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CN111879941B - 基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统及其制备与使用方法 - Google Patents

基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统及其制备与使用方法 Download PDF

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CN111879941B CN202010623610.2A CN202010623610A CN111879941B CN 111879941 B CN111879941 B CN 111879941B CN 202010623610 A CN202010623610 A CN 202010623610A CN 111879941 B CN111879941 B CN 111879941B
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Abstract

本发明属于纳米孔检测技术领域，具体公开一种基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统及其制备与使用方法。本发明的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统，结合固态纳米孔单分子传感器使用，其由一条线性DNA长双链及固定在其上的一个DNA四面体构成；DNA四面体内部与目标蛋白适配，目标蛋白在DNA四面体的结构内的结合位置可人工调整。本发明还提供上述系统的制备方法和使用方法。使用本发明的系统可以通过电信号分析出蛋白分子过孔时的空间位置以及过孔方向，进一步可控制蛋白的空间方向。

Description

基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统及其制备与使用方法
技术领域
本发明属于纳米孔检测技术领域，具体涉及基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统及其制备与使用方法。
背景技术
纳米孔是一种用于检测和表征溶液中单个分子的通用技术。纳米孔主要分为生物纳米孔和固态纳米孔两类。对于生物纳米孔而言，最常用的是生物蛋白纳米孔，例如α-溶血素(英文简称α-HL)。早期生物纳米孔主要用来检测核酸，但是生物蛋白纳米孔的空间和时间分辨率比较低且自身在稳定性、持久性等方面存在不足，固态纳米孔应运而生。固态纳米孔属于人造纳米孔，它的尺寸可控，有更好的稳定性，更加灵敏且可重复利用，是检测蛋白分子的理想工具。
纳米孔单分子传感器相比其它传统单分子检测技术而言具有低成本高通量的优势。当一个带电生物分子在外加电场力的作用下电泳穿过纳米孔时，由于其物理占位作用及其与纳米孔壁间的强相互作用，离子电流会产生瞬间变化，表现为短时的尖峰，每个尖峰对应一个易位事件，通过对电流变化以及易位时间的分析可以获取待测分子的带电特性，形状大小以及运动行为等特征。因此，纳米孔被广泛应用于一些单分子的检测中，如核酸分子，蛋白质，核酸与蛋白的结合物等，甚至用于单个DNA碱基以及蛋白质氨基酸的识别。
因为核酸分子及蛋白质分子的带电状态，取向性以及二级结构等都会产生不同的调制电流，使得实现高精度的核酸分子以及蛋白质分子检测具有极大的挑战性。目前，研究人员已经能够通过纳米孔检测到蛋白质分子的存在，并且能够区分不同种类的蛋白质分子，以及同种蛋白质的不同形态，比如折叠状态与展开状态。当有核酸和蛋白的结合物过孔时，能够分析出核酸上结合的蛋白质的数量。但是，到目前为止，对于蛋白质通过纳米孔时的具体形态还没有准确的研究定论，因为蛋白质是空间立体的结构，它通过孔时的方向性以及过孔过程中是否会发生形变等都无法确定，本发明就是为了解决这一问题。
发明内容
为了分析蛋白分子过孔时的具体动作，包括形变，空间转动等，本发明提供一种基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统及其制备与使用方法。
本发明的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统，结合固态纳米孔单分子传感器使用，其由一条线性DNA长双链及固定在其上的一个DNA四面体构成；DNA四面体内部与目标蛋白适配，目标蛋白在DNA四面体的结构内的结合位置可人工调整。
本发明的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统以DNA自组装四面体结构作为蛋白的核酸载体，通过DNA四面体内部的目标蛋白适配体与目标蛋白的结合，将目标蛋白携带过孔。由于DNA四面体固定在线性DNA长双链上，DNA四面体的位置就不能随意变动，也不能随意转动，结合在其内目标蛋白适配体上的目标蛋白的位置也是固定的，不会随意摆动。整个结构靠线性DNA长双链牵引通过固态纳米孔，所以结构可以以线性DNA长双链为轴纵向转动，但不会横向转动。根据以前的研究结果，双链过孔的方向是很容易区分的，所以整个结合物过孔的方向也是可以确定的，进而目标蛋白的过孔方向也就可以确定了。在设计DNA四面体时，适配体的位置可以调动，使得目标蛋白在核酸四面体中结合的位置、方向可以改变，根据实验结果电信号的差别，可以准确区分蛋白质过孔的方向以及形态是否变化。进一步，还可能实现蛋白质分子过孔方向的精确控制，有广泛的应用前景。
DNA长双链的长度以可牵引DNA四面体通过固态纳米孔为宜。
当目标蛋白为凝血酶时，构成DNA四面体的四条DNA单链的核苷酸序列分别如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.3为：
Figure BSA0000212731110000021
SEQ ID NO.4为：
Figure BSA0000212731110000022
SEQ ID NO.5为：
Figure BSA0000212731110000023
SEQ ID NO.6为：
Figure BSA0000212731110000031
当所述目标蛋白为链霉亲和素时，构成所述DNA四面体的四条DNA单链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.205、SEQ ID NO.206所示；
SEQ ID NO.205为：
AAAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAACTATCCGATTATTTATCAGCGTGCATAGTAGCTGAATCGTTACGTAACATCAGTAAGGTTTTT-biotin；
SEQ ID NO.206为：
TCGATCTAGCTCGAAATCGGATAGTTCAGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCTAATAGCTACAACTCGTTACGATTAGAGCTTGCTACTTTT-biotin。
制备本发明基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统的方法，包括如下步骤：
1)根据目标蛋白的大小和适配位点设计四条DNA单链，使其通过碱基互补配对结合成DNA四面体，并能通过碱基互补将DNA四面体固定在线性DNA长双链上；要求目标蛋白通过其适配位点与DNA四面体中的目标蛋白适配体结合后，其适配位置在DNA四面体内部；
2)合成设计的四条DNA单链后，退火形成DNA四面体；
3)将DNA四面体通过碱基互补固定在线性DNA长双链上。
优选地，DNA四面体通过设计的四条DNA单链以1∶1∶1∶1的比例混合进行退火形成。
具体地，在应用时，可先使DNA四面体结合目标蛋白，再将DNA四面体通过碱基互补固定在线性DNA长双链上，优选固定位置为长双链二分之一处之外的任一处。
由于二分之一处不能区分前后，所以四面体固定位置为长双链二分之一处之外的任一处。
也可先使DNA四面体与线性DNA长双链结合后，再与目标蛋白结合。
优选地，为了合成方便且形成较单链DNA更稳定的双链，所述线性DNA长双链可通过将一条单链DNA分子作为骨架链，然后设计多条短单链(订书链)用于与其互补配对来合成一条线性DNA长双链。在合成双链之前，先确定DNA四面体要结合的位置，然后去掉该结合位置的订书链后，再进行双链合成，以使获得的DNA双链存在待结合DNA四面体的缺口，以在后续步骤中可与DNA四面体结合。
本领域技术人员也可采用其他方式合成所述线性DNA长双链，只要保证其可与DNA四面体结合即可。
使用本发明基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统的方法，包括如下步骤：
A、设计目标蛋白在DNA四面体中适配后方向不同的若干种基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统，分别在溶液中与目标蛋白混合，优选所述DNA四面体与所述目标蛋白的摩尔比为1∶20，得到若干种固定于线性DNA长双链上目标蛋白方向不同的四面体-蛋白结合体；
B、加入固态纳米孔单分子传感器进行过孔，利用机器学习的算法对捕捉到的电流信号进行识别、训练、分类，区分出不同过孔方向目标蛋白的行为。
本发明中，在步骤A制备所述四面体-蛋白结合体时，先将所述DNA四面体结合所述目标蛋白后，再将所述DNA四面体通过碱基互补固定在所述线性DNA长双链上。
优选地，所述目标蛋白在所述线性DNA长双链上的固定位置为所述线性DNA长双链的二分之一处之外的位置。
本发明还提供基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统在检测蛋白分子中的应用。
本发明还提供基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统在控制蛋白空间方向中的应用。
本发明优点在于开发了一个新型DNA携带蛋白过孔的检测机制，蛋白的载体是由四条DNA单链互补配对形成的正四面体结构，蛋白分子结合在四面体内部，整个结构由一条较长的DNA双链牵引过孔。在这个结构中，可以任意改变蛋白分子的结合位置，使其以不同的空间方向通过纳米孔。此结构对除凝血酶以外的蛋白分子也有很好的适用性，只要将结构中的适配体更换为待测蛋白相应的适配体即可。通过这种蛋白过孔方式，可以通过电信号分析出蛋白分子过孔时的空间位置以及过孔方向。也就是，通过本发明设计的四面体结构，可以控制蛋白的空间方向，这是纳米孔检测蛋白分子的一项突破。
本发明实验结果证明，这种DNA四面体携带蛋白分子过孔的机制是可行的，很可能在分子传感、疾病监测等医学领域具有更广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中DNA四面体的结构示意图。
图2为本发明实施例1中四面体-凝血酶结合体的结构示意图；
其中，1为DNA四面体，2为适配体，3为凝血酶，4为适配位点。
图3为本发明实施例2中四面体-凝血酶结合体过孔的示意图。
图4为本发明实施例2中样本过孔的信号轨迹示意图，其中左图为实施例1的仅有DNA四面体结构(未结合凝血酶)过孔的信号轨迹示意图；右图为实施例1中形成的四面体-凝血酶结合体过孔的信号轨迹示意图。
图5为本发明实施例3中四面体-凝血酶结合体固定在线性DNA长双链上四分之一处的结构示意图。
图6为本发明实施例3中四面体-凝血酶结合体固定在线性DNA长双链上二分之一处的结构示意图。
图7为本发明实施例3中固定在线性DNA长双链上的四面体-凝血酶结合体过孔的示意图。
图8为本发明实施例3中四面体-凝血酶结合体固定在线性DNA长双链上的不同位置的样本过孔的信号轨迹示意图；其中，图8A、图8B为固定在四分之一处的样本所对应的电流信号轨迹示意图；图8C为固定在二分之一处的样本所对应的电流信号轨迹示意图。
图9为本发明实施例4中第一个样本四面体-凝血酶结合体的结构示意图。
图10为本发明实施例4中第二个样本四面体-凝血酶结合体的结构示意图。
图11为本发明实施例1中相同浓度的DNA四面体溶液中加入不同比例的凝血酶孵育后在PAGE凝胶中观察实验结果照片。
图12为本发明实施例4中不同样本过孔的电流信号分类结果。
图13为本发明实施例5中不同样本过孔的电流信号分类结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验材料备制
(1)所有DNA链都是通过NUPACK软件设计并模拟。
(2)所有设计好的DNA链都是从上海生工购买。
(3)实验所用的凝血酶(Thrombin)以及其它各类蛋白从索莱宝公司购买。
(4)所有DNA链都用实验用水溶解，并用Nanodrop 2000仪器测定浓度。
(5)纳米孔使用固态氮化硅纳米孔，厚度30nm，使用离子束电镜穿孔，穿孔直径为15nm。
(6)DNA四面体制备在1×TAE/Mg2+缓冲液(40mM Tris，20mM acetic acid，2mMEDTA，和12.5mM magnesium acetate，最终溶液pH＝8.0)中进行。
(7)纳米孔室腔缓冲液为1M氯化钾(KCl)溶液(称取11.182g氯化钾，在37℃下溶解于50mL水)。
(8)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验所用母液为45％PAGE溶液(称取217g丙烯酰胺和8g亚甲双丙烯酰胺，在37℃下溶解，加入去离子水定容至500mL)。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验检测：配制12％PAGE胶(12ml蒸馏水，6ml45％PAGE溶液，150ul 10％过硫酸铵(APS)溶液，15ul四甲基乙二胺(TEMED)溶液)。
纳米孔实验检测：
实验仪器：纳米孔装置、膜片钳放大器。
实施例1 DNA四面体和凝血酶(目标蛋白)结合物的形成
为了研究凝血酶能否进入到DNA四面体内部并与其稳定结合，使用PAGE实验来进行观察证明。
凝血酶空间直径4nm左右，有两个适配体结合位点分别是T-29和T-15。针对凝血酶设计DNA四面体的四条DNA单链核苷酸序列如表1所示。TET-S1、TET-S2、TET-S3、TET-S4是生成四面体结构的四条DNA链，此结构内部不能结合任何蛋白(无目标蛋白适配体)；针对凝血酶，把TET-S1和TET-S2替换成TET-S1-IN和TET-S2-IN(含适配体)，这样TET-S1-IN，TET-S2-IN，TET-S3，TET-S4生成的四面体可以结合凝血酶。
表1针对凝血酶设计DNA四面体的四条DNA单链核苷酸序列
Figure BSA0000212731110000061
Figure BSA0000212731110000071
四条DNA单链通过碱基互补配对结合成DNA四面体(TET-S3，TET-S4，TET-S1-IN，TET-S2-IN)，其中两条单链TET-S1-IN和TET-S2-IN的末端各包含有凝血酶的一个适配体。首先，四条DNA单链以1∶1∶1∶1的比例混合进行退火，94℃保持4分钟，然后在5分钟之内匀速降温至室温(25℃)，形成DNA四面体，其结构见图1，得到DNA四面体溶液。在形成的DNA四面体1中，这两个适配体2的位置正好位于相对的两条边上，且相距4.5nm，而凝血酶空间直径4nm左右，恰好可以结合，得到的四面体-凝血酶结合体结构见图2，结合后凝血酶3通过适配位点4和适配体2结合后，凝血酶3的适配位置在DNA四面体1内部。
在相同浓度的DNA四面体溶液中加入不同摩尔比例的凝血酶，室温下孵育1小时，在PAGE凝胶中观察实验结果，具体见图11。
实验结果证明，加入凝血酶的样品形成了DNA四面体和凝血酶的结合体，且凝血酶的量越多，结合体形成的越多，直至全部结合。表明本实施例的DNA四面体生成效果很好。
实施例2 DNA四面体单独过孔与四面体-凝血酶结合体过孔
使用同一纳米孔进行两个样本的检测，一个样本是只有实施例1的DNA四面体结构(由TET-S3，TET-S4，TET-S1-IN，TET-S2-IN组成)，另一个样本是实施例1中形成的四面体-凝血酶结合体。首先制备的两个样本保证浓度相同，都是2nM，纳米孔装置首先用水清洗干净，再用乙醇排出装置内的气泡，最后用1M KCl缓冲液润洗，然后将样本加入纳米孔装置的顺势端室腔(Cis)，样本的运动方向如图3中的箭头所示，在外加电压的作用下，样本结构会从顺势端室腔穿过纳米孔进入反势端室腔(Trans)，通过膜片钳放大器能够清晰地看到信号的轨迹，具体见图4。根据信号轨迹容易分析出结构过孔的过程，本实施例将没有结构过孔时的电流水平称为level 0。在DNA四面体或四面体-凝血酶结合体过孔时会产生电流下降，此时的电流水平为level 1，在DNA四面体或四面体-凝血酶结合体通过纳米孔后，电流水平恢复到leve 0。两个样本的轨迹用MATLAB程序从阻塞电流和过孔时间两个方面进行分析，从分析结果可知，携带有凝血酶的结构过孔时的阻塞电流较大，也就是带有凝血酶的level 1水平(参见图4中右侧的图)比不带凝血酶的level 1水平(参见图4中左侧的图)低。这个特征可以明显区分过孔的结构是否携带有凝血酶，也证明了使用15nm的纳米孔可以检测到凝血酶的存在。
实施例3 DNA四面体固定在线性DNA长双链的不同位置的样本过孔
本实施例线性DNA长双链选用切断的m13mp18为原料制备，m13mp18本身是一条环状单链DNA分子，长度为7249个核苷酸，通过与一条短链(SITE，如SEQ ID NO.7所示)互补形成内切酶的识别位点，再利用内切酶切断，便成为了单链DNA分子(骨架链Lm13，如SEQ IDNO.8所示)。之后，骨架链Lm13与多条短单链(订书链)互补配对合成一条线性双链DNA。本实施例采用190条订书链(1L-190L，序列参见表2)，在合成双链之前，确定DNA四面体要结合的位置，去掉该结合位置的两条订书链，造成的缺口留待结合DNA四面体，其余部分的订书链全部与骨架链Lm13互补合成双链。本实施例中当DNA四面体结合在四分之一位置时，去掉47L和48L这两条订书链，形成线性DNA长双链备用。当DNA四面体结合在二分之一位置时去掉95L和96L这两条订书链，形成线性DNA长双链备用。
表2
Figure BSA0000212731110000081
Figure BSA0000212731110000091
Figure BSA0000212731110000101
Figure BSA0000212731110000111
Figure BSA0000212731110000121
Figure BSA0000212731110000131
Figure BSA0000212731110000141
Figure BSA0000212731110000151
Figure BSA0000212731110000161
Figure BSA0000212731110000171
DNA四面体固定在长链上的具体操作过程是先酶切，让环状DNA成为线性DNA，根据线性DNA的不同预设连接位置的碱基适当调整四面体的碱基序列，使两者可以互补，利用碱基互补配对将DNA四面体固定在长双链的骨架链上。
为了验证电流的瞬时下降产生的额外尖峰是由于四面体-凝血酶结合体的过孔导致的，本实施例改变了DNA四面体固定在线性DNA长双链上的位置，其中一个固定在线性DNA长双链中骨架单链的四分之一处(参见图5)，为此将实施例1中组成DNA四面体的四条序列中的TET-S3、TET-S4调整为TET-S3-quarter，TET-S4-quarter(具体序列参见表3)，按实施例1的方法形成DNA四面体(由序列TET-S1-IN，TET-S2-IN，TET-S3-quarter，TET-S4-quarter组成)与凝血酶的结合体结构后与上述对应的线性DNA长双链组合。另一个固定在中间位置(参见图6)，为此将实施例1中组成DNA四面体的四条序列中的TET-S3、TET-S4调整为TET-S3-half，TET-S4-half(具体序列参见表3)，按实施例1的方法形成DNA四面体(由序列TET-S1-IN，TET-S2-IN，TET-S3-half，TET-S4-half组成)与凝血酶的结合体结构后与上述对应的线性DNA长双链组合。
两种位置的固定在线性DNA长双链上的四面体-凝血酶结合体样本分别过孔。之后进行的纳米孔检测的操作步骤和上面实施例2所述相同，样本的运动方向如图7中的箭头所示。
表3
Figure BSA0000212731110000181
四面体-凝血酶结合体固定在长双链上的不同位置的、本实施例的这两个样本所对应的电流信号会产生二级下降，电流信号轨迹示意图见图8，没有结构过孔时的电流水平为level 0，仅双链过孔时产生电流下降，此时电流水平为level 1，当四面体-凝血酶结合体过孔时会产生额外的电流下降，此时的电流水平成为level 2。
两种样本观察到的电流轨迹有所不同，四面体-凝血酶结合体固定在四分之一处的样本所对应的电流信号轨迹示意图见图8A、图8B，其产生的额外下降尖峰分别在level1阻塞电流的四分之一处(如图8A所示)和四分之三处(如图8B所示)，这是由于双链DNA有两种过孔方向，可能是较短的一段先过孔，也可能是较长的一段先过孔；四面体固定在中间位置的样本所对应的电流信号，其产生的额外下降尖峰位于level 1阻塞电流的中间位置(如图8C所示)。根据MATLAB的数据分析结果，两种样本的过孔时间和阻塞电流基本相同。这种结果表明，电信号尖峰出现是由四面体和蛋白过孔产生的。
实施例4蛋白分子以不同方向过孔
为了检测到蛋白分子以不同方向过孔的信号差异，在实施例2的四面体-凝血酶结合体的基础上，本实施例改变了四面体中适配体的位置，第一个样本是其中一个适配体沿着四面体的边向上移动，使蛋白分子转动一定的角度，调整后的四面体-凝血酶结合体结构示意图见图9，组成其的DNA四面体序列为TET-S3，TET-S4，TET-S1-IN，TET-S2-IN2；第二个样本是另一个适配体沿着它所在边移动，使蛋白分子转动角度，调整后的四面体-凝血酶结合体结构示意图见图10，组成其的DNA四面体序列为TET-S3，TET-S4，TET-S1-IN2，TET-S2-IN；最后一个样本(第三个样本)是适配体位置不变，为实施例2的四面体-凝血酶结合体，具体见图2。TET-S1-IN2和TET-S2-IN2的序列见表4。
表4针对调整适配体位置设计的单链核苷酸序列
Figure BSA0000212731110000191
本实施例四面体-凝血酶结合体设计为固定在实施例3的线性DNA长双链的四分之一处，对应的将TET-S3，TET-S4调整为实施例3中的TET-S3-quarter，TET-S4-quarter，这样在m13mp18单链形成的线性DNA双链的牵引下，三个样本会产生六种过孔方向，但是根据上一步骤(实施例3)的结果，同一个样本的两种相反方向是很容易通过额外尖峰的位置来区分的。所以本实施例主要区分目标蛋白转动角度较小的不同样本。
将三个样本穿过纳米孔装置的信号轨迹以MATLAB程序进行分析，根据MATLAB数据分析得到的结果，如果只分析阻塞电流和过孔时间两个参数，三个样本并没有很大的区别，然后本实施例利用机器学习的算法对捕捉到的电流信号进行识别、训练、分类，可以明显区分出三种样本对应的电流信号，分类结果如图12。图中三个椭圆(1、2、3)圈住的部分分别对应第一样本，第二样本，第三样本的过孔事件，从图中可知，这三个样本可以很好地被区分。其中，第三个样本的平均振幅和峰宽都是最小的，说明当改变了第三个样本中凝血酶的位置，振幅和峰宽都会有不同程度的增加。
实施例5 DNA四面体和不同蛋白结合过孔
为了证明四面体结构载体有很好的适用性，本实施例通过调整核苷酸序列，在DNA四面体内部更换了不同的蛋白适配体，例如链霉亲和素等，重复了以上研究过程，都有相似的结果。如此证明四面体携带蛋白分子过孔来研究蛋白过孔行为的方法是可靠有效的。
对于链霉亲和素来说，只在序列末端进行亲和素(biotin)修饰便可结合，能够结合链霉亲和素的发生改变的四面体序列信息见表5，其他序列(TET-S3、TET-S4、TET-S3-quarter，TET-S4-quarter)同上。即，可结合链霉亲和素的DNA四面体序列为：TET-S1-SA、TET-S2-SA、TET-S3、TET-S4。可结合链霉亲和素并能连接在实施例3的线性DNA长双链的四分之一处的第一样本四条DNA四面体序列为：TET-S3-quarter，TET-S4-quarter，TET-S1-SA，TET-S2-SA2；第二样本四条DNA四面体序列为：TET-S3-quarter，TET-S4-quarter，TET-S1-SA2，TET-S2-SA；第三样本四条DNA四面体序列为：TET-S3-quarter，TET-S4-quarter，TET-S1-SA，TET-S2-SA。将本实施例的三个样本穿过纳米孔装置的信号轨迹以MATLAB程序进行分析(参见实施例4)，分类结果见图13。从图中可知各样本可很好地被区分。
表5
Figure BSA0000212731110000201
Figure BSA0000212731110000211
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统，结合固态纳米孔单分子传感器使用，其特征在于，所述检测系统由一条线性DNA长双链及固定在其上的一个DNA四面体构成；所述DNA四面体内部与目标蛋白适配，所述目标蛋白在所述DNA四面体的结构内的结合位置可人工调整，所述目标蛋白在所述线性DNA长双链上的固定位置为所述线性DNA长双链的二分之一处之外的位置。
2.如权利要求1所述的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统，其特征在于，当所述目标蛋白为凝血酶时，构成所述DNA四面体的四条DNA单链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.3为：
GCTGATAAAACGAGCTAGATCGAGTAGCAAGCTCTAATCGACGGGAAGAGCATGCTCATCCAGTGTCATACAAACGATTCAGCTACTATGCAC；
SEQ ID NO.4为：
AGCATGCTCTTCCCGAAACGAGTTGTAGCTATTAGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTTTACCTTACTGATGTTACGAGTATGACACTGGATG；
SEQ ID NO.5为：
AAAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAACTATCCGATTATTTATCAGCGTGCATAGTAGCTGAATCGTTACGTAACATCAGTAAGGTTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；
SEQ ID NO.6为：
TCGATCTAGCTCGAAATCGGATAGTTCAGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCTAATAGCTACAACTCGTTACGATTAGAGCTTGCTACTTTTGGTTGGTGTGGTTGG；
当所述目标蛋白为链霉亲和素时，构成所述DNA四面体的四条DNA单链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.205、SEQ ID NO.206所示；
SEQ ID NO.205为：
AAAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAACTATCCGATTATTTATCAGCGTGCATAGTAGCTGAATCGTTACGTAACATCAGTAAGGTTTTT-biotin；
SEQ ID NO.206为：
TCGATCTAGCTCGAAATCGGATAGTTCAGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCTAATAGCTACAACTCGTTACGATTAGAGCTTGCTACTTTT-biotin。
3.制备权利要求1或2所述的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)根据目标蛋白的大小和适配位点设计四条DNA单链，使其通过碱基互补配对结合成DNA四面体，并能通过碱基互补将DNA四面体固定在线性DNA长双链上；要求目标蛋白通过其适配位点与DNA四面体中的目标蛋白适配体结合后，其适配位置在DNA四面体内部；
2)合成设计的四条DNA单链后，退火形成DNA四面体；
3)将DNA四面体通过碱基互补固定在线性DNA长双链上。
4.使用权利要求1或2所述的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、设计目标蛋白在DNA四面体中适配后方向不同的若干种基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统，分别在溶液中与目标蛋白混合，得到若干种固定于线性DNA长双链上目标蛋白方向不同的四面体-蛋白结合体；
B、加入固态纳米孔单分子传感器进行过孔，利用机器学习的算法对捕捉到的电流信号进行识别、训练、分类，区分出不同过孔方向目标蛋白的行为。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤A制备所述四面体-蛋白结合体时，先将所述DNA四面体结合所述目标蛋白后，再将所述DNA四面体通过碱基互补固定在所述线性DNA长双链上。
6.权利要求1或2所述的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统在检测蛋白分子中的应用。
7.权利要求1或2所述的基于自组装纳米孔的蛋白行为检测系统在控制蛋白空间方向中的应用。
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