CN111635385B - 一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明专利公开了一种可以直接用于线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用，属于化学与生物分析检测领域。其分子结构式如式I所示

该双光子激发近红外发射的荧光探针具有选择性强，抗干扰能力优越，灵敏度高、成像穿透能力强，成像分辨率高，可用于癌细胞和组织内H2S的快速检测和成像，具有很好的应用前景。

Description

一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针 及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用，属于化学与生物分析检测成像技术领域。

背景技术

硫化氢(H 2 S)在生物体内由酶催化产生，作为人体内气体信号分子，在调节人的生理机能方面起着极其重要的作用。例如，调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等；硫化氢还能够有效清除活性氧，活性氮物种，例如：过氧化氢、超氧阴离子、次氯酸、过氧亚硝基等；硫化氢可参与血红蛋白改变；参与体内亚硝基类化合物的还原；调节体内多种酶的功能。实验表明，硫化氢能够有效地降低AP诱导的神经细胞毒性。硫化氢与FPG表现为负比例关系，升高二型糖尿病病人硫化氢浓度也许有助于降血糖。但是，生物体内硫化氢失调，便会引起动脉和肺动脉高压、老年痴呆症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。所以对生物体内硫化氢的检测意义极其重要。

荧光探针具有操作简便、灵敏度高、膜透性好和快速原位检测等优点。因此荧光探针在生物医学成像分析具有很好的应用前景。而近红外荧光探针因其优越的光学性能而倍受科研工作者的青睐。但是传统的近红外荧光探针虽然其发射位于近红外区，但是其激发大部分仍然在可见光区，因此在成像时会受到组织吸收，自发荧光等的影响而使其穿透深度和分辨率受限。因此发展近红外激发近红外发射的荧光探针具有重要的作用。在过去双光子荧光探针是用两个光子的近红外光激发，但是发射在紫外-可见光区，因此导致穿透深度不够。把双光子与近红外荧光探针相结合，可以很好的解决发射与激发波长短而引起的组织穿透深度受限的问题。因此本发明专利将开发一种双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针。

发明内容

本项目针对上述技术现状和存在的问题，提供一种线粒体靶向双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针MNIR-H 2 S。该荧光探针具有合成简单，反应条件温和，成本较低，且具有大的双光子吸收截面、近红外发射、高灵敏度和高选择性，能实现用荧光法快速便捷的检测癌细胞和组织中的硫化氢。

本发明还提供了该荧光探针的制备方法。

本发明还提供了该荧光探针的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针，其化学结构式如式(I)所示：

本发明还提供一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

S1.将2，4-二羟基水杨醛、乙酰乙酸甲酯加入反应器中，加入溶媒和催化剂，在60～80℃下反应，至2，4-二羟基水杨醛完全消失则终止反应，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，析出得到的黄色固体产物1，干燥所述产物1，所述产物1的结构式如下：

S2.将步骤S1所得的产物1与酮酸加入反应瓶中，加入溶媒和催化剂，加热到80～110℃反应3～5小时，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，滴加适量的高氯酸，析出得到褐色固体，干燥后进行分离提纯，得化合物2，所述化合物2的结构式如下：

S3.将上一步所得的产物2与2，4-二硝基氟苯，二氯甲烷和催化量的三乙胺加入反应瓶中，25～55℃反应3～5小时，将所得产物干燥后进行分离提纯，得到如式(I)所示的目标探针。

本发明荧光探针的合成路线如图1所示。

本发明的荧光探针使用方法为：探针分子溶解在pH＝7.4的PBS缓冲溶剂中，在室温下进行测试。当加入NaHS时，2，4-二硝基苯醚基团可以在H 2 S的诱导下裂解，使荧光得以恢复，探针与H2S的响应机理如图2所示。

本发明的荧光探针的具体特征为：探针自身不具有荧光发射信号，当其与H 2 S作用后，探针分子在668nm处有显著的荧光信号发射峰，荧光强度增强了150倍；因其具有氧正离子，因此，此特征将赋予其具有线粒体靶向的能力，而且经过测定，其具有很好的双光子吸收截面，因此具有双光子激发。

优选地，步骤S1中，步骤S1中：2，4-二羟基水杨醛与乙酰乙酸甲酯的摩尔比为1：1～5。

优选地，步骤S1中：所述催化剂为哌啶，所述溶媒为乙醇，进一步优选所述哌啶为1％～10％的2，4-二羟基水杨醛的质量比重，1摩尔2，4-二羟基水杨醛用2000～5000mL乙醇。

优选地，步骤S1反应过程中，用薄层色谱法跟踪反应，直到2，4-二羟基水杨醛完全消失为止。

优选地，步骤S2中，浓硫酸做为溶媒和催化剂。

优选地，步骤S2中，所述酮酸为4-二乙氨基酮酸。

优选地，步骤S2中：1摩尔酮酸用50～100mL浓硫酸。

优选地，步骤S1或S2中，待大量固体产物析出后，减压抽滤并用冷水洗涤3次，再将得到的固体产物进行干燥。

优选地，步骤S2或S3中，干燥后的产物采用柱层析提纯，进一步优选所述填充剂为200～300目的硅胶，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1。。

本发明还提供了所述的线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的应用，用于癌细胞和组织中硫化氢的荧光检测和成像分析。

相对现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明所述探针分子的合成只需要三步就可以完成，且后处理过程相对简单，合成成本低，对H 2 S具有高灵敏度，高选择性，且能实现用荧光法快速便捷的实现癌细胞和组织中的H 2 S的检测与成像。

(2)本发明所述探针分子自身不具有荧光发射信号，当其与H 2 S作用后，探针分子在668nm处有显著的荧光信号发射峰，荧光强度增强了60倍；因其具有氧正离子，因此，此特征将赋予其具有线粒体靶向的能力，而且经过测定，其具有很好的双光子吸收截面，因此具有双光子激发。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。

附图说明

附图1为本发明双光子激发近红外发射H 2 S荧光探针的合成路线图。

附图2为本发明双光子激发近红外发射H 2 S荧光探针与H 2 S的响应机理示意图。

附图3：(A)为MNIR-H 2 S(表示式Ⅰ所述双光子激发近红外发射H 2 S荧光探针，下同)和MNIR-H 2 S+H 2 S归一化的紫外-可见吸收谱图；(B)探针分子(1μM)对H 2 S的响应的荧光谱图，硫化氢(0-40μM)；(C)为校准曲线；(D)为线性响应；(E)和(F)分别MNIR-H 2 S为加硫化氢前后在可见光下得到的图片。

附图4：(A)为选择性实验,1微摩尔探针分子加入40微摩尔硫化氢或者90微摩尔其它分析物。数字1到16分别是空白(探针分子)，GSH,Cys,Vitamin C,K + ,Ca 2+ ,Na + ,Mg2+ ,Zn 2+ ,Fe 3+ ,Gly,Cu 2+ ,Blank,H 2 S,Pb 2+ ,and Glu；(B)为pH(3～8)对探针分子在加入H 2 S前后的影响。

附图5为激光共聚焦荧光显微镜对HeLa细胞的成像研究：A(a)加探针培养，不加硫化氢刺激下的红色通道成像；A(b)明场和红色通道的叠加成像；A(c)加探针和硫化氢刺激下的红色通道成像图；A(d)为明场与红色通道的叠加成像；B共定位成像：(a)红色通道成像，探针加硫化氢刺激和商业化定位试剂，(b)绿色通道成像，(c)红色通道和绿色通道的叠加成像，(d)共定位相关系数。

附图6为组织和斑马鱼成像研究图片：(A)洋葱组织只加探针分子不加硫化氢的成像图片，(B)洋葱组织加探针和硫化氢刺激的成像图片，(C)斑马鱼只加探针分子不加硫化氢的成像图片，(D)斑马鱼加探针和硫化氢刺激的成像图片。

附图7为实施例1所得产物1的核磁共振氢谱图。

附图8为实施例1所得产物1的核磁共振碳谱图。

附图9为实施例1所得化合物2的核磁共振氢谱图。

附图10为实施例1所得化合物2的核磁共振碳谱图。

附图11为实施例1所得探针分子的核磁共振氢谱图。

附图12为实施例1所得探针分子的核磁共振碳谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原材料和设备为本领域常规使用的原材料和设备。

实施例1

本实施例提供一种用于细胞、组织和斑马鱼中硫化氢检测的线粒体定位的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法。

本实施例双光子激发近红外发射硫化氢荧光探针合成路线如图1所示；双光子激发近红外发射硫化氢荧光探针与H 2 S的响应机理如图2所示。

本实施例具体包括以下步骤：

S1.产物1的合成：

将1.38克0.01摩尔2，4-二羟基水杨醛，2.22克0.02摩尔乙酰乙酸甲酯和0.2克0.0024摩尔哌啶加入反应器中，加入50mL乙醇做溶媒，在75℃的油浴锅中反应，用薄层色谱法跟踪反应，直到2，4-二羟基水杨醛完全消失则终止反应，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，待大量黄色固体析出后，减压抽滤并用冷水洗涤3次，得到的黄色固体干燥，得产物1，1.87g(91.7％的收率)，无需纯化，直接用于下一步；

产物1的核磁共振氢谱如图7所示，核磁共振碳谱如图8所示。

S2.化合物2的合成：

将步骤S1所得的产物1，0.313g(1.00mmol)4-二乙氨基酮酸加入反应瓶中，加入适量的5mL浓硫酸做为溶媒和催化剂，加热到90℃反应3小时，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，滴加适量的3mL高氯酸，待大量的褐色固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得到的褐色固体用恒温干燥箱干燥，干燥后的固体用柱层析提纯(使用200～300目的硅胶为填充剂，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)得到化合物2。

化合物2的核磁共振氢谱如图9所示，核磁共振碳谱如图10所示。

S3.探针分子的合成：

将步骤S2所得化合物2(0.582g,1mmol)和化合物2，4-二硝基氟苯(0.186g,1mmol)溶解在50mL二氯甲烷中，同时加入3mL三乙胺，在氮气保护下，45℃反应3小时，最后溶剂用旋转蒸发仪旋干，剩余物用柱层析提纯(使用200～300目的硅胶为填充剂，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)得到目标探针分子。

该探针分子的核磁共振氢谱如图11所示，核磁共振碳谱如图12所示。

实施例2

本实施例为实施例1所得探针分子检测试验，结果如图3所示。

其中：

(A)为归一化的紫外-可见吸收谱图。

1微摩尔化合物1，2和探针分子MNIR-H 2 S溶于10毫摩尔磷酸缓冲液中(水比DMSO＝99：1，体积比)得到的结果进行归一化；

(B)为探针分子(1μM)对H 2 S的响应的荧光谱图，H 2 S(0～40μM)。

具体为：取实施例1制备的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成1×10 -3 mmol/L待测液。从待测液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，用为pH＝7.4的10毫摩尔的磷酸缓冲溶液稀释至3mL，加入(0～30)当量的硫氢化钠(NaHS)溶液，以662nm为激发光测量其荧光性质。荧光光谱如图3-B所示。由图可见，随着硫氢化钠加入当量的增加荧光逐渐增强。

(C)为校准曲线。

具体为：在3-B得到的结果除去空白得到的结果。

(D)为线性响应。

具体为：当NaHS的用量在0～5毫摩尔时，探针具有很好的响应。

(E)和(F)为加硫化氢前后的荧光图片。

其中：(E)为1微摩尔探针在可见光下的照片；(F)为1微摩尔探针加40微摩尔硫氢化钠反应十分钟后在可见光下的照片。

实施例3

本实施例为实施例1所得荧光探针检测硫化氢的选择性测试，试验结果如附图4所示。

取实施例1制备的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成1×10 -3 mmol/L待测液。从待测液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，用为pH＝7.4的10毫摩尔的磷酸缓冲溶液稀释至3mL，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，数字1～16分别代表空白(探针分子)，GSH,Cys,Vitamin C,K + ,Ca 2+ ,Na + ,Mg 2+,Zn 2+ ,Fe 3+ ,Gly,Cu 2+ ,Blank,NaHS,Pb 2+ ,and Glu，其中第14个加入NaHS标准溶液，10分钟后以622纳米为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，由图4(A)结果可以发现，其他离子对化合物探针的荧光几乎没有影响，而NaHS溶液的加入使化合物探针的荧光显著增强。

图4(B)为pH(3～8)对探针分子在加入NaHS前后的影响。

实施例4

本实施例为双光子荧光显微镜对HeLa细胞的成像研究试验，结果如附图5所示。

我们将本发明所得到的荧光探针应用到HeLa细胞中对硫化氢进行荧光成像应用。具体操作步骤如下：将1μM所合成的双光子激发近红外发射的荧光探针加入到两个育有HeLa细胞的培养皿中，并对培养皿进行编号，在二氧化碳培养箱中培养10分钟后用PBS对细胞进行洗涤三次。在一号培养皿中什么都不加，二号培养皿中加入40μM NaHS。在二氧化碳培养箱中培养30分钟后，用共聚焦显微镜进行成像。5A(a-b)首先对一号培养皿进行成像。用635nm的激光进行激发，在明场通道可以观看到细胞的轮廓图，而在红色通道(640nm-680nm)对细胞进行荧光成像时，此时观察到很弱的荧光信号。5A(c-d)对二号培养皿进行成像研究发现在红色通道下可以清醒的看到探针对硫化氢的荧光成像图。此实验可以说明探针MNIR-H2S能够在细胞内对H2S进行荧光成像；

图5(B)为线粒体共定位成像研究。其中：5B(a)为红色通道(探针分子加硫化氢刺激)；5B(b)为绿色通道，线粒体定位试剂；5B(c)红绿通道叠加结果；5B(d)为共定位系数。

实施例5

本实施例为组织和斑马鱼成像研究试验，结果参见附图6。

本实施例为使用实施例1所得荧光探针对洋葱表皮组织和斑马鱼进行双光子荧光成像。

利用本探针对洋葱表皮组织和斑马鱼内的H 2 S进行双光子荧光成像研究，其具体的操作步骤如下：取1000μm厚的洋葱组织和5天大小的斑马鱼各分成两份，将其浸泡在PBS培养液中，并对两份组织和斑马鱼培养皿进行编号，其中一号培养皿为洋葱组织参比样只加探针不加硫化氢(A)，二号为洋葱组织测试分析样即加探针也加硫化氢刺激(B)，三号为斑马鱼只加探针不加硫化氢刺激(C)，四号为斑马鱼即加探针也加硫化氢刺激成像(D)。

具体操作为：向四份样品中各加入1μM的探针MNIR-H 2 S，并在培养箱中培养30min后，用PBS洗涤三次后，向第二和四个测试培养皿中加入20μM的硫氢化钠，并在培养箱中培育60分钟后用PBS进行洗涤，将参比样和分析样用800nm的激光为激发光进行双光子成像，探测发射光通道为红色通道(640nm-680nm)，成像图如图6(A/B/C/D)所示。双光子成像：激发波长＝800nm，接收范围＝640～680nm；所有的成像用10×的油镜，比例尺：100微米

通过对参比样和分析样的对比发现，探针能够对洋葱组织和斑马鱼内的硫化氢进行荧光成像。

Claims (5)

1.一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将2，4-二羟基水杨醛、乙酰乙酸甲酯加入反应器中，加入溶媒和催化剂，在60～80℃下反应，至2，4-二羟基水杨醛完全消失则终止反应，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，析出得到的黄色固体产物1，干燥所述产物1，所述产物1的结构式如下：

S2.将步骤S1所得的产物1与酮酸加入反应瓶中，加入溶媒和催化剂，加热到80～110℃反应3-5小时，把反应体系冷却到室温后倒入冰水中，滴加适量的高氯酸，析出得到褐色固体，干燥后进行分离提纯，得化合物2，所述化合物2的结构式如下：

S3.将上一步所得的化合物2与2，4-二硝基氟苯，二氯甲烷和催化量的三乙胺加入反应瓶中，25～55℃反应3-5小时，将所得产物干燥后进行分离提纯，得到如式(I)所示的目标探针分子；

步骤S1中：2，4-二羟基水杨醛与乙酰乙酸甲酯的摩尔比为1：1～5，所述催化剂为哌啶，所述溶媒为乙醇，所述哌啶为1％～10％的2，4-二羟基水杨醛的质量比重，1摩尔2，4-二羟基水杨醛用2000～5000mL乙醇；

步骤S2中：浓硫酸作为溶媒和催化剂；1摩尔酮酸用50～100mL浓硫酸；

。

2.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1反应过程中，用薄层色谱法跟踪反应，至2，4-二羟基水杨醛完全消失为止。

3.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S1或步骤S2中：固体产物析出后，减压抽滤并用冷水洗涤3次，再将得到的固体产物进行干燥。

4.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2或步骤S3中：干燥后的产物采用柱层析提纯。

5.根据权利要求3所述的一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤S2或步骤S3中：填充剂为200～300目的硅胶，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1。

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