CN110862455A

CN110862455A - 可结合cd47的多肽及其应用

Info

Publication number: CN110862455A
Application number: CN201911216842.XA
Authority: CN
Inventors: 吴喜林; 吴稚伟; 苏艾荣; 黄碧莲
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: WO2021110181A2; WO2021110181A3; CN110862455B

Abstract

本发明涉及一种可结合人CD47蛋白的多肽，包括3个互补决定区CDR1‑3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1‑13所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:14‑24所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:25‑34所示序列之一。本发明针对CD47这一肿瘤免疫治疗靶点，通过制备CD47蛋白，免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CD47的纳米抗体VHH，并构建了人源化抗体；同时利用流式细胞术检测方法鉴定人源化抗体与细胞表面CD47蛋白的结合。本发明为多种癌症的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。

Description

可结合CD47的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合CD47的多肽及其应用。

背景技术

CD47广泛表达于不同组织细胞表面，是免疫球蛋白超家族成员。CD47蛋白通过与巨噬细胞上的配体信号调节蛋白α(SIRPα)发结合，可发出“别吃我”信号。肿瘤细胞可通过多种途径逃避机体免疫系统的识别和清除,其中即包括过表达细胞表面蛋白CD47。研究表明，使用抗体阻断CD47-SIRPα通路可促使肿瘤细胞被吞噬，靶向CD47是一个极具潜力的抗肿瘤方向，可用于治疗实体瘤和淋巴瘤患者。

1993年，一种来源于羊驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variableheavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。此外随着细胞治疗领域的快速发展，纳米抗体也广泛应用于细胞治疗领域的抗体筛选。

治疗性抗体药物发展的趋势从鼠源、人鼠嵌合、人源化再到全人源，再到近年得到广泛关注的纳米抗体，纳米抗体的研发得到高速发展。2018年9月首个纳米抗体药物获批。目前国内外有多个纳米抗体药物在临床研究阶段。我们期望通过免疫羊驼，获得高亲和力的靶向CD47的治疗性纳米抗体。

发明内容

本发明通过用抗原免疫羊驼，获取羊驼源纳米单抗及其VHH，用于实体瘤及淋巴瘤的治疗。基于这些研究，本发明提供了一种可结合CD47的多肽，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-13所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:14-24所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:25-34所示序列之一。

在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3交错排列。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQ ID NO:35-38所示，但本发明的范围不限于此，也可将框架区FR1-4序列人源化为如SEQ ID NO:39-42所示。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。例如，可设计人源、鼠源或羊驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合人CD47的多肽或结构域。

在一个优选实施方案中，所述多肽为单克隆抗体。

在一个优选实施方案中，所述多肽为VHH。

在一个优选实施方案中，所述多肽为羊驼源的VHH或人源化的VHH。

在一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：

I)CDR2的序列为SEQ ID NO:43,其中，第4位的X表示异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸或苏氨酸，并且第8位的X表示苏氨酸或异亮氨酸；并且

II)CDR1的序列选自SEQ ID NO:1-4，并且CDR3的序列选自SEQ ID NO:25-27。

优选地，CDR1的序列为SEQ ID NO:1，CDR2的序列为SEQ ID NO:14并且CDR3的序列为SEQ ID NO:25；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:2，CDR2的序列为SEQ ID NO:15并且CDR3的序列为SEQID NO:25；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:3，CDR2的序列为SEQ ID NO:16并且CDR3的序列为SEQID NO:25；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:3，CDR2的序列为SEQ ID NO:16并且CDR3的序列为SEQID NO:26；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:4，CDR2的序列为SEQ ID NO:17并且CDR3的序列为SEQID NO:27。

在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：

I)CDR2的序列为SEQ ID NO:44，其中第6位的X为精氨酸或苏氨酸；并且

II)CDR1的序列选自SEQ ID NO:5-8；并且CD3的序列选自SEQ ID NO:28-30。

优选地，所述多肽的CDR序列如下：

CDR1的序列为SEQ ID NO:5，CDR2的序列为SEQ ID NO:18并且CDR3的序列为SEQID NO:28；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:5，CDR2的序列为SEQ ID NO:18并且CDR3的序列为SEQID NO:29；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:6，CDR2的序列为SEQ ID NO:18并且CDR3的序列为SEQID NO:28；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:7，CDR2的序列为SEQ ID NO:18并且CDR3的序列为SEQID NO:28；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:8，CDR2的序列为SEQ ID NO:19并且CDR3的序列为SEQID NO:30。

在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：

I)CDR3的序列为SEQ ID NO:31；并且

II)CDR1的序列选自SEQ ID NO:9和10；并且CD2的序列选自SEQ ID NO:20和21。

优选地，所述多肽的CDR序列如下：

CDR1的序列为SEQ ID NO:9，CDR2的序列为SEQ ID NO:20并且CDR3的序列为SEQID NO:31；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:10，CDR2的序列为SEQ ID NO:21并且CDR3的序列为SEQID NO:31。

在另一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：

CDR1的序列为SEQ ID NO:11，CDR2的序列为SEQ ID NO:22并且CDR3的序列为SEQID NO:32；或

CDR1的序列为SEQ ID NO:12，CDR2的序列为SEQ ID NO:23并且CDR3的序列为SEQID NO:33；

CDR1的序列为SEQ ID NO:13，CDR2的序列为SEQ ID NO:24并且CDR3的序列为SEQID NO:34。

本发明还提供了上述多肽在肿瘤治疗药物中的应用。

本发明还提供了上述多肽的核酸编码序列。

在一个实施方案中，所述核酸编码序列为DNA编码序列或RNA编码序列。

在一个具体实施方案中，所述核酸编码序列存在于基因表达框中。

本发明针对实体瘤和淋巴瘤进行纳米抗体药物开发，通过制备人CD47蛋白、免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合人CD47的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH-huFc1(C47NB)；同时利用流式细胞术评估人源化抗体与细胞表面CD47蛋白的结合。本发明为肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。

附图说明

图1为CD47第3和4次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线；

图2为CD47第4次免疫一周后的血清与多发性骨髓瘤细胞8226细胞表面CD47蛋白结合的流式结果图。其中，横坐标表示血清中抗体结合细胞表面CD47蛋白，纵坐标为市售直标抗体结合细胞表面CD47蛋白。

图3为CD47-VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；

图4为CD47-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对CD47蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为第二轮(2^nd)和第三轮(3^rd)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选40个和46个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；

图5为原核表达的VHH抗体的ELISA检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对人CD47的OD450/空白对照的OD450，比值大于5.0定义为阳性；

图6和7为本发明制备的19个VHH抗体与PRMI8226细胞表面CD47结合的流式图。

具体实施方式

1.免疫原的制备

我们依据NCBI网站上人CD47蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导羊驼产生针对细胞表面CD47蛋白的特异性抗体的多肽CD47，在C端连接His-tag(CD47-his)或兔Fc(CD47-rFc)用于后续纯化及检测。

2.羊驼免疫与抗血清的获得

用250μg CD47-rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对双峰羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用CD47-rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次和第3次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。

抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的CD47-his蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti-Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H₂SO₄中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。

结果如图1所示，3免和4免的抗血清效价分别为1.09×10⁶和3.28×10⁶。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对人CD47蛋白的高滴度抗血清。

为了进一步验证该高滴度的羊驼抗血清是否能有效结合细胞表面CD47蛋白，进行流式细胞检测。将不同稀释浓度的抗血清和免疫前血清分别与人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226细胞共同孵育60min，洗涤细胞后加入荧光二抗Alexa Fluor 488Goat antiAlpaca IgG(H+L),4℃孵育30min后洗涤细胞，上机检测。流式细胞术结果显示，CD47免疫的羊驼抗血清可结合细胞表面CD47蛋白(图2)。综上所述，CD47蛋白诱导了高滴度抗血清，同时该抗血清具有结合细胞表面CD47蛋白的能力，可用于流式检测。

3.VHH噬菌体库构建及淘选

收集200ml免疫后羊驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll-Paque Plus)分离获得羊驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA,通过引物扩增，以及分子克隆等技术，将羊驼的VHH基因克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，得到VHH噬菌体库。为了进一步鉴定CD47-VHH噬菌体库是否构建成功，通过PCR扩增免疫CD47羊驼的VHH目的基因，可以看出目的条带为500bp，大小符合预期(图3)，说明该CD47-VHH噬菌体抗体文库里含有VHH基因。挑选33个克隆进行测序，测序结果显示，所测序列多样性为93.9％；比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，该构建了一个CD47-VHH噬菌体抗体文库的库容为1.35×10⁹，阳性率为100％，序列多样性(Diversity)为93.9％，有效插入率(In frame rate)大于95％。

在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，用VHH-phagemid转化的细菌，进行噬菌体抗体库的复苏，并用PEG/NaCl进行沉淀。将包被有50μg/ml的CD47-His蛋白进行三次富集噬菌体抗体库。将富集的噬菌体，洗脱、转化、涂板、挑取单克隆进行噬菌体与CD47蛋白ELISA的结合鉴定，将结合读值>1.0的克隆进行测序，并克隆至表达载体phv13，转化SS320细胞表达生产纳米单抗。

淘选后的文库与CD47蛋白进行结合检测。噬菌体ELISA结果显示，没有富集前的CD47-VHH噬菌体文库与CD47蛋白的结合读值为0.33，经过一轮、二轮、三轮富集后的噬菌体文库读值分别为0.49、1.73、3.34(图4A)。为了进一步验证富集后的文库中结合CD47-VHH蛋白的阳性噬菌体率，从第2、3轮富集后的文库里分别挑选了40、46个克隆进行单个噬菌体ELISA检测。结果显示，第2轮文库里，42.5％的单个噬菌体克隆为阳性，第3轮文库里89％的噬菌体克隆为阳性，而且结合的平均读值在3.0左右(图4B)，通过CD47蛋白淘选成功地富集了高结合力的CD47-VHH噬菌体文库。

4.VHH原核表达文库的构建及VHH表达

对上述二轮和三轮淘选富集后的2nd-CD47-VHH和3rd-cCD47-VHH噬菌体抗体文库进行PCR扩增；获取并纯化抗体库中所有VHH的基因片段，将VHH的基因片段克隆至原核表达载体，转化SS320菌株，构建VHH的原核表达抗体库；将原核表达抗体库涂布平板，过夜培养，次日随机挑选单克隆菌落600个，使用IPTG诱导表达抗体上清，对抗体上清与CD47蛋白进行ELISA结合检测。

结果显示，有细菌上清与CD47蛋白结合，同时不与空白对照结合，CD47结合的读值/空白对照的读值大于5.0(图5和表1)。将这些序列进行测序比对，剔除重复序列，最终获得52个的VHH抗体序列。进一步的实验证实，这52个VHH抗体中有19个抗体可与细胞表面CD47蛋白结合(SEQ ID NO:1-19)。

表1 19个VHH抗体与CD47蛋白的结合值及其序列

5.流失细胞法检测VHH抗体与肿瘤细胞的结合

将VHH抗体与PRMI 8226细胞混合孵育，100μl/样品，4℃1h；以0.5％PBSF洗涤两遍后，加入二抗Alexa Fluor 488goat anti human IgG，4℃30min；以0.5％PBSF洗涤两遍后，上机检测。MOCK为PBS对照；neg组为阴性对照，即不含抗体的原核表达上清对照；positive为阳性对照，即可结合CD47膜蛋白的阳性抗体对照。结果如图6和7所示，流式检测显示，19个VHH抗体均可与PRMI8226细胞结合，其中，IAP-114、118、121、129、132、140和148的结合力较高。使用人源化的VHH抗体亦得到类似的结果。可见，上述VHH抗体具有靶向结合肿瘤细胞的能力，同时有可能通过阻断肿瘤细胞表面的CD47分子，促进巨噬细胞的吞噬作用，从而达到治疗或者抑制肿瘤生长的效果，因此这19个VHH抗体均有潜力成为治疗肿瘤的新型抗体药物。

因为19个VHH能够识别肿瘤细胞表面的CD47分子，因此19个VHH抗体序列也可以应用于CAR(Chimeric Antigen Receptor,抗原嵌合受体,由VHH序列融合第三代或者第四代CD28-4-1BB-CD3zeta分子序列构成)细胞治疗肿瘤的治疗。另外因为19个VHH能识别肿瘤细胞表面的CD47分子，因此VHH可以通过偶联药物用于ADC(Antibody-drug conjugate,抗体偶联药物)治疗或者偶联同位素用于依赖抗体的分子影像诊断等。

为肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米新药。

6.使用AAV病毒载体装载的人源化VHH进行体内实验

腺相关病毒载体(AAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

AAV Helper-Free病毒包装系统购于Cell Biolabs,San Diego USA。将上述VHH的DNA编码序列通过分子克隆技术插入到pAAV-MCS质粒；通过测序证明构建成功后，将构建好的质粒pAAV-Ab与pHelper和pAAV-DJ质粒按照质量比1:1:1的方式使用PEI转染试剂共转染AAV-293T细胞。转染后分别于48、72、96和120小时收集上清，并用5xPEG8000(sigma)进行浓缩，最后用1.37g/ml氯化铯进行纯化。纯化的AAV溶解于PBS里，进行鉴定和分装后保存于-80℃。

使多发性骨髓瘤模型小鼠接受AAV-VVH(1x10¹¹gc/100μl)肌肉注射，以AAV-GFP为对照组。结果显示，AAV-VVH对多发性骨髓瘤有治疗作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 源道隆（苏州）医学科技有限公司

<120> 可结合CD47的多肽及其应用

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Arg Asn Leu Asn Glu Asn Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Arg Thr Phe Ser Glu Thr Gly

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Arg Asn Leu Ser Glu Asn Gly

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Thr Ile Ser Glu Asn Gly

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Gly Ile Phe Gly Pro Ile Ala

1 5

<210> 6

<211> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Gly Ile Phe Gly Ser Ile Ala

1 5

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Gly Ile Phe Gly Thr Ile Ala

1 5

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<211> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Gly Ile Phe Gly Phe Asn Ala

1 5

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<211> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Leu Thr Phe Ser Glu Ser Gly

1 5

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Leu Pro Phe Ser Glu Thr Gly

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Ser Asp Phe Glu Phe Tyr Ala

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Arg Ile Val Ser Ile Asn Val

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<211> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Asn Trp Ile Gly Gly Asn Thr

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Asn Trp Lys Gly Gly Asn Ile

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<211> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Asn Trp Arg Gly Gly Asn Thr

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<211> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Asn Trp Thr Gly Gly Asn Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Ile Ser Gly Gly Gly Arg Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Ser Gly Gly Gly Ser Thr

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ile Ser Trp Arg Gly Gly Asn Thr

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Ile Ser Trp Thr Gly Asp Tyr Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Thr Arg Ala Leu Tyr Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Thr Ser Asp Gly Ala Thr

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Thr Trp Val Val Gly Arg Thr

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Ala Ala Ser Asp Leu Ser Gly Ser Phe Gly Ser Glu Thr Trp Tyr His

1 5 10 15

Tyr

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Val Ala Ser Asp Leu Ser Gly Ser Phe Gly Ser Glu Thr Trp Tyr His

1 5 10 15

Tyr

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Ala Ala Ser Ser Leu Ser Gly Ser Phe Gly Ser Glu Thr Trp Tyr His

1 5 10 15

Tyr

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Trp Ile Gly Gly Tyr

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Trp Phe Gly Gly Tyr

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<211> 5

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Trp Ile Arg Gly Tyr

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Ala Ala Ser Asp Leu Ser Gly Ser Phe Gly Ser Glu Thr Trp Phe His

1 5 10 15

Tyr

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Asn Val Gly Gly Pro Tyr

1 5

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Asn Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Glu Leu Arg Tyr Arg Asp Tyr

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Ala Ala Asp Asn Gly Pro Arg Ala Tyr Lys Ser Glu Ala Phe Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 35

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Gly

1 5 10 15

Ser

<210> 37

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Arg Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 38

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Pro Gln Pro

20

<210> 39

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 40

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Cys Glu Met Val Ala

1 5 10 15

Tyr

<210> 41

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Ala Asp Ser Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys

1 5 10 15

His Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Ile Asn Trp Xaa Gly Gly Asn Xaa

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Ile Ser Gly Gly Gly Xaa Thr

1 5

Claims

1.一种可结合CD47的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-13所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:14-24所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:25-34所示序列之一。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。

3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽为单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽为VHH。

5.根据权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述多肽为羊驼源的VHH或人源化的VHH。

6.权利要求1-5中任一项所述的多肽在检测细胞表面CD47中的应用。

7.权利要求1-5中任一项所述的多肽在制备肿瘤治疗药物中的应用。

8.权利要求1-5中任一项所述的多肽在制备CAT T细胞治疗剂中的应用。

9.权利要求1-5中任一项所述的多肽的核酸编码序列在基因治疗中的应用。

10.一种检测细胞表面的CD47的试剂，其特征在于，包含权利要求1-5中任一项所述的多肽。