CN111363034B - 一种NANOG Ser68的抗体，以及抑制剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种NANOG Ser68的抗体，以及抑制剂和应用。本发明首次发现了负责NANOG降解的蛋白泛素化酶SPOP，SPOP介导的NANOG降解通过AMPK‑BRAF信号对NANOG Ser68上的磷酸化而受到控制，从而也阻断了SPOP对NANOG的相互作用。针对此特性，本发明首次研发了NANOG Ser68的抗体，可用于制备肿瘤早期筛查和诊断的试剂或用于制备抗肿瘤药物。本发明所提供的磷酸化介导的NANOG稳定性控制癌干细胞干性的调节机制将有助于识别新的药物靶点，改善针对肿瘤发生、复发和转移的治疗策略。

Description

一种NANOG Ser68的抗体，以及抑制剂和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种NANOG Ser68的抗体，以及抑制剂和应用。

背景技术

2003年，Chambers和Mitsui等人同时在Cell杂志报道了一种在囊胚内细胞群(inner cell mass,ICM)、原始生殖细胞以及ESCs表达的新转录因子，将其命名为Nanog，代表生命绿洲和永不枯竭的意思(1,2)。Nanog cDNA序列由2184碱基组成，含有一个开放阅读框，编码由305个氨基酸组成的多肽。该蛋白一般表达于未分化的胚胎干细胞，而在分化的细胞中不表达(3)。Nanog被证实在细胞获得全能性的一系列复杂过程中发挥着非常关键的作用。缺少Nanog将导致胚胎干细胞发育停滞和诱导产生多能干细胞的过程终止。实验证明早期胚胎在没有Nanog存在的情况下是不能存活的(4)。研究认为Nanog是干细胞获得全能性的“总开关”，通过协调一系列基因和蛋白在各自正确的位置上起作用，最终为细胞带来全能性(4)。另外，体细胞来源的Nanog通过核移植形成重构囊胚，而且Nanog也存在于ES细胞融合形成的细胞，这些都说明Nanog表达与核重编程密切相关(5)。同时，具有杂合子Nanog(+/-)的ES细胞相对其纯合体ES细胞易造成ES细胞分化，提示Nanog表达量的高低可决定干细胞干性(6)。

有意思的是，一些研究表明Nanog在肿瘤细胞中重新获得表达，现已在胶质瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌等恶性肿瘤中发现Nanog的表达，而且肿瘤级别越高，Nanog表达越强，临床预后越差(7-9)。Nanog在癌细胞增殖、迁移和侵袭、对药物和化疗抵抗方面都具有重要作用(10)，以至于有研究认为Nanog可作为肿瘤的一个敏感性、特异性的标志物和治疗靶点(7-9)。结合上述Nanog表达对干性获得的重要性及其对肿瘤发生发展的影响，所有证据都提示Nanog在肿瘤细胞中的高表达可促进肿瘤细胞干性获得，继而导致肿瘤干细胞的产生。

Nanog的表达水平受其蛋白转录翻译及蛋白稳定性调控等方面的影响(11)。在细胞中Nanog是一个极不稳定的蛋白，蛋白半衰期非常短暂，只有30分钟(12)。目前影响Nanog蛋白活性及稳定性的因素和机制尚不清楚。

蛋白的泛素化修饰在细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞周期调控等多种生物学功能中发挥着重要作用，泛素化修饰系统的失调与多种人类疾病如肿瘤的发生发展密切相关(13)。泛素化修饰是一种由酶催化的级联反应过程，由泛素激活酶E1，泛素结合酶E2，泛素连接酶E3共同参与，最终将泛素转移到底物蛋白上，从而改变蛋白质的结构和定位。E3泛素连接酶可对底物进行特异性识别，使其被26S蛋白酶体降解(14)。目前在人体中已发现600多种E3泛素连接酶，cullin-RING E3连接酶复合体(CRL)是其中最大的家族，主要由RING蛋白，E3泛素连接酶，cullin支架蛋白组成。哺乳动物体内有8种Cullin蛋白(Cullin1，Cullin2，Cullin3，Cullin4A，Cullin4B，Cullin5，Cullin7，Cullin9)(15)。众多临床报道指出E3泛素连接酶的功能失调会导致癌症的发生(16)。

SPOP(Speckle-type POZ Protein)是泛素连接酶E3家族成员Cul3结合底物蛋白的接头蛋白(adaptor)，通过形成Cullin3-RING-SPOP复合体，可对多种底物蛋白如SRC3、DAXX、BRD4以及PD-L1等进行泛素化降解(17-22)。有研究报道SPOP在肿瘤细胞免疫逃逸、肿瘤抗药性等方面发挥着重要作用(19,23)。在结肠癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、胶质瘤等多种肿瘤中都可以检测到SPOP的定位或功能异常(24,25)，例如：SPOP在正常肾组织中表达很低，但在99％的透明细胞肾癌组织中过度表达，而且SPOP的过表达和转移性透明细胞肾癌有着紧密联系(26)；主要原因在于SPOP在透明细胞肾癌组织中异常定位在细胞质里；在肿瘤的低氧环境促使缺氧诱导因子(HIF)转录增强SPOP过表达的情况下，SPOP蛋白在细胞质中大量累积，并导致肾癌形成(27)。

不同于SPOP异常定位的透明细胞肾癌，SPOP突变体对于前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌及肺癌等诸多肿瘤的促进作用被相继报道(18,28,29)。外显子测序研究证明，SPOP是前列腺癌中最容易发生错义点突变的基因，其基因突变的发生率高达15％，主要发生在与底物结合的MATH结构域的进化保守残基(18)。有研究显示侵润性前列腺癌周围的上皮内瘤变细胞中也可检测到SPOP突变，提示SPOP突变是前列腺癌形成的早期事件，可能诱导前列腺癌的发生(30)。已知SPOP通过降解AR、ERG等蛋白调控肿瘤细胞的迁移、生长等功能，并且SPOP突变还是一个重要的预后指标(31-33)，但SPOP是否调控肿瘤细胞干性获得亟待研究。探究SPOP在肿瘤细胞中新的调控作用，以及发现SPOP的新底物蛋白将有助于加深人们对肿瘤发生和进展的认知，为针对性治疗SPOP突变型肿瘤奠定基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种NANOG Ser68的抗体，以及抑制剂和应用。

第一方面，本发明提供了一种能够特异性识别第68位丝氨酸磷酸化的NANOG的抗体。

在一个优选例中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体是使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示且SEQ ID NO:1的第11位丝氨酸发生了磷酸化的多肽免疫动物制备的抗血清。

第二方面，本发明提供了一种抗体的制备方法，所述抗体能够特异性识别第68位丝氨酸磷酸化的NANOG。

在一个优选例中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在另一优选例中，包括以下步骤：使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示且SEQ IDNO:1的第11位丝氨酸发生了磷酸化的多肽免疫动物。

第三方面，本发明提供了所述抗体的用途，用于制备肿瘤早期筛查和诊断的试剂或用于制备抗肿瘤药物。

第四方面，本发明提供了NANOG的第68位丝氨酸磷酸化的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

在一个优选例中，所述抑制剂是能够特异性识别第68位丝氨酸磷酸化的NANOG的抗体。

在另一优选例中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体是使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示且SEQ ID NO:1的第11位的丝氨酸发生了磷酸化的多肽免疫动物制备的抗血清。

第五方面，本发明提供了一种筛选预防或治疗肿瘤的药物的方法，所述方法包括：

(1)将候选物质加入到存在BRAF与NANOG的体系；和

(2)检测所述体系中BRAF与NANOG的相互作用；

其中，若所述候选物质能抑制BRAF对NANOG的第68位丝氨酸的磷酸化，则表明该候选物质是预防或治疗肿瘤的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到存在BRAF与NANOG的体系中；步骤(2)包括：检测测试组的体系中NANOG的第68位丝氨酸的磷酸化情况，并与对照组比较，其中所述对照组是不添加所述候选物质的存在BRAF与NANOG的体系；其中，若所述候选物质能抑制BRAF对NANOG的磷酸化，则表明该候选物质是预防或治疗肿瘤的潜在物质。

在另一优选例中，所述方法同样也是一种筛选影响NANOG稳定性的试剂的方法。

第六方面，本发明提供了一种筛选预防或治疗肿瘤的药物的方法，所述方法包括：

(a)将候选物质加入到存在SPOP和NANOG的体系；和

(b)检测所述体系中SPOP与NANOG的相互作用；

其中，若所述候选物质能促进SPOP活性，进而抑制NANOG的第68位丝氨酸的磷酸化，则表明该候选物质是预防或治疗肿瘤的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(a)包括：在测试组中，将候选物质加入到存在SPOP和NANOG的体系中；步骤(b)包括：检测测试组的体系中SPOP与NANOG的相互作用，并与对照组比较，其中所述对照组是不添加所述候选物质的存在SPOP和NANOG的体系；其中，若所述候选物质能促进SPOP活性，进而抑制NANOG的第68位丝氨酸的磷酸化，则表明该候选物质是预防或治疗肿瘤的潜在物质。

在另一优选例中，所述方法同样也是一种筛选影响NANOG稳定性的试剂的方法。

第七方面，本发明提供了一种分离的小肽，所述小肽是NANOG的片段，包括BRAF在NANOG的磷酸化结合域。

在一个优选例中，所述小肽包含NANOG的第30～90位的氨基酸序列；或所述小肽包含NANOG的第(30-40)～(80-90)位的氨基酸序列。

第八方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码所述小肽。

第九方面，本发明提供了所述小肽在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

在一个优选例中，所述肿瘤是胶质瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、胃癌、子宫内膜癌或乳腺癌。

第十方面，本发明提供了一种预防或治疗肿瘤的药物，所述药物含有所述小肽，以及药学上可接受的载体。

本发明优点在于：

NANOG是维持胚胎干细胞(ESCs)和癌干细胞(CSC)的重要转录因子。肿瘤干细胞(cancer stem-like cell)是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的根源(34-36)。恶性肿瘤细胞很大程度上具有干细胞样特性，说明恶性肿瘤的发生源于肿瘤细胞的干性获得(37,38)，只有阻断肿瘤细胞的干性获得才有可能成功治愈肿瘤。在这些具有干细胞样特性的肿瘤细胞中，干性转录因子Nanog的蛋白稳定性非常高且呈累积态势(39)，揭示了Nanog稳定性在肿瘤细胞干性获得方面的重要性。我们首先发现了负责NANOG降解的蛋白泛素化酶SPOP，该酶的突变与多种肿瘤的发生发展有着直接而密切的关系。另外，我们发现SPOP的癌相关突变或NANOG S68Y处的突变使得SPOP介导的NANOG降解消失，导致PCa癌梗阻升高和预后不良。此外，SPOP介导的NANOG降解通过AMPK-BRAF信号对NANOG Ser68上的磷酸化而受到控制，从而也阻断了SPOP对NANOG的相互作用。针对此特性，我们首次研发了NANOG Ser68的抗体，以及筛选出相关抑制NANOG Ser68磷酸化的小分子抑制剂。本发明提供了一种由磷酸化介导的NANOG稳定性控制癌干细胞干性的调节机制，有助于识别新的药物靶点，改善针对肿瘤发生、复发和转移的治疗策略。

附图说明

附图1：酶联免疫法(ELISA)证明所制备的NANOG S68抗体特异性结合S68磷酸化的NANOG蛋白。

附图2：用DMSO或激酶抑制剂处理NanoLuc-NANOG HEK293T稳转细胞系6小时，测量荧光素酶活性。

附图3：蛋白质印迹证实了化合物C对NANOG稳定性的影响，化合物C对NANOG稳定性的调节作用取决于SPOP的存在。

附图4：化合物C未能稳定AMPKγ1/2-/-MEF细胞中的NANOG。

附图5：在使用2-DG或停用葡萄糖时，NANOG的半衰期显著缩短。

附图6：化合物C抑制AMPK可显著增加Ser68处NANOG的磷酸化。

附图7：AMPK激活剂AICAR降低Ser68处NANOG的磷酸化。

附图8：AMPK的抑制消除了SPOP和NANOG之间的相互作用，而AMPK的激活加强了SPOP和NANOG之间的相互作用。

附图9：AMPK影响SPOP+/+中NANOG的泛素化，但不影响SPOP-/-细胞。

附图10：AMPK的抑制显著提高了SPOP+/+细胞的成球潜能和增殖能力，但SPOP-/-DU145细胞的成球潜能和增殖能力没有增加。

附图11：随着AMPK的激活，DU145细胞的自我更新能力和增殖能力下降。

附图12：二甲双胍(AMPK激活剂)能减少表达WT-NANOG的DU145细胞的球形成，但不能减少过度表达与癌症相关的NANOG S68Y突变体。

附图13：BRAF激酶增加了Ser68处NANOG的磷酸化。

附图14：用BRAF激酶抑制剂AZ628或LY03009120处理可抑制NANOG Ser68的磷酸化。

附图15：激酶死亡突变体K483M(BRAF)在Ser68不能促进NANOG的磷酸化。

附图16：BRAF可以在细胞中与NANOG结合。

附图17：BRAF的表达，但不是激酶功能消失的突变体K483M，强烈地提高了蛋白水平和延长了NANOG的半衰期。

附图18：敲除BRAF降低了NANG蛋白水平。

附图19：BRAF抑制剂AZ628和SB590885处理也缩短了NANOG的半衰期。

附图20：BRAF的抑制增加了SPOP和NANOG之间的相互作用。

附图21：BRAF的抑制促进了DU145细胞中NANOG的泛素化。

附图22：BRAF抑制剂在SPOP-/-DU145细胞中对NANOG的半衰期影响很小。

附图23：BRAF能够磷酸化丝氨酸68处的NANOG，而丝氨酸68处的NANOG磷酸化阻止了SPOP与NANOG在体外的相互作用。

附图24：敲除BRAF消除了AMPK信号传导对NANOG蛋白水平的抑制作用。

附图25：Ser729到Asp的突变(S729D)完全阻断了NANOG和BRAF之间的相互作用。

附图26：Ser729处的BRAF突变失去了稳定细胞内NANOG的能力。

附图27：BRAF抑制剂SB590885抑制DU145细胞的球形形成和细胞增殖。

附图28：SB590885导致表达WT-NANOG的PCa DU145干性细胞球数量明显减少，但NANOG S68Y的细胞球减少不明显，表明BRAF主要通过与SPOP相互作用来调控PCa干细胞特性。

附图29：BRAF在Ser68直接磷酸化NANOG，并且通过破坏SPOP和NANOG之间的相互作用来增加PCa细胞的自我更新能力和细胞增殖。

具体实施方式

本发明首次揭示了一种由磷酸化介导的NANOG稳定性控制癌干细胞干性的调节机制。发现BRAF在Ser68直接磷酸化NANOG，并且通过破坏SPOP和NANOG之间的相互作用来增加肿瘤细胞的自我更新能力和细胞增殖。本发明还首次研发了NANOG Ser68的抗体。

本发明中，所述的“NANOG的第68位丝氨酸磷酸化的抑制剂”其位点是基于NCBI公布的序列号：79923的NANOG蛋白序列。

如本文所用，所述的“NANOG的第68位丝氨酸磷酸化的抑制剂”是指减少NANOG的第68位丝氨酸发生磷酸化、或降低第68位丝氨酸磷酸化的NANOG活性或稳定性的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物、蛋白抑制剂、抗体、配体、化合物、核酸酶、核酸结合分子等，只要其能够降低第68位丝氨酸磷酸化的NANOG的含量、抑制其活性或功能。

作为本发明的优选方式，所述的NANOG的第68位丝氨酸磷酸化的抑制剂是能够特异性识别第68位丝氨酸磷酸化的NANOG的抗体。这里，“特异性”是指抗体能识别和结合于NANOG的第68位丝氨酸磷酸化位点，但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。其可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

所用的术语“多克隆抗体”指一组与抗原有特异性结合能力的球蛋白，其是由抗原刺激机体，产生免疫学反应后，由机体的浆细胞合成并分泌的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。多克隆抗体的好处在于它们的效价高，特异性高，亲和力强，灵敏度好，便于人为处理和质量控制，此外，多克隆抗体制备相对容易，更为经济。多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。纯化的第68位丝氨酸磷酸化的NANOG小肽，可被施用于动物(如兔，小鼠，大鼠等；较佳地是兔)以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达第68位丝氨酸磷酸化的NANOG小肽的细胞可用来免疫动物生产抗体。多克隆抗体可以用淋巴结注射法，皮下多点注射法，多途径联合注射法等免疫方法制得。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。如本文所用，所述的“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“包括BRAF在NANOG的磷酸化结合域”是指来源于NANOG的全长序列上的片段，较佳地，其含有NANOG的第(30-40)～(80-90)位的氨基酸序列。

如本文所用，所述的“NANOG的第(30-40)～(80-90)位的氨基酸序列”是指一段氨基酸序列片段，其起始于全长NANOG氨基酸序列的第30-40位的任一位的氨基酸，终止于全长NANOG氨基酸序列的第80-90位的任一位的氨基酸。例如，该序列片段可以是全长NANOG氨基酸序列的第31-89位，或可以是全长NANOG氨基酸序列的第32-88位；较佳地，其是全长NANOG氨基酸序列的第30-90位。

本发明提供了一种小肽，该小肽是NANOG的片段，包括BRAF在NANOG的磷酸化结构域的第(30-40)～(80-90)位的氨基酸序列。最优选地，所述的小肽是氨基酸序列是NANOG的第30-90位的氨基酸序列。

在所述的小肽基础上，经过一个或多个(一般1-5个，如2、3、4个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的小肽变体也包括在本发明中。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。

在所述的小肽基础上，经修饰或改良的小肽变体也包括在本发明中，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的小肽变体。所述经过修饰或改良的小肽变体可包含被取代的或人工的氨基酸。也就是说，任何不影响所述小肽的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

一旦获得了所述小肽的序列，就可以用重组法来大批量地获得该小肽。例如可以将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列的蛋白。对于本发明的小肽而言，优选的是采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的多肽。

本发明还提供了编码所述小肽的核酸。所述的核酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。所述的重组法通常是将所述核酸克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明还提供了所述的小肽的应用，用于制备预防或治疗肿瘤的药物。所述的小肽通过结合BRAF、抑制BRAF对NANOG磷酸化、增加NANOG与SPOP的结合，促进NANOG的泛素化降解，预防或治疗肿瘤。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括有效量的本发明所述的NANOG的第68位丝氨酸磷酸化的抑制剂以及药学上可接受的载体。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在药物组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的NANOG的第68位丝氨酸磷酸化的抑制剂施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

在得知了SPOP介导的NANOG降解通过AMPK-BRAF信号对NANOG Ser68上的磷酸化而受到控制，从而也阻断了SPOP对NANOG的相互作用之后，可基于该新发现来筛选通过调节该信号通路，预防或治疗肿瘤的药物或潜在药物。

因此，本发明提供了一种筛选预防或治疗肿瘤的药物的方法，所述方法包括：

(1)将候选物质加入到存在BRAF与NANOG的体系；和

(2)检测所述体系中BRAF与NANOG的相互作用；

其中，若所述候选物质能抑制BRAF对NANOG的第68位丝氨酸的磷酸化，则表明该候选物质是预防或治疗肿瘤的潜在物质。

本发明还提供了一种筛选预防或治疗肿瘤的药物的方法，所述方法包括：

(a)将候选物质加入到存在SPOP和NANOG的体系；和

(b)检测所述体系中SPOP与NANOG的相互作用；

其中，若所述候选物质能促进SPOP活性，进而抑制NANOG的第68位丝氨酸的磷酸化，则表明该候选物质是预防或治疗肿瘤的潜在物质。

以蛋白或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱或检测蛋白的磷酸化情况可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1材料和方法

1.1制备Nanog Ser68磷酸化抗体的方法

1)试剂配制：

SMCC：4.8mg/1ml，溶于水；KLH：1mg/1ml，溶于PBS，加10μl 0.5M EDTA；

多肽：10mg/ml。

两只新西兰兔的用量：500μl SMCC×2＝4.8mg/1ml；

2.5ml KLH×2＝5mg/5ml；

250μl Nanog peptide(pS68)×2＝5mg/500μl

Nanog peptide(pS68)：CDLLIQDSPDS(p)STSPKGKQP(SEQ ID NO.1)。

2)SMCC与KLH偶联：将溶解的SMCC溶液缓慢滴加进入KLH(血蓝蛋白抗体)溶液中，边滴加边轻混匀，4度摇0.5-2h，形成半偶联物；

3)将溶解好的多肽缓慢滴入半偶联物中，边滴加边混匀，4度摇2h。将偶联物分装成500μl一管，置于-80度保存；

4)第一轮多肽偶联物注射(一只兔子的量)：500μl多肽偶联物+500μl弗氏完全佐剂，振荡乳化，打兔子皮下，每次打50-100μl，多孔注射；

5)10-14天后，500μl多肽偶联物+500μl弗氏不完全佐剂，振荡乳化，打兔子皮下；

6)重复5)中操作：10-14天后，500μl多肽偶联物+500μl弗氏不完全佐剂，振荡乳化，打兔子皮下；

7)重复5)中操作：10-14天后，500μl多肽偶联物+500μl弗氏不完全佐剂，振荡乳化，打兔子皮下；

8)10-14天后，500μl多肽偶联物，打兔子耳缘静脉；

9)三天后收兔子血。

1.2构建NanoLuc Nanog融合蛋白细胞系的方法

利用三段法PCR方法构建NanoLuc Nanog融合蛋白质粒，测序验证序列正确，将该质粒转染HEK293T细胞，验证蛋白表达。利用磷酸钙转染进HEK293T细胞，24hr后用嘌呤霉素(1μg/ml)筛选，传代10次，每次换液时加1μg/ml嘌呤霉素，得到稳定表达NanoLuc Nanog融合蛋白细胞系，用western blot和荧光素酶读值验证。

1.3用NanoLuc Nanog融合蛋白细胞系筛选激酶抑制剂的方法

用含10％FBS的DMEM培养基培养稳定转染NanoLuc-Nanog的HEK293T细胞，前一天接96孔板，第二天细胞长到80％左右，每个实验组均设置2个复孔。加小分子化合物处理6h。24h之内收样，每孔加入细胞裂解液80μL，室温裂解细胞30min，然后12000rpm离心15min，取20μL细胞裂解液加入96孔检测板待测，用Promega公司荧光素酶报告基因试剂盒检测，酶标仪读取相应读值。

1.4蛋白印迹法

用RIPA裂解液裂解细胞，用protein A/G琼脂糖珠和相应的抗体孵育细胞裂解液，2-3h后离心去上清，加2×Loading Buffer，100度煮沸样品，跑SDS-Page胶，用相应抗体检测相应的蛋白。

1.5NANOG表达

人前列腺癌细胞(如DU145细胞，购于ATCC)呈上皮细胞样贴壁生长。经检测，该细胞不表达前列腺抗原。人前列腺癌细胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，37度、饱和湿度下5％CO₂的培养箱中进行传代培养。Crispr-cas9技术建立Nanog S68突变体稳定表达的敲入细胞系：在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上检索Nanog外显子序列信息，以NanogS68所在序列为靶标，用在线设计软件www.crispr.mit.edu，在靶标DNA区域设计20bp的Oligo DNA，并选3个高评分的Oligo DNA序列。设计与单链OligoDNA序列互补的一对引物，并加cacc，由Invitrogen公司合成相关Oligo DNA引物，用PAGE胶纯化。应用PrecutsgRNA cloning kit和pSD-gRNA plasmid构建试剂盒，将退火Oligo DNA合成双链DNA(NANOG oligo正向序列：GGAATTCATGAGTGTGGATCCAGCTTG(SEQ ID NO.2)，NANOG oligo反向序列：CCGCTCGAGTCACACGTCTTCAGGTTGCATG(SEQ ID NO.3)；NANOG S68D oligo正向序列：CAGCCCTGATGATTCCACCAGTCCCAAAG(SEQ ID NO.4)，NANOG S68D oligo反向序列：CTGGTGGAATCATCAGGGCTGTCCTGAAT(SEQ ID NO.5))，接入可商业购买的pSPCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体(Addgene,#48138)。验证扩增后，脂质体转染培养细胞，并用500ng/mlPuromycin(Invitrogen)筛选抗生素阳性细胞，建立稳定细胞系。

1.6NANOG半衰期

按时间点在细胞培养液中加入放线菌酮(Chlorhexidine Dihydrochloride,CHX)，加1×Loading Buffer，100度煮沸样品，跑SDS-Page胶，用蛋白印迹法检测相应的蛋白。

1.7磷酸化实验

纯化蛋白与Nanog在含100μM ATP的50μl激酶缓冲培养(25mM的Tris-HCl(pH7.5)，5mM甘油，10mM氯化镁，1mM DTT和0.1mM Na₃VO₄)中，30℃时进行1小时的反应。用17μl 4×laemmli的SDS样品缓冲液终止反应，煮沸反应混合物，用SDS–PAGE胶分离蛋白，用抗pSer68-Nanog抗体检测磷酸化的Nanog蛋白。

1.8蛋白相互作用实验

该方法主要用于体外检测蛋白与蛋白之间的相互作用。从大肠杆菌BL21细胞中分别纯化得到GST和His蛋白，将GST蛋白和His蛋白在含有GST琼脂糖珠的细胞裂解液中孵育，2-3h后离心去上清，加2×Loading Buffer，100度煮沸样品，跑SDS-Page胶，用蛋白印迹法检测相应的蛋白。

1.9泛素化实验

该方法用于检测泛素化酶对底物的泛素化能力。从大肠杆菌BL21中纯化得到带有GST标记的E3泛素化酶蛋白和His标记的底物蛋白，与ubiqutination buffer、DTT、ATP、ub蛋白在37度反应2h，加2×Loading Buffer，100度煮沸样品，跑SDS-Page胶，用蛋白印迹法检测蛋白。

1.10细胞成球实验

将前列腺癌细胞消化成单细胞悬液(1000个/ml)，均匀铺至低吸附的96孔板中，在无血清的MEBM培养基(含有B27，EGF，bFGF等生长因子)中培养10天，观察并拍照。将形成的细胞球收集、摇匀后计数。用Hoechst染色筛除凋亡的肿瘤细胞球。

1.11细胞增殖实验

配制单细胞悬液，接种到96孔板，37度培养箱培养，按时间设定每孔加MTT溶液继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加200μl DMSO放摇床20min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.12构建磷酸化模拟突变体BRAF S729D的方法

点突变用质粒环P法构建，合成引物如下：

Forward Primer：CCGCAGTGCAGATGAACCCTCCTTGAATC(SEQ ID NO:6)

Reverse Primer：CAAGGAGGGTTCATCTGCACTGCGGTGAATTTTTGG(SEQ ID NO:7)

以WT BRAF质粒为模板，进行PCR扩增，

PCR产物用DpnI酶37℃消化30min后，直接转化，挑单克隆提质粒，测序鉴定。磷酸化模拟突变体BRAF S729D质粒的完整序列如SEQ ID NO:8所示。

2结果

2.1 NANOG Ser68抗体的制备

为了进一步研究NANOG Ser68磷酸化的作用，我们制备了能够特异性识别Ser68-磷酸化的NANOG(p-S68NANOG)的抗体。我们的数据清楚地表明，这是一个能特异性针对Ser68磷酸化NANOG的抗体，因为它不识别在Ser68突变的NANOG蛋白肽(图1)。

2.2 AMPK激活剂通过阻断NANOG Ser68上的磷酸化来降低癌干细胞干性

本申请发明人经过广泛而深入的研究，认为Ser68的磷酸化极有可能影响NANOG的蛋白稳定性，因此有理由假定参与NANOG磷酸化的激酶应该影响NANOG的蛋白稳定性。为此，我们构建了稳定表达NanoLuc-NANOG融合蛋白的细胞系，并通过检测NanoLuc活性筛选出244种激酶抑制剂。我们的数据表明，MG132或MLN4924处理有效地提高了NanoLuc活性，表明此分析可以鉴定影响NANOG稳定性的独特化合物(图2)。同时，我们发现化合物C(Dorsomorphin)显著提高了NanoLuc的活性，化合物C是AMPK的特异性抑制剂(图2)，表明化合物C可能对NANOG的稳定性有重要影响。此外，通过蛋白质印迹证实了化合物C对NANOG稳定性的影响(图3)。重要的是，我们发现化合物C对NANOG稳定性的调节作用取决于SPOP的存在(图3中A和B)。为了进一步证实AMPK参与NANOG稳定性的调节，我们在AMPK_1/2-/-MEF细胞中表达了NANOG，并评价了NANOG的半衰期。我们的数据清楚地表明，与WT MEF相比，AMPK_1/2-/-MEF细胞中NANOG的半衰期显著延长。然而，化合物C未能稳定AMPKγ1/2-/-MEF细胞中的NANOG(图4)。

因此，我们检查AMPK的活化是否能促进NANOG的降解。为此，我们使用了2-DG，一种可以通过增加AMP/ATP的细胞浓度来激活AMPK的葡萄糖分子。葡萄糖代谢的缺陷在细胞中产生能量压力，从而激活AMPK激酶。我们的数据表明，在使用2-DG或停用葡萄糖时，NANOG的半衰期显著缩短(图5)。这些数据共同表明AMPK是NANOG稳定性的负调控因子。

然后我们检测AMPK是否影响Ser68的NANOG磷酸化。我们的数据表明，化合物C抑制AMPK可显著增加Ser68处NANOG的磷酸化(图6)。另一方面，AMPK激活剂AICAR降低Ser68处NANOG的磷酸化(图7)。此外，AMPK的抑制消除了SPOP和NANOG之间的相互作用，而AMPK的激活加强了SPOP和NANOG之间的相互作用(图8)。

接下来，我们研究AMPK是否影响依赖于SPOP的存在的NANOG稳定性。我们的数据表明，化合物C对AMPK的抑制延长了NANOG在SPOP+/+细胞中的半衰期，而不是SPOP-/-DU145细胞中的半衰期(图3中A和B)。AMPK影响SPOP+/+中NANOG的泛素化，但不影响SPOP-/-细胞(图9)。这些数据表明AMPK以SPOP依赖的方式影响NANOG的降解和泛素化。

从功能上讲，我们发现AMPK的抑制显著提高了SPOP+/+细胞的成球潜能和增殖能力，但SPOP-/-DU145细胞的成球潜能和增殖能力没有增加(图10)。另一方面，随着AMPK的激活，DU145细胞的自我更新能力和增殖能力下降(图11)。同时，二甲双胍(AMPK激活剂)能减少表达WT-NANOG的DU145细胞的球形成，但不能减少过度表达与癌症相关的NANOG S68Y突变体(图12)的细胞球形成，这确立了AMPK以SPOP依赖的方式调节PCa干细胞特性的概念。这些结果共同表明，AMPK通过调节Ser68处的NANOG磷酸化而影响PCa细胞的干细胞。

由于AMPK的激活降低了Ser68处NANOG的磷酸化，所以AMPK不太可能是直接磷酸化NANOG的蛋白激酶。为了在Ser68上鉴定直接参与NANOG磷酸化的蛋白激酶，我们在网上搜索了网站(www..net.ca/kinase.or)，发现多种激酶是潜在的候选者，包括酪蛋白激酶、Raf激酶、GSK3_和AKT。为了确定哪种激酶是正确的，我们分别与这些激酶共同表达NANOG，并用MG132处理细胞，以避免蛋白质降解的影响。用P-S68抗体检测NANOG的磷酸化。我们的数据显示BRAF激酶，而不是上面列出的其它激酶，特别增加了Ser68处NANOG的磷酸化(图13)。同时，用BRAF激酶抑制剂AZ628或LY03009120处理可抑制NANOG Ser68的磷酸化(图14)。激酶死亡突变体K483M(BRAF)在Ser68不能促进NANOG的磷酸化(图15)，表明BRAF的激酶活性是NANOG磷酸化所必需的。此外，我们发现BRAF可以在细胞中与NANOG结合(图16)。总之，这些数据表明BRAF是一种蛋白激酶，它解释了在Ser68NANOG的磷酸化。

2.3 BRAF抑制剂通过阻断NANOG Ser68上的磷酸化来降低癌干细胞干性

接下来，我们研究BRAF是否影响NANOG的蛋白质稳定性。我们的数据表明，BRAF的表达，但不是激酶功能消失的突变体K483M，强烈地提高了蛋白水平和延长了NANOG的半衰期(图17)。另一方面，敲除BRAF降低了NANG蛋白水平(图18)。BRAF抑制剂AZ628和SB590885处理也缩短了NANOG的半衰期(图19)。

由于BRAF在Ser68能磷酸化NANOG，因此我们研究了BRAF是否影响NANOG与SPOP之间的相互作用。我们的数据显示BRAF的抑制增加了SPOP和NANOG之间的相互作用(图20)，从而促进了DU145细胞中NANOG的泛素化(图21)。因此，BRAF抑制剂在SPOP-/-DU145细胞中对NANOG的半衰期影响很小(图22)，表明BRAF以SPOP依赖的方式影响NANOG的稳定性。

此外，体外磷酸化试验表明，BRAF能够磷酸化丝氨酸68处的NANOG，而丝氨酸68处的NANOG磷酸化阻止了SPOP与NANOG在体外的相互作用(图23)。

2.4 AMPK对NANOG磷酸化的影响依赖于BRAF

接下来，我们研究AMPK对NANOG磷酸化的影响是否依赖于BRAF。我们的数据显示敲除BRAF消除了AMPK信号传导对NANOG蛋白水平的抑制作用(图24)，表明AMPK可能通过BRAF影响NANOG的稳定性。

以前的报道表明，AMPK磷酸化了Ser729处的BRAF，破坏了BRAF与KSR1的异构化，然后阻止了MEK-ERK信号的反常激活。因此，我们研究AMPK是否通过磷酸化BRAF影响NANOG的功能。为此，我们构建了一个磷酸化模拟突变体BRAF Ser729D，并检测其与NANOG的相互作用。我们的数据显示Ser729到Asp的突变(S729D)完全阻断了NANOG和BRAF之间的相互作用(图25)，表明Ser729对于它与NANOG的相互作用是必不可少的。重要的是，我们的数据显示Ser729处的BRAF突变失去了稳定细胞内NANOG的能力(图26)。

功能上，BRAF抑制剂SB590885抑制DU145细胞的球形形成和细胞增殖(图27)。此外，SB590885导致表达WT-NANOG的DU145细胞球状结构明显减少，但不表达NANOGS68Y的细胞球状结构明显减少，表明BRAF主要通过SPOP调控PCa干细胞特性(图28)。综上所述，这些结果表明BRAF在Ser68直接磷酸化NANOG，并且通过破坏SPOP和NANOG之间的相互作用来增加PCa细胞的自我更新能力和细胞增殖(图29)。

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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第十人民医院

<120> 一种NANOG Ser68的抗体，以及抑制剂和应用

<130> /

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Asp Leu Leu Ile Gln Asp Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser Pro Lys

1               5                   10                  15

Gly Lys Gln Pro

            20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaattcatg agtgtggatc cagcttg 27

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgctcgagt cacacgtctt caggttgcat g 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagccctgat gattccacca gtcccaaag 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctggtggaat catcagggct gtcctgaat 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgcagtgca gatgaaccct ccttgaatc 29

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaggagggt tcatctgcac tgcggtgaat ttttgg 36

<210> 8

<211> 2301

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggcggcgc tgagcggtgg cggtggtggc ggcgcggagc cgggccaggc tctgttcaac 60

ggggacatgg agcccgaggc cggcgccggc gccggcgccg cggcctcttc ggctgcggac 120

cctgccattc cggaggaggt gtggaatatc aaacaaatga ttaagttgac acaggaacat 180

atagaggccc tattggacaa atttggtggg gagcataatc caccatcaat atatctggag 240

gcctatgaag aatacaccag caagctagat gcactccaac aaagagaaca acagttattg 300

gaatctctgg ggaacggaac tgatttttct gtttctagct ctgcatcaat ggataccgtt 360

acatcttctt cctcttctag cctttcagtg ctaccttcat ctctttcagt ttttcaaaat 420

cccacagatg tggcacggag caaccccaag tcaccacaaa aacctatcgt tagagtcttc 480

ctgcccaaca aacagaggac agtggtacct gcaaggtgtg gagttacagt ccgagacagt 540

ctaaagaaag cactgatgat gagaggtcta atcccagagt gctgtgctgt ttacagaatt 600

caggatggag agaagaaacc aattggttgg gacactgata tttcctggct tactggagaa 660

gaattgcatg tggaagtgtt ggagaatgtt ccacttacaa cacacaactt tgtacgaaaa 720

acgtttttca ccttagcatt ttgtgacttt tgtcgaaagc tgcttttcca gggtttccgc 780

tgtcaaacat gtggttataa atttcaccag cgttgtagta cagaagttcc actgatgtgt 840

gttaattatg accaacttga tttgctgttt gtctccaagt tctttgaaca ccacccaata 900

ccacaggaag aggcgtcctt agcagagact gccctaacat ctggatcatc cccttccgca 960

cccgcctcgg actctattgg gccccaaatt ctcaccagtc cgtctccttc aaaatccatt 1020

ccaattccac agcccttccg accagcagat gaagatcatc gaaatcaatt tgggcaacga 1080

gaccgatcct catcagctcc caatgtgcat ataaacacaa tagaacctgt caatattgat 1140

gacttgatta gagaccaagg atttcgtggt gatggaggat caaccacagg tttgtctgct 1200

accccccctg cctcattacc tggctcacta actaacgtga aagccttaca gaaatctcca 1260

ggacctcagc gagaaaggaa gtcatcttca tcctcagaag acaggaatcg aatgaaaaca 1320

cttggtagac gggactcgag tgatgattgg gagattcctg atgggcagat tacagtggga 1380

caaagaattg gatctggatc atttggaaca gtctacaagg gaaagtggca tggtgatgtg 1440

gcagtgaaaa tgttgaatgt gacagcacct acacctcagc agttacaagc cttcaaaaat 1500

gaagtaggag tactcaggaa aacacgacat gtgaatatcc tactcttcat gggctattcc 1560

acaaagccac aactggctat tgttacccag tggtgtgagg gctccagctt gtatcaccat 1620

ctccatatca ttgagaccaa atttgagatg atcaaactta tagatattgc acgacagact 1680

gcacagggca tggattactt acacgccaag tcaatcatcc acagagacct caagagtaat 1740

aatatatttc ttcatgaaga cctcacagta aaaataggtg attttggtct agctacagtg 1800

aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt gaacagttgt ctggatccat tttgtggatg 1860

gcaccagaag tcatcagaat gcaagataaa aatccataca gctttcagtc agatgtatat 1920

gcatttggaa ttgttctgta tgaattgatg actggacagt taccttattc aaacatcaac 1980

aacagggacc agataatttt tatggtggga cgaggatacc tgtctccaga tctcagtaag 2040

gtacggagta actgtccaaa agccatgaag agattaatgg cagagtgcct caaaaagaaa 2100

agagatgaga gaccactctt tccccaaatt ctcgcctcta ttgagctgct ggcccgctca 2160

ttgccaaaaa ttcaccgcag tgcagatgaa ccctccttga atcgggctgg tttccaaaca 2220

gaggatttta gtctatatgc ttgtgcttct ccaaaaacac ccatccaggc agggggatat 2280

ggtgcgtttc ctgtccactg a 2301

Claims (2)

1.一种能够特异性识别第68位丝氨酸磷酸化的NANOG的抗体，其特征在于，所述抗体是使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示且SEQ ID NO:1的第11位丝氨酸发生了磷酸化的多肽免疫动物制备的抗血清。

2.根据权利要求1所述的能够特异性识别第68位丝氨酸磷酸化的NANOG抗体的制备方法，其特征在于，使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示且SEQ ID NO:1的第11位丝氨酸发生了磷酸化的多肽免疫动物，制备抗血清。

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