Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN111808193B - 可结合人cd38的纳米抗体及其应用 - Google Patents

可结合人cd38的纳米抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111808193B
CN111808193B CN202010607781.6A CN202010607781A CN111808193B CN 111808193 B CN111808193 B CN 111808193B CN 202010607781 A CN202010607781 A CN 202010607781A CN 111808193 B CN111808193 B CN 111808193B
Authority
CN
China
Prior art keywords
artificial sequence
sequence
gly
ser
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010607781.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111808193A (zh
Inventor
吴稚伟
吴喜林
黄碧莲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Y-CLONE MEDICAL SCIENCE Co.,Ltd.
Original Assignee
Y Clone Medical Science Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Y Clone Medical Science Co ltd filed Critical Y Clone Medical Science Co ltd
Priority to CN202010607781.6A priority Critical patent/CN111808193B/zh
Publication of CN111808193A publication Critical patent/CN111808193A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111808193B publication Critical patent/CN111808193B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种可结合人CD38的多肽，包括3个互补决定区CDR1‑3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1‑36所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:37‑72所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:73‑111所示序列之一。本发明针对造血系统恶性肿瘤进行纳米抗体药物开发和诊断试剂研发，通过制备CD38蛋白、免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CD38的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化抗体C38NB；同时利用人源化小鼠模型体内评估C38NB在治疗多发性骨髓瘤的疗效。本发明为造血系统恶性肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药和细胞治疗治疗新药,同时为造血系统恶性肿瘤的诊断提供相应的检测试剂。

Description

可结合人CD38的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合人CD38的多肽，所述的多肽在制备CD38检测剂或造血系统恶性肿瘤治疗药物中的应用。
背景技术
CD38又称为环状ADP核糖水解酶，是一种跨膜糖蛋白。CD38在正常淋巴细胞和骨髓细胞以及一些非造血起源的组织上表达量很低，而在许多造血系统恶性肿瘤(例如多发性骨髓瘤细胞)和从造血系统恶性肿瘤得到的细胞系中发现表达上调。因此，对于这类CD38阳性的肿瘤病症，可使用抗CD38抗体作为检测剂或治疗剂。
一般而言，抗CD38单克隆抗体可通过抗原抗体免疫反应机制来实现对CD38高表达的肿瘤细胞的清除，主要机制通过1)直接的杀伤作用；2)FcR介导的免疫反应，包括补体介导的细胞毒作用(CDC)、抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用(ADCC)、以及抗体介导的细胞吞噬作用(ADCP)；3)免疫调节作用，通过减少CD38+免疫抑制、调节细胞及促进T细胞扩增和活性等免疫调节作用，对肿瘤细胞进行调控。1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variable heavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
2019年7月，强生公司全球首个CD38单克隆抗体达雷妥尤单抗注射液在中国上市，用于单药治疗复发和难治性多发性骨髓瘤成年患者，但目前国内尚无针对CD38靶点的单克隆抗体药物上市，因此迫切需要开发针对CD38的抗体，用于多发性骨髓瘤等B细胞恶性肿瘤的治疗。
发明内容
本发明通过用抗原免疫羊驼，获取羊驼源纳米单抗及其VHH，用于诊断和治疗B细胞恶性肿瘤病人。基于这些研究，本发明提供了一种可结合CD38的多肽，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-36所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ IDNO:37-72所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:73-111所示序列之一。
在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3交错排列。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQ ID NO:112-115所示(羊驼源)，但本发明的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合CD38的多肽或结构域。例如，人源的FR1-4序列可设计为SEQID NO:116-119。。
在一个优选实施方案中，所述多肽为单克隆抗体。
在一个优选实施方案中，所述多肽为VHH。
在一个优选实施方案中，所述多肽为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
在一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR1的序列为SEQ ID NO:14；并且
II)CDR2的序列为SEQ ID NO:50并且CDR3的序列为SEQ ID NO:89；或者
CDR2的序列为SEQ ID NO:51并且CDR3的序列为SEQ ID NO:90。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR1的序列为SEQ ID NO:15，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:91；并且
II)CDR2的序列为SEQ ID NO:52或53。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR3的序列为SEQ ID NO:98；并且
II)CDR1的序列为SEQ ID NO:23并且CDR2的序列为SEQ ID NO:59；或者
CDR1的序列为SEQ ID NO:25并且CDR2的序列为SEQ ID NO:61。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR1的序列为SEQ ID NO:36，并且CDR2的序列为SEQ ID NO:72；并且
II)CDR2的序列为SEQ ID NO:110或111。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR2的序列为GXSGLIFSGSA，其中X表示半胱氨酸或丝氨酸；
II)CDR1的序列为SEQ ID NO:2或26，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:74或100。
优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:2，CDR2的序列为SEQ ID NO:38，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:74；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:26，CDR2的序列为SEQ ID NO:38，并且CDR3的序列为SEQID NO:74；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:26，CDR2的序列为SEQ ID NO:38，并且CDR3的序列为SEQID NO:100；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:26，CDR2的序列为SEQ ID NO:62，并且CDR3的序列为SEQID NO:74。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR2的序列为IGWXGGXI，其中第4位的X表示丙氨酸或天冬酰胺，第7位的X表示异亮氨酸或缬氨酸；并且
II)CDR1的序列选自由EQ ID NO:6、11、16和21组成的组，并且CDR3的序列选自由SEQ ID NO:78、79、86、92、96和109组成的组。
优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:42，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:78；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:42，并且CDR3的序列为SEQID NO:79；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:11，CDR2的序列为SEQ ID NO:47，并且CDR3的序列为SEQID NO:86；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:16，CDR2的序列为SEQ ID NO:47，并且CDR3的序列为SEQID NO:86；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:16，CDR2的序列为SEQ ID NO:47，并且CDR3的序列为SEQID NO:92；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:16，CDR2的序列为SEQ ID NO:47，并且CDR3的序列为SEQID NO:109；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:21，CDR2的序列为SEQ ID NO:47，并且CDR3的序列为SEQID NO:86；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:21，CDR2的序列为SEQ ID NO:47，并且CDR3的序列为SEQID NO:96。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR2的序列为ITKGGXT，其中X表示异亮氨酸或丝氨酸；并且
II)CDR1的序列为SEQ ID NO:7、8或28，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:81、82或83。
优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:43，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:81；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:8，CDR2的序列为SEQ ID NO:44，并且CDR3的序列为SEQID NO:83；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:28，CDR2的序列为SEQ ID NO:44，并且CDR3的序列为SEQID NO:82。
在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：
I)CDR2的序列为LXWHGXST，其中，第2位的X选自由异亮氨酸、缬氨酸和苏氨酸组成的组，第6位的X为天冬氨酸或甘氨酸；并且
II)CDR1的序列为SEQ ID NO:22、27或30，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:97、101或103。
优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:22，CDR2的序列为SEQ ID NO:58，并且CDR3的序列为SEQ ID NO:97；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:27，CDR2的序列为SEQ ID NO:58，并且CDR3的序列为SEQID NO:97；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:27，CDR2的序列为SEQ ID NO:58，并且CDR3的序列为SEQID NO:101；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:30，CDR2的序列为SEQ ID NO:66，并且CDR3的序列为SEQID NO:103；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:27，CDR2的序列为SEQ ID NO:63，并且CDR3的序列为SEQID NO:97；或
CDR1的序列为SEQ ID NO:30，CDR2的序列为SEQ ID NO:65，并且CDR3的序列为SEQID NO:103。
本发明还提供了上述多肽在制备CD38检测剂中的应用。
本发明还提供了上述多肽在制备CD38阳性肿瘤治疗药物中的应用。CD38阳性肿瘤例如多发性骨髓瘤等。
本发明还提供了编码上述多肽的核酸。
在一个实施方案中，所述核酸编码序列为DNA编码序列或RNA编码序列。
在一个具体实施方案中，所述核酸编码序列存在于基因表达框中。
本发明还提供了包含上述核酸编码序列的表达框的表达载体。
在一个优选实施方案中，所述表达载体为病毒载体。
在一个优选实施方案中，所述表达载体为腺相关病毒表达载体(AAV载体)。
本发明还提供了上述核酸编码序列和表达载体在多发性骨髓瘤治疗药物中的应用。
本发明针对包含多发性骨髓瘤在内的CD38+的B细胞恶性肿瘤进行纳米抗体药物开发和诊断试剂研发，通过制备CD38蛋白、免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CD38的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH-huFc1(C38NB)；同时利用人源化小鼠模型体内评估C38NB在治疗多发性骨髓瘤的疗效。本发明为包含多发性骨髓瘤在内的B细胞恶性肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药,同时为CD38+B细胞恶性肿瘤的诊断提供相应的检测试剂。
附图说明
图1为sCD38第3和5次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线；
图2为sCD38-VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；
图3为sCD38-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对CD38蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第一轮(1st)和第二轮(2nd)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选41、47个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；
图4为原核表达的VHH抗体的ELISA检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对CD38的OD450/空白对照的OD450，比值大于4.5定义为阳性；
图5为VHH-hfc1的原核表达上清与8226细胞表面膜蛋白CD38结合的流式结果图。每个点代表一个克隆，纵坐标为经抗体与细胞共孵育后，抗体结合CD38，使得细胞被荧光染色标记的阳性细胞比例。
具体实施方式
1.免疫原的制备
我们依据NCBI网站上CD38蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导羊驼产生针对CD38胞外段的特异性抗体的多肽sCD38，在C端连接His-tag(sCD38-his)或兔Fc(sCD38-rFc)用于后续纯化及检测。
2.羊驼免疫与抗血清的获得
用250μg sCD38-rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用sCD38-rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次和第3次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血100ml用于噬菌体抗体库的构建。
抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的sCD38-his蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
结果如图1所示，3免和5免的抗血清效价分别为3.28×106和9.84×106。由此可见，该抗原可诱导骆驼产生特异性针对sCD38蛋白的高滴度抗血清。
3.VHH噬菌体库构建及淘选
收集100ml免疫后羊驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque Plus)分离获得羊驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将羊驼的VHH基因克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，得到VHH噬菌体库。为了进一步鉴定sCD38-VHH噬菌体库是否构建成功，通过PCR扩增免疫sCD38羊驼的VHH目的基因，可以看出目的条带约500bp，大小符合预期(图2)，说明该sCD38-VHH噬菌体抗体文库里含有VHH基因。挑选46个克隆进行测序，测序结果显示，所测序列多样性为93.5％；比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，构建了一个sCD38-VHH噬菌体抗体文库的库容为1.5×109，阳性率为97.9％，序列多样性(Diversity)为93.5％，有效插入率(In frame rate)为95.8％。
在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，用VHH-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用PEG/NaCl进行沉淀。将包被有50μg/ml的sCD38-His蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与sCD38蛋白ELISA的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序，并克隆至表达载体pVAX1，转染293F细胞表达生产纳米单抗。
淘选后的文库与sCD38蛋白进行结合检测。噬菌体ELISA结果显示，没有富集前的sCD38-VHH噬菌体文库与sCD38蛋白的结合读值为0.60，经过一轮、二轮富集后的噬菌体文库读值分别为2.72、2.87(图3A)。为了进一步验证富集后的文库中结合sCD38-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第1轮和第2轮富集后的文库里分别挑选41、47个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第1轮文库里，65.9％的单个噬菌体克隆为阳性，第2轮文库里83.0％的噬菌体克隆克隆为阳性，而且结合的平均读值在3.0左右(图3B)，通过sCD38蛋白淘选成功地富集了高结合力的sCD38-VHH噬菌体文库。
4.VHH原核表达文库的构建及VHH表达
对上述一轮和二轮淘选富集后的1st-sCD38-VHH和2nd-sCD38-VHH噬菌体抗体文库进行PCR扩增；获取并纯化抗体库中所有VHH的基因片段，将VHH的基因片段克隆至原核表达载体，转化SS320菌株，构建VHH-hfc1的原核表达抗体库；将原核表达抗体库涂布平板，过夜培养，次日随机挑选单克隆菌落960个，使用IPTG诱导表达抗体上清，对抗体上清与sCD38蛋白进行ELISA结合检测。
结果显示，有细菌上清与sCD38蛋白结合，同时不与空白对照结合，sCD38结合的读值/空白对照的读值大于4.5(图4和表2)。
5.VHH-huFc(C38NB)原核表达抗体的流式结合鉴定
为进一步验证以上抗体能否结合细胞表面CD38蛋白，将以上OD比值大于4.5的克隆，剔除全序列一致的重复序列克隆后，其余共139个克隆进行流式检测。将以上抗体上清以及阴性对照上清NC分别与8226细胞共同于4℃孵育60分钟，洗涤细胞后，加入荧光二抗Alexa Fluor 488Goat anti human IgG(H+L),4℃孵育30min后洗涤细胞，上机检测。流式细胞术结果显示，以上挑出的克隆100％可结合细胞表面CD38蛋白。(图5)。
6.VHH-huFc(C38NB)原核表达抗体与sCD38蛋白的亲和力鉴定
对上述流式检测的全部克隆进行抗体与sCD38蛋白的亲和力测定试验。应用Fortebio生物分子相互作用平台检测亲和力。将待测抗体VHH-hfc1原核表达上清中抗体固化至Anti-human IgG Fc Capture Biosensors(AHC)探头上，固化时间400s,再结合抗原sCD38-his蛋白，结合时间180s,解离时间180s，观察抗体-抗原的结合解离情况，由仪器拟合曲线，导出数据。亲和力测定结果显示，所测的139个C38NB抗体中，125抗体亲和力达1-10Nano mole级水平，14个抗体达到Pico mole级水平，总体抗体亲和力高(表1)。
表1C38NB抗体亲和力汇总
Figure BDA0002561429140000091
Figure BDA0002561429140000101
Figure BDA0002561429140000111
Figure BDA0002561429140000121
注：ka为结合常数，kd为解离常数，KD为亲和力。
将这些序列进行测序比对，剔除CDR区重复序列，获得48个的VHH抗体序列。进一步的实验证实，这48个VHH抗体以及从VHH抗体得到的CDR均可特异性地结合CD38(表2)。
表2 35个VHH抗体与sCD38蛋白的结合值及其序列
Figure BDA0002561429140000122
Figure BDA0002561429140000131
7.流式细胞法检测VHH抗体与肿瘤细胞的结合
将上述VHH抗体与CD38阳性细胞RPMI-8226细胞混合孵育，100μl/样品，4℃1h；以0.5％PBSF洗涤两遍后，加入荧光二抗，4℃30min；以0.5％PBSF洗涤两遍后，上机检测。流式结果显示，19个VHH抗体均可与该细胞结合。使用人源化的VHH抗体亦得到类似的结果。可见，上述VHH抗体具有靶向结合B细胞恶性肿瘤的能力，同时有可能通过靶向肿瘤细胞表面的CD38分子，促进巨噬细胞的吞噬作用，从而达到治疗或者抑制肿瘤生长的效果，因此这48个VHH抗体均有潜力成为治疗肿瘤的新型抗体药物。
因为上述48个VHH能够识别细胞表面的CD38分子，因此这些VHH抗体序列也可以应用于CAR(Chimeric Antigen Receptor,嵌合抗原受体,由VHH序列融合第三代或者第四代CD28-4-1BB-CD3zeta分子序列构成)细胞治疗肿瘤的治疗。另外因为上述VHH能识别肿瘤细胞表面的CD38分子，因此VHH可以通过偶联药物用于ADC(Antibody-drug conjugate,抗体偶联药物)治疗或者偶联同位素用于依赖抗体的分子影像诊断等，为肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米新药。
8.使用AAV病毒载体装载的人源化VHH进行体内实验
腺相关病毒载体(AAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
AAV Helper-Free病毒包装系统购于Cell Biolabs,San Diego USA。将上述VHH的DNA编码序列通过分子克隆技术插入到pAAV-MCS质粒；通过测序证明构建成功后，将构建好的质粒pAAV-Ab与pHelper和pAAV-DJ质粒按照质量比1:1:1的方式使用PEI转染试剂共转染AAV-293T细胞。转染后分别于48、72、96和120小时收集上清，并用5xPEG8000(sigma)进行浓缩，最后用1.37g/ml氯化铯进行纯化。纯化的AAV溶解于PBS里，进行鉴定和分装后保存于-80℃。
ImmunodeficientNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NCG)小鼠购自南京大学模式动物所，与NSG小鼠类似，该小鼠在SCID小鼠基础上缺失了IL2受体基因，导致体内没有小鼠T细胞，B细胞以及极少量的NK细胞。1.0-15x 107PBMC腹腔注射进4-6周的NCG小鼠体内；三周后，采血流式检测人T细胞，通过染色人的CD45+、CD3+、CD4+和CD8+。人CD45阳性细胞的比例到达5％以上，判定为小鼠人源化成功。将上述小鼠腹腔注射RPMI-8226细胞3*106/只，一周后，使小鼠接受AAV-C38NB(1x1011 gc/100μl)肌肉注射，以AAV-GFP为对照组。结果显示，AAV-C38NB对多发性骨髓瘤有治疗作用。
由以上实验结果可知，上述VHH以及人源化后得到的VHH-hfc1抗体均可特异性地识别、结合sCD38，并且在流式细胞层面也可有效结合CD38膜蛋白，也可对骨髓瘤在小鼠体内发展产生抑制作用。说明这些抗体可识别天然构象的细胞表面膜蛋白CD38，可利用其靶向作用，偶联治疗性药物，用以制备抗体偶联药物ADC(Antibody-drug conjugate)或偶联同位素用于依赖抗体的分子影像诊断等。也可应用于CAR疗法，用于治疗多发性骨髓瘤等B细胞恶性肿瘤，比如CAR-T或CAR-NK疗法，将T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)经修饰后表达抗CD38 CAR，从而达到治疗目的。更进一步的，可将编码上述抗体VHH片段的核酸搭载在AAV系统中，用以制备基因治疗药物，达到治疗目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京安锐生物科技有限公司
<120> 可结合人CD38的纳米抗体及其应用
<160> 119
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Pro Thr Phe Ser Ile Asp Thr
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Cys Ser Gly Leu Ile Phe Ser Gly Ser Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Ala Phe Lys Asn Tyr Ala
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ile Ile Phe Ser Gly Ser Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ile Val Phe Gly Ile Tyr Ala
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Leu Thr Phe Asn Asn Tyr Ala
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Asn Ile Phe Arg Ile Asn Pro
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Asn Ile Phe Ser Ile Asn Pro
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Asn Ile Phe Ser Met Asn Ala
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Pro Thr Phe Ala Ser Thr Ala
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Arg Ala Phe Asn Asn Tyr Ala
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Arg Ile His Ser Ile Lys Asp
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Arg Leu Phe Asn Asn Tyr Ala
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Arg Ser Phe Ser Pro Tyr Tyr
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Arg Thr Asp Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Arg Thr Phe Ser Val Asn Ser
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Arg Thr Phe Thr Gly Tyr Ala
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Arg Thr Phe Thr Asn Asn Tyr
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Arg Thr Gly Ser Arg Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gly Arg Thr Ser Asn Asn Tyr Ala
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gly Ser Ala Ala Ser Ile Asp Thr
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gly Ser Ile Phe Asn Ile Asn Pro
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn Arg
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg
1 5
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gly Ser Ser Gly Leu Ile Phe Ser Gly Ser Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gly Ser Thr Ala Ser Ile Asp Thr
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn Ala
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gly Ser Thr Phe Arg Ile Asn Val
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gly Ser Thr Val Ser Ile Asp Thr
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Gly Val Thr Phe Ser Arg Tyr Ala
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gly Tyr Arg Phe Asp Asn Tyr Ala
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Ile Arg Asp Phe Gly Phe Arg Ala
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Ile Arg Asp Phe Ser Phe Arg Ala
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Lys Arg Thr Phe Thr Arg Tyr Ala
1 5
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Val Arg Thr Ser Ser Thr Tyr Ala Gly Ser Thr Tyr Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Met Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Ile Asp Thr Ile Gly Glu Ile
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Ile Ser Trp Asn Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Ile Asp Thr Ile Asp Glu Pro
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Ile Thr Ser His Gly Glu Thr
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Ile Gly Trp Ala Gly Gly Ile Ile
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Ile Thr Lys Gly Gly Ile Thr
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Ile Thr Lys Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Ala Ile Thr Ser Trp Gly Ser Thr
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Ile Asp Trp Ser Gly Ala Arg Thr
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Ile Gly Trp Asn Gly Gly Val Ile
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Val Ser Gly Thr Gly Ser Thr
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Ile Thr Trp Ser Gly Asn Pro
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Ile Thr Trp Ser Gly Thr Gly Thr
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Ile Ser Trp Ser Thr Gly Ser Thr
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Ile Thr Trp Ser Thr Gly Ser Thr
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Ile Thr Arg Ser Gly Thr Gly Thr
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Ile Ser Trp Arg Gly Ser Ser Thr
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Asp Thr Gly Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Ile Ser Tyr Gly Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Leu Ile Trp His Gly Asp Ser Thr
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Ile Ser Arg Ser Gly Arg Ala
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Ile Asn Thr Gly Gly Phe Thr
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Ile Ser Arg Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Ile Asp Thr Ile Gly Gly Ile
1 5
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Leu Thr Trp His Gly Asp Ser Thr
1 5
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Leu Val Trp His Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Leu Ile Trp His Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Ile Asn Asp Ser Gly Asp Tyr Ser
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Ile Asn Trp Thr Gly Gly Ile Thr
1 5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Val Asp Gln Gly Gly Ile Ala Thr
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Val Asp Gln Gly Gly Ile Ile Thr
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Ile Lys Trp Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Ile Ser Val Thr Gly Gly Ala Thr
1 5
<210> 73
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Ala Ala Ser Arg Asp Ile Leu Val Gly Leu Arg Ser Met Ile Pro Arg
1 5 10 15
Asn Phe Gly Ser
20
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Asn Thr Met Trp Gly Ala Arg Gln Asn Lys Asp
1 5 10
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Gly Ala Thr Arg Tyr Thr Leu Arg Glu Leu Glu Leu Tyr Arg Tyr
1 5 10 15
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Asn Thr Val Trp Gly Ala Arg Gln Asn Thr Asn
1 5 10
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Asn Ala Trp His Val Phe Ala Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Ala Ala Lys Phe Val Val Arg Tyr Asp Ser Thr Arg Tyr Ile Arg Gln
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr Val His
20
<210> 79
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Ala Ala Lys Phe Val Ala Arg Tyr Asp Ser Thr Arg Tyr Ile Arg Gln
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr Val His
20
<210> 80
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Ala Ala Asp Thr Trp Gln Leu Asn Thr Val Thr Ser Asp Leu Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Ala Ala Asp Thr Trp Gln Leu Asn Thr Val Thr Ser Asp Leu Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Ala Ala Asp Arg Trp Gln Leu Asn Thr Val Val Ala Asp Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Ala Ala Asp Arg Arg Gln Leu Asn Thr Val Val Ala Asp Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Asn Ala Arg Leu Asp Ile Gly Asp Ser Glu Arg Glu Ile Thr Glu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 85
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
Ala Glu Leu Arg Arg Trp Gly Ala Arg Ser Pro Thr Asp Phe Arg Ser
1 5 10 15
<210> 86
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Ala Gly Lys Tyr Val Ala Arg Tyr Asp Ser Asn Tyr Tyr Ile Arg Asp
1 5 10 15
Asp Glu Tyr Gly Ser
20
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Tyr Ala Ser Phe Phe Phe Ala Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 88
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Ala Ala Phe Arg Gln Glu Arg Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Ser Glu Lys Tyr Asp Tyr
20
<210> 89
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Ala Ala Arg Glu Ser His Asn Asn Gly Arg Asp Pro Lys Asx
1 5 10
<210> 90
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Ala Ala Asn Glu Val Thr Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Thr Arg Ser Phe
1 5 10 15
Glu Tyr Asp Tyr
20
<210> 91
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Ala Thr Gly Trp Gly Ile Ser Gly Ser Tyr His Tyr Thr Pro Lys Val
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr
<210> 92
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Ala Gly Arg Tyr Val Ala Arg Tyr Asp Ser Asn Tyr Tyr Ile Arg Asp
1 5 10 15
Asp Glu Tyr Gly Ser
20
<210> 93
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Ala Thr Ala Gln Thr Thr Ala Thr Met Arg Asp Tyr Pro Arg Tyr Asp
1 5 10 15
Met Asp Gln
<210> 94
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Ala Ala Gln Gly Thr Pro Trp Lys Ile Gly Thr Arg Asn Ser Asp Asp
1 5 10 15
Trp Asp Tyr
<210> 95
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Ala Ala Asp Ser Lys Trp Arg Val Pro Thr Val Val Gly Asp Glu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 96
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Ala Gly Lys Tyr Val Ala Arg Tyr Asp Ser Asn Tyr Tyr Ile Arg Gly
1 5 10 15
Asp Glu Tyr Gly Ser
20
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Ala Ala Ser Arg Asp Ile Leu Leu Gly Val Arg Ser Met Ile Pro Thr
1 5 10 15
Lys Phe Gly Ser
20
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Asn Ala Arg Arg Gly Val Glu Gly Ser
1 5
<210> 99
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Ser Ala Lys Thr Arg Arg Thr Ala Gly Ile Thr Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Asn Thr Met Trp Gly Ala Cys Gln Asn Lys Asp
1 5 10
<210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Ala Ala Ser Arg Asp Ile Leu Leu Gly Val Arg Ser Val Ile Pro Thr
1 5 10 15
Lys Phe Gly Ser
20
<210> 102
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Ala Ala Asp Arg Phe Leu Leu Asn Arg Ala Ile Thr Asp Val Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 103
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Ala Ala Ser Arg Asp Ile Leu Leu Gly Val Pro Ser Met Ile Pro Thr
1 5 10 15
Asn Phe Gly Ser
20
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Asn Ile Ile Gly Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 105
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Ala Ala Arg Trp His Asp Arg Tyr Asp Thr Arg Val Leu Gln Ala Glu
1 5 10 15
Gly Gln Tyr Glu Tyr
20
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Ala Ala Ser Arg Leu Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Ser Gly Asp Tyr Pro
1 5 10 15
Asn
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Ala Ala Ser Arg Leu Tyr Glu Ser Ser Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Pro
1 5 10 15
Asn
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Ala Glu Lys Pro Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Gln Arg Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Ser
<210> 109
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Ala Gly Lys Tyr Val Ala Arg Tyr Asp Ser Asn Tyr Tyr Ile Arg Asp
1 5 10 15
Asp Glu Tyr Gly Pro
20
<210> 110
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Ala Ala Asp Pro Ala Tyr Ser Ile Gly Ala Tyr Tyr Lys Glu Ser His
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr
<210> 111
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
Ala Ala Asp Pro Ala Tyr Ser Ile Asp Ala Tyr Tyr Lys Glu Ser His
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr
<210> 112
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser
20 25
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 114
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Lys His Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Pro Ser Asp Ser
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Cys Tyr Cys
35
<210> 115
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro
1 5 10 15
Lys Pro Gln Pro
20
<210> 116
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Cys Glu Met Val Ala
1 5 10 15
Tyr
<210> 118
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
Ala Asp Ser Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys
1 5 10 15
His Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
1 5 10

Claims (7)

1.一种可结合人CD38的纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，其中，CDR1的序列如SEQ ID NO:17所示 ， CDR2的序列如SEQ ID NO:54所示， CDR3的序列如SEQ IDNO:90所示。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。
3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
4.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备CD38检测剂中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备CD38阳性肿瘤治疗药物中的应用。
6.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体。
7.权利要求6所述的核酸在制备针对CD38阳性肿瘤的基因治疗药物中的应用。
CN202010607781.6A 2020-06-30 2020-06-30 可结合人cd38的纳米抗体及其应用 Active CN111808193B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010607781.6A CN111808193B (zh) 2020-06-30 2020-06-30 可结合人cd38的纳米抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010607781.6A CN111808193B (zh) 2020-06-30 2020-06-30 可结合人cd38的纳米抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111808193A CN111808193A (zh) 2020-10-23
CN111808193B true CN111808193B (zh) 2022-04-05

Family

ID=72856358

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010607781.6A Active CN111808193B (zh) 2020-06-30 2020-06-30 可结合人cd38的纳米抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111808193B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112724248A (zh) * 2021-01-28 2021-04-30 南京拓峰生物科技有限公司 可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用
CN116547307A (zh) * 2021-12-03 2023-08-04 南京维立志博生物科技有限公司 结合cd38的抗体及其用途
CN114292329B (zh) * 2021-12-23 2023-10-20 南京大学 抗cd19抗体及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101616933A (zh) * 2006-10-19 2009-12-30 赛诺菲-安万特 用于治疗癌症的新型抗-cd38抗体
CN110862455A (zh) * 2019-12-03 2020-03-06 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合cd47的多肽及其应用
CN110903394A (zh) * 2019-12-27 2020-03-24 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合cd4的多肽及其应用
CN110922482A (zh) * 2019-12-25 2020-03-27 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合cd19的多肽及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101574920B1 (ko) * 2005-10-12 2015-12-04 모르포시스 아게 인간 ｃｄ38에 특이적인 완전 인간 ｈｕｃａｌ ｇｏｌｄ-유도 치료 항체들의 생성 및 프로파일링
EP3310386B1 (en) * 2015-06-22 2021-07-21 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies for heme malignancies with anti-cd38 antibodies and survivin inhibitors
CN109053892B (zh) * 2018-09-19 2021-03-26 苏州思坦维生物技术股份有限公司 特异结合人及猴cd38抗原的单克隆抗体及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101616933A (zh) * 2006-10-19 2009-12-30 赛诺菲-安万特 用于治疗癌症的新型抗-cd38抗体
CN110862455A (zh) * 2019-12-03 2020-03-06 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合cd47的多肽及其应用
CN110922482A (zh) * 2019-12-25 2020-03-27 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合cd19的多肽及其应用
CN110903394A (zh) * 2019-12-27 2020-03-24 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合cd4的多肽及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mechanisms of Resistance to Anti-CD38 Daratumumab in Multiple Myeloma;Ilaria Saltarella，et al.;《Cells》;20200109;第9卷(第167期);1-14 *
抗人CD38分子单克隆抗体生物学功能研究;温新宇等;《免疫学杂志》;20071130;第23卷(第6期);631-635 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111808193A (zh) 2020-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111848798B (zh) 可结合bcma的纳米抗体及其应用
CN112724248A (zh) 可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用
CN111808193B (zh) 可结合人cd38的纳米抗体及其应用
CN110713536B (zh) 可结合sftsv的多肽、其核酸编码序列及应用
CN110903394B (zh) 可结合cd4的多肽及其应用
CN114276452A (zh) 可结合bcma的纳米抗体及其应用
CN110922482B (zh) 可结合cd19的多肽及其应用
WO2021110181A2 (zh) 可结合cd47的多肽及其应用
CN112538115A (zh) 一种抗人bcma纳米抗体及其制备方法和应用
WO2021143914A1 (zh) 一种激活型抗ox40抗体、生产方法及应用
CN113527493A (zh) 一种b7-h3抗体及其应用
CN110950957B (zh) 可结合ctla4的多肽及其应用
CN110903393B (zh) 可结合IL6Rα的多肽及其应用
CN117820480A (zh) 纳米抗体串联体、编码基因及应用
EP4286520A1 (en) Antigen binding protein and use thereof
CN110950956B (zh) 可结合pd1的多肽及其应用
CN114292329B (zh) 抗cd19抗体及其应用
CN111393527B (zh) 可结合pd-l1的多肽及其应用
CN101585880A (zh) 一种抗人IL-13Rα2单克隆抗体的重链和轻链的可变区
EP4393945A1 (en) Anti-rsv antibody and application thereof
CN117843776B (zh) 抗体分子、核酸、制药用途及炎性疾病治疗方法
CN117820475B (zh) 针对il-17a的新型纳米抗体、药物、制备、方法及应用
WO2024012513A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
EP4201961A1 (en) Antibody specifically bound to glycosylated ceacam5
CN114213539A (zh) 可结合cd4的纳米抗体4nb357及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20211210

Address after: Room 513, building B2, bio nano Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Suzhou area, China (Jiangsu) pilot Free Trade Zone, Suzhou, Jiangsu 215000

Applicant after: Y-CLONE MEDICAL SCIENCE Co.,Ltd.

Address before: 210000 No. 22, Hankou Road, Gulou District, Jiangsu, Nanjing

Applicant before: Nanjing Anrui Biotechnology Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant