CN101181225B - 纳米聚合物胶束药物传递系统和制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于细胞内传递抗癌药物的纳米聚合物胶束药物传递系统和制备方法及其应用。属于生物医用材料和纳米技术领域。所述的传递系统包括纳米聚合物胶束载体和包封于其中的抗癌药物，即将内源性生物分子修饰到低代聚酰胺-胺型树枝状聚合物上，制备纳米聚合物胶束药物传递系统。本发明采用低代聚酰胺-胺型树枝状聚合物，通过对其进行简单的表面修饰，可得到粒径100nm左右的聚合物胶束。实验证明此胶束对抗癌药物具有很好的细胞投递作用。本发明避免了制备高代聚酰胺-胺型树枝状聚合物所需的大量合成及后续纯化工作，该药物传递系统制备简单，在生物体内的毒副作用小。可用于癌症的治疗。
Description
【技术领域】本发明涉及生物医用材料和纳米技术领域，特别是涉及一种用于细胞内传递抗癌药物的传递系统(纳米聚合物胶束药物传递系统)的制备方法。
【背景技术】当前，恶性肿瘤已经成为造成人类死亡的第二大疾病。临床以手术切除、联合化疗、免疫治疗和放疗等为主要治疗手段，其中放疗和化疗的单独或联合应用显著提高了恶性肿瘤的治疗效果。
大多数的放化疗药物，在有效杀伤肿瘤细胞的同时也会破坏正常的组织细胞。为了提高药物的靶向性和降低药物的毒性，聚合物胶束作为药物载体引起了人们广泛的兴趣，聚合物胶束载药范围广、结构稳定、具有优良的组织渗透性、体内滞留时间长，能使药物有效地到达靶点，而且粒径较小，具有纳米材料的特性，是一种很有潜力的药物载体。相比而言，小分子表面活性剂形成胶束的热动力学稳定性不如聚合物胶束，因而其使用受到限制。近年来，两亲性聚合物胶束体系在药物传递方面的应用已有广泛的研究。这些聚合物胶束一般由均聚物或共聚物组成。聚合物的分子量较大，在体内必须先经过逐步的降解过程才能代谢，而有些聚合物的降解产物会对人体产生新的毒副作用。
树枝状聚合物(Dendrimer)是当前正在蓬勃发展的一类三维、高度有序的新型合成聚合物。它在结构上具有高度的几何对称性、精确的分子结构、大量的表面官能团、分子内存在空腔以及分子链增长具有可控性等特点。与传统聚合物相比：树枝状聚合物单分散性好，分子尺寸和表面化学都可以在合成过程中得到完全控制。药物分子结合至聚合物内部的空腔或聚合物表面后可以通过扩散作用和降解作用实现对药物分子的控制释放。因此，树枝状聚合物是一种非常有潜力的药物载体，目前国内外很多研究小组都在开展这方面的研究工作。
聚酰胺-胺型树枝状聚合物(polyamidoamine，PAMAM)是研究较为广泛和成熟的一种树枝状聚合物，现在已经有商品化的产品。在应用于药物载体时多采用6代以上的聚合物，这类聚合物末端基团数多，载药量高。但是高代聚合物制备繁琐、毒性相对较大且价格昂贵(6代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的价格大约是1代的6.6倍)。低代数的PAMAM分子量较低，容易被人体代谢，毒性很小。但在单独作为药物载体时存在着分子量低、分子尺寸小的缺点，限制了低代数PAMAM自身作为药物载体的应用。
【发明内容】本发明的目的是解决低代树枝状聚合物不能作为药物载体单独使用的问题。提供一种纳米聚合物胶束药物传递系统和制备方法及其应用。
本发明提供的用于细胞内传递抗癌药物的纳米聚合物胶束药物传递系统，包括纳米聚合物胶束载体和包封于其中的抗癌药物，其中所述的纳米聚合物胶束载体是由如下(a)和(b)两部分组成的：(a)树枝状大分子，其中所述的树枝状大分子是聚酰胺-胺型树枝状聚合物，和(b)连接在树枝状大分子上的生物分子配基，其中所述的生物分子配基是胆酸、胆固醇、色氨酸、苯丙氨酸。
所述的聚酰胺-胺型树枝状聚合物是1-5代(优选1-3代)的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
生物分子配基与聚酰胺-胺型树枝状聚合物的摩尔比是1∶1-8∶1。
一种上述的纳米聚合物胶束药物传递系统的制备方法，经过以下步骤：
第一、聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备：
以乙二胺为核，与丙烯酸甲酯进行Michael加成反应，得加成产物；之后再与乙二胺经酰胺化反应制得酰胺化产物。具体过程是：
将丙烯酸甲酯加到乙二胺的甲醇溶液中，反应24小时，纯化后得到-0.5代聚酰胺-胺型树枝状聚合物；将上述-0.5代产物加到乙二胺的甲醇溶液中，反应60小时。纯化后得到0代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
重复以上步骤，可得到1-5代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
其中，加料温度为0℃，反应温度为20-25℃，加成产物与乙二胺的摩尔比为1∶18，酰胺化产物与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶2；
第二、生物分子修饰聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备：
在胆酸溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳二亚胺，反应24小时，提纯后得胆酸活化酯。将胆酸活化酯溶液加入到上步制得的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，反应24小时，纯化后得到胆酸分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
或者，
在色氨酸溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳二亚胺，反应24小时，提纯后得色氨酸活化酯。将色氨酸活化酯溶液加入到上步制得的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，反应24小时，纯化后得到色氨酸分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
或者，
在苯丙氨酸溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳二亚胺，反应24小时，提纯后得苯丙氨酸活化酯。将苯丙氨酸活化酯溶液加入到上步制得的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，反应24小时，纯化后得到苯丙氨酸分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
或者，
将氯甲酸胆固醇酯加入到上步制得的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，反应24小时，纯化后得到胆固醇修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
第三、纳米聚合物胶束药物传递系统的制备：
将抗癌药物加入到上步制得的生物分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，得到纳米聚合物胶束药物传递系统。
一种上述的纳米聚合物胶束药物传递系统在细胞内传递抗癌药物的应用：
将以上所述的包封有抗癌药物的纳米聚合物胶束药物传递系统与细胞接触以使所述抗癌药物传递至所述细胞中。
所述的抗癌药物是氨甲蝶呤、喜树碱。
所述的细胞是3T3、HepG2和Hela。
本发明的优点和有益效果：
本发明采用低代聚酰胺-胺型树枝状聚合物，通过对其进行简单的表面修饰，可得到粒径100nm左右的聚合物胶束。实验证明此胶束对抗癌药物具有很好的细胞投递作用。本发明避免了制备高代聚酰胺-胺型树枝状聚合物所需的大量合成及后续纯化工作，该药物传递系统制备简单，在生物体内的毒副作用小。可用于癌症的治疗。
本发明同已有技术相比，具有如下优点：
1.本发明所制备的药物载体可提高对抗癌药物的细胞传递能力；
2.本发明所制备的聚合物胶束没有有机溶剂；
3.本发明所制备的药物载体毒性小，降解产物无毒；
4.本发明所制备的药物载体制备简单，成本低廉，易于推广应用。
【附图说明】
图1为本发明胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物形成的胶束的透射电镜图；
图2为本发明胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物胶束的细胞毒性实验结果，所用细胞为3T3细胞；
图3为本发明胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物胶束对氨甲蝶呤在细胞内的传递效果，所用细胞为HepG2细胞；
图4为本发明胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物胶束对喜树碱在细胞内的传递效果，所用细胞为Hela细胞。
【具体实施方式】
实施例1.
第一、108ml丙烯酸甲酯与9.8ml的乙二胺在甲醇中反应24小时。减压蒸馏除去溶剂和剩余的原料，得到-0.5代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。之后再在甲醇中与大过量的乙二胺反应，减压蒸馏除去溶剂和剩余的原料，得到0代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。重复以上操作，可以获得1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
第二、将1g N-羟基琥珀酰亚胺、1.5g DCC、3g胆酸加入到由100ml四氢呋喃和15ml乙腈组成的溶液中，室温反应24小时。将反应混合物过滤除去二环已基脲，依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液、水洗涤，真空干燥后用硅胶层析柱提纯，得活化酯。
将0.30g活化酯加入到含0.43g 1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的DMF溶液中。室温反应24小时。将反应液倒入30ml蒸馏水中，得到白色乳浊液，向其中加入4％的氢氧化钠溶液，析出固体。把固体用蒸馏水洗至中性，再用四氢呋喃洗涤。用30ml甲醇溶解固体，加入无水硫酸镁干燥24小时，旋干溶液，得到0.11g胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
实施例2.
同实施例1合成1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物和活化酯。
将0.45g活化酯加入到含0.33g 1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的无水甲醇溶液中。室温下反应24小时。然后将反应液旋干，再用水、碱液、四氢呋喃洗涤。得胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物白色固体0.47g。
实施例3.
同实施例1合成1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物和活化酯。
将0.37g活化酯加入到含0.53g 1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的无水甲醇溶液中。室温下反应48小时。然后将反应液放入透析袋中透析纯化。蒸馏除去溶剂后，得到0.73g胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
实施例4.
同实施例1合成1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物和活化酯。
将0.45g活化酯加入到含0.33g 1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的无水甲醇溶液中。室温下反应48小时。然后将反应液放入透析袋中透析纯化。蒸馏除去溶剂后，得到0.68g胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
实施例5.
同实施例1合成3代聚酰胺-胺型树枝状聚合物和活化酯。
将0.22g活化酯加入到含0.38g 3代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的无水甲醇溶液中。室温反应48小时后透析纯化、干燥，得到白色固体0.56g胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
实施例6.
同实施例1合成1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
将0.07g N-羟基琥珀酰亚胺和0.13g DCC加入到含0.10g苯丙氨酸的DMF溶液中，室温搅拌6小时。将上述溶液加入到含0.43g 1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的DMF溶液中。室温下反应72小时。加入乙醚，离心，沉淀物透析纯化，干燥后得到苯丙氨酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
实施例7.
同实施例1合成1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
将0.07g N-羟基琥珀酰亚胺和0.13g DCC加入到含0.123g色氨酸的DMF溶液中，室温搅拌6小时。将上述溶液加入到含0.43g 1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的DMF溶液中。室温下反应72小时。加入乙醚，离心，沉淀物透析纯化，干燥后得到色氨酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
实施例8.
同实施例1合成1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
将0.27g氯甲酸胆固醇酯加入到含0.1ml三乙胺和0.43g 1代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的DMF溶液中。室温下反应24小时。加入乙醚，离心，沉淀物透析纯化，干燥后得到胆固醇修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
实施例9.
同实施例3合成胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。配制浓度为0.5mg/ml的胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的Tris-HCl(15mM，pH＝7.4)溶液，室温振荡，得到聚合物胶束。
实施例10.
同实施例4合成胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。配制浓度为0.5mg/ml的胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的Tris-HCl(15mM，pH＝7.4)溶液，65℃水浴振荡3h，得到聚合物胶束。胶束的粒径约为100nm。结果见附图1。
实施例11.
同实施例10配置不同浓度的胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物胶束溶液。过滤除菌。25mg噻唑兰(MTT)溶于5ml PBS中，过滤除菌，制成MTT溶液。
将3T3细胞种到96孔板中，每孔100μl，约104个细胞，培养24h，然后加入上面所配置的不同浓度的胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物胶束溶液100μl，每组三个孔，继续培养24h。
每孔加入10μl MTT溶液，继续培养4h，最后吸出孔中的液体，用PBS洗几次，加入150μl的DMSO，避光震荡10min。酶标仪检测，测得聚合物胶束的体外毒性：在100μg/ml及其以下时没有毒性，结果见附图2。
实施例12.
同实施例4合成胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。用DMEM培养基配制溶液，其中胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物浓度为100μg/ml，氨甲蝶呤的浓度为50μg/ml。
将HepG2细胞种到96孔板中，每孔100μl，约104个细胞，培养24h，然后加入上述溶液100μl，每组三个孔，继续培养24h。
每孔加入10μl MTT溶液，培养4h，用PBS洗涤后加入150μl的DMSO，避光震荡10min。酶标仪检测，测得聚合物胶束对氨甲蝶呤的细胞传递效果：可使氨甲蝶呤的药效提高约24.7％。结果见附图3。
实施例13.
同实施例4合成胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。用DMEM培养基配制溶液，其中胆酸修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物浓度为100μg/ml，喜树碱的浓度为8μg/ml。
将Hela细胞种到96孔板中，每孔100μl，约104个细胞，培养24h，然后加入上述溶液100μl，每组三个孔，继续培养24h。
每孔加入10μl MTT溶液，培养4h，用PBS洗涤后加入150μl的DMSO，避光震荡10min。酶标仪检测，测得聚合物胶束对喜树碱的细胞传递效果：使喜树碱的药效提高36.3％。结果见附图4。
Claims (7)
1.一种用于细胞内传递抗癌药物的纳米聚合物胶束药物传递系统，其特征在于包括纳米聚合物胶束载体和包封于其中的抗癌药物，其中所述的纳米聚合物胶束载体是由如下(a)和(b)两部分组成的：(a)树枝状大分子，其中所述的树枝状大分子是聚酰胺-胺型树枝状聚合物，和(b)连接在树枝状大分子上的生物分子配基，其中所述的生物分子配基是胆酸、胆固醇、色氨酸、或苯丙氨酸；
所述的生物分子配基与聚酰胺-胺型树枝状聚合物的摩尔比是1∶1-8∶1；
所述的聚酰胺-胺型树枝状聚合物为1-5代产物；
所述的抗癌药物是氨甲蝶呤或喜树碱。
2.根据权利要求1所述的纳米聚合物胶束药物传递系统，其特征在于聚酰胺-胺型树枝状聚合物优选为1-3代产物。
3.一种权利要求1所述的纳米聚合物胶束药物传递系统的制备方法，其特征在于该方法经过以下步骤：
第一、聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备：
以乙二胺为核，与丙烯酸甲酯进行Michael加成反应，得加成产物；之后再与乙二胺经酰胺化反应，得酰胺化产物，具体过程是：
将丙烯酸甲酯加到乙二胺的甲醇溶液中，反应24小时，纯化后得到-0.5代聚酰胺-胺型树枝状聚合物；将上述-0.5代产物加到乙二胺的甲醇溶液中，反应60小时，纯化后得到0代聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
重复以上步骤，可得到1-5代聚酰胺-胺型树枝状聚合物其中，加料温度为0℃，反应温度为20-25℃，加成产物与乙二胺的摩尔比为1∶18，酰胺化产物与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶2；
第二、生物分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物的制备：
在胆酸溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳二亚胺，反应24小时，提纯后得胆酸活化酯；将胆酸活化酯溶液加入到上步制得的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，反应24小时，纯化后得到胆酸分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
或者，
在色氨酸溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳二亚胺，反应24小时，提纯后得色氨酸活化酯；将色氨酸活化酯溶液加入到上步制得的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，反应24小时，纯化后得到色氨酸分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
或者，
在苯丙氨酸溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二环己基碳二亚胺，反应24小时，提纯后得苯丙氨酸活化酯；将苯丙氨酸活化酯溶液加入到上步制得的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，反应24小时，纯化后得到苯丙氨酸分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
或者，
将氯甲酸胆固醇酯加入到上步制得的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，反应24小时，纯化后得到胆固醇修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物；
第三、纳米聚合物胶束药物传递系统的制备：
将抗癌药物加入到上步制得的生物分子修饰的聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶液中，得到纳米聚合物胶束药物传递系统。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：在上述整代的酰胺化反应中将半代树枝状聚合物反应物的甲醇溶液滴加到乙二胺的甲醇溶液中。
5.一种权利要求1所述的纳米聚合物胶束药物传递系统在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：将权利要求1所述的包封有抗癌药物的纳米聚合物胶束药物传递系统与细胞接触以使所述抗癌药物传递至所述细胞中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是所述的抗癌药物是氨甲蝶呤、喜树碱。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征是所述的细胞是3T3、HepG2和Hela。
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