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CN111732741B - 一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法及所得复合交联物和应用 - Google Patents

一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法及所得复合交联物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸与ε‑聚赖氨酸交联的方法及所得复合交联物和应用，该方法是将透明质酸或其盐和ε‑聚赖氨酸或其盐在耦合剂、辅助耦合剂及中性或碱性水环境下进行交联反应，得到复合交联物。本发明在中性或碱性环境下抑制ε‑聚赖氨酸或其盐的质子化，使透明质酸或其盐的羧基与ε‑聚赖氨酸或其盐的氨基发生酰胺化反应，抑制或避免絮凝沉降。本发明透明质酸或其盐与ε‑聚赖氨酸或其盐交联，ε‑聚赖氨酸或其盐相当于交联剂，ε‑聚赖氨酸或其盐在体内的分解代谢产物可以被人体吸收利用，生物相容性好，可避免传统交联剂易引起的细胞毒性。

Description

一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法及所得复合交联物和应用
技术领域
本发明涉及一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，尤其涉及一种透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物的制备方法及所得产品和应用。
背景技术
透明质酸是一种天然存在的聚阴离子黏多糖，是由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖组成的二糖单元重复构成的直链高分子聚合物。透明质酸广泛存在于生物体内，具备优良的生物相容性，因此它是一种理想的天然高分子医用材料。但透明质酸容易被人体内的酶降解，导致其在体内半衰期不长。为了延长透明质酸在体内停留时间，人们对透明质酸进行了大量的修饰和交联。
ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种微生物发酵产生的赖氨酸同聚物，由25-30个赖氨酸聚合而成。它在生物体内生物相容性好，其降解产物是赖氨酸，为人体必需氨基酸，可参与人体的新陈代谢，最终生成二氧化碳和水排出体外。ε-聚赖氨酸是一种对人体安全无毒的聚阳离子多肽，能够抑制革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性菌、真菌等，甚至是某些病毒，抑菌谱广泛，已被广泛用作食品防腐剂。
透明质酸和ε-聚赖氨酸虽然都具有良好的生物相容性，但因两者为带相反电荷的高分子聚合物，两者同时存在于生理pH环境时，会形成不溶性的离子络合物。为了使透明质酸和ε-聚赖氨酸之间发生交联反应形成水凝胶而非絮凝沉降，CN108904875A公开了一种促进慢性创面愈合的抗菌自愈合水凝胶辅料及其制备方法和应用，该专利中先用强氧化剂将透明质酸、海藻酸钠或普鲁兰多糖等氧化成含有醛基的多糖，形成的醛基再与ε-聚赖氨酸、聚乙烯亚氨、壳聚糖季铵盐等阳离子聚合物中的氨基或胺基通过席夫碱反应生成一种含亚胺的具有网络结构的聚合物。在该制备方法中，透明质酸首先需要在强氧化剂的作用下被氧化成醛基，然后加入反应终止剂终止氧化反应，再经透析除去强氧化剂与反应终止剂，最后在pH7.4的PBS缓冲液条件下向纯化的氧化多糖中加入阳离子聚合物进行交联反应，制备过程相对复杂。透明质酸在被强氧化剂氧化成含醛基多糖的同时，也会被氧化降解，透明质酸长链及分子结构会遭到一定程度的破坏。
发明内容
针对透明质酸与ε-聚赖氨酸因自身性能交联反应容易形成絮凝沉降的不足，本发明提供了一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，还可以称为防止或降低透明质酸与ε-聚赖氨酸絮凝沉降的方法或调控透明质酸与ε-聚赖氨酸交联程度的方法，该方法不仅可以解除阴、阳离子聚合物发生络合的配伍禁忌，在交联过程中降低絮凝沉降的产生量或不产生絮凝沉降，还能直接使透明质酸或其盐和ε-聚赖氨酸中自身含有的羧基和氨基官能团进行交联，操作简便易行，不会破坏透明质酸或其盐的长链及分子结构。
研究发现，在酸性环境下，ε-聚赖氨酸的游离羟基会发生质子化而带正电荷，同时失去亲核力。此时，ε-聚赖氨酸会优先与透明质酸发生离子络合反应，形成絮凝沉降，无法形成透明的交联凝胶。而在中性或碱性环境下，将透明质酸或其盐加入含有ε-聚赖氨酸或其盐的溶液中进行反应，透明质酸或其盐的羧基与ε-聚赖氨酸或其盐的氨基会优先发生酰胺化反应，形成透明的交联复合凝胶，不发生絮凝，反应步骤简单，副反应发生的几率也小。
基于上述研究发现，本发明提供了一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，该方法包括透明质酸或其盐和ε-聚赖氨酸或其盐在耦合剂、辅助耦合剂及中性或碱性水环境下进行交联反应的步骤。
进一步的，上述方法中，ε-聚赖氨酸或其盐和透明质酸或其盐可以以固体的形式加入，也可以以溶液的形式加入。优选的，先将ε-聚赖氨酸或其盐、耦合剂和辅助耦合剂在中性或碱性水环境中混合，然后再加入透明质酸或其盐，这样可以使ε-聚赖氨酸或其盐与透明质酸或其盐混合更加均匀，更能避免絮凝沉降的产生。当然，也可以采用先加透明质酸或其盐，再加ε-聚赖氨酸或其盐的方式，但这种加料方式容易造成原料混合不均匀，为了使原料混合均匀一般ε-聚赖氨酸或其盐需要采用缓慢滴加的方式，以避免絮凝的产生，但是这种加入方式操作繁琐、缓慢、效率低。
进一步的，上述方法优选包括以下步骤：
（1）将耦合剂、辅助耦合剂、ε-聚赖氨酸或其盐和水混合均匀；
（2）将上述溶液pH调至中性或碱性，再向其中加入透明质酸或其盐进行交联反应，得交联的复合凝胶；
（3）将上述交联的复合凝胶去除杂质、干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。
本发明在中性或碱性条件下先将耦合剂/辅助耦合剂和ε-聚赖氨酸或其盐混合，随后加入透明质酸或其盐进行反应，简洁、高效的实现了透明质酸或其盐和ε-聚赖氨酸或其盐的交联，避免了这两者接触时形成絮凝沉降，反应步骤简单，副反应小。反应所用的耦合剂为碳二亚胺类物质，所述碳二亚胺类物质是现有技术中报道的可以用于透明质酸交联的含碳二亚胺结构的物质，例如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺及其盐等，1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐可以是其盐酸盐或者其他可行的盐。在使用时，碳二亚胺类物质既可以是一种，也可以是多种的混合。反应所用的辅助耦合剂为琥珀酰亚胺类物质，所述琥珀酰亚胺类物质包括N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）中的一种或多种。通过耦合剂和辅助耦合剂的联用，大大提高了交联效率和程度。
进一步的，交联反应在中性或碱性环境下进行，该环境有利于避免ε-聚赖氨酸或其盐发生质子化，pH优选为7-12，更优选为8-10。pH可以由酸或碱来调整，所用酸可以是盐酸、硫酸、硝酸等常用无机酸，所用碱可以是碱金属氢氧化物等常用无机碱，优选的，所用碱为氢氧化钠。
进一步的，本发明所用的透明质酸或其盐原料的分子量没有特别要求，可以根据产品的应用领域、作用等进行选择，例如在用作细胞培养支架材料时，透明质酸或其盐的分子量一般为200KDa~3000 KDa。所述透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐、锌盐等可用盐，常用的为钠盐。
进一步的，交联反应时，体系中透明质酸或其盐的浓度一般为10g/L~200g/L。在此范围内，原料能较好的溶解，反应体系的粘度也不会太高，能较快的进行反应。当透明质酸或其盐分子量较大时，可以选择较小的浓度，以便于溶解和反应，当透明质酸或其盐分子量较小时，可以选择较大的浓度。
进一步的，本发明所用的ε-聚赖氨酸盐可以是ε-聚赖氨酸盐酸盐等医学可接受的盐。
进一步的，交联反应时，透明质酸或其盐中的羧基、耦合剂和辅助耦合剂的摩尔比为1 : 0.1-2 : 0.1-2，优选1:1-2:0.5-2。
进一步的，交联反应时，透明质酸或其盐中的羧基与ε-聚赖氨酸或其盐中的氨基的摩尔比为1 : 0.1-1。在此摩尔比范围内，能够较好的避免絮凝沉淀的产生。
进一步的，交联反应的条件温和，反应温度在室温或常温下进行即可，交联反应的时间根据交联程度的要求可以为2~24h不等。为了更好的反应，一般将原料混合后，在4℃左右先维持10~30min，使透明质酸或其盐充分溶胀，然后再升至反应温度进行自交联反应。
进一步的，反应后，通过透析、浸泡、洗涤、过滤等方式去除杂质，杂质为未交联的反应物等。透析、浸泡、洗涤所用的介质为水。除杂后进行干燥，干燥为冷冻干燥。干燥后得到干的透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物，该复合交联物在水中会再次吸水溶胀，恢复成透明的交联凝胶状态。
本发明还提供了按照上述方法得到的透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物，该复合交联物通过透明质酸或其盐的羧基与ε-聚赖氨酸或其盐的氨基之间的酰胺化反应制得，除了发挥交联透明质酸自身具有的生物性能外，还引入ε-聚赖氨酸或其盐来赋予透明质酸交联产物更多性能，具有抗菌性和促进细胞增生与加强细胞功能等效果。该透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物可以用在软骨组织工程领域，用作组织工程支架材料。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明在中性或碱性环境下抑制ε-聚赖氨酸或其盐的质子化，使透明质酸或其盐的羧基与ε-聚赖氨酸或其盐的氨基发生酰胺化反应，不产生絮凝沉降。本发明透明质酸或其盐与ε-聚赖氨酸或其盐交联，ε-聚赖氨酸或其盐相当于交联剂，ε-聚赖氨酸或其盐在体内的分解代谢产物可以被人体吸收利用，生物相容性好，可避免传统交联剂易引起的细胞毒性。
2、本发明所得透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物，引入ε-聚赖氨酸或其盐赋予透明质酸交联物更多性能。除了具有交联透明质酸自身具有的生物性能外，还具有抗菌性和促进细胞增生与加强细胞功能等效果。
3、本发明方法简便易行，瞬间成胶，制备的凝胶降解速率缓慢（体外抗酶解能力较强），平衡溶胀速度快。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需要说明的是，本发明未详细说明的工艺参数、原料等均按照本领域常规技术手段进行。
下述实施例中，所用透明质酸来自华熙生物科技股份有限公司。所用的ε-聚赖氨酸盐酸盐购自郑州拜纳佛生物工程股份有限公司。
实施例1 耦合剂与辅助耦合剂用量对透明质酸与ε-聚赖氨酸交联程度的影响
（1）反应液配制：室温下，向100ml去离子水中依次加入耦合剂、辅助耦合剂和1.6gε-聚赖氨酸盐酸盐，溶解完全。用NaOH溶液将pH值调至9.0，再向上述溶液中边搅拌边加入5g透明质酸（1.42╳106Da）进行溶解。
（2）交联反应：将上述配制的反应液放入4℃条件下活化 10~30min，然后取出置于室温下交联反应4h，得到透明的交联复合凝胶。
（3）透析：待反应结束后，将交联复合凝胶浸泡在去离子水中洗涤，除去未交联的反应物。
（4）冷冻干燥：最后经冷冻干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。
所用耦合剂与辅助耦合剂的用量如下表1所示：
上表中，EDC表示1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，Sulfo-NHS表示N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
根据文献《交联透明质酸凝胶修饰度的测定方法研究进展》记载，核磁共振法是目前直接测定交联度的常用方法，但因为透明质酸交联凝胶难溶于水，直接进行核磁共振分析时，重复性和准确性不高。先将交联凝胶进行酶解，对酶解产物进行核磁共振分析，可提高该方法的适用性。而交联透明质酸分子结构中酶的结合域因发生交联反应而减少，使其具有抗酶解能力，交联度越大，抗酶解能力越强，使得先酶解后核磁共振分析的方法准确性仍然不高。所以可以采用溶胀度和持水性来侧面反映透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物的交联程度。其中，交联程度越高，交联度越大，凝胶内部交联的越紧密，凝胶溶胀度越小。同时，持水性与溶胀度呈反比，溶胀度越大，凝胶的持水能力越弱。
根据现有技术的报道，本发明通过溶胀度和凝胶持水能力来反映不同偶合剂与辅助偶合剂用量情况所得产品的交联程度，同时通过肉眼、手触以及测定凝胶强度的方式评价产品的状态。
溶胀度测定
称取一定质量的透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物（W0），浸入盛有足量去离子水的容器中吸水形成凝胶。室温条件下，每隔一定时间，从溶液中取出凝胶置于滤纸上，吸去表面肉眼可见的水分后称重。然后将凝胶块放回溶液中。重复此过程直至恒重（Wc），此时凝胶吸水达到平衡。凝胶溶胀度（SD）计算公式为：SD=（Wc- W0）/ W0。
凝胶持水能力测定
将达到吸水平衡的凝胶置于60℃烘箱内，放置8h后测定凝胶质量变化。凝胶初始质量计为100%，以8h测定的质量为初始质量的百分比表示凝胶的持水能力。
凝胶强度测试
将达到吸水平衡的凝胶切成高3cm，直径1.5cm的圆柱体，于万能试验机下测定水凝胶在破裂时的压力为凝胶强度。圆柱形探头置于凝胶表面，并以0.5mm/min的速度下降，每个试样测定三次，取破裂时的压力平均值，按照下列公式计算凝胶强度：凝胶强度=压力平均值/凝胶横截面积。
所得产品的性能如下表2所示：
通过上表可以看出：耦合剂与辅助耦合剂用量越大，制备所得复合交联凝胶的交联程度越大，凝胶溶胀度越小，持水能力越强，凝胶强度越大。
实施例2 pH对透明质酸与ε-聚赖氨酸交联程度的影响
（1）反应液配制：室温下，向100ml去离子水中依次加入3.59g EDC、2.16g NHS和1.6g ε-聚赖氨酸盐酸盐，溶解完全。用HCl溶液或NaOH溶液将pH值调至2.0~12.0之间，再向上述溶液中边搅拌边加入5g透明质酸（1.42╳106Da）进行溶解。
（2）交联反应：将上述配制的反应液放入4℃条件下活化 10~30min，然后取出置于室温下交联反应8h，得到透明的交联复合凝胶。
（3）透析：待反应结束后，将交联复合凝胶浸泡在去离子水中洗涤，除去未交联的反应物。
（4）冷冻干燥：最后经冷冻干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。
不同pH值反应条件下，透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物形成情况如下表3所示。
在实验过程中发现，在pH≤6.0时，步骤（1）中开始加入透明质酸时，透明质酸会与ε-聚赖氨酸盐酸盐发生絮凝沉降现象，但待所有透明质酸加入，并在步骤（2）下进行反应后，反应体系会发生明显变化，变成一个半透明的具有很大黏弹性的整体凝胶。将凝胶浸泡在去离子水中洗涤时，凝胶会迅速脱水，变成白色不溶物。推测在pH≤6.0时，透明质酸和ε-聚赖氨酸盐酸盐两者之间形成不稳定的离子交联凝胶。在凝胶浸泡在去离子水过程中，pH发生变化，同时水分子也会破坏两者之间的离子键，导致析出白色不溶物。同时，由表3可知，pH在7~12之间，在耦合剂与辅助耦合剂存在下，透明质酸的羧基和ε-聚赖氨酸盐酸盐的氨基之间会发生化学交联形成酰胺键。pH＜8时，ε-聚赖氨酸盐酸盐的氨基亲核力并不强，所以交联程度相对较弱。但pH＞10时，碱降作用增强，所以导致交联程度并不强。因此，透明质酸的羧基与ε-聚赖氨酸盐酸盐发生复合交联优选的pH范围为8~10。
实施例3 不同透明质酸分子量对透明质酸与ε-聚赖氨酸交联程度的影响
（1）反应液配制：室温下，向100ml去离子水中依次加入3.59g EDC、2.16g NHS和1.6g ε-聚赖氨酸盐酸盐，溶解完全。用NaOH溶液将pH值调至9.0，再向上述溶液中边搅拌边加入5g透明质酸进行溶解。
（2）交联反应：将上述配制的反应液放入4℃条件下活化 10~30min，然后取出置于室温下交联反应2h，得到透明的交联复合凝胶。
（3）透析：待反应结束后，将交联复合凝胶浸泡在去离子水中洗涤，除去未交联的反应物。
（4）冷冻干燥：最后经冷冻干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。
不同分子量情况下，透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物形成情况如下表4所示。
由表4可知，相同交联反应条件下，透明质酸分子量越大，交联的程度就越高。
实施例4 透明质酸浓度对透明质酸与ε-聚赖氨酸交联程度的影响
（1）反应液配制：室温下，向100ml去离子水中依次加入EDC、NHS和ε-聚赖氨酸盐酸盐，溶解完全。用NaOH溶液将pH值调至9.0，再向上述溶液中边搅拌边加入透明质酸（1.42╳106Da）进行溶解。
（2）交联反应：将上述配制的反应液放入4℃条件下活化 10~30min，然后取出置于室温下交联反应24h，得到透明的交联复合凝胶。
（3）透析：待反应结束后，将交联复合凝胶浸泡在去离子水中洗涤，除去未交联的反应物。
（4）冷冻干燥：最后经冷冻干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。
不同透明质酸浓度情况下，透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物形成情况如下表5所示。
由表5可知，随着交联反应体系中透明质酸浓度增加，透明质酸和ε-聚赖氨酸盐酸盐复合交联程度逐渐增强。
实施例5 透明质酸与ε-聚赖氨酸的摩尔比对透明质酸与ε-聚赖氨酸交联程度的影响
（1）反应液配制：室温下，向100ml去离子水中依次加入3.59g EDC、2.16g NHS和ε-聚赖氨酸盐酸盐，溶解完全。用NaOH溶液将pH值调至9.0，再向上述溶液中边搅拌边加入5g透明质酸（1.42╳106Da）进行溶解。
（2）交联反应：将上述配制的反应液放入4℃条件下活化 10~30min，然后取出置于室温下交联反应12h，得到透明的交联复合凝胶。
（3）透析：待反应结束后，将交联复合凝胶浸泡在去离子水中洗涤，除去未交联的反应物。
（4）冷冻干燥：最后经冷冻干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。
不同透明质酸的羧基与ε-聚赖氨酸盐酸盐的氨基摩尔比情况下，透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物形成情况如下表6所示。
由表6可知，透明质酸羧基与ε-聚赖氨酸盐酸盐氨基摩尔比≥1:1的情况下，摩尔比越小，透明质酸与ε-聚赖氨酸盐酸盐发生复合交联的程度越强。即在透明质酸浓度一定的情况下，ε-聚赖氨酸盐酸盐浓度越大，两者交联程度越强，但ε-聚赖氨酸盐酸盐的氨基摩尔浓度不能超过透明质酸的羧基摩尔浓度。
对比例1
向100ml去离子水中依次加入1.91g EDC、1.15g NHS和0.64g ε-聚赖氨酸盐酸盐，完全溶解后，用盐酸将pH值调至4.5，再向上述溶液中边搅拌边加入2g透明质酸（1.42╳106Da）进行溶解。结果发现，加入的透明质酸会迅速与ε-PL发生离子络合反应，形成白色的不溶絮状物，并沉降使溶液分层。由此可以看出，酸性条件下，低浓度透明质酸与低浓度ε-聚赖氨酸盐酸盐形成絮凝沉降，无法进行交联。
对比例2
向100ml去离子水中依次加入3.59g EDC、2.16g NHS和1.6g ε-聚赖氨酸盐酸盐，完全溶解后，用氢氧化钠溶液将pH值调至4.5，再向上述溶液中边搅拌边加入5g透明质酸（1.42╳106Da）进行溶解，然后将配制的反应液放在4℃条件下10-30min进行溶胀，再放至室温下进行交联反应24小时得到交联凝胶。待反应结束后，将交联凝胶浸泡在去离子水中洗涤，交联凝胶会迅速脱水，形成白色不溶物。由此可以看出，酸性条件下，高浓度透明质酸与高浓度ε-聚赖氨酸盐酸盐虽然不会发生絮凝，但是所得产物无法复水变为凝胶。
对比例3
向100ml去离子水中依次加入3.59g EDC、2.16g NHS和3.2g ε-聚赖氨酸盐酸盐，完全溶解后，用氢氧化钠溶液将pH值调至9.0，再向上述溶液中边搅拌边加入5g透明质酸（1.42╳106Da）进行溶解，然后将配制的反应液放在4℃条件下10-30min进行溶胀，再放至室温下进行交联反应24小时得到交联凝胶。待反应结束后，将交联凝胶浸泡在去离子水中洗涤，除去未交联的反应物。得到的交联凝胶呈现半透明状态。这是由于ε-聚赖氨酸盐酸盐用量过高时，随着交联凝胶浸泡在去离子水中洗涤，pH逐渐降低，交联凝胶中未参与酰胺化反应的游离氨基会与透明质酸的羧基发生离子络合，出现微量絮凝现象，反映到交联凝胶上，即出现半透明状态。
对比例4
向100ml去离子水中依次加入3.59g EDC、2.16g NHS，完全溶解后，用氢氧化钠溶液将pH值调至9.0，再向上述溶液中边搅拌边加入5g透明质酸（1.42╳106Da）混合均匀，然后一次性加入1.6gε-聚赖氨酸盐酸盐混合均匀，将配制的反应液放在4℃条件下10-30min进行溶胀，再放至室温下进行交联反应24小时得到交联凝胶。待反应结束后，将交联凝胶浸泡在去离子水中洗涤，除去未交联的反应物。得到的交联凝胶呈现半透明状态。由此可以看出，复合交联反应体系中，先加入透明质酸，再一次性加入ε-聚赖氨酸盐酸盐，会导致透明质酸与ε-聚赖氨酸盐酸盐混合不均匀，ε-聚赖氨酸盐酸盐存在局部浓度过高问题，局部会出现不可逆的离子络合反应，从而使复合交联凝胶呈半透明状态，影响复合交联凝胶的外观与复溶性。

Claims (8)

1.一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，其特征是：包括以下步骤：
（1）将耦合剂、辅助耦合剂、ε-聚赖氨酸或其盐和水混合均匀；
（2）将上述溶液pH调至碱性，再向其中边搅拌边加入透明质酸或其盐进行交联反应，得交联的复合凝胶；
（3）将上述交联的复合凝胶去除杂质、干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物；
所述耦合剂为碳二亚胺类物质，所述辅助耦合剂为琥珀酰亚胺类物质；
交联反应的pH为8-10；透明质酸或其盐中的羧基与ε-聚赖氨酸或其盐中的氨基的摩尔比为1 : 0.1-1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述碳二亚胺类物质包括1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺及其盐中的一种或多种，所述琥珀酰亚胺类物质包括N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：透明质酸或其盐中的羧基、耦合剂和辅助耦合剂的摩尔比为1 : 0.1-2 : 0.1-2；透明质酸或其盐中的羧基与ε-聚赖氨酸或其盐中的氨基的摩尔比为1 : 0.1-1。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：交联反应的温度为室温，反应的时间为2~24h。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：透明质酸或其盐的分子量为200KDa~3000KDa；反应时，体系中透明质酸或其盐的浓度为10g/L~200g/L。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：通过冷冻干燥进行干燥。
7.按照权利要求1-6中任一项所述的透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法制得的透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。
8.权利要求7所述的透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物在软骨组织工程中的应用，其特征是：所述透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物作为细胞培养支架材料。
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