CN112079928B

CN112079928B - 一种抗pd-l1的单克隆抗体

Info

Publication number: CN112079928B
Application number: CN202010990579.6A
Authority: CN
Inventors: 薛童丹; 武鹏程; 孔双泉; 曾跃; 张立帆; 樊敏杰; 张梦思; 马晓飞; 尹长城
Original assignee: Beijing Protein Innovation Co ltd
Current assignee: Beijing Protein Innovation Co ltd
Priority date: 2020-09-19
Filing date: 2020-09-19
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2040-09-19
Also published as: CN112079928A

Abstract

本发明涉及一种与人PD‑L1特异结合的单克隆抗体，还提供编码该抗体的核酸序列。本发明还涉及所述PD‑L1单克隆抗体的制备方法，以及所述抗体在伴随诊断的免疫组织化学检测中的用途。

Description

一种抗PD-L1的单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及了一种与人PD-L1特异结合的单克隆抗体及其制备与用途，用途包括所述抗体作为单药一线治疗转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的抗癌药物Keytruda的诊断、治疗、预后评估及监测的体外诊断试剂。

背景技术

PD-L1又称细胞程序性死亡配体1，是T细胞表面细胞程序性死亡受体1(PD-1)的配体之一。PD-L1主要表达在免疫细胞和非造血细胞中，尤其是T细胞、B细胞、巨噬细胞等，许多肿瘤组织中也有PD-L1蛋白的表达。PD-L1与PD-1的结合能够向T细胞传递一种负向调控信号，诱导T细胞进入静息状态，减低CD8+T细胞的增生，限制自身免疫，负向调节炎症反应，保护自身组织，但这也会导致免疫系统无法正常识别和杀伤肿瘤细胞，造成免疫逃逸。

PD-L1/PD-1作为热门的免疫检查点分子靶标，已经开发出许多针对PD-1/PD-L1的抗体用于肿瘤的靶向治疗，包括默沙东开发的Keytruda(Pembrolizumab，帕博利珠单抗)、美施贵宝BMS公司研发的Opdivo(Nivolumab,纳武单抗)、罗氏-基因泰克共同开发的Tecentriq(Atezolizumab，阿特珠单抗)等。许多临床数据显示，PD-1/PD-L1抗体的疗效与患者PD-L1表达水平密切相关，因人而异。因此，对PD-L1表达水平及组织特异性检测成为PD-1/PD-L1靶向治疗的有效辅助手段。美国FDA早已批准多个针对药物治疗的伴随诊断检测，其中，2015年批准的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx就是由Dako公司开发的首个针对在非小细胞癌中检测PD-L1表达的伴随诊断方法。

PD-1单抗药物开发的品种很多，中国已上市品种已经达到5个，每个抗体虽然识别的靶蛋白相同，但表位却不尽相同，因此针对每种抗体进行有效性预估时选择的伴随诊断抗体虽然可以互相借鉴，但亦存在个性差异。本发明的目的是通过噬菌体展示淘选(PhageDisplay Panning)技术筛选出表达量高，亲和力高，特异性良好的PD-L1单克隆抗体用于PD-1单抗应用的伴随诊断，提高药物经济性和安全性。

发明内容

本发明提供一种与人PD-L1特异性结合的单克隆抗体，与现有技术抗体相比，具有表达量更高、和/或PD-L1结合特异性。具体地，本发明包括以下几个方面：

本发明第一方面涉及一种抗PD-L1单克隆抗体，或其抗原结合部分，其重链可变区VH由SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示氨基酸组成；其轻链可变区VL由SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示氨基酸组成。

本发明第二方面涉及一种核酸分子，其编码权利要求1-9所述抗体或其抗原结合部分。

本发明第三方面涉及重组载体，其含有权利要求9所述核酸分子。

在本发明中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述载体可以通过例如将上述核酸分子插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以直接通过人工合成得到。在本发明中，所述表达载体例如为原核表达载体，真核表达载体或噬菌体载体。

在本发明的实施方案中，所述噬菌体载体为pBPI-RD52,该载体以pCANTAB5E基础(购自GE公司)，其限制性酶切位点进行了调整，将NotI位点替换成SfiI位点。

在本发明的实施方案中，所述真核表达载体为pBPIRD1。该载体是将真核表达载体pcDNA3.4(购自Thermo Fisher)进行了改造，在本发明实施方案中，所述改造方法为插入在其下游融合了人IgG1抗体的Fc片段。

在本发明中，在所述噬菌体载体和真核表达载体中连接VH或VL序列后即得到重组载体。

本发明第四方面涉及重组细胞，其含有本发明第三方面任一项的重组载体。

在本发明中，所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述重组细胞可以通过例如转化、转染等方式将上述重组载体整合到细胞内获得。在本发明中，所述原核细胞例如各种基因型的E.coli感受态细胞。在本发明中，所述真核细胞例如人、鼠等来源的哺乳动物细胞。

在本发明的实施方案中，所述原核细胞为TG1([F′traD36 proAB lacIqZΔM15]supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5(rK–mK–))。

在本发明的实施方案中，所述真核细胞为HEK293的衍生细胞系。在本发明实施方案中，所述293细胞是经过驯化后可在特定的培养基中生长的Expi293悬浮细胞。在本发明的实施方案中，所述的特定培养基是没有人或动物来源成分，不含蛋白质，不含血清，化学成分明确的培养基。

本发明第五方面涉及与人PD-L1特异结合的单克隆抗体或其抗原结合部分，其由本发明第二方面任一项的核酸分子、第三方面任一项的重组载体或第四方面任一项的重组细胞制备得到。

在本发明的实施方案中，所述PD-L1单克隆抗体在哺乳动物细胞中表达量很高，并且可以特异性结合人PD-L1。

在本发明的另一实施方案中，所述PD-L1单克隆抗体在肿瘤组织切片的免疫组化检测中特异性染色。

发明的有益效果

本发明获得了一个高表达、高亲和力、高效价的抗PD-L1单克隆抗体，能够用于PD-L1的免疫组织化学检测。

附图说明：

图1：A，真核表达载体pBPI-RD1质粒图谱；B，真核表达载体pBPI-RD52质粒图谱

图2：PD-L1-Fc融合蛋白纯化SDS-PAGE图，蛋白上样量10μg，Marker上样量5μL，泳道1为蛋白Marker，泳道2为PD-L1纯化蛋白。

图3：抗PD-L1抗体细胞上清SDS-PAGE图，上清上样量20μL，Marker上样量5μL，其中泳道1-4为还原样品的电泳条带，具体的，泳道1为细胞上清阴性对照，泳道2、3为筛选出的重组表达抗体A8和A28，泳道4为PD-L1(22C3)抗体，泳道5为蛋白质预染分子量标记。

图4：抗PD-L1纯化抗体SDS-PAGE图，蛋白上样量2μg，Marker上样量5μL，其中泳道1-3为还原样品的电泳条带，具体的，泳道1、2、3为筛选出的高表达重组PD-L1抗体，泳道4为蛋白质预染分子量标记。

图5：抗PD-L1抗体ELISA结果图，ELISA横坐标抗体浓度为μg/mL。

图6：抗PD-L1抗体IHC结果图，A为对照用抗体22C3的IHC染色结果，B为A8的IHC染色结果

具体实施方案

下面将结合实例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为常规产品。

实施例1：人PD-L1蛋白表达

参照Uniprot数据库中登录号为Q9NZQ7的氨基酸序列和结构特征注释，以GenBank中编号为NM_014143.4为基础序列，合成编码人PD-L1胞外区(SEQ ID NO:16)的cDNA序列(SEQ ID NO:15)，并克隆至克隆质粒载体pUC57上(南京金斯瑞生物科技有限公司)，设计引物从质粒载体上扩增目的基因，经EcoRI/XhoI双酶切并回收后克隆入经同样双酶切的真核表达载体pBPI-RD52质粒中上(购自北京华大蛋白质研发中心有限公司)线性化片段，经测序鉴定后进行质粒制备，参照Expi293^TMExpression System Kit(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号A14635)说明书进行Expi293细胞转染和培养，维持细胞活力在70％以上，培养120小时后进行纯化。因重组的PD-L1蛋白带有人抗体Fc片段，所以可以使用Protein A进行纯化，纯化使用HiTrap rProtein A FF(GE公司，货号17507901)按照生产方提供的操作流程进行。

实施例2：抗PD-L1单克隆抗体的制备和筛选

用实施例1中表达的PD-L1融合蛋白免疫6-7周龄BALB/c小鼠，蛋白经皮下注射，在初次免疫之后，每2周进行一次加强免疫，共三次。血样中的抗体效价通过ELISA进行测定。当动物达到合适的抗体效价后，PD-L1进行最后一次免疫加强。三天后，处死小鼠，并放血，收集外周血和脾脏，供mRNA提取和噬菌体展示库构建用。

为构建scFv噬菌体展示库，分离小鼠外周血B细胞，取脾脏用Trizol试剂盒(Invitrogen Inc)提取总RNA，利用逆转录试剂盒(Invitrogen Inc)合成cDNA。使用上述cDNA为模板，利用简并引物扩增轻链可变区和重链可变区片段。因为重链和轻链基因的前导序列和可变序列中高度的DNA序列多态性，简并引物的设计和选择也相对复杂，诸如针对建(scFv/Fab)库和克隆抗体基因目的不同、扩增区域是否包括前导区信号肽、是否包括恒定区等，不同目的使用的策略不一(Jones等，Bio/Technology 9：88-89，1991；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.23：206-211，1993；Le Boeuf等，Gene 82：371-377，1989；Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3833-。3837，1989)。对于5'引物，通常设计这些引物以对应于可变区的第一框架(FR1)，在少数情况下，还对应于前导肽序列(L)。通常将3'引物设计为对应于框架4(FR4)区(多态性较低)或恒定区，在恒定区中易于鉴定保守的同型特异性序列。尽管已经设计了复杂的5'和3'引物组，但它们并不总是完全匹配DNA模板(Gavilondo-Cowley等，Hybridoma 9：407-417，1990；Leung等，BioTechniques 15：286-292，1993)。因此，在PCR扩增过程在FR1和/或FR4区域中可能会因引物人为改变免疫球蛋白重链和轻链基因的天然序列。本发明中选择的建库基础引物序列如下。扩增重链可变区的引物组见下，其中MHV1-MHV10为上游引物，MHVR为下游引物，下游引物与各上游引物成对扩增重链可变区基因。PCR时，每个反应20μl体系中加入上游和下游引物各2μl(终浓度各1μM)，2mM的dNTPs混合液2μl，10×PCR缓冲液2μl,加入cDNA模板1μl和1U热启动Taq DNA聚合酶,加H₂O补足20μl。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行25个循环扩增，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，回收的产物混合后以MHV-FR1和MHV-FR4为引物进行第二轮扩增，模板DNA的量为1μl(约200pg)，其余条件同上，回收的扩增产物5’端带有SfiI切点，3’端带有部分(GGGGS)3的编码序列。

MHV1：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCGATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3’

MHV2：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3’

MHV3：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3’

MHV4：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCAGGTTACTCTGAAAGAGTC-3’

MHV5：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCGAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3’

MHV6：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCGAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3’

MHV7：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’

MHV8：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3’

MHV9：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCGAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3’

MHV10：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCCGATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’

MHVR：5’-GCTACCACCGCCACCTGAGGAGACGGTGACC-3’

利用重链重扩引物：

MHV-FR4：5‘-GAGCCGCCGCCGCCGCTACCACCGCCACC-3’

MHV-FR1：5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’

用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV1-MKV10为上游引物，MKVR为下游引物，下游引物与各上游引物成对扩增轻链可变区基因。PCR时，每个反应20μl体系中加入上游和下游引物各2μl(终浓度各1μM)，2mM的dNTPs混合液2μl，10×PCR缓冲液2μl，加入cDNA模板1μl和1U热启动Taq DNA聚合酶，加H₂O补足20μl。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行25个循环扩增，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μLPCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，回收的产物混合后以MKV-FR1和MKV-FR4为引物进行第二轮扩增，模板DNA的量为1μl(约200pg)，其余条件同上，回收的扩增产物5’端带有部分(GGGGS)3的编码序列，3’端带有第二个SfiI切点。

MKV1：5’-GCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGTAGC

MKV1：GGTGGCGGTGGTAGCGATGTTTTGATGACCCAAACT-3

MKV2：5’-GGTGGCGGTGGTAGCGATATTGTGATGACGCAGGCT-3’

MKV3：5’-GGTGGCGGTGGTAGCGATATTGTGATAACCCAG-3’

MKV4：5’-GGTGGCGGTGGTAGCGACATTGTGCTGACCCAATCT-3’

MKV5：5’-GGTGGCGGTGGTAGCGACATTGTGATGACCCAGTCT-3’

MKV6：5’-GGTGGCGGTGGTAGCGATATTGTGCTAACTCAGTCT-3’

MKV7：5’-GGTGGCGGTGGTAGCGATATCCAGATGACACAGACT-3’

MKV8：5’-GGTGGCGGTGGTAGCGACATCCAGCTGACTCAGTCT-3’

MKV9：5’-GGTGGCGGTGGTAGCCAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3’

MKV10：5’-GGTGGCGGTGGTAGCGACATTCTGATGACCCAGTCT-3’

MKVR：5’-GATCTCCAGCTTGGTCCC-3’

MKVFR1:CGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGTAGC

MKVFR4:CCTTGGCCTATGCGGCCGTTAGATCTCCAGCTT

扩增回收的重链和轻链可变区经重叠PCR延伸为单链抗体序列，双端带有SfiI切点，回收后经SfiI酶切，连接入经SfiI线性化的载体pBPI-RD52。。将构建完成的质粒库转化到大肠杆菌TG1中。从大板中刮出库，并接种到2YTAG液体培养基中。将约10¹²pfu噬菌斑形成蛋白的辅助噬菌体加入含有scFv基因库的TG1样本中，并在震摇中于37℃孵育1小时。加入100μg/ml的氨苄青霉素，且培养物于30℃震摇过夜。细胞于4℃以4000rpm离心15分钟，所得的上清液与5ml 20％PEG 8000/2.5M NaCl混合，并在冰上孵育30分钟。之后噬菌体于4"C以8000rpm离心20分钟进行沉淀。噬菌体混悬于1.5ml含l％BSA的PBS，于涡旋混合器上震动，并以13000rpm离心5分钟，得到成团的碎片。上清液于4℃保存，或直接用于以下的生物筛选。

用PD-L1抗原蛋白包被免疫管，pH7.4的PBS稀释至浓度2μg/mL，2mL/管，4℃包被过夜。第二天，用2％的过滤除菌的脱脂奶粉进行封闭，4mL/管，37℃封闭2h。PBS-T漂洗3次。加入库容1000倍的用封闭液稀释的噬菌体，1mL/管，37℃孵育2h。PBS-T漂洗10次，将未结合的噬菌体洗去。加入1mL pH2.2的0.2M甘氨酸进行洗脱，洗脱时间约8min，加入pH9.0的1MTris进行中和，得到第一轮淘选产物。对第一轮的淘选产物进行滴度的测定，通过菌落PCR进行阳性率的测定，并进行扩增，准备第二轮淘选。重复操作，共进行三轮淘选，可以获得有一定亲和力的噬菌体。各轮淘选结果见下表：

将第三轮淘选的产物侵染到TG1中，涂布氨苄青霉素抗性的平板，获得单克隆。挑取一定数量的单克隆进行摇菌，侵染辅助噬菌体，获得噬菌体上清。

提前一天包被ELISA板，将PD-L1抗原用PBS稀释到浓度2μg/mL，每孔100μL，4℃包被过夜。第二天，用2％过滤除菌的脱脂奶粉进行封闭，每孔300μL，37℃封闭2h。PBS-T漂洗3次。分别加入噬菌体上清100μL，37℃孵育2h进行结合。PBS-T漂洗3次。每孔加入1:1000稀释的抗E-tag的抗血清100μL，37℃孵育2h。PBS-T漂洗3次。每孔加入1:10000稀释的羊抗兔抗体100μL，37℃孵育1h。PBS-T漂洗3次。进行显色，显色液现用现配，A液B液1:1混合，每孔100μL，显色一定时间后用50μL的2N H₂SO₄终止显色，在450nm波长下测量吸光值。根据吸光值筛选出亲和力高的菌株，进行测序鉴定。从高结合克隆中鉴定出8个scFv序列，并从中选出4个scFv抗体用于进一步表征。

实施例3：抗PD-L1单克隆抗体的表达与纯化

将4株抗体的轻链可变区基因融合鼠IgG1恒定区序列通过EcoRI/XhoI酶切位点克隆到pcDNA3.4载体上，重链可变区基因融合鼠κ恒定区通过酶切位点EcoRI/Eco47III克隆到pcDNA3.4载体上。

根据生产商的说明，使用Gibco转染试剂，在Expi293F细胞瞬时表达PD-L1嵌合抗体。简言之，使用ExpiFectamine 293Transfection Kit(Gibco)，用所得的载体转染Expi293F细胞，转染的总DNA为25μg/25mL，转染的Expi293F细胞在37℃，5％CO₂的培养箱中以125RPM转速培养4-5天后，收集细胞培养上清，3500rpm离心5分钟，用0.22μm滤膜过滤，除去细胞残骸。细胞表达上清用SDS-PAGE进行定性和半定量检测，选择表达量高于PD-L122C3的抗体(如图3所示，2株抗体A8和A28表达量明显高于PD-L1 22C3)，使用预平衡的Protein A亲和层析柱(GE)进行纯化，并用20mM柠檬酸，pH3.4缓冲液(洗脱，超滤浓缩后，抗体保存在PBS缓冲液中(pH 7.0)，其浓度通过NanoDrop测定。选择表达量最高的一株抗体A8进一步表征。

实施例3抗PD-L1抗体对PD-L1抗原的亲和力检测

通过ELISA方法检测抗体亲和力，简单而言，PBS包被真核表达PD-L1抗原200ng/孔，4℃过夜包被；弃去孔中液体，0.1％PBST，300μL/孔洗3次；1％ BSA，37℃封闭2h；弃去孔中液体，0.1％PBST，300μL/孔洗3次，PD-L1抗体用封闭液稀释到2μg/mL，依次5倍稀释，共6个浓度，稀释后的样品加入到对应孔中，37℃孵育1h；弃去孔中液体，0.1％PBST，300μL/孔洗3次，山羊抗小鼠-HRP，1:20000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h；0.1％PBST，300μL/孔洗3次，TMB显色，室温孵育8min，加入2N H₂SO₄终止，酶标仪OD450nm读数。结果如图5所示，A8的EC50与PD-L1 22C3抗体相当，约为0.027μg/mL。

实施例4抗PD-L1抗体免疫组织化学检测

取一小块正常人胎盘组织，10％福尔马林(3.7％-4％甲醛)固定后，经洗涤、脱水、透明、浸蜡等步骤处理，石蜡包埋，冷冻切片，常规脱蜡。一抗稀释液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的通用二抗、二氨基联苯肢(DAB)底物、底物稀释液等购自中杉金桥。

免疫组化检测样本组织中PD-L1表达与定位的方法:组织切片脱蜡至水，抗原修复，内源过氧化物酶阻断，以1:200滴加实施例3制备得到的抗体作为一抗和购自Dako的PD-L1(22C3)作为对照抗体，4℃孵育过夜。缓冲液洗3次每次5min。滴加通用HRP酶标二抗，在室温下孵育30分钟。缓冲液洗3次每次5min。DAB显色，复染，脱水封片后显微镜下观察染色情况。

结果如图6所示，PD-L1蛋白高表达于正常人胎盘组织细胞膜上，A8抗体与PD-L1(22C3)抗体均能在细胞膜上特异性强阳染色，胞浆无着色。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 北京华大蛋白质研发中心有限公司

<120> 一种抗PD-L1的单克隆抗体

<130> 2020

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ala Arg Ser Gly Trp Leu Ile His Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Phe

1 5 10 15

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Trp Ala Ser

1

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Asp Ile Val Thr

1 5

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 9

<211> 38

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Met Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 26

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser

20 25

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 13

<211> 36

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

1 5 10

<210> 15

<211> 753

<212> DNA

<213> homo sapien

<400> 15

gaattcgcca ccatgaggat atttgctgtc tttatattca tgacctactg gcatttgctg 60

aacgcattta ctgtcacggt tcccaaggac ctatatgtgg tagagtatgg tagcaatatg 120

acaattgaat gcaaattccc agtagaaaaa caattagacc tggctgcact aattgtctat 180

tgggaaatgg aggataagaa cattattcaa tttgtgcatg gagaggaaga cctgaaggtt 240

cagcatagta gctacagaca gagggcccgg ctgttgaagg accagctctc cctgggaaat 300

gctgcacttc agatcacaga tgtgaaattg caggatgcag gggtgtaccg ctgcatgatc 360

agctatggtg gtgccgacta caagcgaatt actgtgaaag tcaatgcccc atacaacaaa 420

atcaaccaaa gaattttggt tgtggatcca gtcacctctg aacatgaact gacatgtcag 480

gctgagggct accccaaggc cgaagtcatc tggacaagca gtgaccatca agtcctgagt 540

ggtaagacca ccaccaccaa ttccaagaga gaggagaagc ttttcaatgt gaccagcaca 600

ctgagaatca acacaacaac taatgagatt ttctactgca cttttaggag attagatcct 660

gaggaaaacc atacagctga attggtcatc ccagaactac ctctggcaca tcctccaaat 720

gaaaggcacc atcatcatca tcattaactc gag 753

<210> 16

<211> 238

<212> PRT

<213> homo sapien

<400> 16

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg

225 230 235

Claims

1.一种分离的PD-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征包括在于其重链可变区包含VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3序列，其轻链可变区包含VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3序列，其中：

所述VH-CDR1序列为：GYTFTSYW(SEQ ID NO:1)；

所述VH-CDR2序列为：INPSSGYT(SEQ ID NO:2)；

所述VH-CDR3序列为：ARSGWLIHGDYYFDF(SEQ ID NO:3)；

所述VL-CDR1序列为：QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:4)；

所述VL-CDR2序列为：WAS(SEQ ID NO:5)；

所述VL-CDR3序列为：QQSYDIVT(SEQ ID NO:6)。

2.权利要求1所述的单克隆抗体，其重链可变区进一步包含骨架序列VH-FR1，VH-FR2，VH-FR3，VH-FR4，从而按以下结构形成VH序列：

VH-FR1-VH-CDR1-VH-FR2-VH-CDR2-VH-FR3-VH-CDR3-VH-FR4。

3.权利要求2所述的单克隆抗体，其中：

所述VH-FR1序列为：QVHLQQSGAELAKPGASVKMSCKAS(SEQ ID NO:7)；

所述VH-FR2序列为：IHWVKQRPGQGLEWIGY(SEQ ID NO:8)；

所述VH-FR3序列为：EYNQKFMDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYC(SEQ ID NO:9)；

所述VH-FR4序列为：WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:10)。

4.权利要求1所述的单克隆抗体，其轻链可变区进一步包含骨架序列VL-FR1，VL-FR2，VL-FR3，VL-FR4，从而按以下结构形成VL序列：

VL-FR1-VL-CDR1-VL-FR2-VL-CDR2-VL-FR3-VL-CDR3-VL-FR4。

5.权利要求4所述的单克隆抗体，其中：

所述VL-FR1序列为：DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMTCKSS(SEQ ID NO:11)；

所述VL-FR2序列为：LAWYQQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:12)；

所述VL-FR3序列为：TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC(SEQ ID NO:13)；所述VL-FR4序列为：FGAGTKLELK(SEQ ID NO:14)。

6.权利要求1所述的单克隆抗体，其进一步包含鼠IgG1重链恒定区和鼠κ轻链恒定区。

7.一种组合物，包含权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。

8.一种核酸，编码权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。