同种型对照来设置门控。典型单核细胞定义为CD45⁺HLA-DR⁺CD14⁺CD16^-。非典型单核细胞定义为CD45⁺HLA-DR⁺CD14⁺CD16⁺。

969.g2的两种剂量均促使非典型CD14⁺CD16⁺单核细胞在研究第一周期间逐渐耗尽。非典型单核细胞的几乎全部耗尽由7mg/kg剂量引起。通过7mg/kg和1.5mg/kg剂量的非典型单核细胞减少似乎在第4天时间点达到峰值，其中到第11天数量恢复为正常。结果显示在图15c中。条形图显示循环非典型CD14⁺CD16⁺单核细胞在整个研究中的时间点(第0天、第1天、第4天、第18天以及第25天(D))上的平均数量以及标准误差。还绘制血清CSF-1的平均浓度与标准误差。

此实施例证实(i)在食蟹猴中抗体969.g2能够结合CSF-1R并阻断CSF-1结合，(ii)证实抗体969.g2在非人灵长类动物模型中的药理学活性，(iii)证实抗体969.g2在体内选择性耗尽食蟹猴单核细胞的非典型群体-据信为肿瘤相关巨噬细胞的前体，以及(iv)血清CSF-1浓度适合作为用于测量969.g2活性的生物标志物。

实施例7-抑制MCF-7乳腺癌异种移植物的生长

抗体969.g2不能够与小鼠CSF-1R结合。因此，使用抗鼠CSF-1R抗体Ab535进行体内小鼠研究以显示Ab969.g2治疗癌症和纤维化的效用。已在许多体外实验中显示Ab535具有与Ab969.g2可比较的性质和活性。

Ab535已在实施例2的iii)中被显示抑制CSF-1介导的单核细胞存活，在实施例2的iv)中具有可比较的亲和力以及在实施例2的vii)中不触发CSF-1R内化。

如对Ab535进行的体内研究，可如下进行体内MCF-7乳腺癌异种移植物模型：

该研究测量具有人乳腺癌异种移植物MCF-7的皮下移植物的免疫缺陷裸小鼠中皮下施用(s.c.)的抗体Ab535相对于对照抗体、阳性对照和媒介物对照的治疗效力。肿瘤生长抑制用作治疗参数。人乳腺癌MCF-7用作免疫缺陷雌性NMRI：nu/nu小鼠中的皮下异种移植模型。从美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)(USA)肿瘤库获得MCF-7细胞系。针对实验用途，将细胞体外培养在RPMI1640培养基+10％FCS中。从亚汇合培养物收集细胞并皮下接种至小鼠中。在可触知的肿瘤尺寸(4至10mm)时，开始治疗。每周三次给予(s.c.)测试化合物以及媒介物对照。在第24天、第33天以及第40天每天一次静脉内施用阳性对照。在注射时针对体重个别地调整注射体积。每周三次用测径规测量肿瘤直径。根据V＝(长度×(宽度)2)/2计算肿瘤体积。对于计算相对肿瘤体积(RTV)，将各测量日的体积与第一治疗日相关联。在各测量日，计算每组的中位和平均肿瘤体积以及处理组对对照组(T/C)值的百分比中位数。

结果显示在图16中。Ab535显示剂量依赖性抗肿瘤效应。对照小鼠IgG抗体的两种剂量均不引起肿瘤生长抑制。相对肿瘤体积与媒介物对照和引起肿瘤生长抑制的阳性对照是可比较的。

结论：测试抗体Ab535在人乳腺癌异种移植物MCF-7中在最高剂量(30mg/kg/天)下引起统计学显著的抗肿瘤效应。

实施例8-抑制PC-3原位前列腺癌的生长

还使用原位前列腺癌模型PC-3体内测试抗体Ab535的抗肿瘤和抗转移效力。PC-3细胞系被遗传改变以持续地表达萤光素酶，从而允许体内生物发光成像分析，这允许体内监测肿瘤生长和在所选器官中进行离体转移分析。

此研究由随机分组后各包含11只(组5)或12只(其它所有组)雄性NMRI裸小鼠的6个实验组组成。在第0天，将PC-3细胞原位植入至所有参与的雄性NMRI裸小鼠的前列腺中。在第3天，经由体内生物发光成像验证肿瘤生长的开始。在第8天，进行第二体内生物发光成像并根据成像结果将患有肿瘤的动物随机分为六组，以使得平均生物发光强度和因而肿瘤尺寸在各组中是相似的。在后一天(第9天)，启动治疗。组2和组3的动物分别接受30和10mg/kg的对照抗体，每周皮下施用3次，直至第42天。治疗组4和组5的动物分别接受30和10mg/kg的抗体Ab535，每周皮下施用3次，直至第42天。组1的动物代表媒介物对照且接受媒介物(PBS)，每周皮下施用3次，直到第42天。组6的动物代表阳性对照且接受360mg/kg对照，每周静脉内施用一次，持续四周(在第10天、第17天、第24天以及第31天)。在研究过程中，在第3天、第8天(随机分组)、第15天、第22天、第29天、第36天以及第43天使用生物发光成像来体内监测原位植入的PC-3肿瘤的生长。

在研究结束时进行尸体剖检。测定初始肿瘤重量和体积。收集所选器官(肝、脾脏以及肺)，取各自的一部分固定在福尔马林中并且利用体外萤光素酶测定经由生物发光成像分析其余部分的转移模式。另外，收集来自一只腿的股骨和腰椎的相同部分，用于利用体外萤光素酶测定分析骨中的转移模式。

体内生物发光信号由原发性肿瘤和转移灶两者组成(全身成像)。基于这些数据，可针对所有组计算肿瘤生长曲线(图17)。肿瘤发育在所有研究组中是均匀的，直到随机分组和开始治疗。接下来，媒介物对照组1以及两个对照抗体RTE11组2和组3显示规律肿瘤生长。就阳性对照(组6)而言，可观察到在第43天体内测量的肿瘤生长的高度显著的减慢。在利用体内生物发光成像监测时，分别以30或10mg/kg施用的抗体Ab535(组4以及组5)导致肿瘤生长的显著减慢。

在第44天的尸体剖检期间测定初始肿瘤体积和湿重。阳性对照(组6)导致初始肿瘤体积和重量的高度显著的减小。抗体Ab535以30mg/kg施用(组4)，可观察到初始肿瘤体积和重量的显著减小。当Ab535以10mg/kg(组5)施用时，肿瘤体积的减小是显著的但小于组4所显示的。就对照抗体而言，未观察到显著的抗肿瘤效力。

利用生物发光成像技术，在尸体剖检后测量初始肿瘤萤光素酶活性。获得的结果与尸体剖检发现以及体内生长曲线的结果是可比较的。阳性对照(组6)导致初始肿瘤萤光素酶活性的高度显著的减少。以30mg/kg施用的抗体Ab535(组4)导致初始肿瘤萤光素酶活性的显著减少，而当Ab535以10mg/kg施用(组5)时减少量较低。就对照抗体而言，未观察到萤光素酶活性的显著减少。

利用离体生物发光成像技术来分析几种其它器官(肝、脾脏、肺、股骨以及腰椎的一部分)。就阳性对照而言，股骨和腰椎可显示萤光素酶活性的显著减少，而就肝和脾脏而言，信号减少刚好在显著性以下。就以30mg/kg施用的抗体Ab535(组4)而言，肝的萤光素酶活性的减少是显著的并且针对其它所有器官是显著的。对照抗体(组2以及组3)不导致所测试的所有器官中萤光素酶活性的任何减少。

总言之，可证实抗体Ab535在此肿瘤模型中的显著抗肿瘤效力以及显著的抗转移效力。

实施例9-抗CSF-1R抗体在博来霉素诱导的体内肺纤维化模型中的作用

博来霉素是首次从Streptomyces verticillatus分离的抗生素并已经被用作各种癌症的化学治疗剂。肺纤维化的博来霉素模型是良好建立的模型并基本上如Madtes,DK等人，1999,Am J Respir Cell Mol Biol,20,924-34中所述的进行使用。详细的方案可见于以下文献Morschl,E.,Molina,J.G.,Volmer,J.,Mohsenin,A.,Pero,R.S.,Hong,J.S.,Kheradmand,F.,Lee,J.J.和Blackburn,M.R.(2008),A3 adenosine receptor signalinginfluences pulmonary inflammation and fibrosis.Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.39:697-705。

使用的所有小鼠是购自Harlan Labs的野生型C57Blk6雌性小鼠(20g)。使用气管内(IT)切开滴注，其中用阿佛丁麻醉小鼠，并进行气管造口术以滴注50μl盐水中的3.5单位剂量的博来霉素或者单独的50μl盐水作为对照。以这种方式的处理导致在博来霉素暴露之后第7天达到峰值的炎性阶段和在暴露后第21天达到最大的纤维化期。研究了抗体Ab535的作用，其中抗体仅在模型的纤维化期给药并从第9-21天每周三次以30mg/kg皮下施用。在第21天处死动物，并且读出包括肺的病理组织学分析、BAL(支气管肺泡灌洗)流体细胞构成和BAL流体中可溶性胶原的测量。进行病理组织学分析以使用改良的艾氏评分系统对肺损伤进行评分来确定肺纤维化的严重度(Hubner RH等人，2008,Biotechniques 44:507-17)。用10％福尔马林将切下的肺膨胀至25cm压力，并通过一系列醇和二甲苯进行处理，包埋于石蜡中，在处理之前将组织切片进行脱石蜡，并用马森三色染剂进行染色。

使用市售可得的Sircol测定试剂盒按照制造商的说明评估BAL流体中可溶性胶原的量。

使用细胞离心涂片机(cytospin)制备物测定对BAL流体中巨噬细胞群体的作用。将等分试样的BAL细胞甩到显微镜载玻片上，用Diff-Quick进行染色并对巨噬细胞进行计数。

结果发现使用抗CSF-1R抗体Ab535在第9天开始给药的治疗性处理导致博来霉素诱导的肺纤维化极大减少。纤维化的严重度和程度均显著降低。处理的小鼠具有减少的胶原产生、改善的纤维化病理学和改善的肺屏障保护。

图18a显示相较于同种型对照，Ab535对博来霉素诱导的肺纤维化的处理对BALF胶原浓度的作用。

图18b显示与用同种型对照处理相比，Ab535对博来霉素诱导的肺纤维化的处理减少样品的艾氏评分，这因而显示用Ab535处理的小鼠具有改善的纤维化病理学。

图18c显示与用同种型对照处理相比，Ab535对博来霉素诱导的肺纤维化的处理减少血清中白蛋白浓度，这因而显示用Ab535处理的小鼠的血管通透性得到改善。

图19显示来自盐水对照、博来霉素+同种型对照和博来霉素+Ab535处理的动物的肺的病理组织学分析的代表图像。与同种型对照、博来霉素处理的动物相比，用Ab535处理的动物具有极大减少的肺纤维化。

实施例10-抗CSF-1R抗体在肺纤维化的腺苷脱氨酶缺陷模型中的作用

腺苷是强效信号传导核苷，当细胞遭受应激或损伤时其水平升高，并且当腺苷接合其特异性G蛋白偶联受体时产生广泛多样的应答。腺苷脱氨酶(ADA)是嘌呤代谢酶，其将腺苷转换成肌苷。已经产生了敲除ADA的小鼠并显示在血清以及组织诸如肾、肝和肺中具有升高的腺苷水平(Blackburn,MR等人，1998,J Biol Chem,273(9):5093-5100)。这些小鼠呈现出慢性肺病的特征，诸如肺泡破坏、气道炎症和过量的粘液产生，这与肺中腺苷的水平升高有关(Blackburn MR等人，2000,J Exp Med,192:159-70)。这些作用使得小鼠由于呼吸窘迫而在三周龄死亡。使用低剂量方案的外源ADA施用降低腺苷水平并延长这些小鼠的寿命，使得肺纤维化模型得以开发(Chunn JL等人，2005,J Immunol 175:1937-46，Pedrosa M等人，2011,PLoS One,6(7):e22667)。在该模型中，腺苷水平的缓慢升高与肺中促纤维化介质包括TGFβ-1的升高、肺组织中增加的胶原沉积以及增加的肺纤维化病理学有关。为了研究具有抗纤维化潜力的分子的作用，将ADA缺陷小鼠以低剂量外源ADA方案维持几周，然后停止ADA处理，并施用潜在的抗纤维化剂。

在肺纤维化的ADA敲除小鼠模型中研究了抗CSF-1R抗体Ab535的作用。在该模型中，将酶缺陷小鼠在出生后1-21天以ADA酶疗法维持。制备ADA-聚乙二醇(PEG)缀合物(Young HW等人，2004,J Immunol 173:1380-89)并在出生后1、5、9、13和17天施用肌内注射物(分别为0.625、1.25、2.5、2.5和2.5单位)，接着在第21天腹膜内注射5单位。在第21天后不施用进一步的酶。从第25天(出生后)每周三次以100μl体积、30mg/kg皮下给予Ab535直到在第42天将动物处死。

在第42天处死动物，并且读出包括肺的病理组织学分析、BAL流体细胞构成和BAL流体中可溶性胶原的定量。进行病理组织学分析以使用改良的艾氏评分系统对肺损伤进行评分来确定肺纤维化的严重度(Hubner等人，2008,Biotechniques 44:507-17)。用10％福尔马林将切下的肺膨胀至25cm压力，并通过一系列醇和二甲苯进行处理，包埋于石蜡中，在处理之前将组织切片进行脱石蜡，并用马森三色染剂进行染色。

还使用市售可得的Sircol测定试剂盒按照制造商的说明评估了BAL流体中可溶性胶原的量。

使用细胞离心涂片机制备物测定对BAL流体中巨噬细胞群体的作用。将等分试样的BAL细胞甩到显微镜载玻片上，用Diff-Quick进行染色并对巨噬细胞进行计数。

结果发现，使用抗CSF-1R抗体Ab535的治疗性处理显著减少ADA缺陷小鼠的肺纤维化。处理的小鼠具有减少的胶原产生、改善的纤维化病理学和改善的肺屏障功能和保护。

图20a显示与用同种型对照处理相比，Ab535对患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠的处理降低BALF胶原浓度。

图20b显示与用同种型对照处理相比，Ab535对患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠的处理减少样品的艾氏评分，这因而显示用Ab535处理的小鼠具有改善的纤维化病理学。

图20c显示与用同种型对照处理相比，Ab535对患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠的处理减少血清中白蛋白的浓度，这因而显示用Ab535处理的小鼠的血管通透性得到改善。

图20d显示接受Ab535的患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠的处理具有减少数目的BAL流体中巨噬细胞的。

图21显示来自用同种型对照或Ab535处理的正常小鼠(ADA+)和患有诱导肺纤维化的ADA缺陷小鼠(ADA-)的肺的组织病理分析的代表性图像。在ADA-小鼠中，用Ab535处理的动物具有相较于同种型对照极大减少的肺纤维化。

因此，已经显示在两个肺纤维化小鼠模型中使用抗CSF-1R抗体的处理能够有效治疗纤维化疾病。

本发明包括以下实施方案：

1.一种抗CSF-1R抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链的可变结构域包含以SEQID NO：23所示的序列，并且其中所述轻链的可变结构域包含以SEQ ID NO：15所示的序列。

2.根据实施方案1所述的抗CSF-1R抗体，其中所述抗体分子选自具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，例如选自包含Fab、经修饰的Fab’、Fab’、F(ab’)₂、Fv以及scFv片段的群组。

3.根据实施方案1或实施方案2所述的抗CSF-1R抗体，其中所述重链进一步包含重链恒定结构域，并且所述轻链进一步包含轻链恒定结构域。

4.根据实施方案1或实施方案3所述的抗CSF-1R抗体，其具有包含以SEQ ID NO：27所示的序列的重链和包含以SEQ ID NO：19所示的序列的轻链，其中所述抗体重链的C-末端赖氨酸是存在的或是不存在的。

5.根据实施方案1至4中任一项所述的抗CSF-1R抗体，其具有与其连接的效应分子或报告分子。

6.根据实施方案1至5中任一项所述的抗CSF-1R抗体，其针对人CSF-1R的结合亲和力为10pM或小于10pM。

7.第一分离的DNA序列和第二分离的DNA序列，其中所述第一分离的DNA序列编码根据实施方案1至6中任一项所述的抗体的重链，所述第二分离的DNA序列编码根据实施方案1至6中任一项所述的抗体的轻链。

8.一种克隆或表达载体，其包含根据实施方案7所述的第一分离的DNA序列和第二分离的DNA序列，其中第一分离的DNA序列表编码所述重链，第二分离的DNA序列表编码所述轻链。

9.第一克隆或表达载体和第二克隆或表达载体，其中所述第一克隆或表达载体包含编码根据实施方案7所述的重链的第一分离的DNA序列，所述第二克隆或表达载体包含编码根据实施方案7所述的轻链的第二分离的DNA序列。

10.根据实施方案8或实施方案9所述的载体，其中所述载体包含以SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：20所示的序列或以SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：16所示的序列。

11.一种宿主细胞，其包含根据实施方案8或9所述的克隆或表达载体。

12.一种用于制备根据实施方案1至6中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括培养实施方案11的宿主细胞以及分离所述抗体。

13.一种药物组合物，其包含与药学可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中之一种或多种组合的根据实施方案1至6中任一项所述的抗体。

14.根据实施方案13所述的药物组合物，其另外包含其它的活性成分。

15.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体，其用作药物。

16.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体，其用于治疗癌症。

17.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体，其用于治疗纤维化疾病。

18.根据实施方案13或14的药物组合物，其用作药物。

19.根据实施方案13或14的药物组合物，其用于治疗癌症。

20.根据实施方案13或14的药物组合物，其用于治疗纤维化疾病。

21.根据实施方案13或14的药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。

22.根据实施方案13或14的药物组合物在制备用于治疗或预防纤维化疾病的药物中的用途。

23.根据实施方案16使用的所述抗体，其中所述癌症选自：乳腺癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、白血病、淋巴瘤、皮肤癌、食道癌、胃癌、星形细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、头颈癌、胰腺癌以及卵巢癌。

24.根据实施方案17使用的所述抗体，其中所述纤维化疾病选自：肺纤维化诸如特发性肺纤维化和囊性纤维化、肾纤维化、肝硬化、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、瘢痕疙瘩、心肌梗死、硬皮病和关节纤维化。

25.根据实施方案17使用的所述抗CSF-lR抗体，其中所述纤维化疾病选自特发性肺纤维化和囊性纤维化。

26.根据实施方案19或21的用途，其中所述癌症选自：乳腺癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、白血病、淋巴瘤、皮肤癌、食道癌、胃癌、星形细胞癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、肝癌、甲状腺癌、头颈癌、胰腺癌以及卵巢癌。

Claims (15)

1.一种抗CSF-1R抗体或其结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链的可变结构域包含以SEQ ID NO：23所示的序列，并且其中所述轻链的可变结构域包含以SEQ ID NO：15所示的序列。

2.根据权利要求1所述的抗CSF-1R抗体或其结合片段，其中所述抗体是具有全长重链和轻链的完整抗体分子或是其结合片段，其中所述结合片段是Fab、经修饰的Fab’、Fab’、F（ab’）₂、Fv或scFv片段。

3.根据权利要求1所述的抗CSF-1R抗体或其结合片段，其中所述抗体是包含重链恒定结构域和轻链恒定结构域的结合片段。

4.根据权利要求1所述的抗CSF-1R抗体或其结合片段，其具有与其连接的效应分子或报告分子。

5.根据权利要求1所述的抗CSF-1R抗体或其结合片段，其针对人CSF-1R的结合亲和力为10 pM或小于10 pM。

6.第一分离的DNA序列和第二分离的DNA序列，其中所述第一分离的DNA序列编码根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其结合片段的重链，所述第二分离的DNA序列编码根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其结合片段的轻链。

7.一种克隆或表达载体，其包含根据权利要求6所述的编码重链的第一分离的DNA序列和编码轻链的第二分离的DNA序列。

8.第一克隆或表达载体和第二克隆或表达载体，其中所述第一克隆或表达载体包含根据权利要求6所述的编码重链的第一分离的DNA序列，所述第二克隆或表达载体包含根据权利要求6所述的编码轻链的第二分离的DNA序列。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的载体，其中所述载体包含以SEQ ID NO：24和SEQID NO：16所示的序列。

10.一种宿主细胞，其包含根据权利要求7或8所述的克隆或表达载体。

11.一种用于制备根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求10所述的宿主细胞以及分离所述抗体或其结合片段。

12.一种药物组合物，其包含与药学可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一种或多种组合的根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其结合片段。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其另外包含其它的活性成分。

14.根据权利要求12或13所述的药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自乳腺癌和前列腺癌。

15.根据权利要求12或13所述的药物组合物在制备用于治疗或预防纤维化疾病的药物中的用途，其中所述纤维化疾病是肺纤维化。