CN106279278A - 一种具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。该探针分子式为C35H29N5O3PBr，其结构式如式I所示：本发明设计的硫化氢荧光探针，制备简单、合成路线成熟，能够对细胞内线粒体的硫化氢进行快速准确检测并可以荧光成像，应用于水环境和生物细胞体系中硫化氢的传感检测。此外，该探针具有选择性好，响应速度快，抗其他分子干扰能力强等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。
背景技术
硫化氢(H2S)在生物体内由酶催化产生，作为人体内气体信号分子，在调节人的生理机能方面起着极其重要的作用。例如，调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等；硫化氢还能够有效清除活性氧，活性氮物种，例如：过氧化氢、超氧阴离子、次氯酸、过氧亚硝基等；硫化氢可参与血红蛋白改变；参与体内亚硝基类化合物的还原；调节体内多种酶的功能。实验表明，硫化氢能够有效地降低AP诱导的神经细胞毒性。硫化氢与FPG表现为负比例关系，升高二型糖尿病病人硫化氢浓度也许有助于降血糖。但是，生物体内硫化氢失调，便会引起动脉和肺动脉高压、老年痴呆症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。所以对生物体内硫化氢的检测意义极其重要。
然而目前对H2S的检测缺少具有靶向性的探针，不能对细胞内某一特定的细胞器内的硫化氢进行检测，特别缺少对细胞内线粒体靶向的硫化氢探针，从而缺少研究细胞病变过程中对线粒体中硫化氢浓度变化情况的检测工具。本专利通过分子设计，实现了专一性识别硫化氢和在线粒体中检测硫化氢的目的。
发明内容
针对目前硫化氢分子荧光探针检测所面临的问题的现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针。
本发明还提供了一种具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针的制备方法和应用。
本发明采用以下技术方案：
一种具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针，它的分子式为：C35H29N5O3PBr，其结构式如式I所示：
简记为Mito-H2S。
上述的具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：
1)将1eq的4-溴-1,8萘二酸酐和1.5eq的β-氨基丙酸溶于甲醇中，氮气保护，加热回流反应，反应完成后冷却至室温，有固体析出，将固体过滤，得粗产品化合物1-1，直接投下一步反应；所述化合物1-1的结构式如下：
2)将1eq的三苯基磷，1eq的3-溴丙胺氢溴酸溶于乙腈中，氮气保护，加热回流反应，反应完成后冷却至室温，然后分离提纯得到化合物1-2；所述化合物1-2的结构式如下：
3)将所制备的1eq的化合物1-1溶于DMF中，依次加入1eq的HOBt，1eq的EDCI，室温反应30min，然后再加入1eq的化合物1-2，常温反应4-5小时，反应完成后，分离提纯纯化得到化合物1-3；所述化合物1-3的结构式如下：
4)将1eq的化合物1-3溶于DMF中，然后向反应液中加入1.2eq的NaN3，氮气保护，室温反应，反应完成后通过柱色谱分离得到目标化合物Mito-H2S。
本发明探针的合成路线如下：
优选的，所述步骤1)中加热反应温度为75℃，反应时间为6小时。
优选的，所述步骤2)中加热反应温度为85℃，反应时间为16小时；所述步骤2)中分离提纯化合物的具体方法为：将反应产物加入20mL石油醚，有固体析出，将固体过滤，石油醚洗涤，得粗产品，然后用二氯甲烷溶解，并用柱色谱层析分离；所述柱色谱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:50。
优选的，所述步骤3)中分离提纯化合物的具体方法为：将反应产物用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，然后用柱色谱进行分离；所述柱色谱分离的洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:30。
优选的，所述步骤4)中室温反应时间为16小时；所述步骤4)中分离提纯化合物的方法为：将反应产物用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用柱色谱进行分离；所述柱色谱分离的洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:30。
本发明还提供了一种上述的具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针的应用，该探针可以应用于水环境和生物细胞体系中硫化氢的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。
本发明的优点是：(1)探针的合成只需要四步就可以完成，且后处理过程相对简单；(2)本发明通过叠氮识别位点提高化合物对硫化氢的选择专一性，并且三苯基膦正离子加入实现了靶向检测线粒体内硫化氢的目的。该探针具有选择性好，响应速度快，抗其他分子干扰能力强等特点。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性且显著的颜色变化，该试剂可作为显示水溶液中和生物细胞内硫化氢分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的硫化氢分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。
附图说明
图1是实施例一中探针Mito-H2S的1H NMR图谱；
图2是探针Mito-H2S随Na2S的加入荧光谱图的变化情况；
图3是探针Mito-H2S对不同离子和分子的选择性荧光谱图；
图4是探针Mito-H2S对不同离子和分子的选择性柱状图数据；
图5是探针Mito-H2S溶液在Na2S加入前后溶液颜色的变化；
图6是探针Mito-H2S溶液在Na2S加入前后溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化；
图7是探针Mito-H2S应用与细胞中对外源性H2S进行荧光成像；a)只有荧光探针Mito-H2S(5μM)的荧光成像明场图；b)只有荧光探针Mito-H2S(5μM)绿通道成像图；c)明场与荧光成像图重叠图；d)将探针Mito-H2S(5μM)加入到HeLa细胞中培养30min后，加入50μMNa2S再培养20min后明场图，e)加入Na2S后绿通道荧光成像图；f)明场d与荧光成像e图重叠图。
图8是探针Mito-H2S荧光探针对H2S在细胞中的荧光成像图，a)只经过探针Mito-H2S(20μM)培育后的小鼠肝脏组织双光子成像图；b)探针Mito-H2S(20μM)培育30min后再加入100μM的Na2S培育50min后的小鼠肝脏组织双光子荧光成像图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。
实施例1
化合物1-1的合成：
将4-溴-1,8萘二酸酐(2.77g，10mmol，1eq)，β-氨基丙酸(1.34g，15mmol，1.5eq)溶于30mL甲醇中，氮气保护，75℃加热回流反应6h。用TCL板检测反应，反应完全后，冷却至室温，有固体析出。将固体过滤，干燥，得粗产品，产率为68％。直接投下一步反应。
化合物1-2的合成：
将三苯基磷(2.0g，7.54mmol，1eq)，3-溴丙胺氢溴酸(1.65g，7.54mmol，1eq)溶于20mL乙腈中，氮气保护，85℃加热回流反应16h。用TCL板检测反应，反应完全后，冷却至室温。加入20mL石油醚，有固体析出，将固体过滤，石油醚洗涤，得粗产品。用二氯甲烷溶解，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:50。产率为79％。
化合物1-3的合成：
将化合物1-1(700mg，1.75mmol，1eq)溶于3mL DMF中，依次加入HOBt(236.3mg，1.75mmol，1eq,EDCI(336mg，1.75mmol，1eq)，室温反应30min。然后再加入化合物1-2(609mg，1.75mmol，1eq)，常温反应4-5小时。用TCL板检测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:30。产率为72％。
化合物Mito-H2S的合成：
将化合物1-3(350mg，0.538mmol，1eq)溶于3mL DMF中，然后向反应液中加入NaN3(42mg，0.646mmol，1.2eq)。氮气保护，室温反应16小时。用TCL板检测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:30。产率为65％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.47–8.40(m,1H),8.40–8.35(m,1H),8.25–8.18(m,1H),7.96–7.88(m,3H),7.87–7.74(m,13H),7.72(d,J＝8.0Hz,1H),4.23(t,J＝7.3Hz,2H),3.59(d,J＝14.3Hz,2H),3.20(d,J＝6.0Hz,2H),2.46(t,J＝7.3Hz,2H),1.65(s,2H)。该探针的1H NMR图谱见图1。
实施例2
化合物Mito-H2S硫化氢荧光探针随Na2S加入当量的增加荧光谱图的变化
取实施例1制备的Mito-H2S荧光探针溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，用PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)与DMSO体积比为2:1的溶液稀释至3mL，加入不同当量(0-30eq)的硫化钠标准溶液，以440nm为激发光测量其荧光性质。荧光光谱如图2所示。由图2可见，随着Na2S加入当量的增加荧光逐渐增强。
实施例3
化合物Mito-H2S荧光探针对不同分子或离子的选择性
从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，用PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝7.4)与DMSO体积比为2:1的溶液稀释至3mL，配制一系列溶液，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的硫化钠标准溶液，30min后以440nm为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，由图3和图4结果可以发现，其他离子对化合物Mito-H2S的荧光几乎没有影响，而硫化钠溶液的加入使化合物Mito-H2S的荧光显著增强。
实施例4
化合物Mito-H2S荧光探针对硫化氢的可视化检测
从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的样品管当中，加入30摩尔量的硫化钠标准溶液如图5所示，硫化钠可以使合物Mito-H2S荧光探针的PBS：DMSO体积比为2:1的缓冲溶液溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从淡黄色变成红褐色(图5)。伴随着紫外灯下肉眼可视的硫化氢诱导荧光探针发出明亮的黄色荧光(图6)，说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。
实施例5
化合物Mito-H2S荧光探针对细胞外源性硫化氢荧光成像
我们将本发明所得到的荧光探针Mito-H2S应用到HeLa细胞中对硫化氢进行荧光成像应用。具体操作步骤如下：将5μM Mito-H2S荧光探针的DMSO溶液加入到两个育有HeLa细胞的培养皿中，并对培养皿进行编号，在二氧化碳培养箱中培养30min后用PBS对细胞进行洗涤三次。在一号培养皿中什么都不加，二号培养皿中加入20μM Na2S。在二氧化碳培养箱中培养30min后，用共聚焦显微镜进行成像。首先对一号培养皿进行成像。用488nm的激光进行激发，在明场通道可以观看到细胞的轮廓图，而在绿色通道(500nm-550nm)对细胞进行荧光成像时，此时观察不到荧光发射。对二号培养皿进行成像研究发现在绿色通道下可以清醒的看到探针对H2S的荧光成像图，结果如图7所示。此实验可以说明探针Mito-H2S能够在细胞内对H2S进行荧光成像。
实施例6
化合物Mito-H2S荧光探针对小鼠肝脏组织进行双光子荧光成像
利用本探针对小鼠肝脏组织内的硫化氢进行双光子荧光成像研究，其具体的操作步骤如下：取400μm厚的小鼠肝脏组织两份，将其浸泡在PBS培养液中，并对两份组织培养皿进行编号，其中一号培养皿为参比样，二号为测试分析样。向两份样品中各加入20μM的探针Mito-H2S，并在培养箱中培养30min后，用PBS洗涤三次后，向测试培养皿中加入100μM的Na2S，并在培养箱中培育50min后用PBS进行洗涤，将参比样和分析样用780nm的激光为激发光进行双光子成像，探测发射光通道为绿色通道(500nm-550nm)，成像图如图8所示。通过对参比样和分析样的对比发现，探针Mito-H2S能够对小鼠肝脏组织内的硫化氢进行荧光成像。
Claims (9)
1.一种具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针，其特征在于，它的分子式为：C35H29N5O3PBr，其结构式如式I所示：
简记为Mito-H2S。
2.一种权利要求1所述的具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
1)将1eq的4-溴-1,8萘二酸酐和1.5eq的β-氨基丙酸溶于甲醇中，氮气保护，加热回流反应，反应完成后冷却至室温，有固体析出，将固体过滤，得粗产品化合物1-1，直接投下一步反应；所述化合物1-1的结构式如下：
2)将1eq的三苯基磷，1eq的3-溴丙胺氢溴酸溶于乙腈中，氮气保护，加热回流反应，反应完成后冷却至室温，然后分离提纯得到化合物1-2；所述化合物1-2的结构式如下：
3)将所制备的1eq的化合物1-1溶于DMF中，依次加入1eq的HOBt，1eq的EDCI，室温反应30min，然后再加入1eq的化合物1-2，常温反应4-5小时，反应完成后，分离提纯纯化得到化合物1-3；所述化合物1-3的结构式如下：
4)将1eq的化合物1-3溶于DMF中，然后向反应液中加入1.2eq的NaN3，氮气保护，室温反应，反应完成后通过柱色谱分离得到目标化合物Mito-H2S。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中加热反应温度为75℃，反应时间为6小时。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中加热反应温度为85℃，反应时间为16小时。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中分离提纯化合物的具体方法为：将反应产物加入20mL石油醚，有固体析出，将固体过滤，石油醚洗涤，得粗产品，然后用二氯甲烷溶解，并用柱色谱层析分离；所述柱色谱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:50。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中分离提纯化合物的具体方法为：将反应产物用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，然后用柱色谱进行分离；所述柱色谱分离的洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:30。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中室温反应时间为16小时。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中分离提纯化合物的方法为：将反应产物用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用柱色谱进行分离；所述柱色谱分离的洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:30。
9.一种权利要求1所述的具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针的应用，其特征在于，应用于水环境和生物细胞体系中硫化氢的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。
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