CN111603565A

CN111603565A - 抗炎纳米药物载体、其药物组合物及制备方法和应用

Info

Publication number: CN111603565A
Application number: CN202010464905.XA
Authority: CN
Inventors: 王云兵; 马博轩
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2020-09-01

Abstract

本发明公开了一种抗炎纳米药物载体、其药物组合物及制备方法和应用，纳米药物载体是由聚磷酸胆碱和聚甲硫乙基丙烯酸酯构成的双嵌段聚合物，药物组合物包括纳米药物载体及其中包载的诊疗复合分子，诊疗复合分子由具有双光子聚集诱导发光效应的荧光分子通过二羰基键与具有抗炎功能的药物连接而成。本发明的药物组合物具有逐步活性氧响应性，纳米药物载体中的聚甲硫乙基丙烯酸酯嵌段可敏感性转变为亲水，引发载体解离；诊疗复合分子中的二羰基键也可敏感性断裂，使释放的荧光分子和抗炎药物各自发挥诊断与治疗的作用，对急性及慢性炎症，如动脉粥样硬化、关节炎、肺炎等疾病都具有良好的诊断与治疗效果。

Description

抗炎纳米药物载体、其药物组合物及制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米药物载体技术领域，尤其涉及一种抗炎纳米药物载体、其药物组合物及制备方法和应用。

背景技术

炎症被广泛认为是人体对抗创伤的一种自然保护机制，包括微生物对组织的渗透、细胞的指令和调度、微生物和感染细胞的清除、周围组织的液化和损伤组织的愈合等过程。在炎症过程中，如果无法进行准确的破坏和辅助修复，炎症也会导致组织损伤。因此，合理的治疗炎症损伤的策略，包括动脉粥样硬化、关节炎等长期炎症以及肺炎等短期炎症，得到了广泛的研究。一般情况下，糖皮质激素和非甾体类抗炎药常用于炎症治疗。然而，这些药物的各种副作用也令人担忧，如骨质疏松、消化道出血和慢性肾脏疾病。为了降低不良反应，提高治疗效果，近年来各种纳米药物载体如聚合物胶束、脂质体等被开发出来用于炎症的治疗。

系统构建的纳米载药系统已被证明在炎症组织中有选择性的积累能力，其中水肿组织渗漏的血管为纳米颗粒提供了一个外渗途径。因此，纳米药物载体被广泛用于炎症治疗。然而，纳米载体还需要进一步实现药物积累后的智能准确释放。伴随炎症过程，在炎症组织中发现了过表达的活性氧，为炎症治疗中准确的药物传递提供了靶点。因此，在纳米颗粒中引入一系列活性氧响应结构，以实现炎症治疗药物的准确、高效释放。

此外，除了合理的纳米药物治疗策略外，纳米颗粒在体内的可视性在炎症部位的整个循环、积累和分布过程中也应被准确地监测。近年来，荧光成像已被证明是一种高分辨率观察生物微观结构的有力工具。然而，传统的荧光团存在积累后的聚集猝灭效应、背景荧光干扰等严重缺陷。而一种具有聚集诱导发光效应的荧光团作为一类新型分子，在稀溶液中荧光发射较弱，而在聚集态下表现出强荧光。此外，与传统的单光子荧光成像相比，双光子激发荧光显微镜可以提供更清晰的空间分辨率，同时具有更少的自荧光，更深入的组织穿透。因此，具有双光子激发和聚集诱导发光效应的荧光分子将是解决炎症组织纳米医学追踪和空间荧光成像的合适策略

因此，用于动脉粥样硬化，关节炎，肺炎等急、慢性炎症的诊疗纳米药物载体在炎症诊断与治疗方面起着非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种抗炎纳米药物载体、其药物组合物及制备方法和应用，用于动脉粥样硬化，关节炎，肺炎等急、慢性炎症的诊断和治疗，该纳米药物载体具有对高活性氧环境的敏感性以及双光子聚集诱导发光的荧光功能，可在炎症部位，如动脉粥样硬化斑块，关节炎及肺炎损伤部位准确高效给药，同时实现药物在体内及细胞内的精确追踪和定位。

本发明采用的技术方案如下：

一种抗炎纳米药物载体，包括聚磷酸胆碱嵌段和聚甲硫乙基丙烯酸酯嵌段；纳米药物载体的结构式如下所示：

其中，聚磷酸胆碱的聚合度为1-100；聚甲硫乙基丙烯酸酯的聚合度为1-100；优选地，聚磷酸胆碱的聚合度为1-50；聚甲硫乙基丙烯酸酯的聚合度为1-50。

上述的抗炎纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：

S1.将甲硫乙基丙烯酸酯、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和偶氮二异丁腈和四氢呋喃混合，依次经过三个循环的冷冻-泵送-解冻后，在氩气保护下于65-75℃下反应12-36h，然后将反应物在离子水中透析12-36h，冷冻干燥，得到聚甲硫乙基丙烯酸酯；

S2.将步骤S1所得聚甲硫乙基丙烯酸酯与甲基丙烯酰磷酸胆碱溶解于四氢呋喃中，再加入偶氮二异丁腈，冻抽除氧后于65-75℃下反应24-28h，然后透析、冻干，即得。

进一步地，制备方法具体为：

S1.将甲硫乙基丙烯酸酯、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和偶氮二异丁腈和四氢呋喃混合，依次经过三个循环的冷冻-泵送-解冻后，在氩气保护下于70℃下反应24h，然后将反应物在离子水中(MCWO＝1000)透析24h，冷冻干燥，得到聚甲硫乙基丙烯酸酯；

S2.将步骤S1所得聚甲硫乙基丙烯酸酯与甲基丙烯酰磷酸胆碱溶解于四氢呋喃中，再加入偶氮二异丁腈，冻抽除氧后于70℃下反应26h，然后透析、冻干，即得。

进一步地，步骤S1中甲硫乙基丙烯酸酯、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和偶氮二异丁腈的质量比为3500-7000：100-200：25-50；优选为5000:150:30。

进一步地，步骤S2中聚甲硫乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰磷酸胆碱和偶氮二异丁腈的质量比为1500-3000：3000-6000：12-25；优选为2000:4500:20。

一种药物组合物，包括上述的纳米药物载体及其中包载的诊疗复合物。

进一步地，诊疗复合物由具有双光子聚集诱导发光效应的荧光分子通过二羰基键与具有抗炎功能的药物连接而成，如下所示：

进一步地，诊疗复合物由以下方式制备：

将荧光分子团溶解，再滴加到草酰氯溶液中，在室温下搅拌10-15h，减压去除剩余草酰氯及溶剂，加入药物和三乙胺，在室温下反应12-36h，纯化，即得；其中，荧光分子团、草酰氯、三乙胺和药物的摩尔比为1-10：3-30：3-30：1-10。

进一步地，诊疗复合物由以下方式制备：

将荧光分子团溶解，再滴加到草酰氯溶液中，在室温下搅拌12h，减压去除剩余草酰氯及溶剂，加入药物和三乙胺，在室温下反应24h，色谱纯化，即得；其中，荧光分子团、草酰氯、三乙胺和药物的摩尔比为5：20：15：5。

上述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

将纳米药物载体与诊疗复合物溶于四氢呋喃和二甲基亚砜的混合溶剂中，搅拌1-2h，得混合溶液，将该混合溶液加入2-20倍混合溶液体积的生理盐水或超纯水中，搅拌1-4h，除去有机溶剂，制得；

或将纳米药物载体与诊疗复合物溶于四氢呋喃，然后在40-60℃旋转蒸发0.5-2h，除去有机溶剂，再加入生理盐水或超纯水，充分振荡水化，制得。

进一步地，四氢呋喃和二甲基亚砜的体积比为1-2:1-2；优选为1:1。

上述的纳米药物载体或权利要求5所述的药物组合物在制备诊断和/或治疗急、慢性炎症的药物中的应用。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明中，聚甲硫乙基丙烯酸酯嵌段可敏感性转变为亲水，引发载体解离；诊疗复合分子中的二羰基键也可敏感性断裂，具有活性氧敏感引发药物释放特性以及双光子聚集诱导发光等功能，可在炎症部位，如动脉粥样硬化斑块，关节炎及肺炎损伤部位准确高效给药，同时实现药物在体内及细胞内的精确追踪和定位；

2、本发明中，聚磷酰胆碱嵌段作为载体亲水壳层，为纳米载体提供了优异的生物相容性，制得的载药胶束粒径尺寸分布在10-200nm之间；

3、本发明制得的载药胶束，通过在体外细胞水平和体内动物水平上与自由药物对比，在药效、生物安全性和循环时间方面均有明显提高，可以实现高效低毒的药物递送；

4、本发明制得的载药胶束在用于动脉粥样硬化，关节炎及肺炎过程中，具有良好的炎症组织双光子成像效果，能够实现细胞层面的高效抗炎，具有优异的炎症治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为为聚合物载体的核磁共振氢谱图；

图2为诊疗复合物的核磁共振氢谱图；

图3为诊疗胶束的粒径分布图的透射电镜图；

图4为不同活性氧条件下胶束的粒径变化结果图；

图5为胶束的荧光发射谱图；

图6为胶束在不同条件下的体外药物释放结果图；

图7为胶束对巨噬细胞的炎症因子抑制结果图；

图8为动物试验中胶束对肺炎成像及治疗的结果图；

图9为动物试验中胶束对关节炎成像及治疗的结果图；

图10为动物试验中胶束对动脉粥样硬化成像及治疗的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明较佳实施例提供的一种抗炎纳米药物载体及其药物组合物，药物组合物包括纳米药物载体及其中包载的诊疗复合物。其中，纳米药物载体是由聚磷酸胆碱和聚甲硫乙基丙烯酸酯构成的双嵌段聚合物，诊疗复合物由具有双光子聚集诱导发光效应的荧光分子通过二羰基键与具有抗炎功能的药物连接而成。

纳米药物载体的制备方法具体包括以下步骤：

(1)将甲硫乙基丙烯酸酯(3.5g)、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(0.1g)和偶氮二异丁腈(25mg)加入四氢呋喃的Schlenk烧瓶中。经过三个循环的冷冻-泵送-解冻程序后，在70℃的氩气保护下进行反应，反应时间为24小时。所得溶液对在离子水中(MCWO＝1000)透析24小时，然后冷冻干燥得到聚甲硫乙基丙烯酸酯；

(2)将步骤(1)所得物(0.3g)与甲基丙烯酰磷酸胆碱(0.6)溶解于四氢呋喃中，然后加入偶氮二异丁腈(2.5mg)，冻抽除氧后于70℃下反应26h，接着透析，最后冻干，得到纳米药物载体；其中，聚磷酸胆碱嵌段的聚合度为30；聚甲硫乙基丙烯酸酯嵌段的聚合度为30；

(3)将荧光团(0.2g)溶解，再滴加到草酰氯(0.032mL)溶液中。在室温下搅拌12小时后，在减压下去除多余的草酰氯和溶剂。将药物(0.09g)和三乙胺(0.11mL)溶解，加入。室温下反应24h后，用色谱纯化，得到诊疗复合物。

制得的纳米药物载体核磁共振氢谱图谱如图1所示。¹H NMR(DMSO-d₆/CD₃OD＝1/1,400MHz):δ＝2.10(m,100H),2.71(m,102H),3.33(m,900H),3.66(m,100H),3.94(m,100H),4.11(m,100H),4.20(m,100H)ppm.

诊疗复合物的核磁共振氢谱图谱如图2所示。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz):δ＝0.87(m,3H),1.23(s,3H),1.39(s,2H),1.64(m,2H),2.01(m,1H),2.30(m,1H),3.89(d,1H),4.54(d,2H),4.89(s,2H),7.04(t,4H),7.36(t,6H),7.74(d,4H),7.92(d,2H),8.18(t,2H),8.59(t,2H),9.06(d,2H)ppm.

由其出峰位置以及积分比例可知纳米药物载体和诊疗复合物已被成功合成。

实施例2

在实施例1的基础上，药物组合物的制备方法具体包括以下步骤：

称取实施例1制得的纳米药物载体20mg、诊疗复合物10mg，溶解于4mL二甲基亚砜和四氢呋喃的混合溶液中，其中，二甲基亚砜和四氢呋喃以体积比为1:1混合，然后再滴加到10mL超纯水中，搅拌4h，透析除去有机溶剂，制得药物组合物胶束。

制得的药物组合物胶束粒径图及透射电镜图如图3所示，由图可知本发明制得的载体可在水中包覆诊疗复合物，自组装形成核-壳结构的胶束，其大小均一，形态规整。

试验例1

胶束的稳定性和敏感性的研究

将实施例2制得的胶束置于37℃，不同浓度过氧化氢浓度(0,0.01,0.1,1,10mM)的条件下，每隔一段时间用动态光散射仪DLS测定其粒径变化，粒径变化结果如图4所示。

由图4可知，本发明制得的胶束在无过氧化氢条件下表现出很好的稳定性，而在1mM及以上浓度的过氧化氢条件下胶束迅速膨胀，其粒径最终稳定在160nm左右。

试验例2

胶束聚集诱导发光特性研究

将实施例2制得的胶束加入二甲基亚砜，过氧化氢水溶液或纯水中，于410nm下激发聚合物载药胶束，观察其荧光发射情况，其荧光发射图谱如图5所示。

由图5可知，胶束荧光强度随着双光子荧光团在二甲基亚砜中的溶解而消失，而将聚合物载药胶束溶于水或过氧化氢溶液中，因其聚集态较为致密，而具有较强的荧光。

试验例3

胶束体外药物释放行为

将实施例2制得的胶束制成浓度为1mg/mL的溶液，然后取2mL转移到截留分子量为3500的透析袋中，将透析袋密封后置于100mL PBS或1mM过氧化氢溶液中，于37℃避光条件下持续震荡，在固定时间内取出2mL，用高效液相色谱仪测药物释放量，其结果如图6所示。

由图6可知，胶束在活性氧环境下会实现药物的快速释放。

试验例4

胶束对巨噬细胞的抗炎作用

将实施例2制得的胶束,或自由药物与被脂多糖激活的巨噬细胞共培养48h，取上清液检测炎性分子(TNF-α，IL-1β，MPO)的含量，结果如图7所示。

由图7可知，与自由药物相比，本发明制得的胶束能够实现细胞层面的高效抗炎。

试验例5

动物试验验证胶束对炎症组织的成像能力及抗炎效果

将已知载药量的胶束冷冻干燥，再用生理盐水复溶，配置成一定浓度的储存液，并配置相同药物浓度的自由药物储存液。以动脉粥样硬化小鼠，关节炎小鼠和肺炎小鼠为动物模型，建立炎症模型。由尾静脉分别注射自由药物、胶束或等体积的生理盐水。药物的药量为10mg/Kg老鼠。用双光子激光共聚焦显微镜观察胶束的成像能力，检测各项炎症指标，实验结果分别如图8、图9和图10所示。

由图8、图9和图10可知，胶束具有优良的双光子成像能力，可在动脉粥样硬化，关节炎及肺炎等炎症病灶处明显看到胶束的富集所发出的强荧光。此外，自由药物相比，胶束具有更好的抑制炎症效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗炎纳米药物载体，其特征在于，包括聚磷酸胆碱嵌段和聚甲硫乙基丙烯酸酯嵌段；纳米药物载体的结构式如下所示：

其中，聚磷酸胆碱的聚合度为1-100；聚甲硫乙基丙烯酸酯的聚合度为1-100。

2.根据权利要求1所述的抗炎纳米药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将甲硫乙基丙烯酸酯、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和偶氮二异丁腈和四氢呋喃混合，依次经过三个循环的冷冻-泵送-解冻后，在氩气保护下于65-75℃下反应12-36h，然后将反应物在离子水中透析，最后冷冻干燥，得到聚甲硫乙基丙烯酸酯；

3.根据权利要求2所述的抗炎纳米药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中甲硫乙基丙烯酸酯、4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和偶氮二异丁腈的质量比为3500-7000：100-200：25-50。

4.根据权利要求2所述的抗炎纳米药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中聚甲硫乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰磷酸胆碱和偶氮二异丁腈的质量比为1500-3000：3000-6000：12-25。

5.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的纳米药物载体及其中包载的诊疗复合物。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述诊疗复合物由具有双光子聚集诱导发光效应的荧光分子通过二羰基键与具有抗炎功能的药物连接而成。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述诊疗复合物由以下方式制备：

8.权利要求5-7中任一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述四氢呋喃和二甲基亚砜的体积比为1-2:1-2。

10.权利要求1所述的纳米药物载体或权利要求5-7中任一项所述的药物组合物在制备诊断和/或治疗急、慢性炎症的药物中的应用。