CN111995880B - 一种生物发酵类胡萝卜素的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微生物发酵来源的类胡萝卜素提取方法，所述方法包括：(1)将含有类胡萝卜素的微生物发酵液进行喷雾干燥，得到第一菌粉；(2)将所述干菌粉使用破壁机破壁，得到第二菌粉；(3)将所述的破壁菌粉进行皂化处理，过滤，得到第三菌粉；(4)将第三菌粉进行萃取，过滤，收集滤液；(5)将所述滤液进行浓缩得到浓缩液并低温搅拌结晶，加入少量无水乙醇润洗，过滤，获得晶体，将晶体进行真空干燥，获得类胡萝卜素纯晶体。该方法的破壁率达99％，萃取率达98％以上，总收率达90％以上，且工艺操作简单、条件温和、类胡萝卜素损失少、产品质量稳定，溶剂回收率高，有效降低了成本，适合工业化生产。

Description

一种生物发酵类胡萝卜素的提取方法

技术领域

本发明涉及微生物活性成分提取分离技术领域。更具体的，涉及一种微生物发酵来源的类胡萝卜素提取方法。

背景技术

类胡萝卜素(carotenoids)是一类重要的天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类的黄色、橙红色或红色的色素之中。它是含40个碳的类异戊烯聚合物，即四萜化合物。典型的类胡萝卜素是由8个异戊二烯单位首尾相连形成。类胡萝卜素的颜色因共轭双键的数目不同而变化。共轭双键的数目越多，颜色越移向红色。迄今被发现的天然类胡萝卜素已达700多种，根据化学结构的不同可以将其分为两类，一类是胡萝卜素族(只含碳氢两种元素，不含氧元素，如β-胡萝卜素和番茄红素)，另一类是叶黄素族(有羟基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能团，如叶黄素和虾青素)。类胡萝卜素是体内维生素A的主要来源，同时还具有抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老等功效。

目前，类胡萝卜素的制备方法主要包括天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。天然提取法，类胡萝卜素产量低，成本高，且受制于原料来源；化学合成法存在安全隐患；而微生物发酵法具有工艺简单、生产效率高、生物活性与天然植物提取物一致等优点，越来越受到关注。随着现代分子遗传技术的发展，促进了基因的分离，实现了体内功能互补、重组酶的特性优化和转基因植物的创造，推动了类胡萝卜素的微生物发酵生物合成的进展。由微生物发酵生产的类胡萝卜素已经成为工业合成类胡萝卜素的很好替代品。其中，真菌微生物(如酿酒酵母，红法夫酵母，三孢布拉氏霉菌)作为食品药品行业应用广泛的发酵工程菌，无疑是微生物发酵产业化生产类胡萝卜素的最佳选择。

通常真菌微生物细胞壁的厚度大约为0.1～0.3μm，当细胞老化时，厚度还会增加，结构坚韧，很难破除，必须利用外力使之破坏或分解。而类胡萝卜素属于胞内产物，萃取过程中必须完全破坏真菌微生物细胞壁的结构，才能使类胡萝卜素充分释放出来得以有效萃取，否则类胡萝卜素会因为细胞壁的阻碍较难萃取出来。真菌微生物细胞壁独特的结构致使其破壁不易，常用的破壁方法如研磨法、冻融法、酸法、高压均质法、超声波法等对真菌微生物细胞壁的破壁效果并不理想,并且有些方法还会破坏胞内生物大分子物质的活性。

专利CN110407659A采用高压均质机对真菌微生物进行破壁，破壁压力100MPa，能耗较高，破壁率一般不超过80％；另外高压均质机需在液体环境中破壁，破壁后，细胞内容物大量涌出，固液分离较麻烦，即使采用膜浓缩进行固液分离，含水量仍然高达40％～50％，大大增加了后续真空干燥成本；专利CN201310116039.5公开了一种虾青素的提取方法，该方法采用酸性水溶液对藻类进行破壁，破壁步骤简单，破壁率高达95％以上，但破壁温度较高，导致虾青素不稳定而有效成分损失(一般大于25％)；有专利采用酶法破壁，但酶解处理耗时较长，一般数小时，类胡萝卜素损失在20％左右，且采用酶法破壁成本较高。

故真菌微生物破壁是生物发酵类胡萝卜素提取的难点所在，也是制约其提取收率和提取成本的重要原因。破壁不完全会增加类胡萝卜素萃取工艺的难度，限制其提取收率；另外，由于类胡萝卜素为还原性的物质，极易氧化，破壁过程中长时间暴露在不稳定环境中会增加其氧化风险，降低其纯度。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物发酵来源的类胡萝卜素提取方法。根据本发明的实施例，所述的方法包括：(1)将含有类胡萝卜素的发酵液进行喷雾干燥，得到第一菌粉；(2)使用低温剪切式破壁机将所述第一菌粉进行破壁处理，得到第二菌粉(3)向所述第二菌粉中加入碱性乙醇溶液进行皂化，过滤得到第三菌粉；(4)向第三菌粉中加入有机溶剂进行萃取，过滤菌粉收集滤液；(5)将所述的滤液进行真空减压浓缩，获得浓缩液并置于低温环境中搅拌结晶，加入少量无水乙醇润洗，过滤获得晶体，将晶体置于真空干燥箱中干燥，获得类胡萝卜素纯晶体。

发明人发现，采用先喷雾干燥后破壁的方案，避免了先破壁后干燥过程中类胡萝卜素长时间暴露在高温环境下的弊端，减少了类胡萝卜素的氧化和异构化损失，促进了产品收率的提高；同时采用单一溶剂进行萃取和结晶，避免了多种混合溶剂萃取、结晶导致的溶剂回收不易的问题，溶剂回收率可达90％以上，降低了成本；更重要的是，本发明采用低温剪切式破壁机进行干酵母细胞破壁，通过优化破壁条件，使酵母细胞破壁率高达99％以上，且破壁损失较小，极大地利于后续类胡萝卜素的萃取纯化，使最终萃取率高达98％以上，类胡萝卜素晶体纯度可达99.9％，总收率达90％以上，产品质量稳定，适合工业化生产。

根据本发明的实施例，所述类胡萝卜素的提取工艺还可以具有下述附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述微生物为类胡萝卜素发酵表达常用真核微生物工程菌(包括酿酒酵母，红法夫酵母，三孢布拉氏霉菌)，发酵固含量在5％～20％之间。

根据本发明的实施例，所述喷雾干燥参数设定为：进风温度150～200℃，优选180～190℃；出风温度70～90℃，优选80～90℃。

根据本发明的实施例，所述破壁方法为破壁机破壁，破壁条件为：温度0～10℃，第一菌粉含水量5％～15％，优选10％，破壁率至少98％。

根据本发明的实施例，所述碱的乙醇溶液为氢氧化钠的乙醇溶液。

根据本发明的实施例，所述氢氧化钠乙醇溶液浓度为1％～10％，优选2％～5％。

根据本发明的实施例，所述氢氧化钠乙醇溶液为干菌体重量的2～10倍，优选5～10倍。

根据本发明的实施例，使用有机溶剂对第二菌粉进行萃取。

根据本发明的实施例，所述有机溶剂选自乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯和乙酸异丁酯，优选乙酸乙酯；

根据本发明的实施例，所述有机溶剂加入总量为第一菌粉重量的10～30倍。

根据本发明的实施例，所述萃取次数为2～3次。

根据本发明的实施例，步骤(5)中，将所述萃取液进行真空减压浓缩。

根据本发明的实施例，所述真空减压浓缩的温度设置为40～50℃。

根据本发明的实施例，所述浓缩至萃取液的最终浓度为10～50g/L。

根据本发明的实施例，所述浓缩液放置于低温环境中搅拌结晶，加入少量无水乙醇润洗，过滤。

根据本发明的实施例，结晶的温度为-10℃～10℃，优选-4℃～4℃。

根据本发明的实施例，结晶时间2～24h，优选4～10h。

根据本发明的实施例，所述晶体置于真空干燥箱中进行干燥处理。

根据本发明的实施例，所述干燥温度为20～60℃，优选40～50℃。

根据本发明的实施例，所述干燥时间为2～20h，优选10～15h。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1显示表达番茄红素的酿酒酵母细胞破壁前的镜检图；

图2显示表达番茄红素的酿酒酵母细胞破壁后的镜检图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

以下实施例中所用的低温剪切式破壁机型号JRG-3C，该设备为通用型破壁机，冷却形式为封闭式循环水冷却。

以下实施例中采用的破壁率计算方法如下：

(1)分别取A1克破壁后菌粉和A2克破壁前菌粉于15ml离心管中；

(2)其中A1直接加入若干丙酮萃取，随后转移至20ml容量瓶中，继续加入丙酮萃取直至丙酮呈无色为止，定容至20ml,得到待测液A；

(3)A2按热酸法抽提酵母类胡萝卜素方法进行破壁抽提，然后按(2)所述加入丙酮若干萃取至无色为止，定容至20ml,得到待测液B；

(4)将待测液A及待测液B用异丙醇稀释N倍，后用紫外分光光度计于各样品对应波长下以异丙醇为空白，测定吸光度值A；吸光度值控制在0.2～0.8之间，否则需调整稀释倍数。

(5)菌粉含量计算

式中：

A是稀释液在对应波长下的吸光度，其中番茄红素波长为470nm，β-胡萝卜素为450nm，虾青素为480nm；N是测定吸光度时溶液的稀释倍数；

V是丙酮提取液的体积(ml),此处数值为20；

A^1％是1％浓度时的消光系数，其中番茄红素为3450AU，β-胡萝卜素为2500AU，虾青素为2100AU；

M是菌粉的称取质量(mg)；

10为A^1％时溶液的浓度(mg/ml)。

(6)破壁率计算

酵母细胞破壁后，可用丙酮直接抽提测定类胡萝卜素含量；而未破壁细胞则无法直接提取，需要先破壁后再用丙酮抽提测定含量，故本发明以破壁后细胞的类胡萝卜素含量与破壁前细胞类胡萝卜素的含量的比值定义破壁率，故破壁率计算公式为：

破壁率＝X1/X2*100％，X1为破壁后细胞的类胡萝卜素含量，X2为破壁前细胞的类胡萝卜素含量。微生物发酵来源的类胡萝卜素提取方法

在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物发酵来源的类胡萝卜素提取方法。根据本发明的实施例，该方法包括：S1干燥处理；S2破壁处理；S3皂化和过滤处理；S4萃取和过滤处理；S5浓缩、结晶、润洗、干燥处理。本发明的提取方法条件采用先干燥后破壁的方法，降低了类胡萝卜素暴露于高温环境的风险，减少了氧化和异构化的损失，极大地提升了后续成品的纯度。采用低温剪切式破壁机进行破壁，不造成降解损失的同时，破壁率也高达98％以上，降低了后续的萃取纯化的难度。采用单一的溶剂进行萃取和结晶，避免了采用多种混合溶剂萃取结晶导致的溶剂回收不易的问题，溶剂回收率达90％以上，降低了成本。该方法工艺简单、条件温和、产品纯度高、无重金属污染，总收率高达90％以上，产品质量稳定，适合工业化生产。

具体的技术方案如下：

一种生物发酵类胡萝卜素的提取方法，它包括如下步骤：

S1干燥处理

在该步骤中，将含有类胡萝卜素的微生物发酵液进行喷雾干燥，得到第一菌粉。由此，以便于去除发酵液中的大部分水分，有利于后续破壁处理。

根据本发明的实施例，喷雾干燥参数设定为进风温度150～200℃，优选180～190℃，出风温度70～90℃，优选80～90℃。

S2破壁处理

在该步骤中，将第一菌粉调节至10％左右的含水量，使用低温剪切式破壁机进行破壁处理。由此，以便于将细胞内色素暴露出来，以便于后续萃取。

本方案使用的低温剪切式破壁机利用两个转辊相对运行时产生的复合机械力场，使加入的干菌粉在低温下被剪切破壁，破壁率至少98％。

根据本发明的实施例，步骤S2中，破壁温度为0～10℃，保证了类胡萝卜素不会在破壁过程中造成降解损失。

根据本发明的实施例，步骤S2中，破壁时间为30～60min。本发明对破壁时间不作严格限定，只要破壁率达到98％以上即可，可根据实际情况灵活调整。

S3皂化和过滤处理

在该步骤中，向第二菌粉加入碱的乙醇溶液进行搅拌皂化，过滤并得到第三菌粉。由此，以便于去除干菌粉中脂溶性杂质和其它杂色素。

根据本发明的实施例，皂化所用的氢氧化钠乙醇溶液浓度为1％～10％，优选2％～5％，加入量为干菌体重量的2～10倍，优选5～10倍。通过加入氢氧化钠乙醇溶液进行皂化，以便将脂溶性杂质和其它杂色素去除，再通过过滤保留含类胡萝卜素的菌粉。

根据本发明的实施例，皂化处理是在40℃～50℃下进行30～60min，根据脂溶性杂质和杂色素的含量来确定具体皂化时间和温度，并尽量较少类胡萝卜素的破坏和降解。

S4萃取和过滤处理

在该步骤中，将第三菌粉进行重复萃取和过滤处理。由此，以便于使有机溶剂将菌粉中的类胡萝卜素充分萃取出来，以便于无机盐等杂质随着菌粉被过滤除去。

根据本发明的实施例，利用类胡萝卜素易溶于有机溶剂的特性，将其从破碎菌粉中萃取出来。完成萃取后过滤分离出菌粉和萃取液，分离出的菌粉可重复萃取，将萃取得到的萃取液进行合并。

根据本发明的实施例，萃取所用的有机溶剂选自乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯和乙酸异丁酯，优选乙酸乙酯，有机溶剂加入总量为第一菌粉重量的10～30倍。

根据本发明的实施例，步骤S4中，萃取的次数为2～3次。本发明对萃取次数不作严格限制，只要将菌粉中的类胡萝卜素萃取殆尽即可，具体可根据实际情况进行灵活调整。

根据本发明的实施例，本发明对于过滤方式不作严格限制，只要在不造成类胡萝卜素的破坏和降解的条件下，将菌粉和萃取液分离出来即可，具体可根据实际情况进行灵活选择。

S5浓缩、结晶、润洗、干燥处理

在该步骤中，将步骤S4中得到的萃取液进行真空减压浓缩，将萃取液浓缩至合适的浓度。由此，以便除去大部分的有机溶剂，并且可对有机溶剂进行回收处理，降低了工艺的成本。

根据本发明的实施例，真空减压浓缩设置的温度为40～50℃，萃取液浓缩至10～50g/L。

在该步骤中，将浓缩液置于低温环境中搅拌结晶。由此，以便使类胡萝卜素结晶析出，起到分离除杂的目的。

根据本发明的实施例，结晶处理完成后加入少量无水乙醇润洗，过滤，收集类胡萝卜素晶体。以便于进一步去除残余的脂溶性杂质，进一步提高纯度。

根据本发明的实施例，结晶是在0～10℃的低温环境进行的，结晶时间为2～24h。由此，以便使类胡萝卜素结晶充分析出，进一步提高得率和纯度。

根据本发明的实施例，结晶完成后进行过滤处理。由此，以便于分离去除有机溶剂，得到类胡萝卜素结晶，以便于后续干燥。

根据本发明的实施例，本发明对加入无水乙醇的量不作严格限制，只要有效去除晶体中残余的脂溶性杂质即可，具体可根据实际情况进行灵活调整。

根据本发明的实施例，本发明采用滤膜对晶体进行过滤。本发明对于过滤方式不作严格限制，只要在不造成类胡萝卜素的破坏和降解的条件下，将类胡萝卜素结晶和有机溶剂分离出来即可，具体可根据实际情况进行灵活选择。

根据本发明的实施例，在该步骤中，将所述的类胡萝卜素晶体置于真空干燥箱中进行干燥处理。由此，以便去除残余的有机溶剂和水分。

根据本发明的实施例，干燥的温度为20～60℃，优选40～50℃；干燥时间为2-20h，优选10～15h。由此，以便于充分去除残余的有机溶剂和水分，获得高纯度类胡萝卜素成品。

实施例1

一种生物发酵类胡萝卜素的提取方法，以表达番茄红素的酿酒酵母发酵液为原料进行提取，具体为：

(1)将发酵放罐后的20L番茄红素发酵液进行喷雾干燥，设定进风温度190℃，出风温度90℃，喷干得到干酵母菌粉1kg；

(2)干酵母菌粉采用纯化水加湿调节至含水量为10％，然后采用低温剪切式破壁机进行破壁处理，破壁30min，冷却形式为封闭式循环水冷却，温度8℃，收集破壁菌粉，经检测破壁率大于98％，番茄红素含量损失小于2％；

(3)破壁后的干燥菌粉中加入10L氢氧化钠含量为1％的乙醇溶液进行皂化，于40℃温度条件下搅拌60min，过滤收集菌粉，尽量抽干乙醇；

(4)向步骤(3)中得到的菌粉中加入10L乙酸乙酯进行萃取，于50℃温度条件下搅拌萃取30min，重复3次，合并萃取液，过滤菌体收集萃取液；

(5)将萃取液进行真空减压浓缩，设置温度为45℃，浓缩至终番茄红素终浓度为50g/L，并回收乙酸乙酯循环使用；

(6)将浓缩液进行冷冻结晶，放置于0℃低温环境中缓慢搅拌结晶8h，结晶完成后，采用滤膜过滤结晶母液进行溶剂回收，晶体加入少量无水乙醇润洗过滤；

(7)过滤后的晶体置于真空干燥箱中进行干燥，干燥温度设定为50℃，干燥时间为10h。得到番茄红素晶体纯品90g，含量98.86％，萃取率98％，产品总收率90％，乙酸乙酯溶剂总回收率92％。

实施例2

一种生物发酵类胡萝卜素的提取方法，以表达β-胡萝卜素的酿酒酵母发酵液为原料进行提取，具体为：

(1)将发酵放罐后的22Lβ-胡萝卜素发酵液进行喷雾干燥，设定进风温度180℃，出风温度80℃，喷干得到干酵母菌粉1.32kg；

(2)干酵母菌粉采用纯化水加湿调节至含水量为10％，然后采用低温剪切式破壁机进行破壁处理，破壁45min，冷却形式为封闭式循环水冷却，温度4℃，收集破壁菌粉，经检测破壁率大于99％，β-胡萝卜素含量损失小于1.5％；

(3)破壁后的干燥菌粉加入6.6L氢氧化钠含量为2％的乙醇溶液进行皂化，于40℃温度条件下搅拌60min，过滤收集菌粉，尽量抽干乙醇；

(4)向步骤(3)中得到的菌粉中加入16.5L乙酸乙酯进行萃取，于40℃温度条件下搅拌萃取60min，重复2次，合并萃取液，过滤菌体收集液；

(5)将萃取液进行真空减压浓缩，设置温度为40℃，浓缩至终β-胡萝卜素终浓度为40g/L，并回收乙酸乙酯循环使用；

(6)将浓缩液采用冷冻结晶，放置于-4℃低温环境中缓慢搅拌结晶4h。结晶完成后，采用滤膜过滤结晶母液进行溶剂回收，晶体加入少量无水乙醇润洗过滤；

(7)将过滤后的晶体置于真空干燥箱中进行干燥，干燥温度设定为50℃，干燥时间为12h。得到β-胡萝卜素晶体纯品120g，含量99.90％，萃取率98.5％，产品总收率91％，乙酸乙酯溶剂总回收率91％。

实施例3

一种生物发酵类胡萝卜素的提取方法,以表达虾青素的酿酒酵母发酵液为原料进行提取，具体为：

(1)将发酵放罐后的25L虾青素发酵液进行喷雾干燥，设定进风温度190℃，出风温度90℃，喷干得到干酵母菌粉1.4kg；

(2)干酵母菌粉采用纯化水加湿调节至含水量为9％，然后采用低温剪切式破壁机进行破壁处理，破壁60min，冷却形式为封闭式循环水冷却，温度0℃，收集破壁菌粉，经检测破壁率大于99％，虾青素含量损失小于2.5％；

(3)破壁后的干燥菌粉加入8.4L氢氧化钠含量为3％的乙醇溶液进行皂化，于40℃温度条件下搅拌30min，过滤收集菌粉，尽量抽干乙醇；

(4)向步骤(3)中得到的菌粉中加入7L乙酸乙酯进行萃取，于50℃温度条件下搅拌萃取30min，重复3次，合并萃取液，过滤菌体收集萃取液；

(5)将萃取液进行真空减压浓缩，设置温度为40℃，浓缩至终番茄红素终浓度为45g/L，并回收乙酸乙酯循环使用；

(6)将浓缩液采用冷冻结晶，放置于4℃低温环境中缓慢搅拌结晶10h。结晶完成后，采用滤膜过滤结晶母液进行溶剂回收，晶体加入少量无水乙醇润洗过滤；

(7)将过滤后的晶体置于真空干燥中干燥，干燥温度设定为40℃，干燥时间为15h。得到虾青素晶体纯品26.94g，含量97.89％，萃取率96.7％，产品总收率89.8％，乙酸乙酯溶剂总回收率95％。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种酿酒酵母发酵来源的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)将含有类胡萝卜素的酿酒酵母发酵液干燥，得到第一菌粉；

(2)所述第一菌粉含水量调节至5％～15％，进行破壁处理，得到第二菌粉；

(3)将所述第二菌粉进行皂化处理，得到第三菌粉；

(4)使用单一有机溶剂对第三菌粉进行萃取处理，得到萃取液；

(5)将所述的萃取液进行浓缩、结晶、润洗、干燥，得到类胡萝卜素晶体纯晶体；

其特征在于：步骤(2)中破壁处理需使微生物细胞破壁率至少达98％；步骤(3)、(4)、(5)中不引入水；得到的类胡萝卜素晶体纯度至少达97％，总收率至少达89％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的类胡萝卜素选自番茄红素、β-胡萝卜素和虾青素。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥为喷雾干燥；

喷雾干燥进风设定为温度150～200℃；

喷雾干燥出风设定为温度70～90℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述喷雾干燥进风设定为温度180～190℃。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述喷雾干燥出风设定为温度80～90℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破壁处理为使用剪切式破壁机对微生物进行破壁；

所述破壁处理前的第一菌粉含水量调节至5％～15％，

所述破壁处理温度为0～10℃。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述破壁处理前的第一菌粉含水量调节至10％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述皂化处理为使用氢氧化钠的乙醇溶液进行皂化；

所述氢氧化钠乙醇溶液浓度为1％～10％，

所述氢氧化钠乙醇溶液加入量为第一菌粉重量的2～10倍。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钠乙醇溶液浓度为2％～5％。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钠乙醇溶液加入量为第一菌粉重量的5～10倍。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用单一有机溶剂第三菌粉进行萃取处理；

所述的有机溶剂选自乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯和乙酸异丁酯；

所述的有机溶剂加入总量为第一菌粉重量的10～30倍。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中使用无水乙醇对结晶进行润洗。

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