CN111004868A

CN111004868A - 一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN111004868A
Application number: CN202010013356.4A
Authority: CN
Inventors: 翟少伦; 肖霜艳; 翟颀; 温肖会; 魏文康; 吕殿红; 周秀蓉; 贾春玲
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111004868B

Abstract

本发明公开了一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒。本发明所研制的山羊鼻内肿瘤病毒荧光PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、省时省力的优点。根据山羊鼻内肿瘤病毒特异性区域设计合成一对特异性引物，能够特异性扩增出山羊鼻内肿瘤病毒基因片段；山羊鼻内肿瘤病毒的诊断、流行病学调查、监测净化等方面提供了相应的技术支持与帮助。

Description

一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测领域，具体涉及一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光 PCR引物、探针及试剂盒。

背景技术

羊鼻内肿瘤多是引起腺瘤，临床上多表现为鼻腔息肉、流鼻液、鼻腔肿瘤。如果不及时处理，羊只最终呼吸困难，窒息死亡。该病发病率不高，在5-15％之间，但死亡率高达100％。该病呈世界性流行，在我国多发于内蒙古、陕西、四川、重庆等地。近年来，该病有南移趋势。我国南方的贵州、福建、湖南、广东等地陆续报道。

羊外源性逆转录病毒是一类引起羊肿瘤性疾病的重要病原。其中在山羊群中常流行的是山羊鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus 2,ENTV-2)，而在绵羊群中流行的是绵羊鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus 1,ENTV-1)和绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte Sheep Retrovirus，JSRV)。羊内源性逆转录病毒(endogenous JaagsiekteSheep Retrovirus，enJSRV) 多存在于羊基因组中，目前认为其不能产生传染性的病毒粒子，但对羊的生殖发育起到重要的作用。在基因组水平上，羊外源性逆转录病毒和内源性逆转录病毒同源性很近，高达95％以上。因此，研发一种PCR试剂盒用于山羊鼻内肿瘤病毒的精准诊断非常必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒以及使用该试剂盒对山羊鼻内肿瘤病毒进行快速检测的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明首先提供一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR引物，该引物能扩增基因一段山羊鼻内肿瘤病毒的保守序列，所述引物组的核苷酸序列为：

ENTV2-F 5’-ATGGCAATAGTTTATATCTGCAAT-3’；

ENTV2-R 5’-GATGGCCTTGTATCAACATAAATGG-3’。

本发明还提供一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR探针，其核苷酸序列如下：

5’-ATATAAGAATCCCGTAACACCTACATCTC-3’。

进一步的，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为BHQ。

本发明还提供一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包含前面所述的PCR引物组和前面所述的探针。

进一步的，试剂盒还包括反转录混合酶、缓冲液。

本发明还提供前面所述引物组在检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR试剂盒中的应用，

(1)核酸提取：提取待检样品中的RNA；

(2)荧光定量PCR：以提取的核酸为模板，用前面所述引物组ENTV2-F、ENTV2-R和前面所述探针进行荧光定量PCR，获得扩增曲线；

(3)结果判断：对扩增曲线进行分析，以确定样本是否含有山羊鼻内肿瘤病毒。

进一步的，步骤(2)荧光PCR反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性2min；98℃变性10s，53℃退火延伸30s，共计45个循环。

进一步的，步骤(2)荧光PCR反应体系

进一步的，步骤(3)结果判断：阳性对照有标准S曲线产生，阴性对照无曲线产生的情况下，待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦40，判定为山羊鼻内肿瘤病毒核酸阳性；Ct值>40 或是无Ct值，则判定为山羊鼻内肿瘤病毒核酸阴性。

本发明的有益效果是：

本发明运用分子生物学、生物信息学等方法进行了大量的序列比对、引物和探针设计及反应体系优化，遴选出可以检测山羊鼻内肿瘤病毒的引物、探针及试剂盒。此试剂盒具有特异性强、灵敏度高、省时省力等优点，可以为山羊鼻内肿瘤病毒的诊断、调查、防控及净化提供技术支持与帮助。

附图说明

图1为山羊鼻内肿瘤病毒荧光PCR检测试剂盒用于未知样品的检测，未知样品取自广东地区临床山羊，曲线①：山羊鼻内肿瘤病毒阳性对照，曲线②为临床某样品的荧光定量曲线。

图2为山羊鼻内肿瘤病毒荧光PCR检测试剂盒灵敏度试验结果；曲线①-⑩分别为阳性质粒的10⁰倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍的倍比稀释结果。

图3是山羊鼻内肿瘤病毒荧光PCR检测试剂盒特异性试验结果；曲线①：山羊鼻内肿瘤病毒阳性对照；曲线②：小反刍兽疫病毒、山羊痘病毒、羊败血性链球菌、边界病毒、羊副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒。

具体实施方式

为了更好地阐述本发明的技术方案，下面将结合实施例以及附图对本技术方案进行说明，但并不局限于此。

试验材料：

山羊鼻内肿瘤病毒阳性重组质粒由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存；山羊痘活疫苗购自重庆澳龙生物制品有限公司；山羊痘与小反刍兽疫二联苗购自国药集团扬州威克生物工程有限公司；羊败血性链球菌病活疫苗购自青海生物药品厂有限公司；牛病毒性腹泻阳性毒株、边界病毒毒株、羊副流感病毒3型病毒毒株由江苏省农业科学院兽医研究所毛立博士馈赠。

主要试剂：

荧光试剂盒：包含上述的ENTV2-F和ENTV2-R、荧光探针以及反转录混合酶(PrimeScript 1Step Enzyme Mix)、缓冲液(2×1Step Buffer)和双蒸水

PrimeScript 1Step Enzyme Mix、2×1Step Buffer试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司；双蒸水等购自天根生化科技(北京)有限公司。

实施例1引物和探针

根据山羊鼻内肿瘤病毒基因序列设计出扩增山羊鼻内肿瘤病毒基因序列的引物对，本发明经过大量筛选，筛选出特异性以及灵敏度最佳的引物对：ENTV2-F和ENTV2-R，以及 TaqMan探针，其碱基序列如下：

ENTV2-F:ATGGCAATAGTTTATATCTGCAAT(SEQ ID NO:1)；

ENTV2-R:GATGGCCTTGTATCAACATAAATGG(SEQ ID NO:2)。

ENTV2探针：

FAM-ATATAAGAATCCCGTAACACCTACATCTC-BHQ1(SEQ ID NO:3)。

实施例2

1)标准样品的制备

提取了山羊鼻内肿瘤病毒的RNA，即山羊鼻内肿瘤病毒的阳性标准品。

2)阳性标准样品的荧光定量PCR检测

将上述步骤的山羊鼻内肿瘤病毒阳性标准品进行稀释检测。

在最优扩增条件下对稀释好的阳性标准品进行扩增，荧光定量PCR扩增反应体系为：

3)结果分析

检测结果如图1的曲线①所示，山羊鼻内肿瘤病毒阳性标准品出现S曲线并有Ct值。

实施例3一种荧光定量PCR检测方法

(1)核酸提取：从广东地区采集的100份临床山羊鼻内样本的RNA。

(2)荧光定量PCR扩增反应体系为：

反应的程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，98℃变性10s，53℃退火延伸30s，循环45次。

同时，设置阴性对照组和阳性对照组，其中阴性对照为生理盐水。阳性对照组使用含山羊鼻内肿瘤病毒阳性标准品的溶液作为核酸模板。

(3)结果判断：阳性对照有标准S曲线产生，阴性对照无曲线产生的情况下，待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦40，判定为山羊鼻内肿瘤病毒核酸阳性。检测结果发现，100份临床样本中有1份山羊鼻内肿瘤病毒阳性样本，进一步经核酸测序，确定该样本感染山羊鼻内肿瘤病毒。如图1所示，曲线①：山羊鼻内肿瘤病毒阳性对照；曲线②：临床阳性样品。

对上述荧光检测PCR方法作进一步的效果检测。

1.灵敏度检测

使用本发明设计的ENTV2-F、ENTV2-R引物，山羊鼻内肿瘤病毒阳性重组质粒为模板 (浓度为23.7ng/μL)进行扩增。阳性重组质粒进行倍比稀释(分别为10⁰倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍十个梯度稀释)，来测定该方法的灵敏度。

如图2所示，曲线⑨的Ct值为40，为山羊鼻内肿瘤病毒阳性，即本发明的试剂盒灵敏度为2.37×10^﹣5pg/μL，换算为拷贝数则为6.89个拷贝/μL，说明本发明荧光定量PCR灵敏度高。

2.特异性检测

(1)核酸提取：提取山羊鼻内肿瘤病毒、山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病毒、羊副流感病毒3型的RNA，分别编号为①～⑥。

(2)荧光定量PCR：在荧光定量PCR板中，每孔按照试剂盒配比加入反应要素：1.25μL 的ENTV2-F，1.25μL的ENTV2-R，1.5μL的荧光探针，0.5μL的PrimeScript 1Step EnzymeMix，12.5μL的2×1Step Buffer，6μL的ddH₂O，2μL的RNA模板；以山羊鼻内肿瘤病毒阳性为对照，进行荧光定量PCR，测量荧光信号；反应的程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，98℃变性10s，53℃退火延伸30s，共45个循环。

(3)结果判断：图3显示，只有山羊鼻内肿瘤病毒阳性对照出现S曲线并有Ct值，如曲线①所示；而山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病毒、羊副流感病毒3型等未呈现S曲线且无Ct值，如曲线②所示。

综上所述，本发明开发的山羊鼻内肿瘤病毒试剂盒具有高灵敏度，仅需2.37×10^﹣ ⁵pg/μL 即可；试剂盒还具有良好的特异性，通过此方法，山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病毒、羊副流感病毒3型等并未呈现S曲线且无Ct值。因此，本发明开发的试剂盒可以广泛地用于检测山羊鼻内肿瘤病毒。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学研究院动物卫生研究所

<120> 一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcaatag tttatatctg caat 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatggccttg tatcaacata aatgg 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atataagaat cccgtaacac ctacatctc 29

Claims

1.一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：

ENTV2-F：5’-ATGGCAATAGTTTATATCTGCAAT-3’；

ENTV2-R：5’-GATGGCCTTGTATCAACATAAATGG-3’。

2.一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：

5’-ATATAAGAATCCCGTAACACCTACATCTC-3’。

3.根据权利要求2所述的荧光PCR探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为BHQ。

4.一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1的PCR引物组、权利要求2或3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括反转录混合酶、缓冲液。

6.如权利要求1所述引物组在检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR试剂盒中的应用，其特征在于，包含以下步骤：

(1)核酸提取：提取待检样品中的RNA；

(2)荧光定量PCR：以提取的核酸为模板，用权利要求1所述引物组ENTV2-F、ENTV2-R、权利要求2或3所述探针进行荧光定量PCR，获得扩增曲线；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)荧光PCR反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性2min；98℃变性10s，53℃退火延伸30s，共计45个循环。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)荧光PCR反应体系：

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)结果判断：阳性对照有标准S曲线产生，阴性对照无曲线产生的情况下，待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦40，判定为山羊鼻内肿瘤病毒核酸阳性；Ct值>40或是无Ct值，则判定为山羊鼻内肿瘤病毒核酸阴性。