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CN106929565A - 基于纳米结构的蛋白质单分子电子器件及其制备和应用 - Google Patents

基于纳米结构的蛋白质单分子电子器件及其制备和应用 Download PDF

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CN106929565A
CN106929565A CN201511022939.9A CN201511022939A CN106929565A CN 106929565 A CN106929565 A CN 106929565A CN 201511022939 A CN201511022939 A CN 201511022939A CN 106929565 A CN106929565 A CN 106929565A
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李清宁
丁韬力
严勇
万成
魏颖颖
孙利
李成强
孙杰
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Peking University
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Abstract

本发明公开了一种基于纳米结构的蛋白质单分子电子器件及其制备和应用。将单个蛋白质或其复合物分子固定于纳米孔处的对电极上，通过检测溶液中该蛋白质或其复合物分子的电导率来表征其构象涨落的动力学特征，从而实现对蛋白质的活性及其与底物分子的生化反应过程的检测。本发明可作为一种极具发展潜力的第三代测序方法，无需制备特殊的DNA测序文库，无需对核酸进行标记，可进行超长、连续、快速、精准的碱基阅读，若制备成高通量平行的分子器件，可实现超低成本的DNA测序等。

Description

基于纳米结构的蛋白质单分子电子器件及其制备和应用
技术领域
本发明是涉及一种单酶生物传感器，可以用于单分子DNA的测序,也可用于检测溶液中浓度极低的底物分子,属于第三代DNA测序器件。
背景技术
DNA测序技术是近代生命科学发展的重要里程碑之一。近十年来，低成本、高通量DNA测序技术的出现，引起了生命这一高度复杂系统中最为庞大、最为核心的核酸序列信息爆发性地增长，使生命科学和医学面临前所未有的机遇和挑战。生命遗传密码的彻底破译将成为可能，遗传信息大数据的普及将惠及到人类社会每一个普通成员的生存和健康。
目前大量使用的新一代测序技术是所谓的第二代测序技术。该测序技术通过对被测核酸进行平行扩增，构建测序文库，克隆出上百万固相化单链核酸模板片段，进行高通量并行序列测定。第二代测序技术存在下列不足：(1)DNA测序文库制备需要较大量的起始DNA样本；(2)样本的平行扩增可能导致测序文库制备的偏性；(3)制备测序文库需要大量的分子生物学操作，文库制备时间较长，成本高；(4)通过DNA生物合成反应在DNA测序模板上进行逐个碱基阅读，一次生化反应仅能阅读一个碱基且读长较短，这也是测序速度和通量难以提升的瓶颈；(5)测序结果报告周期长。因此虽然第二代测序技术比第一代桑格测序技术在测序通量方面具有巨大优势，在不到十年时间内使人类个体基因组的测序成本下降了近万倍，但是与未来应用于实际的需求相比，第二代测序技术仍然是一项昂贵的技术，不利于推广应用。
第三代测序技术是目前国际学术界和产业界追捧的对象。第三代测序技术有如下三个特点：(1)实现单分子DNA测序。无需对测序对象进行扩增，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性；(2)实现连续测序。也就是DNA链上碱基的阅读是不间断的，这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使DNA的读长大幅度增加；(3)更低的测序成本。第三代测序技术在生化反应中无需不断加入生化试剂，测序没有试剂成本。由上述三个特征可以看出，第三代测序技术的实现将会是生命科学和医学发展史上的又一里程碑，帮助人们随时随地、实时、低成本地获取人体、环境各种各样的核酸信息，随时掌控生命体中遗传与变异、表达与调控、感染和防卫等事件，真正促进4P和精准医疗的实现。
目前为止，第三代测序技术按原理可以分为三类。
(1)成像测序法
通过高分辨率成像技术进行核酸序列鉴定，是最早报导的单分子DNA测序技术。早在1977年Cole等通过锇等配位化合物与碱基进行特异性结合，并从电子显微镜上观察到Os点阵，获得了单链DNA影像(Cole et al.Molecular microscopy of labeledpolynucleotides:stability of osmium atoms.J MolBiol(1977)vol.117,387-400)。近二十多年来，有许多用扫描探针显微镜对核酸分子进行显微成像和碱基识别的报导，不过其识别的准确度和速度还远远达不到DNA测序的要求(Driscoll et al.Atomic-scaleimaging of DNA using scanning tunneling microscopy.Nature(1990)vol.346,294-296；Tanaka et al.Partial sequencing of a single DNA molecule with a scanningtunneling microscope(2009)vol.4,518-522)。
(2)合成测序法
本世纪初，美国加州理工发表了单分子合成测序的成果。在玻片上构建单分子DNA测序文库，采用具有可切除封闭基团的荧光标记碱基进行测序(Harris et al.Single-molecule DNA sequencing of a viral genome.Science(2008)vol.320,106–109.)，但是该方法测序通量低、读长短、错误率高且产品成熟度差，并没有形成销售。PicBio等公司在核苷酸的磷酸分子上修饰荧光基团，通过检测合成过程中能够自动切除的荧光基团，实现单分子DNA碱基的连续阅读(Eid et al.Real-TimeDNASequencingfromSinglePolymeraseMolecules.Science(2009)vol.323,133-138.)。为了提高单分子荧光检测的灵敏度，其芯片采用Z波导腔。该技术能够自动、快速、并行地实现单分子DNA测序，但测序成本高、通量低，准确性较差。
(3)纳米孔测序法
纳米孔测序方法使单链DNA分子在电场驱动下穿过纳米尺度的微孔，通过实时检测过孔电流的变化，识别过孔单链DNA上的碱基(Michael.Oxford Nanopore announcementsets sequencing sector abuzz.NatureBiotechnol.(2012)Vol.30,295–296.)。制备纳米孔的材料可以采用天然的或经改造的蛋白质分子(如α溶血素(Clark et al.Continuousbase identification for single-molecule nanopore DNA sequencing.NatureNanotechnol.(2009)vol.4,265-270.)、Msp蛋白(Manrao et al.Reading DNA at single-nucleotide resolution with amutantMspAnanopore and F29 DNA polymerase.NatureBiotechnol.(2012)vol.30,349–353；Cherf et al.Automated forward and reverseratcheting of DNA in ananopore atprecision.Nature Biotechnol.(2012).vol.30,344–348.))，也可以使用微纳加工制备的固态纳米孔(如氮化硅(Iqbal etal.Solid-state nanopore channels with DNA selectivity.Nature Nanotechnol.(2007)vol.2,243-248.)、石墨烯(Garaj et al.Graphene as a subnanometer trans-electrode membrane.Nature(2010)vol.467,190-193.))。生物纳米孔在单链DNA分子碱基的准确识别方面还存在技术瓶颈。固态纳米孔由于孔径的可控性和稳定性、单链过孔速度、纳米孔长度等因素，尚未实现DNA链单个碱基的识别。一些公司通过在纳米孔上构建场效应器件、引入可检测横向隧道电流的对电极、组装具有分子识别功能的分子基团、增加荧光标记分子等方法，试图提高单碱基识别能力。
生命系统中存在着多种能够高效精准识别核酸碱基序列的蛋白质分子。将蛋白质分子在识别碱基时其分子构象产生的微小变化转换成电信号，并进行放大和快速测定，无疑是一种理想的测序方法。本发明就是针对目前单分子DNA测序存在的成本高、准确率低、重复性差等问题，通过检测DNA聚合酶或RNA聚合酶等蛋白质分子在核酸合成过程中导电率的波动情况，推断单链核酸上的碱基序列，发展一种低成本、快速核酸测序器件。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白质分子电子器件及其制备方法，利用该蛋白质分子电子器件来实现快速、低成本的核酸测序或核酸分子的检测。
当酶与底物反应时，会发生蛋白质构象涨落，这种构象涨落可引起单个蛋白质的电特性发生微小变化。例如：对于DNA聚合酶等与核酸相互作用的酶类，当四种不同碱基沿单链核酸模板合成时，酶的构象会因被合成碱基种类的不同产生微小差异，并引起相应的电导率变化。因此通过检测溶液中单个核酸酶导电率的差异，可以实现单个核酸分子的合成测序。
由此，本发明提出了一种基于纳米复合结构的蛋白质分子电子器件，通过检测溶液中单个酶分子的电导率来表征其构象涨落的动力学特征，从而检测蛋白质的活性及其与底物分子的生化反应过程。
本发明的技术方案如下：
一种蛋白质分子电子器件，包括悬空膜结构、纳米对电极和蛋白质或其复合物分子，其中：悬空膜结构的膜上具有一纳米孔，纳米孔的直径小于等于10纳米；纳米对电极包括两个纳米电极，分别设置在纳米孔两侧，电极之间的间隙为1～100纳米；单个蛋白质分子或蛋白质复合物分子组装在纳米孔处，连接两个纳米电极。
进一步的，所述悬空膜结构的悬空膜可以是硅、氮化硅、二氧化硅、云母、石墨烯等薄膜材料。
所述纳米电极的材料通常为金、铂、钯或它们的合金等金属材料，或者是这些材料中的两种或更多种的合金；还可以是石墨烯等非金属导电材料，例如碳纳米管。
所述蛋白质或蛋白质复合物分子根据不同的检测目的进行选择，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA外切酶、逆转录酶、脲酶等蛋白质及其与其他生物分子组成的复合物，例如，可以利用DNA聚合酶或RNA聚合酶实现单分子DNA测序，利用DNA外切酶实现DNA序列的检测，利用逆转录酶实现RNA测序，利用脲酶检测液体中的尿素。
所述蛋白质也可以和一种或多种生物大分子(包括其他蛋白质、核酸、糖、脂以及其他生物高分子材料等)进行交联，构建成的多功能的蛋白质复合体。
本发明的蛋白质分子电子器件可以通过下述方法制备：
1)制备悬空膜结构；
2)在悬空膜上制备纳米对电极，组成纳米对电极的两个纳米电极的尖端之间的距离在1～100纳米，除尖端外，纳米电极的其余部分覆盖绝缘层；
3)在悬空膜上、两个纳米电极之间加工出直径小于等于10纳米的纳米孔；
4)对纳米电极进行化学修饰，然后使蛋白质或其复合物分子交联到纳米孔处，与两个纳米电极的尖端相连。
上述步骤1)，可以利用微纳加工手段对Si/SiO2/SiN基片进行处理，制备出以Si/SiO2为支架，支架上附着一定厚度的SiN膜的悬空膜结构。其中，所述SiN膜的厚度优选为30～150纳米。也可以利用微纳加工手段加工出石墨烯材料的悬空膜结构。
上述步骤2)可采用电子束光刻工艺制备纳米对电极，其中所述绝缘层可以是氧化铝或其他材料的绝缘层。两个纳米电极尖端之间的距离优选为10纳米。
上述步骤3)优选利用高能聚焦电子束(TEM)加工纳米孔。
上述步骤4)对纳米电极进行化学修饰的目的是使电极表面带上化学基团，以便进一步组装蛋白质分子。可采用巯基化合物对纳米电极进行修饰，例如将纳米电极浸泡在含巯基化合物的有机溶剂中，避光反应一段时间。巯基与电极材料金等发生反应，通过金硫键连接，巯基化合物另一端的基团(如羧基)游离在外，可以与蛋白质通过化学交联组装在一起。所述巯基化合物例如巯基乙酸、巯基十一烷酸等，所述有机溶剂常用的有乙醇等。
上述步骤4)，将化学修饰后的纳米电极置于含有蛋白质或其复合物分子的溶液中进行交联，蛋白质或其复合物分子被纳米孔捕获并固定在两个纳米电极间。
在上述蛋白质分子电子器件基础上，本发明还提出了一种检测装置，包括溶液槽、蛋白质分子电子器件、一对电化学电极和微弱电流检测平台，其中所述蛋白质分子电子器件的悬空膜结构将溶液槽分隔为两部分，悬空膜结构两边的溶液只能通过纳米孔连通；所述电化学电极分别放置在两边的溶液中，用于驱动并检测纵向过孔电流；所述蛋白质分子电子器件中的两个纳米电极分别通过导线连接微弱电流检测平台，通过检测通过蛋白质或其复合物分子的横向隧道电流，得到蛋白质或其复合物分子的导电率变化状况。
所述电化学电极可以采用常见的银/氯化银电极、铂丝电极等。
根据通过蛋白质或其复合物分子电流值(即横向隧道电流)的变化，可以确定蛋白质构象的动力学特征，从而获得蛋白质催化反应底物的信息或DNA、RNA序列信息。而且，可以在单一芯片上实现多器件阵列化制备。每个蛋白质分子电子器件可以作为一个结构单元，在同一芯片上同时平行加工数万个相同的结构单元，可以实现高通量的单分子检测。
本发明的蛋白质分子电子器件的一个具体应用就是作为核酸序列的检测器件，将核酸聚合酶等蛋白质分子对核酸单链上碱基识别的特异性和纳米复合结构上单个核酸聚合酶的电流测定相结合，向溶液槽的溶液中添加核酸模板及合成原料(四种核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，通过纳米对电极检测核酸聚合酶在合成过程中导电率的变化，实现核酸单链上碱基序列的检测。
当生物酶与底物结合和反应时其蛋白质构象涨落导致动力学特性产生微小变化，并引起通过酶分子电流的变化。因此，利用本发明基于蛋白质分子电子器件的检测装置还可以实现蛋白质分子活性和生化反应过程的检测。
本发明的有益效果：
本发明可作为一种极具发展潜力的第三代测序方法，采用纳米复合结构的蛋白质分子电子器件具备如下优点：无需制备特殊的DNA测序文库，无需对核酸进行标记，可进行超长、连续、快速、精准的碱基阅读，可制备成高通量平行的分子器件，可实现超低成本的DNA测序等，具体描述如下：
(1)本发明将单个酶分子固定于对电极之间，通过捕捉蛋白质电导率的变化，实现核苷等底物生化反应过程的监测，无需对测序对象进行扩增和放大，即可直接对单链核酸分子测序，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性。如果采用RNA逆转录酶，则可直接对RNA链测序，无需对RNA进行逆转录。
(2)本发明提出的单个酶分子的电特性检测是在生物化学反应过程中实现的，也就是通过纳米复合结构实时检测每个单体核苷酸的合成过程。因此，该器件可以实现连续、不间断的测序，这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使DNA或RNA的读长大幅度增加。
(3)本发明提出的核酸测序器件，在测序过程中除了一次性加入普通核苷酸单体(如四种dNTP)外，无需加入其他生化试剂，在核酸测序过程中试剂成本仅仅为几美元。
(4)本发明通过在纳米孔两边加上一对电化学电极，由于核酸带有负电，对被测序的核酸形成电场驱动，大幅度提高纳米孔和蛋白质对核酸的捕获效率，可实现连续测序。
(5)本发明实现可以在单一芯片上实现多器件的阵列化制备，在同一芯片上可以同时平行加工数万个相同的结构单元，对数万条核酸分子同时进行测序，实现高通量的单分子测序。
(6)本发明提出的纳米复合结构蛋白质分子器件还可以作为检测单个生物酶活性的研究平台，而以前没有任何方法可以研究单个酶分子在生化反应过程中的动力学行为。同时，通过固定不同的生物酶分子，可以检测多种底物分子，成为一种超高灵敏度的生物传感器，为极微量底物检测提供新技术。
附图说明
图1是本发明一种纳米孔-对电极芯片结构示意图；
图2是本发明一种基于纳米孔-对电极-蛋白质分子电子器件的结构及检测电路示意图。
图3是实施例1中通过原子力显微镜(AFM)表征的蛋白质组装结果。
图中：1-悬空膜结构，1a-Si基底，1b-SiO2膜，1c-SiN膜，2-缓冲液，3-纳米对电极，4-绝缘层，5-蛋白质分子，6-纵向电极。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例进一步对本发明进行说明，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：基于纳米孔-对电极结构的DNA聚合酶分子电子器件
(1)纳米孔-对电极结构的制备：利用光刻、干法刻蚀、湿法刻蚀、反应离子束刻蚀等一系列微纳加工手段对Si/SiO2/SiN基片进行处理，制备得到具有尺寸为2平方微米、厚度为30纳米的SiN膜的悬空膜结构1，如图1所示。其中，SiO2膜1b作为绝缘缓冲层，起到支撑SiN膜1c、减少电学测量中电容效应的作用；Si基底1a主要起支撑SiO2膜1b的作用。悬空膜结构1的材料并不限于Si/SiO2/SiN，也可以采用石墨烯等其他材料制备悬空膜结构。在悬空膜结构1上，采用常规的电子束光刻工艺制备纳米对电极3，加工流程包括氧化、涂胶、电子束曝光、金属沉积、PR清洗、BOE刻蚀，以及再次涂胶、电子束曝光，制备出尖端暴露、其余部位被氧化铝绝缘层4覆盖的纳米金(或钯、铂及其合金)对电极3。纳米金电极宽50纳米，两电极间隙10纳米，结构参见图1和图2。然后利用300kV的高能聚焦电子束(TEM)在悬空膜中心、纳米金电极对之间加工直径小于等于10纳米的纳米孔，得到纳米孔-对电极芯片。该纳米孔-对电极芯片可单个使用，也可做成阵列形式，并行使用，提高通量。
(2)纳米对电极表面的修饰：用巯基乙酸(或巯基十一烷酸)的乙醇溶液(浓度1mM)对纳米对电极表面进行化学修饰。具体加工流程为：将纳米孔-对电极芯片用等离子体发生器(plasma generator)处理后放在去离子水中浸泡5分钟，氮气吹干；浸泡在无水乙醇中短时间保存；配制浓度为1毫摩的巯基乙酸(或巯基十一烷酸)的乙醇溶液，将纳米孔-对电极芯片放入其中浸泡，室温下避光反应24小时；结束后取出纳米孔-对电极芯片，用去离子水浸泡30分钟并用氮气吹干。
(3)纳米孔-对电极-蛋白质复合结构的化学交联法制备：向离心管中注入500微升N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液(100mM)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(100mM)的1:1(体积比)混合溶液(起活化羧基的作用)，放入进行过化学修饰的纳米孔-对电极芯片，将200微升Q5高保真DNA聚合酶(50微克/毫升)滴入离心管中，避光保存1小时，使Q5高保真DNA聚合酶与化学修饰过的纳米对电极进行交联，Q5高保真聚合酶(图2中的蛋白质分子5)被纳米孔捕获并固定在纳米对电极间，如图2所示。结束后将芯片取出，放在去离子水中浸泡，保存备用。获得的纳米孔-对电极-蛋白质复合结构具有检测DNA生物合成过程的功能。
(4)将纳米孔-对电极-蛋白质芯片封装于一个微型溶液槽中，溶液槽分隔成两部分。从溶液槽两边的进液端口顺序注入3mL超纯水、3mL氯化钾缓冲液(1M)，通过芯片中间的纳米孔将分隔的溶液槽连通。如图2所示，在溶液槽的两边的缓冲液2中分别放置一个银/氯化银电极作为纵向电极6，构建纳米孔通道的纵向电学回路，用于驱动核酸序列的过孔行为，并监测过孔电流。从纳米对电极3处引出导线，连接微弱信号检测平台，构建通过蛋白质分子的横向电学回路，用于检测核酸反应过程中微弱的过蛋白电流，以此识别碱基种类。
(5)通过纵向电极施加0.1～1伏的电压，监测纵向过孔电流。当Q5高保真聚合酶被纳米孔捕获并固定在纳米对电极间时，过孔电流大小从纳安量级降低到0.1纳安量级水平，电流的波动值在0.1纳安量级。检测所用微弱信号检测平台包括：微电极固定台、微小电信号检测屏蔽箱、微电流放大器、微小信号发生器等，可采用Axon700B膜片钳放大系统进行检测。通过原子力显微镜(AFM)观察，确认Q5高保真DNA聚合酶被固定在纳米对电极3之间，结果如图3所示。从图3可以看到黄色的纳米金电极，白色点状物为修饰的蛋白，证明蛋白质被成功组装在纳米金电极上。将溶液槽中氯化钾缓冲液更换为超纯水，通过图2所示的检测电路对蛋白质的导电率进行检测，整个检测电路置于电学信号检测屏蔽箱内。
(6)在施加负极电压的微型溶液槽的溶液中加入适量的单链DNA模板序列和引物，以及相应的四种dNTPs，在纳米对电极3两端施加0.1～1V电压，监测Q5高保真DNA聚合酶合成时纳米对电极间的电流信号变化。DNA合成速度约为1至10碱基/微秒。纳米对电极间电流的波动值表示DNA聚合酶合成碱基种类，用于鉴别对应合成的碱基。
(7)记录蛋白质分子电子器件纳米对电极间的电流波动谱，分析DNA模板序列。
实施例2：基于纳米孔-对电极结构的RNA聚合酶分子电子器件
(1)纳米孔-对电极结构的制备：同实施例1。
(2)纳米对电极表面的修饰：同实施例1。
(3)纳米孔-对电极-蛋白质复合结构的化学交联法制备：：向离心管中注入500微升NHS溶液(100mM)与EDC溶液(100mM)的1:1混合溶液，放入进行过化学修饰的纳米孔-对电极芯片，将200微升RNA聚合酶(50微克/毫升)滴入离心管中，避光保存1小时，使RNA聚合酶与纳米对电极进行交联。结束后取出，放在去离子水中浸泡，保存备用。该纳米孔-对电极-蛋白质复合结构具有检测DNA序列的功能。
(4)将纳米孔-对电极-蛋白质芯片封装于一个微型溶液槽中，溶液槽分隔成两部分。从溶液槽两边的进液端口顺序注入3mL超纯水、3mL氯化钾缓冲液(1M)，通过芯片中间的纳米孔将分隔的溶液槽连通。在溶液槽的两边的缓冲液中分别放置一个银/氯化银电极，构建纳米孔通道的纵向电学回路，从纳米对电极处引出导线，连接微小信号检测平台，用于驱动核酸序列的过孔行为，并监测过孔电流。从纳米对电极处引出导线，连接微弱信号检测平台，构建通过蛋白质分子的横向电学回路，用于检测核酸反应过程中微弱的过蛋白电流，以此识别碱基种类。
(5)通过纵向电极施加0.1～1伏的电压，监测纵向过孔电流。当RNA聚合酶被纳米孔捕获并固定在纳米对电极间时，过孔电流从纳安量级降低到0.1纳安量级水平，电流的波动值在0.1纳安量级。微弱信号检测平台包括：微电极固定台、微小电信号检测屏蔽箱、微电流放大器、微小信号发生器等。
(6)在施加负极电压的微型溶液槽的溶液中加入适量的双链DNA模板序列，以及相应的四种核糖核苷酸，在纳米对电极两端施加0.1～1V电压，监测RNA聚合酶合成时纳米对电极间的电流信号变化。RNA合成速度约为1至10碱基/微秒。纳米对电极间电流的波动值表示RNA聚合酶合成不同碱基，用于鉴别对应合成的碱基类别。
(7)记录蛋白质分子电子器件纳米对电极间的电流波动谱，分析DNA模板序列。
实施例3：基于纳米孔-对电极结构的DNA外切酶分子电子器件
(1)纳米孔-对电极结构的制备：同实施例1。
(2)纳米对电极表面的修饰：同实施例1。
(3)纳米孔-对电极-蛋白质复合结构的化学交联法制备：向离心管中注入500微升NHS溶液(100mM)与EDC溶液(100mM)的1:1(体积比)混合溶液，放入进行过化学修饰的纳米孔-对电极芯片，将200微升DNA外切酶(50微克/毫升)滴入离心管中，避光保存1小时，使DNA外切酶与化学修饰过的纳米金对电极进行交联。结束后取出，放在去离子水中浸泡，保存备用。该纳米孔-对电极-蛋白质复合结构具有检测DNA序列的功能。
(4)将纳米孔-对电极-蛋白质芯片封装于一个微型溶液槽中，溶液槽分隔成两部分。从溶液槽两边的进液端口顺序注入3mL超纯水、3mL氯化钾缓冲液(1M)，通过芯片中间的纳米孔将分隔的溶液槽连通。在溶液槽的两边的缓冲液中分别放置一个银/氯化银电极，构建纳米孔通道的纵向电学回路，用于驱动核酸序列的过孔行为，并监测过孔电流。从纳米对电极处引出导线，连接微弱信号检测平台，构建通过蛋白质分子的横向电学回路，用于检测核酸反应过程中微弱的过蛋白电流，以此识别碱基种类。结构如图2所示。
(5)通过纵向电极施加0.1～1伏的电压，监测纵向过孔电流。当DNA外切酶被纳米孔捕获并固定在纳米对电极间时，过孔电流从纳安量级降低到0.1纳安量级水平，电流的波动值在0.1纳安量级。微弱信号检测平台包括：微电极固定台、微小电信号检测屏蔽箱、微电流放大器、微小信号发生器等。
(6)在施加负极电压的微型溶液槽的溶液中加入适量的单链DNA模板序列，在纳米对电极两端施加0.1～1V电压，监测DNA外切酶剪切DNA模板链碱基时纳米对电极间的电流信号变化。纳米对电极间电流的波动值表示DNA外切酶剪切不同碱基，用于鉴别对应的碱基类别。
(7)记录蛋白质分子电子器件纳米对电极间的电流波动谱，分析DNA模板序列。
实施例4：基于纳米孔-对电极结构的逆转录酶分子电子器件
(1)纳米孔-对电极结构的制备：同实施例1。
(2)纳米对电极表面的修饰：同实施例1。
(3)纳米孔-对电极-蛋白质复合结构的化学交联法制备：向离心管中注入500微升NHS溶液(100mM)与EDC溶液(100mM)的1:1(体积比)混合溶液，放入进行过化学修饰的纳米孔-对电极芯片，将200微升逆转录酶(50微克/毫升)滴入离心管中，避光保存1小时，使逆转录酶与纳米金电极进行交联。结束后取出，放在去离子水中浸泡，保存备用。该纳米孔-对电极-蛋白质复合结构具有检测DNA序列的功能。
(4)将纳米孔-对电极-蛋白质芯片封装于一个微型溶液槽中，溶液槽分隔成两部分。从溶液槽两边的进液端口顺序注入3mL超纯水、3mL氯化钾缓冲液(1M)，通过芯片中间的纳米孔将分隔的溶液槽连通。在溶液槽的两边的缓冲液中分别放置一个银/氯化银电极，构建纳米孔通道的纵向电学回路，用于驱动核酸序列的过孔行为，并监测过孔电流。从纳米对电极处引出导线，连接微弱信号检测平台，构建通过蛋白质分子的横向电学回路，用于检测核酸反应过程中微弱的过蛋白电流，以此识别碱基种类。结构如图2所示。
(5)通过纵向电极施加0.1～1伏的电压，监测纵向过孔电流。当逆转录酶被纳米孔捕获并固定在纳米金对电极间时，过孔电流大小从纳安量级降低到0.1纳安量级水平，电流的波动值在0.1纳安量级。微弱信号检测平台包括：微电极固定台、微小电信号检测屏蔽箱、微电流放大器、微小信号发生器等。
(6)在施加负极电压的微型溶液槽的溶液中加入适量的单链RNA模板序列和引物，以及相应的四种脱氧核糖核苷酸，在纳米对电极两端施加0.1～1V电压，监测逆转录酶合成时纳米对电极间的电流信号变化。DNA合成速度约为1至10碱基/微秒。纳米对电极间电流的波动值表示逆转录酶合成不同碱基，用于鉴别对应合成的碱基类别。
(7)记录蛋白质分子电子器件纳米对电极间的电流波动谱，分析DNA模板序列。

Claims (10)

1.一种蛋白质分子电子器件，包括悬空膜结构、纳米对电极和蛋白质或其复合物分子，其中：悬空膜结构的膜上具有一纳米孔，纳米孔的直径小于等于10纳米；纳米对电极包括两个纳米电极，分别设置在纳米孔两侧，电极之间的间隙为1～100纳米；单个蛋白质分子或蛋白质复合物分子组装在纳米孔处，连接两个纳米电极。
2.如权利要求1所述的蛋白质分子电子器件，其特征在于，所述悬空膜结构的悬空膜是硅、氮化硅、二氧化硅、云母或石墨烯薄膜材料。
3.如权利要求1所述的蛋白质分子电子器件，其特征在于，所述纳米电极的材料是金、铂、钯或它们的合金，或者是石墨烯。
4.如权利要求1所述的蛋白质分子电子器件，其特征在于，所述蛋白质或其复合物分子根据不同的检测目的进行选择，所述蛋白质选自下列蛋白质中的一种：DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA外切酶、逆转录酶、脲酶；蛋白质复合物是所述蛋白质与其他生物分子组成的复合物。
5.权利要求1～4任一所述蛋白质分子电子器件的制备方法，包括以下步骤：
1)制备悬空膜结构；
2)在悬空膜上制备纳米对电极，组成纳米对电极的两个纳米电极的尖端之间的距离在1～100纳米，除尖端外，纳米电极的其余部分覆盖绝缘层；
3)在悬空膜上、两个纳米电极之间加工出直径小于等于10纳米的纳米孔；
4)对纳米电极进行化学修饰，然后使蛋白质或其复合物分子交联到纳米孔处，与两个纳米电极的尖端相连。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)利用微纳加工手段对Si/SiO2/SiN基片进行处理，制备出以Si/SiO2为支架，支架上附着SiN膜的悬空膜结构。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)采用电子束光刻工艺制备纳米对电极；步骤3)利用高能聚焦电子束加工出纳米孔。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤4)将纳米电极浸泡在含巯基化合物的有机溶剂中，避光反应一段时间进行化学修饰；然后再将化学修饰后的纳米电极置于含有蛋白质或其复合物分子的溶液中进行交联，蛋白质或其复合物分子被纳米孔捕获并固定在两个纳米电极间。
9.一种基于蛋白质分子电子器件的检测装置，包括权利要求1～4任一所述的蛋白质分子电子器件，以及溶液槽、一对电化学电极和微弱电流检测平台，其中所述蛋白质分子电子器件的悬空膜结构将溶液槽分隔为两部分，悬空膜结构两边的溶液只能通过纳米孔连通；所述电化学电极分别放置在两边的溶液中，用于驱动并检测纵向过孔电流；所述蛋白质分子电子器件中的两个纳米电极分别通过导线连接微弱电流检测平台，通过检测通过蛋白质或其复合物分子的横向隧道电流，得到蛋白质或其复合物分子的导电率变化状况。
10.权利要求1～4任一所述蛋白质分子检测器件作为核酸序列检测器件的应用。
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