CN112121179A

CN112121179A - 一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用

Info

Publication number: CN112121179A
Application number: CN202010967367.6A
Authority: CN
Inventors: 刘明录; 张传鹏; 金海锋; 强邦明; 王立新; 冯建海; 王亮; 韩庆梅; 许淼; 卢永灿
Original assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-15
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2020-12-25

Abstract

一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用。本发明提供一种组合物，所述组合物包括SMN腺相关病毒载体、星形胶质细胞。通过SMN腺相关病毒载体与星型胶质细胞的联合治疗可以对神经进行精准治疗和营养恢复，更有利于SMA病人的恢复。本发明采用本人口腔黏膜干细胞诱导分化的星形胶质细胞与AAV载体携带SMN基因注射一起用于纠正患者的SMN基因缺失或突变和运动神经元功能障碍。经口腔黏膜干细胞诱导的星形胶质细胞纯度高，时间短，能够提供大量细胞。AAV载体携带SMN基因能够精确治疗SMA疾病，诱导的星形胶质细胞具有分泌神经因子的功能，促进神经元恢复。

Description

一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用

技术领域

本发明涉及一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用，属于生物与新医药技术领域。

背景技术

脊髓性肌萎缩症是一种常染色体隐性运动神经元疾病，除神经肌肉连接缺损和骨骼肌萎缩外，还伴有脊髓突触和运动神经元的丢失。运动神经元端粒存活（SMN1）基因的缺失或突变是导致SMN蛋白全长水平较低的主要原因。

脊髓性肌萎缩症（SMA）是婴幼儿最常见的遗传性死亡原因。据估计，活产的发病率为1/10000，欧洲和亚洲后裔的携带者比率约为1/40-50。SMA是存活运动神经元1（SMN1）基因缺失和其他突变导致SMN蛋白丢失的结果。人类有一种SMN1同源物SMN2，它主要编码一种截短的、快速降解的蛋白质产物，这是由于核苷酸替换导致外显子7被排除。

星形胶质细胞，是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，历来被认为是神经系统的支持细胞，起着营养和保护、离子缓冲、递质代谢的作用。

目前的SMA药物Spinraza以SMN2基因表达为靶点，旨在修饰SMN2剪接，增加功能性全长SMN蛋白的产生。SMN是一种广泛表达的细胞内蛋白，已知与snRNP的组装和包含编码和非编码RNA的其他细胞RNP的形成密切相关。同样专利201810652815.6增加SMN蛋白表达的方法是利用CRISPR/Cas9技术破坏SMN2的7号内含子上的剪接沉默子ISS-N1或ISS+100而实现增加功能性全长SMN蛋白的产生。另一种产品Zolgensma以SMN1基因为靶点，利用AAV载体传递功能性全长SMN1基因，提高细胞SMN蛋白水平。同样专利CN108795946A提供了一系列携带人为设计SMN1基因表达框的重组腺相关病毒。通过体内实验表明，重组腺相关病毒载体能够高效地导入中枢神经系统，持续稳定地表达SMN1蛋白，延长脊髓性肌萎缩（SMA）模型动物的生存期，增加其体重，恢复其生长发育。

对于Spinraza和Zolgensma，以及相关专利，由于它们只能通过反义寡核苷酸或者增加SMN1基因的表达来纠正细胞中的SMN蛋白水平，因此必须尽早使用，否则，如果运动神经元细胞因为缺乏保证细胞生长的营养而死亡，它们就没有用处了。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用，纠正患者的SMN基因缺失或突变和运动神经元功能障碍；更好的激活和营养肌神经细胞。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种组合物，所述组合物包括SMN腺相关病毒载体、星形胶质细胞。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述SMN腺相关病毒载体表达SMN；所述SMN的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

所述SMN腺相关病毒载体中表达SMN的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

所述SMN腺相关病毒载体与星形胶质细胞的比例为80-120vg：1个。

所述星形胶质细胞由人口腔黏膜干细胞诱导分化得到。

所述SMN腺相关病毒载体的制备方法包括质粒载体的制备、细胞转染、病毒收集；所述质粒载体的制备，将表达SMN的核苷酸序列构建到腺相关病毒AAV-IRES-hrGFP上，得到pAAV质粒载体。

所述细胞转染，采用辅助质粒、包装质粒、pAAV质粒感染HEK293细胞；所述辅助质粒、包装质粒、pAAV质粒的质量体积比为1.5-2.5：0.8-1.2：0.8-1.2。

所述辅助质粒为pHelper，所述包装质粒为pAAV-RC8。

上述组合物在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用，所述SMN腺相关病毒载体、星形胶质细胞可以混合后再使用，也可以分开依次使用。

所述SMN腺相关病毒载体、星形胶质细胞可以混合后一起注射，也可以分开单独注射。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

（1）通过SMN腺相关病毒载体与星型胶质细胞的联合治疗可以对神经进行精准治疗和营养恢复，更有利于SMA病人的恢复。

（2）本发明采用本人口腔黏膜干细胞诱导分化的星形胶质细胞与AAV载体携带SMN基因注射一起用于纠正患者的SMN基因缺失或突变和运动神经元功能障碍。自体口腔黏膜干细胞诱导分化为星形胶质细胞，采用自体口腔黏膜干细胞诱导的星形胶质细胞用于临床不存在伦理问题，且降低免疫排斥反应。经口腔黏膜干细胞诱导的星形胶质细胞纯度高，时间短，能够提供大量细胞。AAV载体携带SMN基因能够精确治疗SMA疾病，诱导的星形胶质细胞具有分泌神经因子的功能，促进神经元恢复。

（3）本发明所述组合物，体外试验中和脊髓下运动神经元细胞（SMN-）共培养，SMN腺相关病毒载体、星型胶质细胞起到协同作用，共同促进脊髓下运动神经元细胞（SMN-）的运动神经元轴突的增长，促进脊髓下运动神经元细胞的标志物TUBB3、ISL1的基因的表达，促进脊髓下运动神经元细胞的细胞因子的NEFL、ISL1的表达。

附图说明

图1：本发明采用的星形胶质细胞的显微镜图；

图2：各实验组的运动神经元细胞的轴突长度的柱状图；

图3： RT-PCR方法检测脊髓下运动神经元细胞相关基因TUBB3表达量；

图4：RT-PCR方法检测脊髓下运动神经元细胞相关基因ISL1表达量；

图5： ELISA方法检测脊髓下运动神经元细胞相关细胞因子NEFL表达量；

图6：ELISA方法检测脊髓下运动神经元细胞相关细胞因子ISL1表达量。

具体实施方式

实施例1 SMN腺相关病毒载体的制备

（1）pAAV-IRES-hrGFP-SMN质粒载体的制备

SMN氨基酸序列见SEQ ID NO.1，基因序列见SEQ ID NO.2，将其构建到腺相关病毒AAV-IRES-hrGFP上，委托北京博迈德生物科技有限公司合成制备。

（2）细胞转染

HEK293细胞在15cm培养皿中，培养至细胞铺满培养皿70%进行转染。26ug辅助质粒（pHelper），包装质粒（ pAAV-RC8）13μg ，pAAV质粒（pAAV-IRES-hrGFP-SMN）13μg，使用96ul脂质体（汉恒生物）感染24h。

（3）病毒收集

A、转染后5天，收集上清，然后用甲苯酸酶核酸酶处理2小时（37℃）。

B、离心（3850g，5 min）收集上清。

C、用0.22um过滤器过滤，收集滤液。

D、使用Amicon Ultra-15离心过滤器，离心（5000g，45min），将0.22um过滤器过滤后滤液浓缩75倍。

E、碘克沙醇密度梯度纯化AAV，并取出40%病毒层。

1）使用双蒸水将OptiPrep^TM（AXIS-SHIELD PoC AS）稀释，制作成15%、25,40,54%的碘克沙醇溶液；

2）将10mL54,40,25，15%依次注入到10-15mL病毒收集液以下；

3）离心30500rpm，9h，18℃；

4）小心取出40%碘克沙醇溶液层的病毒，通过离心过滤器将病毒用PBS进行重悬，得到SMN腺相关病毒载体；

5）使用qPCR绝对定量方法进行病毒滴度测定。

实施例2 星形胶质细胞的培养

本发明中采用CN111254114A的方法，通过人口腔黏膜干细胞诱导分化为星形胶质细胞。由专业人员取出人口腔黏膜切片，培养获得人口腔黏膜干细胞，进行诱导分化为星形胶质细胞。

实施例3 细胞功能检测

（a）神经元轴突长度的检测

通过星型胶质细胞+SMN腺相关病毒载体、SMN腺相关病毒载体、星型胶质细胞、星型胶质细胞（SMN-）分别与脊髓下运动神经元细胞（货号BFN60808759，青旗生物技术发展有限公司）进行共培养。

具体步骤如下：

（1）采用专利CN111254114A的方法培养获得星型胶质细胞；

（2）本发明通过crispr/cas9 knockout方法敲除星型胶质细胞以及脊髓下运动神经元中的SMN基因，获得星型胶质细胞（SMN-）和脊髓下运动神经元（SMN-）；

（3）星型胶质细胞+SMN腺相关病毒载体、SMN腺相关病毒载体、星型胶质细胞、星型胶质细胞（SMN-）分别与脊髓下运动神经元细胞（货号BFN60808759，青旗生物技术发展有限公司）或脊髓下运动神经元细胞（SMN-）进行共培养7天，进行神经元轴突长度的测量。

（4）显微镜下测量神经元细胞轴突的长度（测量数量不少于20条）。

运动神经元正常组

实验组1：整合SMN基因的腺相关病毒+星型胶质细胞

将1*10⁵ 个脊髓下运动神经元细胞接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%。然后24孔板中加入1*10⁸vg(vector genome)整合SMN基因的腺相关病毒载体，然后加入1*10⁶个星型胶质细胞。

实验组2：整合SMN基因的腺相关病毒载体

将1*10⁵ 个脊髓下运动神经元细胞接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；然后24孔板中加入1*10⁸vg(vector genome)整合SMN基因的腺相关病毒载体。

实验组3：星型胶质细胞

将1*10⁵ 个脊髓下运动神经元细胞接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；然后24孔板中加入1*10⁶个星型胶质细胞。

实验组4：星型胶质细胞（SMN-）

将1*10⁵个脊髓下运动神经元细胞接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；然后24孔板中加入1*10⁶个星型胶质细胞（SMN-）。

上述各组进行共培养7天，每两天换一次液，进行神经元轴突长度的测量。

对照组：将1*10⁵个脊髓下运动神经元细胞接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；每两天换一次液，继续培养7天，进行神经元轴突长度的测量，为635μm

运动神经元SMN敲除组：

实验组1：整合SMN基因的腺相关病毒载体+星型胶质细胞

将1*10⁵ 个脊髓下运动神经元细胞（SMN-）接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；然后24孔板中加入1*10⁸vg(vector genome) 整合SMN基因的腺相关病毒载体，然后加入1*10⁶个星型胶质细胞。

实验组2：整合SMN基因的腺相关病毒载体

将1*10⁵ 个脊髓下运动神经元细胞（SMN-）接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；然后24孔板中加入1*10⁸vg(vector genome) 整合SMN基因的腺相关病毒载体。

实验组3：星型胶质细胞

将1*10⁵ 个脊髓下运动神经元细胞（SMN-）接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；然后24孔板中加入1*10⁶个星型胶质细胞。

实验组4：星型胶质细胞（SMN-）

将1*10⁵ 个脊髓下运动神经元细胞（SMN-）接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；然后24孔板中加入1*10⁶星型胶质细胞（SMN-）。

将细胞进行共培养，每两天换一次液，共培养至7天。

对照组：将1*10⁵个脊髓下运动神经元细胞（SMN-）接种在24 孔板中，然后加入1mL培养基（DMEM高糖+10%FBS），培养至细胞铺满培养皿面积的30%；每两天换一次液，继续培养7天，进行神经元轴突长度的测量，长度为430μm。

经检测，正常的脊髓下运动神经元细胞与星型胶质细胞（SMN+）以及SMN腺相关病毒载体共培养的运动神经元细胞的轴突长度显著长于其他实验组，更明显长于对照组。

经检测运动神经元SMN敲除组的共培养，实验组1的运动神经元轴突长度显著长于其他实验组，实验1组的运动神经元轴突长度为638μm、实验2组的运动神经元轴突长度为596μm、实验3组的运动神经元轴突长度为554μm、实验4组的运动神经元轴突长度为498μm，对照组的运动神经元轴突长度为430μm；实验2组的运动神经元轴突长度为对照组的1.39倍；实验3组运动神经元轴突长度为对照组的1.29倍，而实验1组运动神经元轴突长度为对照组的1.48倍，实验1组的运动神经元轴突长度和正常的脊髓下运动神经元细胞单独培养的长度接近。

可见，SMN腺相关病毒载体、星型胶质细胞可以起到协同作用，共同促进脊髓下运动神经元细胞（SMN-）的运动神经元轴突的增长。

（b） qPCR检测TUBB3、ISL1。

QPCR检测步骤：首先使用RNeasy Plant Mini Kit（购自Qiagen公司，货号：74904）提取脊髓下运动神经元细胞的RNA，提取方法见试剂盒说明书。使用PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（购自TaKaRa公司，货号：RR047A）逆转录二者的RNA形成cDNA，操作方法见试剂盒说明书。使用二者cDNA作为模板，荧光定量PCR试剂购自赛诺公司，检测的基因包括TUBB3、ISL1，以β-atcin基因作为内参基因。定量PCR引物序列见表1。每个PCR反应设3个重复。RT-PCR的程序设置为：94℃ 3min，（94℃ 15s，58℃ 30s，72℃30s）×35cycle，在退火过程收集荧光。

表1 荧光定量的基因及引物序列

经检测运动神经元正常组，与星型胶质细胞（SMN+）以及SMN腺相关病毒载体共培养的运动神经元细胞的TUBB3和ISL1表达量明显高于其他实验组。经检测运动神经元SMN敲除组的共培养比较，在实验组1中，TUBB3和ISL1表达量显著高于运动神经元SMN敲除组中其他实验组。

（3）ELISA法检测细胞因子；

检测步骤：

共培养至第六天后将培养基换成1ML DMEM，然后培养24h（37℃；5% CO₂），收集上清。检测步骤请参阅检测试剂说明书

人ISL LIM同源框蛋白1(ISL1)ELISA试剂盒（购自上海双赢生物科技有限公司规格为96T）

人NEFL Elisa检测试剂盒（购自北京冬歌博业生物科技有限公司规格为96T）

在正常组和敲除组中，与星型胶质细胞和SMN腺相关病毒共培养后的脊髓下运动神经元细胞标志物细胞因子ISL1, NEFL通过ELISA检测就本组内比较而言都有显著增高，且具有显著性的差异，证明成功星形胶质细胞能有效的促进脊髓下运动神经元细胞的生长。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用

<130> 2020

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 294

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu

1 5 10 15

Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp

20 25 30

Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala

35 40 45

Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly

50 55 60

Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser

65 70 75 80

Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp

85 90 95

Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr

100 105 110

Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr

115 120 125

Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro

130 135 140

Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu

145 150 155 160

Asn Glu Ser Gln Val Ser Thr Asp Glu Ser Glu Asn Ser Arg Ser Pro

165 170 175

Gly Asn Lys Ser Asp Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ala Pro Trp Asn Ser

180 185 190

Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Met Pro Gly Pro Arg Leu Gly Pro Gly

195 200 205

Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asn Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

210 215 220

Pro Pro His Leu Leu Ser Cys Trp Leu Pro Pro Phe Pro Ser Gly Pro

225 230 235 240

Pro Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro Ile Cys Pro Asp Ser Leu Asp Asp

245 250 255

Ala Asp Ala Leu Gly Ser Met Leu Ile Ser Trp Tyr Met Ser Gly Tyr

260 265 270

His Thr Gly Tyr Tyr Met Gly Phe Arg Gln Asn Gln Lys Glu Gly Arg

275 280 285

Cys Ser His Ser Leu Asn

290

<210> 2

<211> 1491

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

cggggcccca cgctgcgcat ccgcgggttt gctatggcga tgagcagcgg cggcagtggt 60

ggcggcgtcc cggagcagga ggattccgtg ctgttccggc gcggcacagg ccagagcgat 120

gattctgaca tttgggatga tacagcactg ataaaagcat atgataaagc tgtggcttca 180

tttaagcatg ctctaaagaa tggtgacatt tgtgaaactt cgggtaaacc aaaaaccaca 240

cctaaaagaa aacctgctaa gaagaataaa agccaaaaga agaatactgc agcttcctta 300

caacagtgga aagttgggga caaatgttct gccatttggt cagaagacgg ttgcatttac 360

ccagctacca ttgcttcaat tgattttaag agagaaacct gtgttgtggt ttacactgga 420

tatggaaata gagaggagca aaatctgtcc gatctacttt ccccaatctg tgaagtagct 480

aataatatag aacagaatgc tcaagagaat gaaaatgaaa gccaagtttc aacagatgaa 540

agtgagaact ccaggtctcc tggaaataaa tcagataaca tcaagcccaa atctgctcca 600

tggaactctt ttctccctcc accacccccc atgccagggc caagactggg accaggaaag 660

ccaggtctaa aattcaatgg cccaccaccg ccaccgccac caccaccacc ccacttacta 720

tcatgctggc tgcctccatt tccttctgga ccaccaataa ttcccccacc acctcccata 780

tgtccagatt ctcttgatga tgctgatgct ttgggaagta tgttaatttc atggtacatg 840

agtggctatc atactggcta ttatatgggt ttcagacaaa atcaaaaaga aggaaggtgc 900

tcacattcct taaattaagg agaaatgctg gcatagagca gcactaaatg acaccactaa 960

agaaacgatc agacagatct ggaatgtgaa gcgttataga agataactgg cctcatttct 1020

tcaaaatatc aagtgttggg aaagaaaaaa ggaagtggaa tgggtaactc ttcttgatta 1080

aaagttatgt aataaccaaa tgcaatgtga aatattttac tggactcttt tgaaaaacca 1140

tctgtaaaag actggggtgg gggtgggagg ccagcacggt ggtgaggcag ttgagaaaat 1200

ttgaatgtgg attagatttt gaatgatatt ggataattat tggtaatttt atggcctgtg 1260

agaagggtgt tgtagtttat aaaagactgt cttaatttgc atacttaagc atttaggaat 1320

gaagtgttag agtgtcttaa aatgtttcaa atggtttaac aaaatgtatg tgaggcgtat 1380

gtggcaaaat gttacagaat ctaactggtg gacatggctg ttcattgtac tgtttttttc 1440

tatcttctat atgtttaaaa gtatataata aaaatattta attttttttt a 1491

Claims

1.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括SMN腺相关病毒载体、星形胶质细胞。

2.根据权利要求1所述的一种组合物，其特征在于：所述SMN腺相关病毒载体表达SMN；所述SMN的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种组合物，其特征在于：所述SMN腺相关病毒载体中表达SMN的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的一种组合物，其特征在于：所述SMN腺相关病毒载体与星形胶质细胞的比例为80-120vg：1个。

5.根据权利要求1所述的一种组合物，其特征在于：所述星形胶质细胞由人口腔黏膜干细胞诱导分化得到。

6.根据权利要求1所述的一种组合物，其特征在于：所述SMN腺相关病毒载体的制备方法包括质粒载体的制备、细胞转染、病毒收集；所述质粒载体的制备，将表达SMN的核苷酸序列构建到腺相关病毒AAV-IRES-hrGFP上，得到pAAV质粒载体。

7.根据权利要求6所述的一种组合物，其特征在于：所述细胞转染，采用辅助质粒、包装质粒、pAAV质粒感染HEK293细胞；所述辅助质粒、包装质粒、pAAV质粒的质量体积比为1.5-2.5：0.8-1.2：0.8-1.2。

8.根据权利要求7所述的一种组合物，其特征在于：所述辅助质粒为pHelper，所述包装质粒为pAAV-RC8。

9.根据权利要求1所述的一种组合物在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用，其特征在于：所述SMN腺相关病毒载体、星形胶质细胞可以混合后再使用，也可以分开依次使用。

10.根据权利要求9所述的一种组合物在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用，其特征在于：所述SMN腺相关病毒载体、星形胶质细胞可以混合后一起注射，也可以分开单独注射。