KR101636531B1 - Six 1을 포함하는 전사인자를 이용한 근육 분화능을 갖는 근육줄기세포의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3의 네 가지 전사인자를 포함하는 근육줄기세포 제조용 조성물, 이를 이용한 근육줄기세포의 제조방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 근육줄기세포에 관한 것이다. 본 발명의 일 양태에 따라 제조된 근육줄기세포는 안정적인 근육분화능을 가진다.

Description

Six 1을 포함하는 전사인자를 이용한 근육 분화능을 갖는 근육줄기세포의 제조방법 {The method for preparing myogenic stem cell using transcription factors including Six 1}

본 발명은 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3의 네 가지 전사인자를 포함하는 근육줄기세포 제조용 조성물 및 키트, 이를 이용한 근육줄기세포의 제조방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 근육줄기세포에 관한 것이다.

뒤센형 근이영양증과 같은 선천성 근육질환에 대한 다양한 치료법이 시도되고 있지만 효과적인 치료법이 없는 상황이다. 또한 노령화 사회에 진입함에 따라 근위축증(sarcopenia) 환자가 증가하는 추세이며, 뿐만 아니라 운동으로 인한 근육손상 역시 증가하는 추세이다. 이러한 선천성 및 후천성 근육질환의 치료를 위해 줄기세포 치료법이 시도되고 있다.

현재 근육질환의 치료를 위해 시도 중인 줄기세포의 종류로 근육아세포(myoblasts), 근육위성세포(muscle satellite cells), 역분화줄기세포(induced pluripotent stem cells), 지방유래 줄기세포(adipose tissue derived stem cells) 등을 들 수 있다.

그러나 근육아세포 및 근육위성세포의 경우 근육에서 샘플을 채취해야 하는데 근육조직을 떼어내는 것이 매우 침습적인 것이 한계점이다. 한편 역분화 줄기세포를 근육질환에 적용할 경우 적절한 근육분화배지를 통해 분화시킨 뒤 세포표면 마커를 통해 선별하여 적용하는 방법이 제시되고 있으며, 지방유래 줄기세포의 경우 미세환경(niche) 조절을 통해 근육으로의 분화를 촉진시키는 방법이 제시되고 있다. 그러나 역분화 줄기세포 및 지방유래 줄기세포는 세포 분열 및 증식이 빨라서 줄기세포 치료를 위한 세포 수를 확보하기에는 좋지만, 목적세포인 근육이 아닌 다른 세포로 분화하거나 근육으로의 불완전한 분화 가능성에 그 한계가 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 근육질환치료에 활용할 수 있는, 적합한 줄기세포 확보를 위해 예의 노력한 결과, 체세포에 배아단계에서의 특정 근육분화에 관여하는 인자 및 특정 자기재생능에 관여하는 인자의 도입이 근육으로 분화하는 근육 줄기세포주를 바로 확립시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 근육줄기세포 제조용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 근육으로 안정적으로 분화할 수 있는 근육줄기세포 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 생산된 근육 줄기세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태는 Six1 (Sine oculis homeobox homolog 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; Eya1 (Eyes absent homolog 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; Esrrb (Estrogen-related receptor beta) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 Pax3 (Paired box 3) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 체세포로부터 근육줄기세포를 제조하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "근육줄기세포(myogenic stem cell)"는 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가 재생산 능력 및 근육으로의 분화할 수 있는 능력을 모두 포함하는 근육줄기세포의 특성을 갖는 세포를 의미하며, 자가 재생산능력 또는 무한증식 능력 및 근육분화 능력을 보이는 세포라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 자가 재생산 능력 및 근육 분화능력은 마커로서 확인이 가능하다. 또한 상기 근육줄기세포는 예를 들면 자가 재생능과 함께, Pax7 또는 Myf5의 발현을 보이는 세포일 수 있다.

본 발명에서 용어 "체세포"는 분화능 및 자가재생능이 제한된 성체를 구성하는 세포를 의미한다. 예를 들면 상기 체세포는 개체의 피부, 모발, 지방, 혈액 등을 구성하는 체세포일 수 있고, 바람직하게는 섬유아세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 체세포는 구체적으로 태아기(embryonic period)의 섬유아세포일 수 있다. 상기 체세포는 천연 발생의 체세포 또는 유전자 변형 체세포일 수 있다. 상기 체세포는 인간을 포함한 동물로부터 유래하는 것일 수 있으며, 또한 바람직하게 인간 또는 마우스 유래일 수 있다.

본 발명의 조성물은 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3의 각 단백질 또는 이들 각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 Six1, Eya1, Esrrb, 및 Pax3는 인간 또는 마우스 유래일 수 있다. 또한 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질은 각각 독립적으로 그의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있으며, 또한 야생형 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 변형, 치환 또는 결실 등의 변이가 있으나, 상기 단백질의 기능을 유지하는 단백질은 모두 포함한다.

상기 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3의 각 단백질을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드는 야생형 단백질을 코딩하는 핵산 서열일 수 있다. 구체적으로 상기 Six1, Eya1, Esrrb, 및 Pax3의 각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들은 각각 NCBI Reference Sequence: NM_009189.3, NCBI Reference Sequence: NM_010164.2, NCBI Reference Sequence: NM_011934.4, 및 NCBI Reference Sequence: NM_008781에 해당하는 핵산 서열일 수 있다. 또한 상기 야생형의 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기한 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3의 각 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 각각의 폴리뉴클레오티드는 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 (게놈, 또는 cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.

상기 체세포에 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3의 각 단백질 또는 이의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 체세포에 전달 또는 도입하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는, 세포에 핵산분자 또는 단백질을 제공하는 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 조성물에 포함되는 유효 성분들을 체세포의 배양액에 투여하는 방법 또는 체세포에 직접 주입하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 형태의 DNA로 세포 내로 도입하거나, 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 해당 폴리뉴클레오티드를 각각 삽입한 바이러스 벡터로 형질전환시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스, 시험관 내 전사(in vitro transcription)에 의해 생산한 메신저 RNA, 또는 엘렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 도입을 위해 렌티 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노 바이러스 또는 센다이(Sendai Virus) 바이러스를 이용할 수 있으며, 바람직하게 렌티 바이러스를 이용할 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 선별마커가 있거나, 또는 테트온(Tet-On) 시스템에 의해 발현이 조절될 수 있는 벡터에 포함될 수 있다.

상기 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 독립적으로 4개의 발현벡터에 각각 포함될 수 있으며, 또한 상기 폴리뉴클레오티드들이 1개의 벡터에 모두 포함되거나, 또는 2개 또는 3개의 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드들이 임의의 조합으로 나누어져 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 Six1 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1조성물; 및 Eya1 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Esrrb 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 Pax3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2조성물을 포함하는, 체세포로부터 근육줄기세포를 제조하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 체세포 및 상기 근육줄기세포는 상기한 바와 같다.

본 발명의 키트에서, 제1조성물에 포함되는 상기 Six1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 선별마커를 포함하는 벡터에 포함될 수 있다. 상기 선별 마커는 항생제 또는 형광선별마커일 수 있으며, 바람직하게는 항생제 마커일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 선별마커로서 퓨로마이신을 이용하였다.

상기 제2조성물에서 상기 Eya1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Esrrb 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 독립적으로 서로 다른 벡터에 포함되거나, 2개의 벡터에 임의로 조합되어 포함되거나, 또는 하나의 벡터에 모두 포함되는 형태로 제공될 수 있다. 또한 바람직하게 상기 Eya1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Esrrb 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 테트온(Tet-ON) 시스템에 의해 발현이 조절되는 것일 수 있다. 용어 "테트온(Tet-on) 시스템"은 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 존재할 때 목적 유전자가 유도 발현될 수 있는 시스템을 의미한다.

상기 키트는 형질전환된 세포를 선별하기 위한 물질 또는 단백질의 발현을 조절하기 위한 물질을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 근육줄기세포 제조를 위해 이용가능한 물질이라면 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 Six1의 도입을 선별하기 위해 퓨로마이신을 사용하였으며, 단백질의 발현을 조절하기 위해 독시사이클린을 이용하였다.

본 발명의 다른 양태는 1) Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 체세포에 도입하는 단계; 및 2) 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 도입된 체세포를 배양하는 단계를 포함하는, 체세포로부터 근육줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 근육줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 체세포 또는 상기 근육줄기세포는 상기한 바와 같다.

본 발명의 근육줄기세포 제조방법에서, 상기 제 1)단계는 체세포에 Six1 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 먼저 체세포에 도입한 다음, 이후 Six1가 도입된 세포에 Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법에 의할 수 있다. 상기 Six1을 체세포에 먼저 도입하여, Six1으로 형질전환된 세포주에 나머지 인자들을 도입하는 방법에 의할 경우 근육줄기세포를 보다 용이하게 확보할 수 있다.

또한 본 발명의 근육줄기세포 제조방법은 상기 Six 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 체세포에 도입한 후, 이어서 Six1 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 선별마커로 선별하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 선별 마커는 항생제 또는 형광선별마커일 수 있으며, 바람직하게는 항생제 마커일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 선별마커로서 퓨로마이신을 사용하였다. 상기 선별마커로 선별된 마커는 Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입 이전에 계대배양할 수 있다. 바람직하게는 8 내지 10회 계대 배양할 수 있다. 7회 이내로 계대 배양할 경우 형질전환 및 세포선별이 미완료된 상태일 수 있다.

본 발명의 근육줄기세포 제조방법에서, 상기 Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들은 테트온 시스템을 이용하여 과발현되는 것일 수 있다. 이 경우 상기 제조방법은 Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 Six1로 형질전환된 세포에 도입 후 독시사이클린(doxycycline)으로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 독시사이클린은 전사인자의 형질도입 후 초기에 처리하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 근육줄기세포 제조방법은 세포표면 마커를 이용하여 단일세포로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 형질도입을 통해 확립한 세포주의 순수도를 높이기 위함이다. 상기 세포표면 마커는 근육분화마커 및 줄기세포 관련 마커 (예를 들면 중간엽 줄기세포 관련 마커) 모두를 포함할 수 있다. 일 구체예에서는 CD90.2 마커를 이용하여 CD90.2 음성 세포를 선별하였다.

본 발명의 근육줄기세포 제조방법에서 상기 2) 단계의 형질전환된 체세포의 배양은 Six1, Eya1, Esrrb, 및 Pax3의 네 가지 전사인자의 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 근육세포 증식배지에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 근육세포 증식 배지는 당해 분야에서 근육세포 배양에 통상적으로 사용되는 모든 배지를 포함하며, 통상의 기술자는 알려져 있는 배지에 적절한 변형을 가할 수 있다. 바람직하게 상기 근육세포 증식 배지는 FBS 및 6 내지 15%의 말 혈청을 포함하는 배지이거나 또는 재조합 마우스 섬유아세포 성장인자(recombinant murine fibroblast growth factor)-basic을 포함하는 배지일 수 있다. 일 구체예에서 DMEM (high glucose) + 10% FBS + 10% 말 혈청 + 재조합 마우스 섬유아세포 성장인자-basic (5ng/ml)등을 포함하는 배지에서 배양하였다.

또한 본 발명의 제조방법은 상기 배양에 의해 확보된 형질전환된 체세포의 단일클론에서 근육분화초기마커의 발현이 높은 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 근육분화초기마커는 Pax7, Myf5, MyoD 또는 이들의 조합일 수 있다. 이를 통해 선별된 세포주는 선별하기 전의 세포주보다 높은 근육 분화능을 보인다. 구체적으로 선별 전의 세포는 근육분화 배지에서 배양한 후 10일부터 다핵을 갖는 근육다발을 보이는 반면, 선별 후의 세포는 근육 분화 배지에서 3일간 배양하면 다핵을 갖는 근육다발을 관찰할 수 있으며, 근육분화의 성숙도가 높은 것을 확인할 수 있다.

상기 배양은 계대 7 내지 15로 배양하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서 계대 7 내지 15로 배양된 상기 근육줄기세포에서 형질전환 후 안정된 형태를 관찰할 수 있었다.

본 발명의 근육줄기세포 제조방법에 의해 근육분화능을 가지면서 동시에 자기재생능을 갖는 세포주를 확립하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 근육줄기세포 제조방법에 의해 제조되는 근육줄기세포를 제공한다.

상기 근육줄기세포는 Pax7, Myf5, 또는 MyoD를 발현하는 것일 수 있다.

또한 상기 근육줄기세포는 근육분화 배지에서 배양될 경우 마이오제닌(mygenin)의 발현이 크게 증가하는 특징을 갖는다. 상기 근육분화 배지는 통상적으로 쓰이는 근육분화 배지 모두를 포함하며, 구체적으로 FBS 미포함 및 근육줄기세포의 증식배지 보다 낮은 함량의 말혈청을 포함하는 배지일 수 있다. 예를 들면 2% 내지 5%의 말혈청 포함하는 배지일 수 있다.

본 발명에서 네 가지 전사인자를 도입하여 세포표면마커 및 근육분화마커로 선별하여 확립한 근육 줄기세포 유사 세포주는 세포 배양용 접시에 대한 접착능이 작은 것을 그 특징으로 한다. 형태학적으로는 그 크기가 작고 핵과 세포질이 둥글며 근육 성상세포 (muscle satellite cells)와 유사한 모양을 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 근육 줄기세포주는 증식능이 뛰어나며 자기재생능을 보이는 것을 특징으로 한다. 상기의 배지에서 지속적으로 계대 배양이 가능하며, 본 발명의 실시예에는 계대 50까지 일정한 모양을 유지하며 배양할 수 있다.

본 발명의 Six1, Eya1, Pax3 및 Esrrb의 조합은 체세포로부터 근육 분화능을 갖는 근육 줄기세포를 제공할 수 있어, 선천성 및 후천성 근육질환 또는 근육손상에 대한 세포 치료제로서 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 Six1, Eya1, Esrrb, Pax3의 네 가지 전사인자 도입 전략 모식도이다.
도 2는 본 발명의 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3의 네 가지 전사인자 도입으로 과발현된 유전자 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 근육 줄기세포 유사 세포를 분화 전 후 근육 분화 마커를 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 4는 중간엽 줄기세포 및 근육줄기세포에 대한 다양한 세포표면 마커의 발현을 FACS 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 세포표면 마커로 선별하기 전 세포를 근육 분화 배지에서 15일간 배양한 결과를 나타낸다.
도 6은 세포표면 마커로 근육 줄기세포 유사세포를 선별한 후 세포를 근육 분화 배지에서 3일간 배양한 결과를 보여준다.
도 7은 세포표면 마커로 근육 줄기세포 유사세포를 선별한 후의 세포를 형광면역염색을 통해 근육분화 마커를 확인한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 근육줄기세포의 제작

1.1. 마우스 배아 섬유아세포의 배양

근육줄기세포 제작을 위한 체세포로 마우스의 섬유아세포를 이용하였다. 마우스 섬유아세포는 임신 13.5일령인 C57BL6 마우스의 배아(embryo)를 잘게 다진 후, 콜라겐분해효소(collagenase) 처리를 통해 단일세포를 분리하였다. 이를 DMEM (고농도의 글루코스(high glucose)) + 10% FBS(우태아 혈청) + 1% 글루타맥스(glutamax)로 구성된 배지에서 배양하고, 2계대가 되었을 때 1x10⁵의 세포를 6웰 플레이트에 접종(seeding)하였다.

1.2. 렌티바이러스 제조

실시예 1.1에서 제조된 섬유아세포로 유전자 도입을 위해 렌티바이러스를 이용하였다. 렌티바이러스의 제조방법은 5x10⁶의 293FT 세포주를 접종하였다. 293FT 세포에 플라스미드를 포장 혼합물 (packaging mixture), 및 리포펙타민을 통하여 형질주입(transfection)하고 48시간 경과 후 배양액을 취하여 3000rpm, 15분간 원심분리하였다. 이 후 상층액을 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 제조된 렌티바이러스 용액을 다음 실험에 이용하였으며, 남는 용액은 분주하여 70℃에 보관하였다.

1.3. Six1 유전자의 도입

Six1과 퓨로마이신 저항성 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 렌티바이러스를 생산하고 마우스 배아 섬유아세포가 2계대가 되었을 때 1x10⁵ 의 세포를 6웰 플레이트에 접종하였다. 렌티바이러스액과 폴리브렌을 혼합하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양하고 DMEM (high glucose) + 10% FBS + 10% 말 혈청 + 재조합 마우스 섬유아세포 성장인자-basic (5ng/ml) + 1% 페니실린/스트렙토마이신 배지로 교환한 후 배양한다. 6웰 플레이트의 세포가 플레이트 바닥 면적의 80% 내지 90%를 차지할 때 퓨로마이신 (5/ml)으로 선별하였다. 퓨로마이신으로 선별하는 과정을 거치면 대다수의 세포가 죽고 일부 퓨로마이신 저항성 있는 세포들이 살아남게 되는데, 퓨로마이신에 의해 선별된 세포를 계대 8이 될 때까지 배양하였다.

1.4. Eya1 , Esrrb 및 Pax3 유전자 도입

계대 8인 Six1 형질전환 세포주를 6웰 플레이트에 1x10⁵ 의 세포 수로 접종하였다. 접종한 뒤 18시간 뒤에 각각 Eya1, Esrrb, Pax3를 포함하는 세 종류의 플라스미드를 사용하여 1.2에서 제시한 방법으로 제조된 세 종류의 렌티바이러스액을 각각 600ul씩 15ml 코니컬튜브에 넣고 폴리브렌 (10mg/ml)을 첨가하여 볼텍싱을 통해 잘 섞는다. 세 종류의 렌티바이러스와 폴리브렌의 혼합액을 계대 8인 Six1 세포주를 접종해 둔 배양용기에 넣어주었다. 그 후 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하고 DMEM (high glucose) + 10% FBS + 10% 말 혈청 + 재조합 뮤라인 섬유아세포 성장 인자-basic (5ng/ml) + 1% 페니실린/스트렙토마이신 배지로 교환한 후 배양하였다. 이 때 독시사이클린을 배지에 첨가하여 형질도입한 Eya1, Esrrb 및 Pax3를 과발현시켰다. 계속해서 계대 배양을 실시하고 계대 7에서 근육 분화 마커의 발현을 관찰하였다.

실시예 2. 제작된 근육 줄기세포주의 분석

상기 실시예 1에서 제조된 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3 네 가지 전사인자가 도입된 세포의 근육 분화능을 살펴보기 근육분화 마커를 확인하였다. 또한 이와 함께 상기 네가지 전사인자 중 일부가 도입된 근육줄기세포에 대한 근육 분화 마커도 확인하였다(도 3 참조). 근육분화 마커의 확인을 위해 계대 7인 확립한 각 세포주들을 6웰 플레이트에 접종하였다. 6웰 플레이트의 90% 정도로 세포가 자라면, 트리졸을 사용하여 RNA를 분리한 뒤 이를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이후 근육분화마커인 Pax7, Myf5, MyoD, Myogenin, 및 Desmin에 대하여 PCR을 수행하여, 1.5% 아가로즈젤에 전기영동을 실시하였다. 그 결과 1) Six1만 도입된 세포, 2) Six1과 Eya 두 가지 전사인자가 도입된 세포, 3) Six1, Eya1 및 Pax3의 세 가지 전사인자가 도입된 세포에서는 Pax7, Myf5, MyoD, Myogenin, Desmin의 거의 발현하지 않거나 미약하게 발현하는 반면, 상기 Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3 네 가지 전사인자가 도입된 세포의 경우 Pax7, Myf5, MyoD, Myogenin, 및 Desmin이 모두 높게 발현하는 것을 확인하였다 (도 3).

또한 단백질 수준에서의 근육분화마커의 확인을 위하여 Pax7, Myf5, MyoD, Myogenin, Myosin heavy chain2에 대해서 면역형광 염색을 실시하였다. 상기 네 가지 인자가 도입된 세포를 4 well chamber 슬라이드에 접종하여 슬라이드 면적의 80%정도로 세포가 성장을 하면 4% 파라포르말린(paraformaline)으로 고정하였다. 수세후 메탄올을 챔버슬라이드에 추가한 뒤 -20℃에서 15분간 놓아둔 다음 수세하였다. 이후 5% BSA(Bovine serum albumin)를 사용하여 블록킹 과정을 1시간 동안 실온에서 실시한 다음, Pax7, Myf5, MyoD, Myogenin, Myosin heavy chain2 항체를 1:200으로 희석시킨 다음 추가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 PBS/T를 사용하여 수세한 뒤, FITC와 TRITC와 결합되어 있는 2차 항체를 1:500으로 희석한 뒤 챔버슬라이드에 첨가하였다. 이를 1시간 동안 실온에서 반응시킨 뒤 PBS/T를 사용하여 수세하였다. 이후 DAPI를 10분간 적용시켜 핵을 염색시킨 뒤 슬라이드를 커버슬립으로 덮어 공초점레이저 현미경으로 형광발현을 관찰하였다. 이를 통해 본 발명에서 제시한 세포주가 근육분화 마커인 Pax7, Myf5, MyoD, Myogenin, Myosin heavy chain2을 단백질 수준에서 발현하며 근육으로 분화하는 능력을 가짐을 확인할 수 있다 (도 7).

상기 세포를 근육 분화배지에 적용하여 근육 분화배지에서의 근육분화능력을 관찰하였다. 이를 위해 상기 세포를 6웰 플레이트에 5x10⁵ 개씩 접종하였다. 24시간 뒤 세포가 안정화되면 5% 말혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 H-DMEM을 분화배지로 하여 배지를 교환하였다. 배지교환은 24시간마다 실시하였다. 15일간 배양 후 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 뒤 Pax7, Myf5, MyoD, Myogenin 에 대하여 PCR을 실시하였다. 그 결과 1) Six1만 도입된 세포, 2) Six1과 Eya 두 가지 전사인자가 도입된 세포, 3) Six1, Eya1 및 Pax3의 세 가지 전사인자가 도입된 세포에서는 Pax7, Myf5, MyoD 및 Myogenin의 증가를 관찰할 수 없었지만, 본 발명의 네가지 인자가 모두 도입된 세포는 15일간 근육분화 배지에서 배양하였을 경우 후기 근육분화 마커인 Myogenin의 발현이 특이적으로 증가한 것을 확인하였다 (도 3). 이는 본 발명에 따른 근육줄기세포의 근육분화 배지에서의 근육분화능을 입증하는 결과이다. 또한 이와 더불어 본 발명의 네가지 인자가 모두 도입된 세포는 근육분화 배지에서 다핵을 갖는 근육다발(myotube)로 분화하는 것을 관찰하였다. 이러한 다핵을 갖는 근육다발은 분화배지를 적용한지 5일째부터 관찰가능하며 10일째가 되면 더욱 명확해졌다.

Claims (15)

1. Six1 (Sine oculis homeobox homolog 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
   Eya1 (Eyes absent homolog 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
   Esrrb (Estrogen-related receptor beta) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
   Pax3 (Paired box 3) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 체세포로부터 근육줄기세포를 제조하기 위한 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 Six1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Eya1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Esrrb 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 독립적으로 벡터에 포함된 것인 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 Eya1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Esrrb 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 하나의 벡터에 포함된 것인 조성물.
4. Six1 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1조성물; 및
   Eya1 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Esrrb 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Pax3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2조성물을 포함하는, 체세포로부터 근육줄기세포를 제조하기 위한 키트.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 Six1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 선별마커를 포함하는 벡터에 포함된 것인 키트.
6. 청구항 4에 있어서, Eya1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Esrrb 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Tet-on 시스템에 의해 발현이 조절되는 벡터에 포함되는 것인 키트.
7. 청구항 4에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포인 것인 키트.
8. 1) Six1, Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 체세포에 도입하는 단계; 및
   2) 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 체세포로부터 근육줄기세포의 제조방법.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 제 1) 단계는 체세포에 Six1 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입 후, 상기 Eya1, Esrrb 및 Pax3의 각 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것인 체세포로부터 근육줄기세포의 제조방법.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 Eya1, Esrrb 및 Pax3의 각 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 체세포에 도입하기 전에 Six1 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 선별마커로 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 체세포로부터 근육줄기세포의 제조방법.
11. 청구항 8에 있어서, 상기 Eya1, Esrrb 및 Pax3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 테트온 시스템을 이용하여 과발현되는 것인 체세포로부터 근육줄기세포의 제조방법.
12. 청구항 8에 있어서, 상기 2) 단계에서 세포의 배양은 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 근육세포 증식배지에서 배양하는 것인 체세포로부터 근육줄기세포의 제조방법.
13. 청구항 8에 있어서, 상기 2) 단계 전에 세포표면 마커를 사용하여 단일세포로 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 체세포로부터 근육줄기세포의 제조방법.
14. 청구항 8 내지 12항에 의해 제조되는 근육줄기세포.
15. 청구항 13에 있어서, 상기 근육줄기세포는 Pax7, Myf5 또는 MyoD를 발현하는 것인 근육줄기세포.

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