CN112315947A

CN112315947A - 一种装载姜黄素的外泌体在制备护肤品或者修复皮肤损伤药品中的应用

Info

Publication number: CN112315947A
Application number: CN202011327081.8A
Authority: CN
Inventors: 黄迎庆; 刘向晖; 汪春芳
Original assignee: Suzhou Innokare Bio Phaarmaceutical Tech Co ltd
Current assignee: Suzhou Innokare Bio Phaarmaceutical Tech Co ltd
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明提供了一种装载有姜黄素的外泌体在制备护肤品或者修复皮肤损伤的药品中的应用，姜黄素加载在外泌体上，能够被皮肤细胞有效吸收，可以应用于美白皮肤、改善皮肤色泽、修复皮肤损伤或疤痕、减少皮肤皱纹、延缓皮肤衰老中的一项或者多项应用。

Description

一种装载姜黄素的外泌体在制备护肤品或者修复皮肤损伤药品中的应用

技术领域

本发明属于生物技术研究应用领域，尤其是涉及装载有姜黄素的外泌体在制备护肤品或者修复皮肤损伤药品中的应用。

背景技术

外泌体（exosome）是一类直径在30~300nm左右的细胞外囊胞结构，在正常生理过程中由各种细胞释放到细胞外。在动物和人体内的各种体液中，比如血液、尿液、组织液、脑脊液、唾液以及母乳中，以及植物提取液中都发现有大量的外泌体存在。近年来的研究表明，外泌体内往往含有功能性的蛋白质、核酸、多肽、以及其他细胞因子，参与细胞间的信号传导、免疫调节等重要的生理过程，在细胞发育、组织再生、抗原呈递、炎症反应等方面发挥重要的生理功能。同时，外泌体作为一种天然的生物纳米材料，在药物开发中也常常被作为药物传送的纳米载体被广泛研究。

姜黄素（curcumin）是一类来源于姜黄根部的多酚类天然产物，在亚洲尤其是南亚、东南亚等地作为一种香料在食物和药物中有着广泛的应用。提纯后的姜黄素是一种明亮的橙黄色粉末，分子式为C21H20O6，一般以烯醇式和酮式两种同分异构体的形式存在。大量的研究工作表明姜黄素具有抗炎、抗氧化、调节细胞凋亡等功能，在肿瘤治疗、炎症调节、皮肤修复等方面有潜在的应用价值。

在对利用姜黄素的医用研究中，研究者们发现姜黄素的水溶性差，肠道吸收效率低，在体内常常以非活性的形态存在，生物利用度不高，在体外实验中表现出来的抗炎、抗氧化等功能无法在体内实验中得到有效实现。由于这些原因，直到今天，也没有基于姜黄素的药物获得FDA的批准上市。目前姜黄素主要是以食品添加剂的形式用于各种食品和保健品中。现在市场上也有一些化妆品、护肤品中直接添加了姜黄素，其目的是想要利用姜黄素的抗氧化功能达到美白的效果，同时想利用姜黄素调节细胞凋亡的功能达到清理皮肤死亡细胞、修复皮肤疤痕的作用。然而由于姜黄素的亲油性和极差的生物利用度，这种直接添加在化妆品、护肤品中的姜黄素同样很难被皮肤细胞吸收，无法发挥它相应的生理功能，因而在美白皮肤、延缓皮肤衰老、修复皮肤等方面的效果往往不能尽如人意。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述技术手段的局限性而提供一种装载有姜黄素的外泌体在护肤品或者修复皮肤损伤的药品制备中的应用。

本发明通过以下技术方案实现本发明的目的。

根据本发明的一方面，本发明提供了一种装载有姜黄素的外泌体用于制备护肤品或者修复皮肤损伤的药品，可以应用于美白皮肤、改善皮肤色泽、修复皮肤损伤或疤痕、减少皮肤皱纹、延缓皮肤衰老中的一项或者多项应用。姜黄素主要的生物活性有抗炎、抗氧化、调节细胞凋亡。姜黄素的抗炎、抗氧化的功能可以有效地阻止皮肤由于日照等原因引起的衰老和损伤，减少皮肤色素沉积，明显地改善皮肤的光泽。同时也会更好地保持皮肤弹性，减少皱纹。对于已经受损的皮肤细胞，姜黄素可以调节其凋亡，促进组织再生，加快修复各种皮肤创伤，减少疤痕。外泌体是细胞间传递各种生物大分子、进行信号调节的工具，姜黄素加载在外泌体上，能够被皮肤细胞有效吸收，从而实现它的生理功能。

根据本发明的一方面，本发明使用的外泌体可以是来自植物提取液中的外泌体，也可以是来自动物体液的外泌体，还可以是来自细胞培养产生的外泌体。这里的体液是血液、尿液、唾液、组织液、脑脊液、母乳等体液中的一种或者几种的混合。这里的细胞培养产生的外泌体可以是干细胞培养产生的，也可以是体细胞培养产生的，还可以是其它工程细胞等培养产生的。这些细胞培养产生的外泌体，一般可以通过收集细胞培养液，然后富集和纯化来获得。

从成本考虑，可以优选来自动物母乳比如牛奶中的外泌体。

根据本发明的一方面，本发明使用的外泌体可以通过常用的外泌体富集纯化工艺进行收集。这些工艺包括分步离心、高速离心、密度梯度离心、膜分离浓缩和纯化、沉淀、免疫吸附等常用方案中的一种或几种联用。富集和纯化外泌体的工艺选择主要根据外泌体的来源、生产的规模、富集纯化的效率、设备的可利用度来综合考虑选取。

根据本发明的一方面，将姜黄素溶解于合适的溶剂中，与悬浮在缓冲溶液中的外泌体混合后，姜黄素可以通过扩散、电转移等方式被装载到外泌体中。姜黄素装载到外泌体的效率与外泌体的粒径、外泌体的浓度、混合时间、混合温度都有一定的相关性。

优选地，溶解姜黄素的有机溶剂可以是乙醇或者二甲亚砜。

优选地，姜黄素在有机溶剂中的浓度范围为0.1~20mg/mL。

优选地，缓冲溶液可以是磷酸盐（PBS）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液、3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸（MOPSO）缓冲液、三羟基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）缓冲液和2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液的其中任一种，缓冲液浓度范围为10-100mmol/L，缓冲液pH范围为5.5-7.5。

优选地，外泌体直径为30~200nm。

优选地，外泌体与姜黄素混合时，外泌体在溶液中的质量浓度为0.05%~5%。

优选地，外泌体与姜黄素混合时，外泌体与姜黄素的质量比范围为1:0.1 到1:10。

优选地，外泌体与姜黄素混合时，混合时间的范围为5分钟到24小时。

优选地，外泌体与姜黄素混合时，温度控制在15~37⁰C。

根据本发明的一方面，装载有姜黄素的外泌体可以通过离心、沉淀、超滤、层析等方法富集纯化。

根据本发明的一方面，纯化后的姜黄素外泌体可以制成各种常用的用于接触皮肤的制剂剂型。通过混合姜黄素外泌体与各种常用的用于皮肤保护或者治疗的制剂，制备成含姜黄素外泌体的护肤品或者药品。与护肤肤用凝胶混合，制成含姜黄素外泌体的凝胶制剂；重新悬浮于适当的水溶液或者乳液，制成含姜黄素外泌体的水剂或者乳剂；浸泡面膜或者喷洒在面膜上，制成含姜黄素外泌体的面膜制品；与常用的皮肤乳剂、霜剂混合，制成含姜黄素外泌体的乳剂或者霜剂；悬浮于适当的溶液并装入雾化装置中，制成含姜黄素外泌体的雾化制剂。

优选地，姜黄素外泌体在制备好的制剂中的含量为0.05~5%。

根据本发明的一方面，制成的含有装载姜黄素的外泌体的护肤品或者药品制剂，可以直接涂抹于皮肤上，达到美白皮肤、改善皮肤色泽、修复皮肤损伤或疤痕、减少皮肤皱纹、延缓皮肤衰老等效果。

本发明的有益效果包括：

1.利用外泌体的脂质双分子层的结构，将生物利用度低的姜黄素装载到外泌体上，解决姜黄素溶解度差的问题，可以有效提高姜黄素的生物利用度。

2.充分利用了外泌体作为生物纳米材料的载具功能，使得皮肤细胞可以直接吸收外泌体及其装载的姜黄素，从而保证了姜黄素的生理活性在皮肤细胞内展现其功效。

3.利用姜黄素调节细胞凋亡的功能，可以及时清除受损的皮肤细胞，促进皮肤细胞的再生，达到修复皮肤损伤的目的。

4.利用姜黄素抗炎和抗氧化的功能，延缓皮肤衰老，保持皮肤弹性，减少皱纹，同时也减少黑色素沉积，改善皮肤色泽，美白皮肤。

附图说明

图1为本发明的流程示意图

图2为实施例1中收集的外泌体的粒径分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。本发明基本流程如附图1所示，包括收集外泌体原液、富集纯化外泌体、装载姜黄素到外泌体上、制备含姜黄素外泌体的护肤品或者药品、使用制备的护肤品或者药品、检验护肤品或者药品的效果等步骤。下述的实施例是为了进一步说明本发明的具体流程的一些实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

实施例1

收集牛奶中的外泌体。本实施例富集、纯化牛奶中的外泌体并确认分析，以供其他实施例使用。具体操作如下：

1.收集新鲜的脱脂牛奶。

2.用1N盐酸酸化脱脂牛奶到pH=4~4.5左右，低速离心去除沉淀，收集上清液，用截流孔径0.45 微米的滤膜过滤。

3.上清液继续用盐酸酸化到pH=2.5~2.8，保持2~60分钟。

4.用1N氢氧化钠溶液调节溶液pH=7.0~7.5。

5.采用截留分子量500KD的膜进行切向流过滤浓缩至初始体积的1%，然后用10mM的PBS溶液超滤换液。

6.换液后的外泌体溶液用0.22um的膜进行终端过滤。

7.外泌体通过Malvern Panalytic Nanosight进行检测，观察收集到的外泌体的粒径分布和浓度。

附图2是对牛奶中收集的外泌体稀释8000倍后的Nanosight检测结果。从检测结果可以看出，收集到的外泌体的粒径峰值直径在137nm左右，峰值粒径的外泌体浓度大约5X10¹⁰颗粒/mL。

实施例2

制备装载有姜黄素的外泌体。具体操作步骤如下：

1.将实施例1中得到的外泌体稀释在10mM的PBS中，配制成0.1mg/mL（0.01%）的外泌体溶液。

2.姜黄素溶解于乙醇中，用10mM的PBS稀释到0.1mg/mL。

3.按体积比1:1混合外泌体溶液和姜黄素溶液，在25⁰C低速搅拌混合15分钟。

4.转移混合液到离心管中在，10000g离心30分钟，0.2um膜过滤上清液。

5.过滤后的上清液在100000g离心60分钟，去除上清液，收集沉淀。

6.用10mM的PBS重悬收集装载有姜黄素的外泌体。

7.收集到的外泌体检测420nm的光吸收，计算装载的姜黄素浓度。

本实施例收集到的外泌体溶液显黄色。姜黄素在420nm处有特征吸收。通过UV-Vis测量收集到的外泌体溶液在420nm处的吸收，然后与姜黄素在420nm的吸收标准曲线对比，可以计算出制备的装载有姜黄素的外泌体的外泌体含量以及姜黄素的装载效率。在本实施例中姜黄素的装载效率为1.3mg姜黄素/1mg外泌体。

实施例3

装载有姜黄素的外泌体在制备护肤品上的应用。具体步骤如下：

1.实施例2中收集的外泌体用PBS稀释到1mg/mL的质量浓度。

2.按1:1的体积比在25⁰C混合外泌体溶液和市场上常用的护肤芦荟凝胶，搅拌30分钟，然后在4⁰C静置2小时后备用。制备好的含外泌体的凝胶中的外泌体质量浓度约为0.05%。

3.制备好的含姜黄素外泌体的凝胶均匀涂抹在测试皮肤上，每日早晚各一次，连续涂抹28天。作为对照，不含姜黄素外泌体的芦荟凝胶也同样操作于对照测试的皮肤上。

4.检测皮肤弹性。采用Reviscometer RVM 600皮肤声波传播时间探测仪测量皮肤的共振声波传播时间来检测皮肤弹性和紧密程度。测试数值越低，说明传播时间越短，意味着皮肤弹性越好，越紧密，皱纹越少。反之，则说明皮肤皱纹多，弹性差。

表1是皮肤弹性的对比测试结果。从测试结果可以看出，在测试实验28天时，涂抹了含有姜黄素外泌体凝胶的皮肤比对照条件下的皮肤有明显更短的共振声波传播时间。这个结果说明含有姜黄素外泌体凝胶能够有效地延缓皮肤衰老，减少皱纹，保持皮肤弹性。

表1 皮肤弹性的对比测试结果

测试用凝胶	使用凝胶前皮肤测试的共振传播时间（AU）	使用凝胶28天后皮肤测试的共振传播时间 (AU)
			实施例3中制备的凝胶	162±61	164±54
护肤芦荟凝胶	158±47	193±59

Claims

1.一种装载姜黄素的外泌体在制备护肤品或者修复皮肤损伤药品中的应用，其特征在于所述的护肤品或者药品中含有装载姜黄素的外泌体。

2.根据权利要求1所述的护肤品或者药品的应用，其特征在于，所述的护肤品或者药品是用于美白皮肤、改善皮肤色泽、修复皮肤损伤或疤痕、减少皮肤皱纹、延缓皮肤衰老中的一项或者多项应用。

3.根据权利要求2所述的护肤品或者药品，其特征在于，所述的护肤品或者药品中含有质量浓度0.005%~10%的装载有姜黄素的外泌体。

4.根据权利要求3所述的装载有姜黄素的外泌体，其特征在于，所述的外泌体的直径范围在30~300nm。

5.根据权利要求3所述的装载有姜黄素的外泌体，其特征在于，所述的姜黄素装载量为每1克外泌体装载0.01g~5g姜黄素。

6.根据权利要求2所述的护肤品或者药品，其特征在于，所述的护肤品或者药品可以是面膜、凝胶、乳液、悬浮液、水溶液、乳膏、霜剂、雾化剂等制剂形式中的任一种。

7.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述的外泌体可以是来自植物提取的外泌体，也可以是从体液中提取的外泌体，还可以是通过细胞培养产生的外泌体，或者是多种外泌体的混合物。

8.根据权利要求7中所述的体液中的外泌体，其特征在于，所述的体液可以是血液、尿液、唾液、组织液、脑脊液、乳液中的任一种或者多种的混合。

9.根据权利要求8中所述的体液，其特征在于，所述的体液可以来自人体，也可以来自其他动物体。

10.根据权利要求7中所述的细胞培养中的外泌体，其特征在于，所述的细胞培养生产的外泌体可以是干细胞产生，也可以是体细胞产生，还可以是其它工程细胞产生的外泌体。