KR101771070B1

KR101771070B1 - Mrs와 cdk4의 결합을 저해하는 항암제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101771070B1
Application number: KR1020150159368A
Authority: KR
Inventors: 권남훈; 이진영; 김성훈
Original assignee: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date: 2015-11-13
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2017-08-24
Also published as: WO2017082494A1; KR20170056146A

Abstract

본 발명은 MRS와 CDK4의 결합을 저해하는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편과 CDK4(Cyclin-dependent kinase 4) 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계; MRS와 CDK4의 결합을 측정하는 단계; 시험 물질에 의한 MRS와 CDK4의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계; MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포나 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법과 상기 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 대한 것이다.
본 발명은 MRS가 암 발생과 진행에 중요한 CDK4와 직접 결합하여 안정화시키는 CDK4의 신규한 조절자라는 발견을 바탕으로 전혀 새로운 작용 기작의 항암제를 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물은 MRS의 발현을 억제하거나 MRS와 CDK4의 결합을 억제하여 CDK4 단백질의 수준을 낮추고, 암의 진행을 효과적으로 막을 수 있는, 특히 p16^INK4a를 발현하지 않는 암 치료제를 개발하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

MRS와 CDK4의 결합을 저해하는 항암제 스크리닝 방법{Methods for screening anti-cancer agents inhibiting interactions between MRS and CDK4}

본 발명은 MRS와 CDK4의 결합을 저해하는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편과 CDK4(cyclin-dependent kinase 4) 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계; (b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 MRS와 CDK4의 결합을 측정하는 단계; (c) 시험 물질 존재하에서의 MRS와 CDK4의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 MRS와 CDK4의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 MRS와 CDK4의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계; (d) MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및 (e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법과 상기 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 대한 것이다.

메치오닐 티알엔에이 합성효소(methionyl-tRNA synthetase, MRS)는 번역을 위한 개시자(initiator) 및 연장자(elongator) tRNA^Met에 메치오닌을 결합하는 필수적인 효소이다. Met-tRNA^Met는 단백질 중합 반응의 개시 및 폴리펩티드의 연장에 반드시 필요하기 때문에, 번역 뿐 아니라 잠재적으로 다른 생물학적 과정을 조절하는 결정적인 위치에 있다. 예를 들어, MRS는 산화 스트레스에 반응하여 tRNA에 대한 특이성을 조절하고 합성 중인 폴리펩티드 사슬에 더 많은 메치오닌이 삽입되도록 하여, 증가한 메치오닌이 활성산소종을 제거할 수 있도록 한다(Lee et al., 2014; Wiltrout et al., 2012). UV를 조사하면, MRS의 효소 활성은 S662 위치가 GCN2 의존적으로 인산화되면서 억제되고 번역의 개시 반응이 저해된다(Kang et al., 2012; Kwon et al., 2011). MRS가 인산화되면, MRS에 결합하고 있는 종양억제자인 AIMP3와 분리되며, 분리되어 나온 AIMP3는 DNA 를 복구하기 위하여 핵 안으로 이동한다. 이러한 맥락에서 MRS는 UV 조사에 의한 DNA 손상 반응과 번역 억제를 조정하는 링커의 역할을 하는 것으로 볼 수 있다(Kwon et al., 2011). 이같은 실험 결과는 MRS가 다양한 세포 자극에 반응하여 세포질과 핵의 생물학적 과정을 조정하는 능력이 있음을 시사한다.

세포 주기를 조절하는 데 있어서, Cyclin과 Cyclin 의존성 키나아제(CDK)들이 시기적절하게 복합체를 형성하고 활성화 및 비활성화되는 것이 매우 중요하다. D형 Cyclin, 특히 Cyclin D1과의 복합체를 형성하는 CDK4와 CDK6는 G1/S 세포 주기의 전이를 담당하고, 성장과 휴지에 관한 결정에 중요하게 관여한다(Musgrove et al., 2011). 세포 주기의 정지를 조절하는 데 두 종류의 CDK 억제제가 중요한 역할을 한다. 이들 두 가지 유형은 INK4 유형(p16^INK4a, p15^INK4b, p18^INK4c, p19^INK4d)과 KIP/CIP 유형(p21^CIP1 ^/ ^WAF1, p27^KIP1, p57^KIP2)이다(Sherr and Roberts, 1995; Witkiewicz et al., 2011; Zou et al., 2002). KIP/CIP형 억제제가 광범위한 CDK 그리고 Cyclin과 3중 복합체(ternary complex)를 형성하는 반면에, INK4형 억제제는 CDK4 또는 CDK6와 특이적으로 결합하고, CDK4/6와 Cyclin D의 복합체 형성을 억제한다(Franklin et al., 1998).

CDK4는 Ras에 의해 활성화되는 마우스 배아 섬유세포(mouse embryonic fibroblast)의 암세포로의 변이, Erbb2 또는 Hras에 의한 유선의 종양 형성, 발암 물질과 Myc으로 유발되는 피부암에서 매우 중요하게 작용하는 것으로 보고된 바 있다(Berthet and Kaldis, 2007; Malumbres and Barbacid, 2009; Reddy et al., 2005; Yu et al., 2006; Zou et al., 2002). 또한, CDK4-Cyclin D1 복합체는 유방암을 발병하게 하고, 확산시키는 데에 충분하다(Yu et al., 2006). 이러한 연구 결과는 암에서의 CDK4의 중요성을 강하게 입증하지만, 어떠한 기작을 통해 CDK4의 수준이 암에서 높게 유지되는지는 완전히 이해되어 있지 않다.

따라서 세포 주기를 이상 조절하여 암의 발생과 진행에 중요한 역할을 하는 CDK4의 활성을 조절할 수 있는 분자적 기작을 보다 구체적으로 밝히고, 이를 바탕으로 CDK4를 억제하는 신규한 작용 기작의 항암제를 개발해야할 필요가 있다.

이에 본 발명자들은 MRS가 CDK4에 직접 결합하여 CDK4 단백질을 안정화시키고 세포 주기가 원활하게 진행될 수 있도록 하는 기능이 있으며, MRS와 CDK4의 결합을 억제하면 세포 주기가 진행되지 않아 암 세포의 분열과 증식을 억제할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

(a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편과 CDK4(cyclin-dependent kinase 4) 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계;

(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 MRS와 CDK4의 결합을 측정하는 단계;

(c) 시험 물질 존재하에서의 MRS와 CDK4의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 MRS와 CDK4의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 MRS와 CDK4의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계;

(d) MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및

(e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

상기 항암제 스크리닝의 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

상기 항암제 스크리닝의 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

(a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 MRS ( methionyl - tRNA synthetase ) 또는 이의 단편과 CDK4( cyclin - dependent kinase 4) 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계;

(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 MRS 와 CDK4 의 결합을 측정하는 단계;

(c) 시험 물질 존재하에서의 MRS 와 CDK4 의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 MRS 와 CDK4의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 MRS 와 CDK4 의 결합 수준의 변화를 판단하 는 단계;

(d) MRS 와 CDK4 의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및

(e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명자들은 MRS가 단백질 번역에서 수행하는 원래의 기능 외에, CDK4에 결합하여 CDK4 단백질을 분해되지 않도록 안정화시키고, CDK4로 인한 세포 주기 진행이 원활하게 진행할 수 있도록 하는 새로운 기능이 있음을 발견하였다. MRS의 발현을 억제하여 CDK4와 반응할 수 있는 MRS의 수준을 감소시키거나, MRS와 CDK4의 반응을 직접 저해할 수 있는 인자들은 CDK4 단백질 수준을 감소시키며, 결과적으로 세포가 분열하지 못하고 G0/G1 세포 주기에 정지되어 있도록 한다. MRS와 CDK4의 결합이 억제되면 암 세포의 증식과 종양 성장이 억제되며, 특히 암 환자에서도 MRS와 CDK4 발현 수준 사이에 강한 상관관계가 있고, MRS의 수준이 암 진행의 예후에도 연관되어 있음이 관찰되었다. 본 발명자들은 이 같은 MRS와 CDK4의 기능적인 관계에 대한 발견을 바탕으로 MRS와 CDK4의 결합을 저해할 수 있는 제제를 스크리닝하여 항암제로 선별할 수 있는 항암제 스크리닝 방법을 본 명세서에서 처음으로 공개한다.

상기 (a) 단계는 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편과 CDK4(cyclin-dependent kinase 4) 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계이다.

본 발명에서 ‘단백질’은 ‘폴리펩타이드(polypeptide)’ 또는 ‘펩타이드(peptide)’와 호환성있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 상기 ‘단편’은 단백질의 일부분을 의미한다. 또한 본 발명에서 ‘폴리뉴클레오티드(polynucleotide)’ 또는 ‘핵산’은 단일- 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 폴리펩티드를 형성하는 리보솜으로 전달하는 RNA이다.

본 발명에서 ‘MRS(methionyl-tRNA synthetase)’는 메치오닌 아미노산을tRNA에 연결시키는 역할을 하는 메치오닐 티알엔에이 중합효소를 의미한다. 인간에서는 MARS 유전자에 암호화되어 있으며, MRS의 서열 정보는 NM_004990(mRNA), NP_004981.2, P56192.2(단백질) 등의 Genbank accession number로 공지되어 있다. 인간의 MRS 단백질은 900개의 아미노산으로 구성되어 있으며, N-말단부터 시작하여 GST-like domain(1 내지 266번째 아미노산), catalytic domain(267 내지 598번째 아미노산), tRNA binding domain(599 내지 900번째 아미노산)으로 구분될 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 MRS 단백질은 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간의 MRS 단백질 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한 상기 MRS의 단편은 MRS에서 CDK4와의 결합에 필요한 부분을 포함하는 단편을 의미한다. 본 발명자들은 MRS의 catalytic domain과 tRNA binding domain이 CDK4와 결합할 수 있으며, GST-like domain은 결합을 저해하는 것을 도메인 맵핑(domain mapping) 방법으로 확인하였다. 나아가 MRS의 catalytic domain에서는 메치오닌 활성화 반응(메치오닌에 ATP를 결합시키고 pyrophosphate를 방출하는 반응)이 일어나는 부분, 구체적으로는 인간의 MRS 단백질 아미노산 서열의 596번째 라이신(K596)이 MRS와 CDK4의 결합에 필수적이라는 것을 밝혔다. 따라서 본 발명을 실시하기 위한 MRS의 단편은 서열번호 1로 표시되는 인간의 MRS 아미노산 서열에서 596번째 라이신(K596)을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 1의 서열에서 1 내지 266번째 아미노산 서열에 해당하는 GST-like domain(서열번호 3)은 포함하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에서 ‘CDK4(cyclin-dependent kinase 4)’는 cell division protein kinase 4로도 알려져 있는 사이클린 의존성 키나아제로, Ser/Thr protein kinase family에 속하며, 세포 주기에서 G1/S의 진행에 중요하다. CDK4는 D type cyclin에 의해 활성이 G1/S 주기에만 발휘되도록 조절되며 p16^INK4a에 의해 활성이 억제된다. CDK4가 인산화하는 단백질로 retinoblastoma protein(Rb)이 있다. 인간의 CDK4는 CDK4 유전자에 암호화되어 있으며, 서열정보는 NM_000075.3(mRNA), NP_000066.1(단백질) 등의 Genbank accession number로 공지되어 있다.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 CDK4 단백질은 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에서 유래한 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 13으로 표시되는 인간의 야생형(WT) CDK4 단백질의 아미노산 서열 또는 서열번호 15로 표시되는 인간의 CDK4 R24C 돌연변이 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CDK4 R24C 돌연변이는 CDK4 아미노산 서열의 24번째 아르기닌이 시스테인으로 치환된 CDK4의 내재적인 억제자인 p16^INK4a와 결합하지 않는 돌연변이이다. 본 발명에 따르면 MRS가 야생형 CDK4 뿐 아니라, CDK4 R24C 돌연변이와도 직접 결합한다.

또한 상기 CDK4의 단편은 MRS와의 결합에서 필요한 부분을 포함하는 단편을 의미한다. 본 발명자들은 MRS가 CDK4의 N-말단 부위에 결합하는 것을 확인하였다. 구체적으로는 인간 CDK4의 아미노산 서열(서열번호 13)에서 1 내지 102번째 아미노산(서열번호 17)을 포함하는 단편이 MRS와 결합할 수 있음을 밝혔다. 따라서 본 발명을 실시하기 위한 CDK4의 단편은 서열번호 13에서 1 내지 102번째 아미노산 서열(서열번호 17)을 포함하는 단편일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 MRS 또는 이의 단편, 그리고 CDK4 또는 이의 단편은 이들의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 ‘기능적 동등물’이란 상기 MRS와 이의 단편, 그리고 CDK4 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 MRS와, 서열번호 13으로 표시되는 CDK4의 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서‘실질적으로 동질의 생리활성’이란 야생형 MRS와 야생형 CDK4 사이의 직접적이고 특이한 결합을 재현할 수 있는 것을 의미한다. 즉, MRS의 단편의 기능적 동등물은 전체 길이의 CDK4 또는 그 단편에 결합할 수 있는 활성을 갖는 것으로, 특히 인간 MRS의 K596 또는 이에 대응되는 위치에 라이신 아미노산을 포함하는 것이며, CDK4의 단편의 기능적 동등물이란 전체 길이의 MRS 또는 MRS에서 CDK4에 결합하는 부위에 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물은 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실된 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 MRS 또는 CDK4 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조 변경이 이에 포함된다.

본 발명의 방법에서 ‘접촉(contacting)’은 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예를 들어, 2개의 폴리펩티드)를 결합시키거나, 제제와 세포(예를 들어, 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다. 또한 테스트하고자 하는 단백질이 고정상의 표면에 배열된 단백질 칩(protein chip)이나 단백질 어레이(protein array)를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법을 세포 안에서 실시할 때에는 MRS와 CDK4는 세포 내재적으로 발현되는 것을 이용하거나, MRS나 이의 단편, CDK4 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하여 형질전환시킴으로써 과발현되도록 하여 실시할 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 시험관 내 또는 단백질 어레이와 같은 in situ로 실시할 때에는 MRS 또는 이의 단편, 그리고 CDK4 또는 이의 단편은 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의하여 제작하여 준비할 수 있다. 예를 들어 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산과 재조합 발현 벡터를 제작하고 적절한 숙주세포에서 발현시켜 수득할 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 실시하는데 필요한 상기 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법으로도 제작될 수 있다.

또한 본 발명의 방법에서 ‘시험 물질’은 시험 제제(test agent) 또는 제제(agent)와 호환가능하게 사용할 수 있는 것으로, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.

구체적으로 본 발명의 방법을 통해 선별되는 항암제는 MRS와 CDK4의 단백질 결합을 저해하거나, CDK4와 결합할 수 있는 MRS 단백질 발현 수준을 낮출 수 있는 것이라면 물질의 특성에 제한 받지 않으며, 예를 들어 메치오닌 아미노산 유사체, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 천연추출물 및 화학물질 등일 수 있다. 바람직하게는 MRS의 발현을 낮출 수 있는 shRNA 또는 siRNA, 그리고 MRS의 CDK4 결합 활성을 억제하는 메치오닌 유사체 등의 형태일 수 있다. 상기 ‘유사체(mimetics 또는 analog)’는 표준 물질(reference molecule)과 구조적으로 유사하지만, 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 유사체는 표준 물질과 비교할 때 당업자에 의해 예상될 수 있는 바와 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성(utility)을 갖는다.

상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 접촉시킨 MRS와 CDK4의 결합을 측정하는 단계이다.

상기 MRS와 CDK4의 결합을 측정하는 단계는 두 단백질의 결합 정도를 측정하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이라면 제한없이 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 투 하이브리드(two hybrid) 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay, co-IP), 조직면역염색과 공동국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay, SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis, BIA), 질량 분석법(mass spectrometry, MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관 내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 단백질 칩(protein chip) 또는 어레이(array), Venus BiFC(biomolecular fluorescence complementation, BiFC) 등에서 적절히 선택하여 MRS와 CDK4 사이의 결합을 측정할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 세포 내에 HA, Strep, 방사성 동위원소 등으로 적절하게 표지된 MRS와 CDK4를 과발현시켜 co-IP 실험을 실시하거나, GST pull-down 실험을 이용하여 MRS에 결합하고 있는 CDK4 단백질의 수준을 측정하거나, 반대로 CDK4에 결합하고 있는 MRS의 단백질의 수준을 측정하였다. 또한 세포 안에서 MRS와 CDK4가 결합하는 양상을 두 단백질의 결합에 의한 Venus 형광 보완(fluorescent complementation) 방법인 BiFC 방법을 이용하여 관찰하였다.

상기 (c) 단계는 (b)에서 측정한 시험 물질 존재하에서의 MRS와 CDK4의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 MRS와 CDK4의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 MRS와 CDK4의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계이다.

즉, (b) 단계에서 도출된 시험 물질 존재 또는 부존재하에서 접촉시킨 MRS와 CDK4의 단백질의 결합 수준의 차이를 파악하여 시험 물질이 MRS와 CDK4의 결합에 미치는 영향을 판단하는 단계이다.

상기 (d) 단계는 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계이다.

본 발명자들은 구체적인 실시예에서 MRS와 CDK4는 세포 안에서 특이적으로 직접 결합하며, MRS와의 결합을 통하여 CDK4는 분해되지 않도록 안정화되고, 결과적으로 CDK4에 의한 세포 주기의 진행이 원활하게 이루어지는 것을 다양한 세포 실험을 통하여 확인하였다. CDK4 단백질의 안정화는 MRS 단백질과의 직접적인 결합을 통하여 이루어지는 것으로, CDK4 단백질이 MRS 단백질에서 해리되면 CDK4 단백질이 불안정해지고 분해되어 그 수준이 감소하게 되고, 결과적으로 CDK4가 담당하던 세포 주기가 진행하지 못하여 세포들이 분열하지 못하고 G0/G1 주기에 정지해 있게 된다. 이 같은 효과는 MRS의 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA, 그리고 MRS와 CDK4 단백질의 결합을 저해하는 메치오닌의 유사체이자 활성 억제제인 FSMO를 이용하여 확인할 수 있었다. MRS와 CDK4 사이의 결합을 억제함으로써 세포 분열을 저해할 수 있으므로, 비정상적으로 세포 분열하는 암세포의 발생과 증식을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

또한 다른 실시예에서는 종양 발생 관련 세포 실험과 이종이식(xenograft)의 동물 실험을 통하여 MRS의 발현 수준을 억제하면 CDK4 단백질 수준이 감소하며, 암 세포의 증식, 종양의 형성과 성장이 억제되는 것을 확인하였고, 유방암 환자의 종양 조직의 단백질 발현 분석 결과는 MRS가 CDK4 단백질과의 상호작용을 통해 암의 발생 또는 암의 예후와 밀접하게 관련되어 있음을 보여주었다.

이상의 본 발명자들의 발견을 통하여 당업자는 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 물질이 CDK4를 불안정하게 하여 세포 주기 진행을 억제함으로써 항암 활성을 가질 수 있음을 이해할 수 있다. 상기 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 물질은 대표적으로 MRS와 CDK4의 결합 자체를 저해하는 물질 또는 CDK4와 결합 가능한 MRS 단백질의 양을 감소시키는 물질일 수 있다. 본 발명의 항암제 스크리닝 방법에 따라 선별된 항암제에 대한 구체적인 예는 본 발명에 따른 항암용 조성물에 대한 설명에 서술되어 있다.

상기 (e) 단계는 (d) 단계에서 선별된 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계이다.

(e) 단계는 (d) 단계에서 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 것으로 선별된 시험 물질이 구체적으로 암 또는 종양 모델의 세포 또는 동물에서 CDK4 단백질의 불안정화로 예측되는 항암 활성을 갖는지 확인하는 단계이다. 상기 항암 활성은 비정상적인 세포 분열의 증가, 정상 세포에서 암 세포로의 전환, 암 세포의 세포 분열과 증식, 종양의 발생과 성장 등을 억제하는 것을 의미한다.

상기 암 또는 종양 모델의 세포 또는 동물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이면 적절히 선택하여 (d) 단계에서 선별된 물질의 항암 활성을 확인해 볼 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 부착 비의존성 연한천 방법(anchorage independent soft agar assay)를 이용하여 세포의 발암성(transformability)을 측정하였고, 인간의 암 세포주를 마우스에 주입하는 이종이식(xenograft)을 이용하여 체내 종양의 발생과 형성 과정을 관찰한 바 있다.

본 발명에 따른 항암제 스크리닝 방법은 상기 (d)와 (e) 단계 사이에 추가적으로

(1) 시험 물질을 CDK4를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;

(2) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CDK4 단백질 수준을 측정하는 단계; 및

(3) 대조군 세포와 비교하여 CDK4 단백질 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계를 실시할 수 있다.

본 발명에 따르면 CDK4가 분해되지 않도록 안정화하는 데에는 MRS와의 직접적인 결합이 필요하기 때문에 MRS와 CDK4의 결합 수준이 감소하면 CDK4의 단백질 수준이 감소할 것임을 이해할 수 있다. 상기 (1) 내지 (3)의 단계는 (d) 단계에서 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 것으로 선별된 시험 물질이 CDK4 단백질 수준을 감소시키지 여부를 추가적으로 확인하는 것이다. 상기 추가적인 단계는 (d) 단계에서 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 제제로서 선별되었으나 위음성(false-positive)인 경우, 또는 MRS와 CDK4의 결합을 저해하는 수준이 CDK4의 불안정화를 야기하는데 부족한 경우를 판단하여 제거하기 위하여 실시할 수 있다.

상기 (1) 단계에서는 (d) 단계에서 선별된 시험 물질을 CDK4를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계이다.

상기 CDK4를 발현하는 세포는 CDK4를 내재적으로 발현하는 세포일 수도 있고, CDK4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 CDK4를 과발현하는 세포일 수도 있다. 예를 들어, CDK4를 발현하는 다양한 암 세포주 중에서 적절하게 선택하여 시험 물질의 CDK4 불안정화 효과를 검증할 수 있다. 상기 ‘접촉’의 의미는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 (2) 단계는 (1) 단계에서 시험 물질과 접촉한 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CDK4 단백질 수준을 측정하는 단계이다.

상기 CDK4 단백질 수준을 측정하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 단백질 검출 방법을 제한없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침강법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩(chip) 방법 등을 사용할 수 있다.

상기 (3) 단계는 대조군 세포와 비교하여 CDK4 단백질 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계이다.

상기 (3) 단계는 앞서 (2) 단계에서 측정한 시험 물질을 접촉한 세포와 접촉하지 않은 대조군 세포에서 측정한 CDK4 단백질 수준을 비교하고, CDK4 단백질 수준이 실제로 감소한 것으로 나타난 시험 물질을 추가적으로 선별하게 된다.

본 발명에 따른 항암제 스크리닝 방법을 실시하기 위한 세포는 p16^INK4a를 발현하지 않는 것이 바람직하다.

상기 p16^INK4a는 세포에서 내재적으로 발현되어 CDK4의 활성을 억제하는 동시에 CDK4를 안정화시키는 단백질이다. 본 발명자들은 실시예에서 p16^INK4a가 MRS와 경쟁적으로 결합하는 것을 확인하였다. p16^INK4a와 MRS는 CDK4에서 동일한 아미노산 위치에 결합하지는 않지만, 경쟁적으로 결합할 정도로 CDK4 상에서 유사하거나 가까운 거리에서 결합할 것으로 판단된다. p16^INK4a가 CDK4와 결합하면 CDK4 활성에 필요한 Cyclin D1과의 결합을 저해하지만, MRS는 CDK4와 Cyclin D1의 결합을 저해하지 않는 것으로 보아 결합의 기능적인 성격은 상이한 것으로 판단된다.

그럼에도 p16^INK4a는 MRS와 경쟁적으로 CDK4와 결합하기 때문에, p16^INK4a가 높은 수준으로 존재하는 환경에서는 MRS와 CDK4의 결합 효율이 상대적으로 떨어지게 되며, MRS와 CDK4의 결합 억제로 인한 CDK4 단백질 수준 감소의 효과가 발휘되기 어려운 점이 있다. 본 발명의 실시예에서도 MRS 발현 억제로 인한 CDK4 단백질의 불안정화 효과가 p16^INK4a를 발현하지 않는 세포에서 더욱 분명하게 나타나는 것으로 관찰한 바 있다. 따라서 본 발명의 방법을 실시하기 위한 세포는 p16^INK4a를 발현하지 않는 세포인 것이 바람직하다.

상기 p16^INK4a를 발현하지 않는 세포는 세포에서 본래 p16^INK4a를 발현하지 않는 세포이거나, 또는 p16^INK4a를 발현하지만 유전자 변이 또는 조작 등의 이유로 p16^INK4a를 현하지 않는 세포일 수도 있고, p16^INK4a의 발현을 억제하기 위한 siRNA 또는 shRNA로 형질전환한 세포일 수도 있다. p16^INK4a를 내재적으로 발현하지 않는 세포로서, MRS와 CDK4의 결합 억제로 인한 CDK4 단백질 수준의 감소 효과를 확인할 수 있는 세포로는 구체적으로는 A549, H460, H1299(이상 폐암 유래 세포주), MDA-MB-231, MDA-MB-453, BT20, T47D, MCF7(이상 유방암 유래 세포주), HT-29, SW620, HCT116(이상 결장암(colon cancer) 유래 세포주) 등이 있다.

앞서 서술한 것과 동일한 이유로, 본 발명의 방법에 따른 항암제의 스크리닝 방법은 MRS와 경쟁적으로 CDK4에 결합하는 p16^INK4a를 발현하지 않는 암을 대상으로 하는 것이 바람직하다.

상기 p16^INK4a를 발현하지 않는 암은 구체적으로는 유방암, 폐암, 결장암, 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 자궁경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 경구암, 중피종, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 신장암, 위암, 피부암, 기저세포암, 흑색종, 편평세포암종, 구강편평세포암종, 대장직장암, 교모세포종, 자궁내막암 및 악성뇌교종으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 유방암, 폐암 또는 결장암일 수 있다.

한편 본 발명자들은 MRS와 p16^INK4a가 CDK4에 경쟁적으로 결합하는 것을 밝히는 과정에서 MRS가 야생형 CDK4 뿐 아니라 p16^INK4a의 조절을 받지 않는 CDK4 R24C 돌연변이에도 직접 결합하는 것을 발견하였다. CDK4 R24C 돌연변이는 CDK4 아미노산 서열의 24번째 아르기닌이 시스테인으로 치환된 것으로, p16^INK4a와 결합하지 못하고 항상 인산화 활성을 갖으며, 인간의 피부암 조직에서 관찰된 바 있다. 또한 R24C 돌연변이가 마우스에서 발현되면, 짧은 기간 동안 육종, 내분비 계통의 암, 상피세포 암, 폐암, 간암, 림프종 등 다양한 종류의 암을 유발하는 것이 관찰되었다(Sotillo et al., 2001).

MRS가 CDK4 R24C에 결합하므로, MRS의 발현을 저해하거나 MRS와 CDK4 R24C의 결합을 저해하는 제제를 이용하면 p16^INK4a의 조절을 받지 않는 CDK4 R24C의 활성을 억제할 수 있음을 알 수 있다. 즉, CDK4가 R24C로 돌연변이된 피부암을 비롯한 상기 다양한 종류 암에 대하여 MRS와 CDK4 R24C의 결합을 이용한 새로운 치료 전략을 시도할 수 있는 것이다. CDK4 R24C는 p16^INK4a와 결합하지 않기 때문에, 앞서 서술한 야생형 CDK4의 경우와는 달리 MRS에 의한 조절 효과가 p16^INK4a의 발현 여부에 영향을 받지 않을 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 항암제 스크리닝의 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 선별된 항암제는 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키고, CDK4 단백질을 불안정화하여 세포 주기 진행을 억제할 수 있는 것이라면 물질의 특성에 특별한 제한을 받지 않으나, 작용 기작에 따라 대표적으로 MRS와 CDK4 두 단백질의 결합 자체를 저해하는 물질 또는 MRS의 발현을 억제하여 CDK4와 결합가능한 MRS 단백질의 수준을 낮추는 물질을 생각해 볼 수 있다.

본 발명의 방법으로 선별된 항암제는 구체적으로는 메치오닌 아미노산 유사체, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 천연추출물 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명자들은 MRS에 특이적인 siRNA(si-MRS) 또는 shRNA(sh-MRS)를 사용하여 유방암 세포주 또는 폐암 세포주에서 MRS의 발현을 억제하면 MRS에 결합한 CDK4의 수준이 감소하고, CDK4 단백질이 분해되어 감소하며, 결과적으로 CDK4에 의한 세포 주기 진행이 억제되어 BrdU 삽입율의 감소와 G0/S기 세포 주기 정지(arrest) 등의 현상이 나타나는 것을 확인하였다. 이 같은 MRS 발현 억제제의 효과는 p16^INK4a가 존재하지 않는 조건에서 더욱 분명하게 관찰되었다.

나아가 MRS의 발현이 억제된 MDA-MB-231 유방암 세포는 부착 비의존성 연한천 실험에서 MRS의 발현이 억제되지 않은 대조군 유방암 세포와 비교하여 세포 부착에 의존하지 않고 증식하는 암 세포의 형질이 현저하게 낮았으며, 이종이식으로 마우스에 주입되었을 때에는 종양의 성장 속도가 크게 감소하였다. 이는 siRNA 또는 shRNA 등 MRS의 발현을 억제할 수 있는 제제는 암 질환의 예방과 치료에 효과적으로 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.

따라서 본 발명에 따른 항암제 스크리닝으로 선별된 항암제는 MRS 특이적인 siRNA 또는 shRNA일 수 있다. 상기 siRNA 또는 shRNA는 MRS mRNA에 특이적으로 결합하여 mRNA의 분해를 유도할 수 있는 10 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 바람직하게는 서열번호 19로 표시되는 염기서열로 이루어진 siRNA 또는 서열번호 21로 표시되는 염기서열로 이루어진 shRNA일 수 있다.

또한 본 발명자들은 MRS와 CDK4의 결합을 억제할 수 있는 메치오닌 유사체(mimetics)가 CDK4를 불안정화시키는 효과가 있음을 확인하였다. 시판 중인 13종의 메치오닌 유사체 중에서 단백질 번역 억제 효과와 CDK4 단백질 감소 효과를 바탕으로 선별한 FSMO는 MRS에 특이적인 활성 억제제이며, 특히 ATP를 메치오닌에 결합시키고 PPi(pyrophosphate)를 방출하는 MRS의 아미노아실레이션(aminoacylation) 활성을 억제하는 것으로 확인되었다. 상기 aminoacylation 반응은 메치오닌을 tRNA에 결합시키기 전 활성화시키는 단계로서, FSMO가 MRS의 메치오닌 활성화 반응을 억제하는 것은 MRS와 CDK4의 결합을 억제하는 데 중요한 의미가 있다. 본 발명자들이 CDK4와 MRS 결합의 도메인 맵핑(domain mapping)과 MRS 아미노산 치환 돌연변이 실험을 통해 밝힌 바와 같이, 메치오닌 활성화 반응에 중요하게 관여하는 596번째 라이신(K596)이 CDK4과 MRS의 결합에 필수적이기 때문이다. 즉, MRS에서 메치오닌 활성화에 중요한 부분, 특히 K596에 결합하는 물질 또는 메치오닌 활성화 반응을 저해하는 물질 등은 본 발명의 항암제로 선별될 가능성이 큰 물질들이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 FSMO는 MRS와 CDK4의 결합을 직접 저해하는 것을 pull-down, co-IP, BiFC 등 다양한 in vitro 또는 세포 실험으로 확인하였으며, FSMO를 처리한 세포는 MRS의 발현이 억제된 세포와 유사하게 BrdU 삽입율이 현저하게 감소하고, 세포 주기가 정지하는 등 세포 분열이 원활하게 일어나지 않음을 관찰하였다.

따라서 본 발명에 따른 항암제 스크리닝으로 선별된 항암제는 MRS에 결합하여 CDK4와의 결합을 저해할 수 있는 메치오닌 유사체일 수 있으며, 구체적으로는 Boc-S-trityl-L-homocysteine, Fmoc-DL-selenomethionine, Fmoc-DL-ethionine, Fmoc-Sec(Mob)-OH(FSMO), Fmoc-α-methyl-DL-methionine 등에서 선택된 것일 수 있고, 바람직하게는 Fmoc-Sec(Mob)-OH(FSMO)일 수 있다.

본 발명에 따른 항암용 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 내 투여일 수 있으며, 바람직하게는 혈관 내 투여일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성 성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

본 발명의 항암용 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강흡입제의 형태로 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아, 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피투여’는 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입투여제의 경우, 본 발명에 따른 조성물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한 본 발명에 따른 항암용 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 수크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 항암용 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다양하게 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 암 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 MRS가 암 발생의 주요 원인 단백질 중의 하나인 CDK4와 직접 결합하여 안정화시킨다는 발견을 바탕으로 MRS 또는 이의 단편과 CDK4 또는 이의 단편을 이용하여 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 물질을 항암제로 선별하는 항암제 스크리닝 방법과 상기 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 MRS의 발현을 억제하는 siRNA, shRNA 등의 제제, 그리고 MRS와 CDK4의 결합을 억제하는 메치오닌 유사체 등은 특히 p16^INK4a를 발현하지 않는 암에서 CDK4 단백질의 수준을 낮추고 암의 발생과 진행을 억제하는 효과가 뛰어나다.

도 1은 MRS의 발현을 억제하거나 메치오닌을 결핍시킨 조건에서 세포 주기 진행을 확인하는 실험 결과를 나타낸다.
도 1A는 MRS에 대한 shRNA(sh-MRS) 또는 대조군 shRNA(sh-Cont)를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포의 BrdU 삽입율(incorporation, 왼쪽 패널)과 PI 염색과 유세포분석을 이용한 세포 주기 분석 결과를 나타낸다(Proportion of cells(%), 오른쪽 패널). 데이터는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표시하였다. 도 1B는 메치오닌 결핍(-Met) 조건에서 9시간 동안 배양한 H460 세포의 BrdU 삽입율과 세포 주기 분석 결과를 나타낸다. 데이터는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다. 도 1A과 도 1B에서 **는 p<0.05, ***는 p<0.001를 나타낸다. 도 1C는 shRNA를 발현하는 MDA-MB-231 세포 또는 H460 세포에서 [³⁵S]Met으로 표지된 메치오닌의 삽입율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 MRS의 영향을 받는 세포 주기 관련 단백질을 찾기 위한 단백질 어레이 실험과 면역 블롯 실험 결과를 나타낸다.
도 2A는 shRNA를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포에서, 그리고 도 2B는 메치오닌 결핍 조건의 H460 세포에서 Cyclin D1, p21, CDK4, CDK3, c-ABL 단백질 수준의 변화를 나타낸다. 도 2C는 9시간 동안 메치오닌 결핍시킨 MDA-MB-231 세포(왼쪽 패널)와 H460 세포(오른쪽 패널)와 각각의 대조군의 세포 용해물을 이용한 면역 블롯 결과를 나타낸다. 도 2D는 HA로 표지된 CDK4 또는 CDK3를 streptavidin으로 표지된 MRS를 공동발현한 H460 세포를 이용한 공동면역침강(co-IP) 실험 결과를 나타낸다. WCL은 전체 세포 용해물(whole cell lysate)를 의미한다.
도 3은 세포 내 MRS와 CDK4의 결합을 관찰하기 위한 Venus BiFC 실험 결과를 나타낸다. 자주색 형광(Alexa fluor 647)은 HA 표지된 MRS, 적색 형광(Alexa fluor 594)은 Flag 표지된 CDK4 또는 WRS를 나타내며, 청색 형광은 DAPI로 염색된 핵, 녹색 형광은 VN 또는 VC와 각각 접합된 두 단백질의 결합으로 형성되는 Venus 형광 단백질을 나타낸다.
도 4는 MRS와 CDK4 결합의 구조적인 특징을 확인하기 위한 결합 부위 맵핑(domain mapping) 실험 결과를 나타낸다.
도 4A는 6시간 동안 메치오닌 결핍시킨 MDA-MB-231 세포에서 MRS와 CDK4의 결합을 확인하기 위한 co-IP 실험 결과를 나타낸다. 도 4B는 MRS와 CDK4 단백질의 단편을 나타내는 모식도이다. MRS는 GST-like domain(1-266 amino acids(aa)), catalytic domain(267-597 aa) 및 tRNA binding domain(598-900 aa)으로 구분되며, 전체 길이(Full, 1-900 aa)의 MRS와 F1(1-266 aa), F2(267-597 aa), F3(598-900 aa), F4(1-597 aa), F5(267-900 aa) 등 다섯 종류의 단편이 실험에 사용되었다. CDK4는 N-말단과 C-말단으로 나누고, 전체 길이(Full, 1-303 aa)의 CDK4와 N(1-102 aa) 및 C(103-303 aa) 등 두 종류의 단편이 실험에 사용되었다. 도 4C는 방사능 표지된 CDK4의 단편과 GST-MRS를 이용한 GST pull-down 실험 결과를 나타내는 방사능 사진(autoradiography)이다. 도 4D는 방사능 표지된 MRS 단편과 GST-CDK4를 이용한 GST pull-down 실험 결과를 나타내는 방사능 사진(autoradiography)이다. 도 4E는 Flag 표지된 CDK4와 Strep 표지된 MRS(WT, 야생형;HA, H560A 돌연변이;KQ, K596Q 돌연변이)를 공동으로 과발현시킨 H460 세포 용해물을 이용한 co-IP 실험 결과를 나타낸다. 도 4F는 CDK4 단백질의 안정성을 확인하기 위하여 사이클로헥사마이드(CHX, 120μg/ml)를 0, 4, 8시간 동안 처리한 H460 세포의 용해물의 면역 블롯 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 메치오닌 유사체(Met analogs)를 선별하기 위한 스크리닝 실험 결과를 나타낸다.
도 5A는 13종류의 메치오닌 유사체(1mM)가 단백질 번역에 미치는 영향을 확인하기 위한, 반딧불 루시퍼라제를 이용한 in vitro translation 실험 결과를 나타낸다. 데이터는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다. 도 5B는 각각의 메치오닌 유사체가 CDK4 관련 단백질 수준에 미치는 영향을 확인하는 면역 블롯 실험 결과를 나타낸다. -Met은 메치오닌 결핍 조건을 의미한다.

도 6은 메치오닌 유사체인 FSMO가 MRS의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험 결과를 나타낸다.
도 6A는 FSMO(1mM)로 인한 단백질 번역 억제의 회복 효과를 확인하기 위하여 메치오닌(M), 세린(S), 시스테인(C), 류신(L) 아미노산(aa, 25mM)을 첨가하고 실시한 in vitro translation 실험 결과를 나타낸다. 도 6B는 FSMO(150μM)가 MRS, CRS, SRS 및 KRS(각각 cysteinyl-, seryl-, 및 lysyl-tRNA 합성효소)의 촉매활성에 미치는 영향을 확인하기 위한 in vitro aminoacylation 실험 결과를 나타낸다. 데이터는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표시하였다. 도 6C는 FSMO(0, 150, 300μM)가 MRS의 메치오닌 활성화 작용에 미치는 영향을 확인하기 위한 ATP-PPi exchange 실험 결과를 나타낸다. 가로축은 시간(분)이고, 데이터는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표시하였다. 도 6D는 다양한 농도의 FSMO 또는 borrelidin을 처리한 H460 세포의 면역 블롯 실험 결과를 나타낸다. 도 6E는 FSMO(상단)와 borrelidin(하단)이 농도에 따라 단백질 번역에 미치는 영향을 나타낸 in vitro translation 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 FSMO가 MRS와 CDK4의 결합과 세포 주기 진행에 미치는 영향을 확인한 실험 결과이다.
도 7A는 FSMO가 MRS와 CDK4의 결합에 미치는 영향을 확인하기 위한 GST pull-down 실험 결과를 나타낸다. 도 7B는 Myc 표지된 MRS와 HA 표지된 CDK4를 공동으로 과발현시킨 H460 세포 용해물을 이용한 co-IP 실험 결과를 나타낸다. FSMO는 25 또는 50μM 농도로 4시간 동안 처리하였다. 도 7C는 FSMO(50μM)가 H460 세포에서 내재적으로 발현되는 MRS와 CDK4의 결합에 미치는 영향을 확인하기 위한 co-IP 실험 결과를 나타낸다. 도 7D는 세포 내 MRS와 CDK4의 결합을 관찰하기 위한 Venus BiFC 실험 결과를 나타낸다. 자주색 형광(Alexa fluor 647)은 HA 표지된 MRS, 적색 형광(Alexa fluor 594)은 Flag 표지된 CDK4 단백질을 나타내며, 청색 형광은 DAPI로 염색된 핵, 녹색 형광은 VN 또는 VC와 각각 접합된 두 단백질의 결합으로 형성되는 Venus 형광 단백질을 나타낸다. FSMO는 50μM 농도로 6시간 동안 처리하였고, 메치오닌 결핍(-Met)은 6시간 동안 지속되었다. 단백질 분해를 막기 위해 MG132(50μM)로 2시간 동안 전처리하였다. 도 7E는 FSMO(50μM) 처리한 H460 세포의 BrdU 삽입율을 나타내며, 도 7F는 PI 염색과 FACS를 이용한 세포 주기 분포 경향을 나타낸다. **는 p<0.05, ***는 p<0.001이고, 데이터는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표시하였다.
도 8은 p16^INK4a의발현과 MRS에 의한 CDK4 조절의 관계를 알아보기 위한 실험 결과를 나타낸다.
도 8A는 p16^INK4a를 발현하지 않는 세포(p16^INK4a-)와 p16^INK4a를 발현하는 세포(p16^INK4a+)에서 MRS에 대한 siRNA(si-MRS)가 CDK4의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하는 면역 블롯 실험 결과를 나타낸다. 도 8B는 FSMO와 p16^INK4a에 대한 siRNA(si-p16^INK4a)가 p16^INK4a를 발현하는 WI-26 세포에서 CDK4의 단백질 수준에 미치는 영향을 확인하는 면역 블롯 실험 결과를 나타낸다. 도 8C는 FSMO가 CDK4의 단백질 수준에 미치는 영향을 정상 세포(회색, n=6), p16^INK4a를 발현하는 암 세포주(청색, n=4) 및 p16^INK4a를 발현하지 않는 암 세포주(녹색, n=11)에서 확인, 분석한 도표를 나타낸다. CDK4, CDK2, MRS 및 p-eIF2α의 단백질 수준은 면역 블롯으로 도출하고, Image J 프로그램을 이용하여 정량화하여 색이 진할수록 발현 수준이 높은 것으로 표시하였다.
도 9는 p16^INK4a와 MRS의 관계를 확인하기 위한 실험 결과를 나타낸다.
도 9A는 MRS 단백질의 수준을 증가시키거나(왼쪽 패널), p16^INK4a의 수준을 증가시키는 조건(오른쪽 패널)에서 CDK4와의 결합을 확인한 GST pull-down 실험 결과를 나타낸다. 도 9B는 si-p16^INK4a가 WI-26 세포에서 과발현된 Flag 표지한 CDK4와 Strep 표지한 MRS의 결합에 미치는 영향을 확인하는 co-IP 실험 결과를 나타낸다. 도 9C 상단은 CDK4에서 R24의 위치를 나타내는 모식도(PDB ID: 1BI7)이고, 하단은 HA 표지된 CDK4(WT 또는 R24C 돌연변이)와 Strep 표지된 MRS를 공동으로 과발현한 293T 세포 용해물을 이용한 co-IP 실험 결과를 나타낸다. 청색 화살표는 R24C의 위치를 나타낸다. 도 9D는 MRS가 방사능 표지된 Cyclin D1과 GST-CDK4의 결합에 미치는 영향을 나타낸 방사능 사진(autoradiography)이다.
도 10은 MRS의 수준과 암 질환 사이의 상관관계를 세포와 동물 모델에서 확인한 실험 결과이다.
도 10A는 유방암 세포주에서 면역 블롯으로 확인한 MRS와 CDK4 단백질 수준을 Image J를 이용하여 정량화하고 p16^INK4a 유무에 따라 비교한 것으로, 진한 색이 발현 수준이 높은 것으로 표시한 도표이다. 도 10B는 shRNA를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포의 부착 비의존성 연한천 실험 결과를 나타낸다. 도 10C는 shRNA를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포를 주입한 마우스에서의 종양 형성 경향을 나타낸다. 도 10D는 이종이식 실험의 마우스들의 시간에 따른 체중의 변화(Body weight(g))를 나타낸다. 도 10E는 이종이식 실험의 마우스에서 측정한 시간에 따른 종양의 크기(Tumor size(mm³)) 변화를 나타낸다. 도 10F는 이종이식으로 형성된 종양 조직에서 MRS, CDK4, Ki-67 단백질 발현 수준을 확인하는 면역조직화학 염색 사진을 나타낸다.
도 11은 MRS의 수준과 암 질환 사이의 상관관계를 암 환자에서 확인한 실험 결과이다.
도 11A는 유방암 환자의 재발 없는 생존율(RFS), 도 11B는 폐암 환자의 전체 생존률(OS)을 나타낸 카플란 마이어 플롯이다. 도 11C는 유방암 조직 어레이(breast cancer tissue array)를 이용한 단백질 발현 분석 점수의 기준을 나타낸다. MRS, CDK4, Cyclin D1, p-Rb, p16^INK4a 각각에 대하여 단백질 염색 신호 강도에 따라 0, 1+, 2+ 또는 3+으로 분류하였다. 도 11D는 p16^INK4a를 발현하지 않는 암 조직에서, 도 11E는 p16^INK4a를 발현하는 암 조직에서 분석한 CDK4와 MRS 수준의 상관관계를 나타낸다. 도 11F는 p16^INK4a를 발현하지 않는 암 조직에서, 도 11G는 p16^INK4a를 발현하는 암 조직에서 분석한 MRS 수준(낮음, MRSL; 높음, MRSH)에 따른 가산점(weighted sum of score)의 차이를 나타낸다. 데이터는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표시하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

세포 배양 및 형질전환

본 발명에 사용된 MDA-MB-231, 293, 293T, NIH3T3, WI-26, WI-38, CCD18C0, HeLa, BT20, MCF7, HT29, T47D 세포주는 American Type Culture Collection 또는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였고, GFP를 발현하는 MDA-MB-231 세포주는 Cell Biolabs에서 구입하였다. 각각의 세포주는 5% CO₂, 37℃에서 50μg/ml 페니실린/스트렙토마이신과 열로 비활성화한 10% FBS(defined fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM(Hyclone) 배지를 사용하여 배양하였다. HCC1937, MDA-MB-453, MDA-MB-436, MDA-MB-468, A549, H460, HCT116, H1299, Panc10.05, SW620 세포주는 한국세포주은행에서 구입했으며, 5% CO₂, 37℃에서 10% FBS와 50μg/ml 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI를 사용하여 배양하였다. BT474, HCC70, HCC1569, HCC1954, HCC1419, HS578T, HCC2218, HCC1395 세포주는 American Type Culture Collection 또는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하여 동일한 방법으로 배양하였다. MCF10A 세포주는 5% CO₂, 37℃에서 10μg/ml 인슐린, 100ng/ml 콜레라 독소(cholera toxin), 25ng/ml 표피성장인자(epidermal growth factor), 500ng/ml 히드로코르티손(hydrocortison), 0.2%(v/v) 암포테리신 B(amphotericin B), 5% 말 혈청, 50μg/ml 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/F12 배지에서 배양하였다.

유전자 과발현을 위한 플라스미드와 siRNA는 각각 Fugene HD(Roche)와 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 세포 내로 도입하였다. 유전자 발현을 억제하기 위하여 사용한 siRNA의 서열은 다음과 같다: si-MRS, 5’-CUACCGCUGGUUUAACAUUUCGUUU-3’, 서열번호 19; si-p16^INK4a, 5′-CGCACCGAAUAGUUACGGU-3′, 서열번호 20. 대조군 siRNA(si-Control)는 Invitrogen사의 stealth RNAi negative control duplex(medium GC)를 구입하여 사용하였다.

안정적 세포주(stable cell line) 제작

GFP를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 MRS에 대한 shRNA(sh-MRS, 5’-GGCGAAACTCTTGGATCTA-3, 서열번호 21) 또는 대조군 shRNA(sh-Control; SMART choice inducible non-targeting control hEF1a/turboRFP VSC6573, Thermo Scientific)를 포함하는 Smart choice inducible lentivirus(GE Healthcare)로 감염시켰다. 렌티바이러스로 형질전환된 세포는 퓨로마이신(puromycin, 1μg/ml)을 이용하여 적합한 콜로니들을 선별하였다. sh-MRS 및 sh-Control의 발현은 독시사이클린(doxycycline, 1μg/ml)을 처리하여 유도하였다.

FACS를 이용한 세포 주기 분석

배양한 세포들은 트립신을 처리하여 수득하였고, 차가운 PBS로 두 번 세척한 후, 4℃에서 2시간 동안 70% 에탄올로 고정하였다. 다시 차가운 PBS로 두 번 세척하고, 어두운 곳에 37℃에서 30분 동안 1×PBS, 100μg/ml RNase A, 50μg/ml PI(propidium iodide, Sigma)를 포함하는 500μl PI 염색 용액으로 처리하였다. PI염색된 세포는 유세포 분석기(flow cytometry, BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 세포 주기의 G0/G1기, S기, G2/M기에 있는 세포의 비율(%)을 Cell Quest acquisition software(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.

IncuCyte를 이용한 세포 생존율 분석

세포를 96웰 플레이트에 웰당 2000개 세포를 접종하여 배양하였다. 다음날, 다양한 농도의 FSMO와 5% FBS를 포함하는 DMEM 또는 RPMI로 교체하고, IncuCyte Kinetic Live Cell Imaging System(Essen BioScience)을 이용하여 세포의 성장을 관찰하였다. MDA-MB-231 세포 또는 H460 세포를 발현하고자 하는 유전자를 포함하는 pcDNA3-empty vector, pcDNA3-CDK4, pEXPR-IBA105-MRS, pEXPR-IBA105-CDK4, pcDNA3-MRS 또는 pcDNA3-LRS로 형질전환시키고, 세포 성장 속도를 측정하였다.

반딧불 루시퍼라제 in vitro translation

in vitro translation(단백질 번역) 분석은 토끼 망상적혈구 용해질(reticulocyte lysate, Promega)을 사용하여 실시하였다. 반응 용액은 1template (0.5mg/ml 반딧불 루시퍼라제 DNA), 1μl 화합물, 1μl 메치오닌(1mM stock), 1μl 증류수, 6μl 토끼 망상적혈구 용해질을 포함한다. 반응 용액을 1.5시간 동안 30℃에서 배양하였다. 아미노산 과다 주입에 의한 번역 회복을 관찰하기 위해, 각각의 아미노산(Met, Ser, Cys 및 Leu, 25mM stock)을 반응 샘플에 추가하여 배양한 후, 2× 발광효소 기질(10μl)을 혼합물에 첨가하였다. 각 샘플은 96웰 플레이트에 옮겨서 EnVision Multilabel Reader(PerkinElmer)를 사용하여 화학발광의 수준을 측정하였다. 보렐리딘(borrelidin)과 메치오닌 유사체는 각각 Sigma와 Anaspec에서 구입하였다.

세포 주기 단백질 어레이

shRNA(sh-Cont, sh-MRS)를 안정적으로 발현하도록 형질전환된 MDA-MB-231 세포에서 sh-RNA의 발현은 4시간 동안 독시사이클린을 처리하여 유도하였다. H460 세포는 9시간 동안 10%의 투석한 FBS가 포함된 Met-free DMEM 배지에서 배양하여 메치오닌 결핍 상태를 유도하였다. 세포 주기 단백질 배열 키트(cell cycle protein array kit, Full moon biosystems)의 지침서를 따라 단백질 용해물(protein lysate)을 준비하였다. 간략하게, 비오틴(biotin)을 단백질에 결합시키고, 세포 신호 관련 단백질에 특이적인 항체가 배열된 array slide에 배양하였다. Cy3-streptavidin으로 컨쥬게이션하고 건조한 후에, Genepix 4100A microarray scanner(Molecular devices)를 사용하여 532nm에서 형광 수준을 측정하고 분석하였다.

In vitro 아미노아실화 ( aminoacylation ) 분석

A549 세포에 트립신을 처리하고, 차가운 PBS로 희석한 다음, 얼음 위에서 5초 간격으로 5번 초음파로 분쇄하였다. 아미노아실화 분석은 37℃에서 30mM Hepes(pH 7.4), 100mM 칼륨 아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 2mM ATP, 100 /ml yeast tRNA 및 25μCi의 [³⁵S]Met, [³⁵S]Cys(1,000Ci/mmol, PerkinElmer) 또는 [³H]Ser, [³H]Lys(40Ci/mmol, PerkinElmer)와 20 단백질 용해물을 포함하는 반응 용액을 배양하여 실시하였다. 아미노아실화 반응은 5% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 적신 3MM 여과지 위에서 중지시키고, 5% 트리클로로아세트산으로 세척하여 건조한 다음, 액체섬광계수기(liquid scintillation counter, PerkinElmer)를 사용하여 방사능을 검출하였다.

메치오닌 삽입율 분석

MDA-MB-231과 H460 세포를 12웰 플레이트에서 배양하였다. 세포에 8시간 동안 각각 0, 25, 50, 100μM의 농도의 FSMO를 처리하고, [³⁵S]Met를 포함하는 Met-free media로 교체하였다. 2시간 배양한 후, 세포를 용해하여 방사능 단백질의 수준을 액체섬광계수기를 이용하여 측정하였다.

BrdU 삽입율 분석

MDA-MB-231과 H460 세포를 웰당 4000개 세포의 농도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 세포가 부착된 후, 세포에 8시간 동안 50μM FSMO와 2% 혈청이 포함된 배지를 처리하거나 9시간 동안 10%의 투석한 FBS가 포함된 Met-free DMEM 배지를 처리하여 메치오닌 결핍 상태를 유도하였다. 각각의 배지에 포함된 BrdU 용액(100μl)을 각 웰에 추가하여 2시간 동안 배양하였다. BrdU 삽입된 세포를 고정하고, 세포 증식 분석 키트(cell proliferation assay kit, Cell Signaling)의 지침을 따라 항체를 처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 세척 버퍼로 3번 세척한 뒤 테트라메틸벤자이딘(tetramethylbenzidine, TMB) 기질 100μl를 추가하여, 상온에서 30초 동안 배양하였다. 세포 내에 도입된 BrdU의 양은 ELISA(Tecan)를 이용하여 450nm로 측정하였다.

In vitro pull - down assay

GST에 연결시킨 융합 단백질을 대장균(E. coli) Rosetta 2에서 37℃에서 16시간 동안 1mM IPTG로 유도하여 발현시켰다. 세포를 수득하여 초음파 분쇄하고, 세포 용해물은 용해 버퍼(lysis buffer, 단백질 분해효소 억제제와 0.5% Triton X-100을 포함하는 PBS)에서 glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. TNT-coupled translation kit(Promega)를 이용하여 합성한 방사능 표지된 단백질 또는 293 세포에서 과발현하여 수득한 단백질 추출물은 GST 융합 단백질과 함께 4℃에서 2시간 내지 하룻밤 동안 반응시켰다. 비드(beads)를 용해 버퍼로 3번 세척하고, 용출된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고, 방사능 사진(autoradiography) 또는 면역 블롯 실험으로 검출하였다.

Quantitative Real Time PCR(qRT-PCR)

RNA는 miRNeasy Mini kit(Qiagen)를 이용하여 제조사 지침에 따라 세포에서 추출하였다. 총 2μg의 RNA를 M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)와 random hexamer를 이용하여 역전사하였다. 추출한 RNA에서 cDNA를 합성하기 위한 PCR 사이클은 65℃/5분, 37℃/2분, 25℃/10분, 37℃/50분, 그리고 70℃/15분이다. qRT-PCR은 POWER SYBR GREEN master mix(Applied Biosystems)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 실시하였다. RT-PCR에 사용한 MRS와 CDK4의 프라이머의 염기서열은 서열번호 22 내지 25에 기재되어 있다.

BiFC 분석과 면역형광 이미징

MRS는 HA tag을 포함하는 p-BiFC-VC155 벡터에 클로닝하였고, 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS)와 CDK4는 Flag tag을 포함하는 p-BiFC-VN173 벡터에 클로닝하였다. H460 세포를 커버 슬립에 접종하고 p-BiFC-VC155-MRS를 p-BiFC-VN173-WRS 또는 p-BiFC-VN173-CDK4와 공동 형질전환시켜 24시간 동안 배양하였다. 세포에 FSMO(50μM)를 처리하기 전에 2시간 동안 MG132(50μM)를 처리하고, 2% FBS 존재하에서 6시간 동안 추가로 배양하였다. 메치오닌 결핍을 유발하기 위하여 세포를 MG132(50μM)와 10%의 투석한 FBS를 포함하는 Met-free DMEM 배지로 6시간 동안 배양하였다. 배양한 세포는 미리 냉각시킨 100% 메탄올로 7분 동안 고정하고, 실온에서 15분 동안 3% CAS로 블로킹한 후, Flag 항체와 HA 항체로 각각 1시간 또는 하룻밤 동안 반응시키고, Alexa fluor 594 또는 Alexa fluor 647와 결합된 2차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 빛이 없는 조건에서 10분 동안 DAPI 용액으로 핵을 염색하였다. 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 60× 배율에서 형광을 관찰하였다.

복합체 구조의 모델링

CDK4-p16^INK4a 복합체의 도식 모델은 단백질의 알려진 구조를 참고하여 Coot(Emsley and Cowtan, 2004)를 이용하여 수동으로 조립한 후에 PyMOL을 사용하여 생성되었다. 복합체 모델링에 사용한 단백질의 알려진 구조는 다음과 같다: CDK4-Cyclin D1 복합체, 2W96; CDK6-p16^INK4a 복합체, 1BI7.

부착 비의존성 연한천 분석( anchorage - independent soft agar assay )

0.6% low-melting 한천을 포함하는 기본 한천 혼합물 1ml을 12웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 냉각하였다. 안정적으로 형질전환된 MDA-MB-231 세포를 3×10³cells/well의 농도로 0.6% low-melting 한천과 10% 혈청을 포함하는 DMEM과 같은 부피로 혼합하여 웰에 굳힌 기본 한천 위에 첨가하였다. 부착 비의존성 세포의 성장을 확인하기 위해, 각 웰에 10% DMEM을 첨가하였다. 1달간 배양한 세포를 10% 메탄올/10% 아세트산으로 10분 동안 고정하고, 1시간 동안 0.01% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

In vivo 이종이식 실험( xenograft )

동물 실험은 서울대학교의 대학 동물 관리 및 사용 위원회 지침을 준수하였다. 6주령 암컷 BALB/c Slc-nu/nu SP nude 마우스의 배측면에 GFP를 발현하며 sh-RNA(sh-MRS 또는 sh-Cont)로 안정적으로 형질전환된 MDA-MB-231 세포(1×10⁶ cells)를 피하 접종하였다(군당 마우스 5마리). siRNA의 발현을 유도하기 위하여 독시사이클린 염산염 수용액(5% sucrose, 2mg/ml)을 제공하였다. 이종이식을 받은 마우스는 매일 상태를 관찰하였고, 3일 마다 몸무게와 종양 크기를 측정하였다. 3주 후, 마우스에서 형성된 종양 부위에서 방출되는 형광 신호를 Optix MX3(ART)를 사용하여 촬영한 뒤 마우스를 희생하여 종양 조직을 수득하였다. 종양 조직의 무게를 측정하고, 면역조직화학염색을 실시하였다.

조직 마이크로어레이 블록의 제조

포르말린으로 고정하고 파라핀에 내장한 조직 블록(block)을 Accu Max Array 조직 배열 기기(Petagen)를 사용하여 배열하였다. 간략하게, 유방 전문 병리학자가 분석을 위한 각 종양의 대표적인 부위를 선택하여 H&E 슬라이드에 표시하였다. 각공여자 조직 블록의 지정된 부위를 지름이 3mm인 조직 실린더(tissue cylinder)로 펀치하여 조직을 수득하고, 격자 패턴으로 수여자 블록으로 옮겼다.

면역조직화학 염색

면역조직화학 염색(immunohistochemistry, IHC)은 파라핀에 내장된 조직 절편을 4mm 두께로 준비하고, 표준적인 H&E 염색을 실시하였다. 절편은 자일렌으로 파라핀을 제거하고 농도구배 에탄올 수용액으로 재수화하였다. 조직 절편의 내재적인 퍼록시다제(peroxidase)를 억제하기 위해 10분 동안 3%(v/v) 과산화수소 용액을 처리하였고, 20분 동안 100℃에서 항원 노출(epitomic retrieval) 2번 용액(Leica Biosystems, pH 6.0)을 염색 전에 처리하였다. MRS(Neomics), p16^INK4a(Santa cruz), Cyclin D1(Santa cruz), CDK4(Santa cruz), pRb(Abcam)에 대한 1차 항체로 반응시키고, 이후 과정은 자동화된 Leica Bond-max immunostainer(Leica Biosystems)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 실시하였다. 염색된 조직 절편의 이미지는 IP Lab 소프트웨어(BD Biosciences Clontech)와 니콘 TE2000 도립 현미경(inverted microscope)을 이용해 촬영하였다. 슬라이드는 Harris haematoxylin으로 대조염색하였다. 조직 절편에 포함된 정상적인 유방 조직과 적절한 대조군 조직을 양성 대조군으로 사용하였다. H&E 염색된 슬라이드는 유방 전문 병리학자가 관찰하여 검토하였다. IHC 염색 결과를 해석하기 위하여 MRS, p16^INK4a, Cyclin D1, CDK4, pRb의 IHC 염색 결과를 비율에 따라 0부터 100까지 단계로 나누고, 다시 핵 염색의 강도에 따라 고배율 시야(high-power field, HPF)에서 ‘0’, ‘1+’, ‘2+’또는 ‘3+’으로 분류하였다. 높은 수준의 MRS의 발현에는 ‘2+’ 및 ‘3+’의 점수를 부여하였고, 높은 수준의 다른 마커 발현에는 ‘1+’ 내지 ‘3+’의 점수를 부여하였다. IHC 결과의 해석은 의학적 지표나 실험 결과에 관한 어떤 정보가 제공되지 않은 상태(blinded)에서 이루어졌다. WSS(weighted sum of score)를 부여하는 기준은 표 2에 기재하였다.

< 실시예 1>

MRS에 의한 세포 주기 진행과 CDK4 단백질 수준의 조절

<1-1> MRS의 발현 억제와 메치오닌 결핍이 세포 주기 진행에 미치는 영향

진핵 생물의 MRS는 핵 안에서 전사, rRNA 합성과 같은 생명 현상의 중추적인 역할을 담당한다(Ruggero and Pandolfi, 2003). 상기 전사와 rRNA 합성은 세포 주기 조절에도 매우 중요하므로, MRS가 DNA 합성과 세포 주기를 조절하는데 관여하는지 알아보았다.

먼저 MRS의 발현 억제가 세포 주기 진행에 미치는 영향을 알아보기 위하여 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포를 MRS에 대한 shRNA(sh-MRS) 또는 대조군 shRNA(sh-Cont)을 안정적으로 발현(stable expression)하도록 형질전환하고, BrdU 삽입율과 유세포분석기(FACS)를 이용한 세포 주기 분석을 실시하였다(도 1A). MRS의 발현이 억제된 세포는 대조군과 비교하여 BrdU 삽입율이 크게 감소하였으며, 세포 주기의 GO/G1기에 있는 세포의 비율이 대조군에 비하여 현저하게 높고, 반대로 S기에 있는 세포의 비율은 현저하게 낮은 것으로 나타났다. 폐암 세포주인 H460 세포와 MRS에 대한 siRNA를 이용한 실험에서도 동일한 결과가 관찰되었다(데이터 미도시).

MRS의 발현 억제 외에, MRS의 활성에 영향을 미치는 메치오닌(methionine, Met) 결핍 상태에서 세포 주기 분석을 실시하였다(도 1B). 메치오닌 결핍 상태(-Met)의 H460 세포는 대조군(Control)과 비교하여 BrdU 삽입율이 크게 떨어지고 GO/G1기에 정지(arrest)해 있는 세포의 비율이 크게 증가하여 MRS 발현 억제와 매우 유사한 결과를 나타내었다. 메치오닌 결핍 상태의 MDA-MB-231 세포에서도 유사한 결과가 관찰되었다(데이터 미도시).

MRS의 발현 억제와 메치오닌 결핍 조건은 결과적으로 활성화된 MRS가 고갈된 상태를 유도한다는 공통점이 있다. 번역 개시에 중요한 활성화된 MRS의 결핍으로 인하여 단백질 번역(translation) 반응이 비특이적으로 저해되고 있는지 알아보았다. MRS의 발현을 억제한 세포(sh-MRS)의 메치오닌 삽입율을 측정하여 세포 전체 단백질 번역 반응을 측정한 결과, 대조군(sh-Cont)과 비교하여 단백질 번역 반응에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(도 1C).

이상의 결과는 세포 주기가 GO/G1기에서 S기로 진행하고 세포 분열을 유도하는데 활성화된 MRS가 필수적이라는 것을 보여준다.

<1-2> MRS에 의해 조절되는 세포 주기 단백질의 특정

MRS가 세포 주기를 조절하는 분자적 기작을 이해하기 위하여 MRS의 직접적인 영향을 받는 타겟 또는 하위 신호 전달 체계를 조사하였다.

MRS의 발현 억제(도 2A) 또는 메치오닌 결핍(도 2B) 조건에서 세포 주기에 관련된 단백질 어레이(protein array)를 이용하여 대조군과 비교하여 그 수준이 크게 변하는 단백질을 조사하였다. 분석 대상인 60종류의 세포 주기 관련 단백질 중, 18종류의 단백질은 변화가 없었으며, 42종류의 단백질은 MRS의 발현 억제 또는 메치오닌 결핍에 의해 수준이 크게 변하였는데, 이 중 31종류는 MRS 발현 억제 또는 메치오닌 결핍 어느 한 조건에서만 수준이 변하였고, 6종류는 두 조건에서 반대 방향의 변화를 보였으며, 나머지 5종류는 두 조건에서 같은 방향으로 변하는 것으로 나타났다(데이터 미도시). 이들 5종류의 단백질 중, p21^WAF1, CDK3, CDK4, Cyclin D1은 MRS 발현 억제와 메치오닌 결핍의 두 조건에서 단백질 수준이 감소하였다. p21^WAF1는 세포 주기 뿐 아니라 여러 신호 전달 체계에 관여하는 복잡한 조절 단백질이며, CDK3는 세포 주기의 GO기에서 G1기로의 진행을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 한편 CDK4와 Cyclin D1은 공동으로 G1기로부터 S기로의 진행을 관장하며, Cyclin D1은 CDK4의 부재 중에는 내재된 불안정성으로 쉽게 분해되는 등 기능적으로 CDK4와 밀접하게 관련된 단백질들이다.

상기 단백질 어레이를 통해 선별된 단백질 중 MRS에 의한 세포 주기 조절에 더욱 관련 있을 것으로 판단되는 CDK3와 CDK4를 세포에서 발현하고 MRS와의 상호작용을 확인하였다. 메치오닌 결핍시킨 MDA-MB-231 세포에서 CDK4는 단백질 수준이 현저하게 감소하였으나, CDK3는 단백질 어레이 결과와는 달리 실제 세포에서는 크게 변하지 않는 것으로 나타났다(도 2C, 왼쪽 패널은 MDA-MB-231 세포, 오른쪽 패널은 H460 세포). 또한 CDK3와 CDK4를 각각 H460 세포에서 MRS와 과발현하여 공동면역침강 실험(co-immunoprecipitation, co-IP)을 실시한 결과, CDK4는 MRS와 함께 면역침강되지만, CDK3는 MRS와 거의 면역침강되지 않는 것으로 관찰되었다(도 2D). 따라서 실제로 세포 안에서는 CDK4가 MRS와 상호작용할 것으로 생각되었다.

한편, MRS가 CDK4의 발현을 전사 단계에서도 조절하는지 여부를 알아보기 위하여 MDA-MB-231 세포에서 siRNA를 이용하여 MRS의 발현을 억제하고 qRT-PCR로 CDK4의 전사 수준을 확인한 결과, MRS의 발현을 억제한 세포(si-MRS)는 대조군(si-Cont)과 CDK4의 mRNA 발현 수준이 매우 유사한 것으로 나타났다(도 2E). 즉 MRS는 CDK4의 전사 수준에는 관여하지 않음을 알 수 있었다.

이상의 실험 결과를 통해 MRS가 세포 주기를 조절하는데 있어서 CDK4가 가장 주요한 타겟이자 작용인자(effector)일 것으로 추론되었다. <실시예 1-1>에서 확인한 바와 같이, MRS의 발현이나 활성을 억제한 조건에서 전체적인 단백질 번역은 큰 변함이 없는데 비해(도 1C), CDK4의 단백질 수준은 감소하므로, MRS는 CDK4 단백질 특이적으로 안정화하는 것으로 판단되었다.

<실시예 2>

MRS와 CDK4의 직접적 결합

<2-1> 세포 내 MRS와 CDK4의 결합 수준 측정

MRS가 CDK4의 단백질 수준을 조절하는 기작을 이해하기 위하여 세포 내에서 MRS와 CDK4가 직접 결합하는지 알아보았다.

MRS와 CDK4의 세포 내 결합을 관찰하기 위하여 Venus BiFC(Biomolecular fluorescence complementation)를 이용하였다(Kwon et al., 2011; Shyu et al., 2008). 형광 단백질인 Venus의 C-말단(VC)을 MRS에 결합시키고, Venus의 N-말단(VN)을 CDK4에 결합시킨 컨스트럭트를 제작하고, H460 세포에서 발현시켜 MRS와 CDK4가 결합하여 Venus의 녹색 형광이 생성되는지 관찰하였다(도 3). MRS와 CDK4를 공동발현한 세포에서는 강한 녹색 형광이 관찰되었으나, CDK4 대신 WRS를 MRS와 공동발현한 세포에서는 녹색 형광이 전혀 나타나지 않아 MRS와 CDK4가 세포 안에서 특이적인 결합을 하는 것을 확인하였다.

<2-2> MRS 와 CDK4 의 결합의 구조적 특징

MRS와 CDK4가 서로 결합하는 기작을 이해하기 위하여 메치오닌의 결핍 상태에서 MRS와 CDK4의 결합의 변화를 관찰하고, MRS와 CDK4의 단편을 제작하고 결합 여부를 확인하여 MRS와 CDK4 결합의 구조적 기반을 알아보았다.

<실시예 1>에서는 MRS와 CDK4가 함께 면역 침강되어 MRS와 CDK4가 직접 결합할 가능성이 매우 큰 것으로 확인한 바 있다. 이에 MDA-MB-231 세포에서 메치오닌을 결핍시키고 co-IP 실험을 반복한 결과, 메치오닌 결핍 조건에서 MRS의 총량에는 큰 변화가 없었던 반면, CDK4와 결합하고 있는 MRS의 양은 크게 감소한 것으로 나타났다(도 4A). 이는 CDK4 단백질의 안정화되어 그 수준을 유지하는데 MRS와의 결합이 중요함을 보여주는 것이다.

MRS와 CDK4에서 결합이 일어나는 부분을 특정하기 위하여 MRS와 CDK4의 기능적인 단편을 제작하고 결합 여부를 알아보았다. MRS는 GST-like domain(1-266 amino acids), catalytic domain(267-597 amino acids), tRNA binding domain(598-900 amino acids)으로 기능에 따라 도메인을 구분하고, 총 5가지 단편(F1, 1-266 amino acids, 서열번호 3; F2, 267-597 amino acids, 서열번호 5; F3, 598-900 amino acids, 서열번호 7; F4, 1-597 amino acids, 서열번호 9; F5, 267-900 amino acids, 서열번호 11)을 제작하였고, CDK4는 N-말단(1-102 amino acids, 서열번호 17)과 C-말단(103-303 amino acids)으로 구분하여 총 2가지 단편(N, C)을 제작하였다(도 4B). GST pull-down 실험을 이용하여 CDK4의 단편과 전체 MRS의 결합을 확인한 결과, CDK4의 N-말단이 MRS와의 결합에 중요한 것으로 나타났다(도 4C). MRS의 단편과 전체 CDK4의 결합을 GST pull-down 실험으로 확인한 결과, MRS의 catalytic domain 또는 tRNA binding domain이 CDK4와의 결합에 중요한 것으로 나타났다(도 4D). 한편 MRS의 단편 중 GST-like domain과 catalytic domain을 모두 포함하는 F4 단편의 경우에는 catalytic domain을 가지고 있음에도 CDK4와 결합하지 않아, GST-like domain이 MRS와 CDK4의 결합을 저해할 것으로 판단되었다.

MRS의 catalytic domain이 CDK4의 결합에 중요한 것으로 확인되었으므로, MRS의 catalytic domain을 메치오닌 결합 부위(Met binding site)와 메치오닌 활성화 부위(Met activation site)로 세분화하여 결합에 미치는 영향을 확인하였다. MRS 아미노산의 560번째 위치의 히스타민(H560)과 596번째 위치의 라이신(K596)이 각각 메치오닌의 결합과 메치오닌의 활성화 반응에 필수적인 것으로 알려져 있다(Fourmy et al., 1991; Mechulam et al, 1991). MRS에서 H560을 알라닌으로 치환한 돌연변이(H560A)와 K596을 글루타민으로 치환한 돌연변이(K596Q)를 각각 도입하고, co-IP를 이용하여 CDK4와의 결합 여부를 조사한 결과(도 4E), H560A 돌연변이(HA)는 여전히 CDK4와 결합하였으나, K596Q 돌연변이(KQ)는 CDK4와 결합하지 못하여 MRS의 catalytic domain에서 특히 메치오닌 활성화 부위가 CDK4의 결합에 중요함을 알 수 있었다. 또한 사이클로헥시미드(cycloheximide, CHX)를 이용하여 새로운 단백질 합성(de novo protein synthesis)을 억제한 상황에서, 야생형(WT) MRS 또는 H560A 돌연변이(HA)는 단백질 합성 억제 이전부터 H460 세포에 존재하고 있던 CDK4를 안정화시켜 4시간 이상 존속하게 하는 반면, K596Q 돌연변이(KQ)는 CDK4를 안정화시키지 못하여 CDK4는 4시간 전에 이미 면역 블롯으로 감지되지 않을 수준으로 분해된 것으로 나타났다.

이상의 실험 결과는 세포 안에서 MRS는 CDK4 특이적으로 직접 결합하여 CDK4 단백질이 분해되지 않도록 안정화시키는 역할을 하는 것을 보여준다. MRS와 CDK4가 결합하는 데는 MRS의 catalytic domain과 CDK4의 N-말단이 결합에 중요하며, MRS catalytic domain에서는 특히 메치오닌 활성화 부위인 K596이 CDK4와의 결합에 필수적인 것으로 확인되었다.

< 실시예 3>

메치오닌 유사체를 이용한 MRS 와 CDK4 의 결합의 저해

<3-1> 메치오닌 유사체의 스크리닝

메치오닌 결핍이 MRS의 활성에 미치는 영향과 결과적으로 MRS와 CDK4의 결합을 억제하는 기작을 이해하기 위하여 메치오닌 유사체(methionine mimetics)를 선별하고 MRS의 활성과 CDK4의 결합에 미치는 영향을 알아보았다.

시판 중인 13종의 메치오닌 유사체를 구입하여 각각의 유사체가 반딧불 루시퍼라제(firefly luciferase)를 이용한 in vitro translation system에서 번역(translation)에 미치는 영향과 CDK4와 CDK4의 하위 신호 전달 단백질인 Cyclin D1, pRb(Rb의 780번째 아미노산 세린(S780)에 인산화된 형태)의 단백질 수준에 미치는 영향을 면역 블롯으로 알아보았다(도 5). 실험에 사용한 메치오닌 유사체는 표 1에 기재한 바와 같다. 분석 대상인 13종류의 메치오닌 유사체중 3종류의 유사체는 단백질 번역과 CDK4 관련 신호 전달 단백질에 아무런 영향이 없었으며(3, 10, 13번 유사체), 5종류의 유사체는 단백질 번역과 CDK4 관련 신호 전달 단백질의 수준을 모두 감소시키는 효과가 있었고(2, 4, 5, 6, 7번 유사체), 나머지 5종류의 유사체는 단백질 번역만 억제하고 CDK4 관련 신호 전달 단백질에는 아무런 영향이 없었다.

<3-2> 메치오닌 유사체 FSMO가 MRS 활성에 미치는 영향

<실시예 3-1>에서 CDK4 관련 신호 전달 단백질의 수준을 감소시킨 것으로 확인된 5종류의 유사체 중 MRS의 수준을 변화시키지 않으면서 CDK4 관련 신호 전달 단백질 수준을 감소하는 효과가 가장 큰 6번 유사체인 Fmoc-Sec(Mob)-OH(FSMO)를 선별하여 FSMO가 MRS의 활성에 미치는 영향을 알아보았다.

반딧불 루시퍼라제를 이용한 번역 시스템에서 FSMO(1mM)에 의해 단백질 번역이 크게 감소하였는데(도 6A), 메치오닌을 반응에 추가했을 때(+M)만 FSMO에 의해 감소한 단백질 번역이 회복되었으며, 세린(+S), 시스테인(+C), 류신(+L)을 추가했을 때는 단백질 번역이 회복되지 않았다. 또한 in vitro aminoacylation 반응(Catalytic activity) 측정에서(도 6B), FSMO(150μM)는 MRS의 활성을 억제하였으나, CRS(cysteinyl-tRNA synthetase), SRS(seryl-tRNA synthetase), KRS(lysyl-tRNA synthetase)의 활성에는 아무런 영향이 없었다. 즉 FSMO가 메치오닌 특이적인 반응경쟁자(competitor)이자, MRS의 특이적 억제자임을 확인하였다. 특히 ATP-PPi exchange assay에서 확인한 바와 같이(도 6C), FSMO는 농도의존적으로 MRS의 메치오닌 활성화 반응(methionine activation reaction)을 억제하는 것으로 나타났다. 앞서 <실시예 2-2>에서는 MRS에서 메치오닌 활성화 반응이 일어나는 부위, 구체적으로는 K596이 CDK4와의 결합에 특히 중요함을 확인한 바 있다. FSMO가 MRS의 메치오닌 활성화 부위에 결합하여 MRS와 CDK4의 반응을 저해할 가능성이 크다.

마지막으로 FSMO가 단백질 번역과 CDK4 단백질 수준에 미치는 영향을 threonyl-tRNA synthetase의 강력한 억제제인 borrelidin과 비교하였다. FSMO와 borrelidin을 각각 다른 농도로 H460 세포에 처리하고 CDK4 관련 단백질의 수준의 변화를 면역 블롯으로 관찰하였다(도 6D). 별도로 FSMO와 borrelidin의 농도의존적 단백질 번역 억제 효과를 반딧불 루시퍼라제 시스템을 이용하여 측정하였다(도 6E). FSMO는 MRS 활성에 대하여 농도에 따라 구분되는 효과를 나타내었는데, 일반적으로 전체 단백질 번역 수준을 저해하지 않는 25μM의 농도에서 CDK4와 Cyclin D1의 단백질 수준은 현저하게 감소시킨 것이다. 이는 MRS가 CDK4를 조절하는 활성과 통상적인 단백질 번역에 필요한 촉매 활성은 어느 정도 구분될 수 있는 것임을 보여준다. 또한 borrelidin이 전체 단백질 번역을 약 70% 정도 감소시키는 농도인 25nM에서 CDK4의 단백질 수준에는 큰 영향을 미치지 않았는데, 이는 MRS에 의한 CDK4 단백질의 수준의 조절 현상이 단순히 일반적인 단백질 번역의 저해로 일어나는 것이 아닌 CDK4 특이적인 현상임을 반증하는 것이다.

<3-3> FSMO가 CDK4와 MRS 결합과 세포 주기에 미치는 영향

MRS 특이적 억제제이자 CDK4의 단백질 수준을 변화시키는 것으로 확인된 FSMO가 CDK4와 MRS의 결합을 직접 저해하고 세포 주기 진행을 변화시킬 수 있는지 알아보았다. 앞선 <실시예 3-2>에서 FSMO는 CDK4의 결합에 중요한 MRS의 메치오닌 활성화 부위에서 관장하는 반응을 억제하는 것으로 관찰된 바 있다.

FSMO가 CDK4와 MRS의 결합에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다양한 농도의 FSMO(25, 50, 100μM)를 처리하고 GST pull-down 실험한 결과, MRS에 결합하는 CDK4 단백질의 수준이 FSMO 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 7A). FSMO가 MRS와 CDK4의 반응을 직접적으로 억제하는 효과는 H460 세포에서 MRS와 CDK4를 과발현하여 실시한 co-IP 실험(도 7B)과 Venus BiFC 실험(도 7D)에서도 동일하게 관찰되었다. 나아가 H460 세포에서 내재적으로 발현되는 MRS와 CDK4의 결합에 대한 FSMO의 효과도 co-IP 실험으로 확인하였다(도 7C). 특히 FSMO를 처리한 3시간에 걸쳐, CDK4 단백질 수준의 감소가 나타나기 전에 이미 CDK4에 결합하고 있는 MRS의 수준이 현저하게 감소하였는데, 이는 CDK4 단백질 수준 감소가 일어나기 전에 CDK4와 MRS의 결합의 해리가 선행되며, MRS와 CDK4의 결합이 CDK4 단백질의 안정화에 중요함을 보여주는 것이다.

FSMO가 CDK4와 MRS의 결합을 억제함으로써 세포 주기 진행에 미치는 영향을 BrdU 삽입율(도 7E)과 세포들의 세포 주기 분포 경향(도 7F)를 분석하여 알아보았다. FSMO(50μM)를 처리한 H460 세포에서는 대조군과 비교하여 BrdU 삽입율이 현저하게 감소하였으며, GO/G1기에 정지해 있는 세포들의 비율이 크게 증가한 것으로 나타났다. FSMO가 MRS와 CDK4의 결합을 억제하여 CDK4의 단백질 수준을 감소시킴으로써 세포 주기가 정상적으로 진행되지 않은 것으로 이해된다.

이상의 메치오닌 유사체인 FSMO를 이용한 실험 결과는 MRS가 CDK4의 단백질 수준을 조절하는 효과는 일반적인 단백질 번역을 전체적으로 억제하는 것이 아니라 CDK4 단백질 특이적인 것이며, MRS는 CDK4와 직접 결합하여 CDK4 단백질을 안정화시키는 것을 보여준다. 따라서 FSMO와 같이 MRS와 CDK4의 결합을 저해할 수 있는 물질은 CDK4 단백질을 불안정하게 하여 수준을 감소시키고, 결과적으로 CDK4에 의한 세포 주기 진행을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 4>

CDK4의 결합에 대한 MRS와 p16 ^INK4a 의 관계

<4-1> p16 ^INK4a 발현 여부와 MRS에 의한 CDK4 조절 효과

p16^INK4a는 세포 내재적으로 발현되는 CDK4의 억제인자이다. p16^INK4a는 Cyclin D1과 경쟁적으로 CDK4와 결합하여 CDK4의 활성을 억제하는 동시에 CDK4의 안정성은 증가시키는 것으로 알려져 있다(Bockstaele et al., 2006). 이에 CDK4의 안정성 조절에 있어서 MRS와 p16^INK4a의 기능적 관계를 알아보았다.

다양한 세포주에서 MRS에 대한 siRNA(si-MRS)를 처리하고 CDK4 수준을 측정한 결과(도 8A), p16^INK4a를 발현하지 않는 세포에서 MRS의 발현을 억제한 경우에만 CDK4이 불안정화되어 단백질 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 FSMO는 p16^INK4a를 발현하는 폐 유래 세포주인 WI-26에서 p16^INK4a에 대한 siRNA(si-p16^INK4a)로 p16^INK4a의 발현을 억제한 조건에서만 CDK4 단백질의 수준을 감소시키는 효과가 있는 것으로 관찰되었다(도 8B).

세포 내 p16^INK4a 존재와 MRS의 CDK4 단백질 수준 조절 효과의 관계를 더 확인하기 위하여, p16^INK4a를 발현하거나 발현하지 않는 다양한 세포주에 FSMO(0, 25, 50, 100μM)를 처리하고, CDK4와 다른 종류의 사이클린 의존성 키나아제인 CDK2, MRS 그리고 단백질 번역억제의 마커인 p-eIF2α의 단백질 수준의 변화를 면역 블롯으로 분석하고, Image J 소프트웨어를 이용하여 정량화하였다(도 8C). p16^INK4a를 발현하는 정상 세포주(회색으로 표시)와 암 세포주(청색으로 표시; 자궁경부암 세포주, HELA; 유방암 세포주, HCC1937, MDA-MB-436, MDA-MB-468)에서는 FSMO를 처리하여도 CDK4 단백질의 수준에 큰 변화가 없었으나, 앞선 실시예에서 사용된 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 포함하는 p16^INK4a를 발현하지 않는 암 세포주(녹색으로 표시; 폐암 세포주, A549, H460, H1299; 유방암 세포주, MDA-MB-231, MDA-MB-453, BT20, T47D, MCF7; 결장암 세포주, HT-29, SW620, HCT116)에서는 FSMO에 의하여 CDK4의 단백질 수준이 크게 감소하였다. 분석한 모든 세포주에서 CDK2, MRS, 그리고 p-eIF2α의 수준에는 큰 변화가 없는 것으로 나타났다.

<4-2> p16 ^INK4a 와 MRS 의 CDK4 결합상 특징의 비교

CDK4의 내재적 억제제인 p16^INK4a는 MRS와 동일하게 CDK4의 N-말단에 결합함이 알려져 있으므로, p16^INK4a와 MRS의 기능적 관계를 CDK4와의 결합을 분석하여 알아보았다.

p16^INK4a 단백질의 양을 고정시키고 MRS 단백질의 양을 증가시키거나(도 9A, 왼쪽 패널), 반대로 MRS 단백질의 양을 고정시키고 p16^INK4a 단백질의 양을 증가시키는 조건(도 9A, 오른쪽 패널)에서 GST pull-down 실험을 이용하여 CDK4와의 결합을 조사한 결과, MRS 단백질의 양을 증가시키는 조건에서는 CDK4에 결합하고 있는 p16^INK4a의 양이 감소하고, 반대로 p16^INK4a 단백질 양을 증가시키는 조건에서는 CDK4에 결합하고 있는 MRS의 양이 감소하여, p16^INK4a와 MRS는 CDK4와 결합하는데 직접 경쟁하는 관계임을 알 수 있었다. 한편 p16^INK4a를 발현하는 WI-26 세포를 이용한 co-IP 실험에서는 p16^INK4a의 발현을 siRNA(si-p16^INK4a)로 억제시켰을 때 CDK4에 결합하는 MRS의 양이 증가하는 것을 알 수 있었다(도 9B).

CDK4에 경쟁적으로 결합하는 MRS와 p16^INK4a가 CDK4와 정확히 동일한 위치에 결합하는지를 CDK4의 돌연변이를 이용하여 알아보았다. CDK4가 p16^INK4a와 결합하는데 아미노산 서열의 24번째 아르기닌(R24)이 필수적이며, 이 아르기닌이 시스테인으로 치환된 돌연변이(R24C)는 활성 억제제인 p16^INK4a와 결합하지 않아 항상 활성을 갖는다(Sotillo et al., 2001). CDK4의 R24C 치환 돌연변이는 유전성과 비유전성 피부암 환자에서 발견되었으며, R24C 돌연변이를 갖는 마우스는 피부암을 비롯하여 내분비 계통의 암(endocrine tumor), 혈관육종(hemangiosarcoma) 등의 육종, 폐암, 간암, 림프종(lymphoma)을 일으키는 것으로 보고되었다. CDK4의 R24C 돌연변이와 MRS의 결합을 293T 세포에서 co-IP로 확인한 결과(도 9C), MRS는 야생형 CDK4와 비슷한 수준으로 CDK4의 R24C 돌연변이와 결합하는 것으로 관찰되었다. 이는 MRS가 p16^INK4a와 경쟁적으로 CDK4와 결합하지만, p16^INK4a가 결합하는 CDK4의 동일한 아미노산과 상호작용을 하는 것은 아니라는 것을 시사한다.

한편 MRS는 p16^INK4a와는 대조적으로, CDK4가 Cyclin D1과 결합하는 것을 억제하지는 않음을 GST pull-down 실험을 통해 확인하였다(도 9D). 이는 MRS와 CDK4의 결합과 p16^INK4a와 CDK4의 결합이 기능적으로 상이함을 나타낸다.

이상의 실험 결과는 p16^INK4a와 MRS는 CDK4의 동일한 위치에 결합하는 것은 아니지만, 서로 경쟁적으로 결합하며, MRS와 CDK4의 결합을 억제하여 CDK4 단백질 수준을 감소시키는 효과는 p16^INK4a를 발현하지 않는 세포에서 더욱 분명하게 발휘되는 것을 보여준다. 나아가 MRS는 야생형 CDK4 뿐만 아니라 R24C 돌연변이에도 결합하므로, MRS의 발현을 조절하거나, MRS와 CDK4의 R24C 돌연변이의 결합을 저해하는 제제를 이용하여 p16^INK4a의 조절을 받지 않는 CDK4 R24C 단백질을 불안정하게 하고, 돌연변이 CDK4의 인산화 활성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 5>

MRS 의 수준과 암 질환 사이의 상관관계

<5-1> 암 세포와 암 모델 동물에서의 MRS 와 암 질환의 상관성

세포 주기의 이상 조절은 종양 발생의 가장 중요한 원인이며, Cyclin D와 CDK4는 건강한 정상 세포에는 영향을 미치지 않지만 종양의 발생과 암 세포의 상태를 유지하는데 필수적임이 잘 알려져 있다(Choi et al., 2012; Vogelstein and Kinzler, 2004). CDK4는 유방암과 폐암에서 높은 수준으로 감지되는 단백질이기도 하다(An et al., 1999; Kim et al., 1997, Peurala et al., 2013; Samady et al., 2004; Wu et al., 2011; Yu et al., 2006). 앞선 실시예들에서 확인된 바와 같이, CDK4 단백질이 MRS에 의하여 안정화되는 것을 확인하였으므로, MRS의 수준과 암 발생 또는 진행 과정의 상관관계를 세포와 동물 모델에서 알아보았다.

먼저 다양한 유방암 세포주에서 MRS와 CDK4의 단백질 발현 수준을 면역 블롯으로 확인하고 정량화한 결과(도 10A), 대체적으로 p16^INK4a를 발현하지 않는 세포에서 MRS의 발현 수준이 높으면 CDK4 수준도 높고, MRS의 발현 수준이 낮으면 CDK4 수준도 낮은 것으로 나타났다.

MRS와 CDK4 단백질 수준의 상관관계 그리고 MRS에 의한 CDK4 조절이 암 발생에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MRS에 대한 shRNA(sh-MRS) 또는 대조군 shRNA(sh-Cont)를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 유방암 세포를 이용하여 부착 비의존성 연한천 실험(anchorage independent soft agar assay)을 실시하였다(도 10B). MRS의 발현이 억제된 세포(sh-MRS)에서는 대조군(sh-Cont)과 비교하여 암 세포로 형질변환 비율(transformability)이 현저하게 낮은 것으로 관찰되었다.

또한 MRS의 발현 억제가 종양 발생 또는 암의 진행에 미치는 영향을 체내에서 확인하기 위하여 sh-MRS 또는 sh-Cont를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 유방암 세포를 마우스 배측면에 주입하여 암의 발생과 성장 결과를 관찰하는 이종이식(xenograft) 실험을 실시하였다(도 10C). MRS의 발현이 억제된 유방암 세포를 주입한 마우스(sh-MRS)는 MRS의 발현이 억제되지 않은 유방암 세포를 주입한 마우스(sh-Cont)와 비교하여 실험 기간 동안 체중에는 큰 차이가 없었으나(도 10D), 종양 성장 속도는 현저하게 감소한 것으로 관찰되었다(도 10E). 또한 sh-MRS로 MRS의 발현이 억제된 유방암 세포에서 유래한 종양 조직에서는 MRS와 CDK4, 그리고 세포 분열의 마커인 Ki-67의 발현 수준도 sh-Cont을 발현하는 유방암 세포에서 유래한 종양 조직과 비교하여 현저하게 감소한 것으로 나타났다. 즉, MRS의 발현을 억제하여 CDK4 단백질 수준을 감소시키는 것이 종양의 성장을 억제하는 데 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다.

<5-2> 암 환자에서 관찰되는 MRS 와 암 질환의 상관성

MRS의 수준과 암 발생 또는 진행 과정의 상관관계를 암 환자에서 알아보았다.

유방암 환자(도 11A, 재발없는 생존률, RFS)와 폐암 환자(도 11B, 전체 생존률, OS)에서 MRS의 발현 수준과 생존율의 상관성을 확인한 결과, 유방암과 폐암에서 모두 MRS의 발현 수준이 높은 환자들은 MRS의 발현 수준이 낮은 환자와 비교하여 생존률이 감소하여 예후가 좋지 않은 것으로 나타났다.

암 진행에 있어서 MRS4와 CDK4 관련 신호 전달 단백질의 상관관계를 파악하기 위하여, 272개의 유방암 조직을 포함하고 있는 조직 마이크로 어레이(tissue micro array, TMA)를 MRS, CDK4, Cyclin D1, pRb와 p16^INK4a에 대한 항체로 염색하고, 각각의 단백질에 대하여 발현 수준을 나타내는 점수를 부여하여 발현 정도를 분석하였다(도 11C). 분석한 유방암 조직 중 p16^INK4a를 발현하지 않는 조직이 전체의 74.9%에 달하여, 유방암에서 p16^INK4a의 발현이 상당히 높은 비율로 정상 상태에서 벗어나 있는 것으로 나타났다. p16^INK4a를 발현하지 않는 유방암 조직에서는 MRS의 발현 수준과 CDK4의 발현 수준이 높은 상관관계를 나타낸 반면(도 11D), p16^INK4a를 발현하는 유방암 조직에서는 MRS와 CDK4의 발현 수준 사이에 아무런 상관성이 관찰되지 않았다(도 11E).

MRS가 CDK4 단백질을 안정화하면, CDK4 뿐만 아니라 CDK4에 의해 활성화되는 하부 신호 전달의 강화 효과가 나타나게 된다. 따라서 앞서 분석한 암 조직의 단백질 발현의 상관관계에서 MRS와 CDK4 사이에 높은 상관관계가 존재하면, CDK4와 결합하는 Cyclin D1, 그리고 CDK4에 의해 인산화되는 Rb에 이르는 CDK4-Cyclin D1-pRb로 이어지는 단백질에서 MRS와 연속적인 상관관계가 존재할 가능성이 커진다. CDK4-Cyclin D1-pRb에서 MRS와 연속적인 상관관계를 보이는 경우, 각각의 단백질의 발현 점수의 합에 가산점(additional point, AP)을 더하여 가중치 합산(weighted sum of score, WSS)을 계산하는 방식으로 연속적 상관관계 가능성을 고려하여 분석하였다. 구체적인 가산점 부여 기준은 표 2에 기재한 바와 같다. p16^INK4a를 발현하지 않는 암 조직에서는 MRS 수준이 높은 조직(MRSH)의 WSS이 MRS 수준이 낮은 조직(MRSL)과 비교하여 현저하게 증가하였으나(도 11F), p16^INK4a를 발현하는 암 조직에서는 MRSH와 MRSL의 WSS 사이에 유의한 차이가 없었다(도 11G).

이상의 세포 실험과 동물 실험, 그리고 암 환자 조직의 단백질 발현 분석 결과는 MRS가 CDK4 단백질과의 결합을 통해 암의 발생 또는 진행과 밀접하게 관련되어 있으며, 특히 p16^INK4a를 발현하지 않는 암 조직에서 MRS와 CDK4의 기능적인 상관관계가 높게 나타나는 것을 관찰하였다. 이는 MRS의 발현을 억제하거나 MRS와 CDK4의 결합을 억제함으로써, 특히 p16^INK4a를 발현하지 않는 암에서 CDK4 단백질의 수준을 감소시키고, 암의 진행을 효과적으로 막을 수 있음을 제시한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 또는 이의 단편과 CDK4(cyclin-dependent kinase 4) 또는 이의 단편을 이용하여 MRS와 CDK4의 결합 수준을 감소시키는 물질을 항암제로 선별하는 항암제 스크리닝 방법을 이용하여 전혀 새로운 작용 기작의 항암제를 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물은 MRS의 발현을 억제하거나 MRS와 CDK4의 결합을 억제하여 CDK4 단백질의 수준을 낮추므로 특히 p16^INK4a를 발현하지 않는 암 질환용 치료제를 개발하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Methods for screening anti-cancer agents inhibiting interactions between MRS and CDK4 <130> NP15-0109 <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 900 <212> PRT <213> Homo sapiens MRS protein (NP_004981.2) <400> 1 Met Arg Leu Phe Val Ser Asp Gly Val Pro Gly Cys Leu Pro Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Glu Val Leu Ile Ser Thr 20 25 30 Val Gly Pro Glu Asp Cys Val Val Pro Phe Leu Thr Arg Pro Lys Val 35 40 45 Pro Val Leu Gln Leu Asp Ser Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Thr Ser Ala 50 55 60 Ile Cys Arg Tyr Phe Phe Leu Leu Ser Gly Trp Glu Gln Asp Asp Leu 65 70 75 80 Thr Asn Gln Trp Leu Glu Trp Glu Ala Thr Glu Leu Gln Pro Ala Leu 85 90 95 Ser Ala Ala Leu Tyr Tyr Leu Val Val Gln Gly Lys Lys Gly Glu Asp 100 105 110 Val Leu Gly Ser Val Arg Arg Ala Leu Thr His Ile Asp His Ser Leu 115 120 125 Ser Arg Gln Asn Cys Pro Phe Leu Ala Gly Glu Thr Glu Ser Leu Ala 130 135 140 Asp Ile Val Leu Trp Gly Ala Leu Tyr Pro Leu Leu Gln Asp Pro Ala 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cgcttctatc tgctgtacat tcggcctgag ggccaggaca gtgctttctc ctggacggac 120 ctgctgctga agaataattc tgagctgctt aacaacctgg gcaacttcat caacagagct 180 gggatgtttg tgtctaagtt ctttgggggc tatgtgcctg agatggtgct cacccctgat 240 gatcagcgcc tgctggccca tgtcaccctg gagctccagc actatcacca gctacttgag 300 aaggttcgga tccgggatgc cttgcgcagt atcctcacca tatctcgaca tggcaaccaa 360 tatattcagg tgaatgagcc ctggaagcgg attaaaggca gtgaggctga caggcaacgg 420 gcaggaacag tgactggctt ggcagtgaat atagctgcct tgctctctgt catgcttcag 480 ccttacatgc ccacggttag tgccacaatc caggcccagc tgcagctccc acctccagcc 540 tgcagtatcc tgctgacaaa cttcctgtgt accttaccag caggacacca gattggcaca 600 gtcagtccct tgttccaaaa attggaaaat gaccagattg aaagtttaag gcagcgcttt 660 ggagggggcc aggcaaaaac gtccccgaag ccagcagttg tagagactgt tacaacagcc 720 aagccacagc agatacaagc gctgatggat gaagtgacaa aacaaggaaa cattgtccga 780 gaactgaaag cacaaaaggc agacaagaac gaggttgctg cggaggtggc gaaactcttg 840 gatctaaaga aacagttggc tgtagctgag gggaaacccc ctgaagcccc taaaggcaag 900 aagaaaaag 909 <210> 9 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens MRS F4 fragment protein (1-597 amino acids) <400> 9 Met Arg Leu Phe Val Ser Asp Gly Val Pro Gly Cys Leu Pro Val Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Glu Val Leu Ile Ser Thr 20 25 30 Val Gly Pro Glu Asp Cys Val Val Pro Phe Leu Thr Arg Pro Lys Val 35 40 45 Pro Val Leu Gln Leu Asp Ser Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Thr Ser Ala 50 55 60 Ile Cys Arg Tyr Phe Phe Leu Leu Ser Gly Trp Glu Gln Asp Asp Leu 65 70 75 80 Thr Asn Gln Trp Leu Glu Trp Glu Ala Thr Glu Leu Gln Pro Ala Leu 85 90 95 Ser Ala Ala Leu Tyr Tyr Leu Val Val Gln Gly Lys Lys Gly Glu Asp 100 105 110 Val Leu Gly Ser Val Arg Arg Ala Leu Thr His Ile Asp His Ser Leu 115 120 125 Ser Arg Gln Asn Cys Pro Phe Leu Ala Gly Glu Thr Glu Ser Leu Ala 130 135 140 Asp Ile Val Leu Trp Gly Ala Leu Tyr Pro Leu Leu Gln Asp Pro Ala 145 150 155 160 Tyr Leu Pro Glu Glu Leu Ser Ala Leu His Ser Trp Phe Gln Thr Leu 165 170 175 Ser Thr Gln Glu Pro Cys Gln Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Gln 180 185 190 Gln Gly Val Leu Ala Leu Arg Pro Tyr Leu Gln Lys Gln Pro Gln Pro 195 200 205 Ser Pro Ala Glu Gly Arg Ala Val Thr Asn Glu Pro Glu Glu Glu Glu 210 215 220 Leu Ala Thr Leu Ser Glu Glu Glu Ile Ala Met Ala Val Thr Ala Trp 225 230 235 240 Glu Lys Gly Leu Glu Ser Leu Pro Pro Leu Arg Pro Gln Gln Asn Pro 245 250 255 Val Leu Pro Val Ala Gly Glu Arg Asn Val Leu Ile Thr Ser Ala Leu 260 265 270 Pro Tyr Val Asn Asn Val Pro His Leu Gly Asn Ile Ile Gly Cys Val 275 280 285 Leu Ser Ala Asp Val Phe Ala Arg Tyr Ser Arg Leu Arg Gln Trp Asn 290 295 300 Thr Leu Tyr Leu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Thr Glu Thr 305 310 315 320 Lys Ala Leu Glu Glu Gly Leu Thr Pro Gln Glu Ile Cys Asp Lys Tyr 325 330 335 His Ile Ile His Ala Asp Ile Tyr Arg Trp Phe Asn Ile Ser Phe Asp 340 345 350 Ile Phe Gly Arg Thr Thr Thr Pro Gln Gln Thr Lys Ile Thr Gln Asp 355 360 365 Ile Phe Gln Gln Leu Leu Lys Arg Gly Phe Val Leu Gln Asp Thr Val 370 375 380 Glu Gln Leu Arg Cys Glu His Cys Ala Arg Phe Leu Ala Asp Arg Phe 385 390 395 400 Val Glu Gly Val Cys Pro Phe Cys Gly Tyr Glu Glu Ala Arg Gly Asp 405 410 415 Gln Cys Asp Lys Cys Gly Lys Leu Ile Asn Ala Val Glu Leu Lys Lys 420 425 430 Pro Gln Cys Lys Val Cys Arg Ser Cys Pro Val Val Gln Ser Ser Gln 435 440 445 His Leu Phe Leu Asp Leu Pro Lys Leu Glu Lys Arg Leu Glu Glu Trp 450 455 460 Leu Gly Arg Thr Leu Pro Gly Ser Asp Trp Thr Pro Asn Ala Gln Phe 465 470 475 480 Ile Thr Arg Ser Trp Leu Arg Asp Gly Leu Lys Pro Arg Cys Ile Thr 485 490 495 Arg Asp Leu Lys Trp Gly Thr Pro Val Pro Leu Glu Gly Phe Glu Asp 500 505 510 Lys Val Phe Tyr Val Trp Phe Asp Ala Thr Ile Gly Tyr Leu Ser Ile 515 520 525 Thr Ala Asn Tyr Thr Asp Gln Trp Glu Arg Trp Trp Lys Asn Pro Glu 530 535 540 Gln Val Asp Leu Tyr Gln Phe Met Ala Lys Asp Asn Val Pro Phe His 545 550 555 560 Ser Leu Val Phe Pro Cys Ser Ala Leu Gly Ala Glu Asp Asn Tyr Thr 565 570 575 Leu Val Ser His Leu Ile Ala Thr Glu Tyr Leu Asn Tyr Glu Asp Gly 580 585 590 Lys Phe Ser Lys Ser 595 <210> 10 <211> 1791 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens MRS F4 fragment mRNA <400> 10 atgagactgt tcgtgagtga tggcgtcccg ggttgcttgc cggtgctggc cgccgccggg 60 agagcccggg gcagagcaga ggtgctcatc agcactgtag gcccggaaga ttgtgtggtc 120 ccgttcctga cccggcctaa ggtccctgtc ttgcagctgg atagcggcaa ctacctcttc 180 tccactagtg caatctgccg atattttttt ttgttatctg gctgggagca agatgacctc 240 actaaccagt ggctggaatg ggaagcgaca gagctgcagc cagctttgtc tgctgccctg 300 tactatttag tggtccaagg caagaagggg gaagatgttc ttggttcagt gcggagagcc 360 ctgactcaca ttgaccacag cttgagtcgt cagaactgtc ctttcctggc tggggagaca 420 gaatctctag ccgacattgt tttgtgggga gccctatacc cattactgca agatcccgcc 480 tacctccctg aggagctgag tgccctgcac agctggttcc agacactgag tacccaggaa 540 ccatgtcagc gagctgcaga gactgtactg aaacagcaag gtgtcctggc tctccggcct 600 tacctccaaa agcagcccca gcccagcccc gctgagggaa gggctgtcac caatgagcct 660 gaggaggagg agctggctac cctatctgag gaggagattg ctatggctgt tactgcttgg 720 gagaagggcc tagaaagttt gcccccgctg cggccccagc agaatccagt gttgcctgtg 780 gctggagaaa ggaatgtgct catcaccagt gccctccctt acgtcaacaa tgtcccccac 840 cttgggaaca tcattggttg tgtgctcagt gccgatgtct ttgccaggta ctctcgcctc 900 cgccagtgga acaccctcta tctgtgtggg acagatgagt atggtacagc aacagagacc 960 aaggctctgg aggagggact aaccccccag gagatctgcg acaagtacca catcatccat 1020 gctgacatct accgctggtt taacatttcg tttgatattt ttggtcgcac caccactcca 1080 cagcagacca aaatcaccca ggacattttc cagcagttgc tgaaacgagg ttttgtgctg 1140 caagatactg tggagcaact gcgatgtgag cactgtgctc gcttcctggc tgaccgcttc 1200 gtggagggcg tgtgtccctt ctgtggctat gaggaggctc ggggtgacca gtgtgacaag 1260 tgtggcaagc tcatcaatgc tgtcgagctt aagaagcctc agtgtaaagt ctgccgatca 1320 tgccctgtgg tgcagtcgag ccagcacctg tttctggacc tgcctaagct ggagaagcga 1380 ctggaggagt ggttggggag gacattgcct ggcagtgact ggacacccaa tgcccagttt 1440 atcacccgtt cttggcttcg ggatggcctc aagccacgct gcataacccg agacctcaaa 1500 tggggaaccc ctgtaccctt agaaggtttt gaagacaagg tattctatgt ctggtttgat 1560 gccactattg gctatctgtc catcacagcc aactacacag accagtggga gagatggtgg 1620 aagaacccag agcaagtgga cctgtatcag ttcatggcca aagacaatgt tcctttccat 1680 agcttagtct ttccttgctc agccctagga gctgaggata actatacctt ggtcagccac 1740 ctcattgcta cagagtacct gaactatgag gatgggaaat tctctaagag c 1791 <210> 11 <211> 634 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens MRS F5 fragment protein (267-900 amino acids) <400> 11 Leu Ile Thr Ser Ala Leu Pro Tyr Val Asn Asn Val Pro His Leu Gly 1 5 10 15 Asn Ile Ile Gly Cys Val Leu Ser Ala Asp Val Phe Ala Arg Tyr Ser 20 25 30 Arg Leu Arg Gln Trp Asn Thr Leu Tyr Leu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr 35 40 45 Gly Thr Ala Thr Glu Thr Lys Ala Leu Glu Glu Gly Leu Thr Pro Gln 50 55 60 Glu Ile Cys Asp Lys Tyr His Ile Ile His Ala Asp Ile Tyr Arg Trp 65 70 75 80 Phe Asn Ile Ser Phe Asp Ile Phe Gly Arg Thr Thr Thr Pro Gln Gln 85 90 95 Thr Lys Ile Thr Gln Asp Ile Phe Gln Gln Leu Leu Lys Arg Gly Phe 100 105 110 Val Leu Gln Asp Thr Val Glu Gln Leu Arg Cys Glu His Cys Ala Arg 115 120 125 Phe Leu Ala Asp Arg Phe Val Glu Gly Val Cys Pro Phe Cys Gly Tyr 130 135 140 Glu Glu Ala Arg Gly Asp Gln Cys Asp Lys Cys Gly Lys Leu Ile Asn 145 150 155 160 Ala Val Glu Leu Lys Lys Pro Gln Cys Lys Val Cys Arg Ser Cys Pro 165 170 175 Val Val Gln Ser Ser Gln His Leu Phe Leu Asp Leu Pro Lys Leu Glu 180 185 190 Lys Arg Leu Glu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Leu Pro Gly Ser Asp Trp 195 200 205 Thr Pro Asn Ala Gln Phe Ile Thr Arg Ser Trp Leu Arg Asp Gly Leu 210 215 220 Lys Pro Arg Cys Ile Thr Arg Asp Leu Lys Trp Gly Thr Pro Val Pro 225 230 235 240 Leu Glu Gly Phe Glu Asp Lys Val Phe Tyr Val Trp Phe Asp Ala Thr 245 250 255 Ile Gly Tyr Leu Ser Ile Thr Ala Asn Tyr Thr Asp Gln Trp Glu Arg 260 265 270 Trp Trp Lys Asn Pro Glu Gln Val Asp Leu Tyr Gln Phe Met Ala Lys 275 280 285 Asp Asn Val Pro Phe His Ser Leu Val Phe Pro Cys Ser Ala Leu Gly 290 295 300 Ala Glu Asp Asn Tyr Thr Leu Val Ser His Leu Ile Ala Thr Glu Tyr 305 310 315 320 Leu Asn Tyr Glu Asp Gly Lys Phe Ser Lys Ser Arg Gly Val Gly Val 325 330 335 Phe Gly Asp Met Ala Gln Asp Thr Gly Ile Pro Ala Asp Ile Trp Arg 340 345 350 Phe Tyr Leu Leu Tyr Ile Arg Pro Glu Gly Gln Asp Ser Ala Phe Ser 355 360 365 Trp Thr Asp Leu Leu Leu Lys Asn Asn Ser Glu Leu Leu Asn Asn Leu 370 375 380 Gly Asn Phe Ile Asn Arg Ala Gly Met Phe Val Ser Lys Phe Phe Gly 385 390 395 400 Gly Tyr Val Pro Glu Met Val Leu Thr Pro Asp Asp Gln Arg Leu Leu 405 410 415 Ala His Val Thr Leu Glu Leu Gln His Tyr His Gln Leu Leu Glu Lys 420 425 430 Val Arg Ile Arg Asp Ala Leu Arg Ser Ile Leu Thr Ile Ser Arg His 435 440 445 Gly Asn Gln Tyr Ile Gln Val Asn Glu Pro Trp Lys Arg Ile Lys Gly 450 455 460 Ser Glu Ala Asp Arg Gln Arg Ala Gly Thr Val Thr Gly Leu Ala Val 465 470 475 480 Asn Ile Ala Ala Leu Leu Ser Val Met Leu Gln Pro Tyr Met Pro Thr 485 490 495 Val Ser Ala Thr Ile Gln Ala Gln Leu Gln Leu Pro Pro Pro Ala Cys 500 505 510 Ser Ile Leu Leu Thr Asn Phe Leu Cys Thr Leu Pro Ala Gly His Gln 515 520 525 Ile Gly Thr Val Ser Pro Leu Phe Gln Lys Leu Glu Asn Asp Gln Ile 530 535 540 Glu Ser Leu Arg Gln Arg Phe Gly Gly Gly Gln Ala Lys Thr Ser Pro 545 550 555 560 Lys Pro Ala Val Val Glu Thr Val Thr Thr Ala Lys Pro Gln Gln Ile 565 570 575 Gln Ala Leu Met Asp Glu Val Thr Lys Gln Gly Asn Ile Val Arg Glu 580 585 590 Leu Lys Ala Gln Lys Ala Asp Lys Asn Glu Val Ala Ala Glu Val Ala 595 600 605 Lys Leu Leu Asp Leu Lys Lys Gln Leu Ala Val Ala Glu Gly Lys Pro 610 615 620 Pro Glu Ala Pro Lys Gly Lys Lys Lys Lys 625 630 <210> 12 <211> 1902 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens MRS F5 fragment mRNA <400> 12 ctcatcacca gtgccctccc ttacgtcaac aatgtccccc accttgggaa catcattggt 60 tgtgtgctca gtgccgatgt ctttgccagg tactctcgcc tccgccagtg gaacaccctc 120 tatctgtgtg ggacagatga gtatggtaca gcaacagaga ccaaggctct ggaggaggga 180 ctaacccccc aggagatctg cgacaagtac cacatcatcc atgctgacat ctaccgctgg 240 tttaacattt cgtttgatat ttttggtcgc accaccactc cacagcagac caaaatcacc 300 caggacattt tccagcagtt gctgaaacga ggttttgtgc tgcaagatac tgtggagcaa 360 ctgcgatgtg agcactgtgc tcgcttcctg gctgaccgct tcgtggaggg cgtgtgtccc 420 ttctgtggct atgaggaggc tcggggtgac cagtgtgaca agtgtggcaa gctcatcaat 480 gctgtcgagc ttaagaagcc tcagtgtaaa gtctgccgat catgccctgt ggtgcagtcg 540 agccagcacc tgtttctgga cctgcctaag ctggagaagc gactggagga gtggttgggg 600 aggacattgc ctggcagtga ctggacaccc aatgcccagt ttatcacccg ttcttggctt 660 cgggatggcc tcaagccacg ctgcataacc cgagacctca aatggggaac ccctgtaccc 720 ttagaaggtt ttgaagacaa ggtattctat gtctggtttg atgccactat tggctatctg 780 tccatcacag ccaactacac agaccagtgg gagagatggt ggaagaaccc agagcaagtg 840 gacctgtatc agttcatggc caaagacaat gttcctttcc atagcttagt ctttccttgc 900 tcagccctag gagctgagga taactatacc ttggtcagcc acctcattgc tacagagtac 960 ctgaactatg aggatgggaa attctctaag agccgcggtg tgggagtgtt tggggacatg 1020 gcccaggaca cggggatccc tgctgacatc tggcgcttct atctgctgta cattcggcct 1080 gagggccagg acagtgcttt ctcctggacg gacctgctgc tgaagaataa ttctgagctg 1140 cttaacaacc tgggcaactt catcaacaga gctgggatgt ttgtgtctaa gttctttggg 1200 ggctatgtgc ctgagatggt gctcacccct gatgatcagc gcctgctggc ccatgtcacc 1260 ctggagctcc agcactatca ccagctactt gagaaggttc ggatccggga tgccttgcgc 1320 agtatcctca ccatatctcg acatggcaac caatatattc aggtgaatga gccctggaag 1380 cggattaaag gcagtgaggc tgacaggcaa cgggcaggaa cagtgactgg cttggcagtg 1440 aatatagctg ccttgctctc tgtcatgctt cagccttaca tgcccacggt tagtgccaca 1500 atccaggccc agctgcagct cccacctcca gcctgcagta tcctgctgac aaacttcctg 1560 tgtaccttac cagcaggaca ccagattggc acagtcagtc ccttgttcca aaaattggaa 1620 aatgaccaga ttgaaagttt aaggcagcgc tttggagggg gccaggcaaa aacgtccccg 1680 aagccagcag ttgtagagac tgttacaaca gccaagccac agcagataca agcgctgatg 1740 gatgaagtga caaaacaagg aaacattgtc cgagaactga aagcacaaaa ggcagacaag 1800 aacgaggttg ctgcggaggt ggcgaaactc ttggatctaa agaaacagtt ggctgtagct 1860 gaggggaaac cccctgaagc ccctaaaggc aagaagaaaa ag 1902 <210> 13 <211> 303 <212> PRT <213> Homo sapiens CDK4 WT protein (NP_000066.1) <400> 13 Met Ala Thr Ser Arg Tyr Glu Pro Val Ala Glu Ile Gly Val Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Arg Asp Pro His Ser Gly His Phe Val 20 25 30 Ala Leu Lys Ser Val Arg Val Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Leu Pro Ile Ser Thr Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Arg Arg Leu Glu 50 55 60 Ala Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Met Asp Val Cys Ala Thr 65 70 75 80 Ser Arg Thr Asp Arg Glu Ile Lys Val Thr Leu Val Phe Glu His Val 85 90 95 Asp Gln Asp Leu Arg Thr Tyr Leu Asp Lys Ala Pro Pro Pro Gly Leu 100 105 110 Pro Ala Glu Thr Ile Lys Asp Leu Met Arg Gln Phe Leu Arg Gly Leu 115 120 125 Asp Phe Leu His Ala Asn Cys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu 130 135 140 Asn Ile Leu Val Thr Ser Gly Gly Thr Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly 145 150 155 160 Leu Ala Arg Ile Tyr Ser Tyr Gln Met Ala Leu Thr Pro Val Val Val 165 170 175 Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu Gln Ser Thr Tyr Ala 180 185 190 Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Met Phe 195 200 205 Arg Arg Lys Pro Leu Phe Cys Gly Asn Ser Glu Ala Asp Gln Leu Gly 210 215 220 Lys Ile Phe Asp Leu Ile Gly Leu Pro Pro Glu Asp Asp Trp Pro Arg 225 230 235 240 Asp Val Ser Leu Pro Arg Gly Ala Phe Pro Pro Arg Gly Pro Arg Pro 245 250 255 Val Gln Ser Val Val Pro Glu Met Glu Glu Ser Gly Ala Gln Leu Leu 260 265 270 Leu Glu Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Ser Ala Phe Arg 275 280 285 Ala Leu Gln His Ser Tyr Leu His Lys Asp Glu Gly Asn Pro Glu 290 295 300 <210> 14 <211> 912 <212> DNA <213> Homo sapiens CDK4 WT mRNA (NM_000075.3) <400> 14 atggctacct ctcgatatga gccagtggct gaaattggtg tcggtgccta tgggacagtg 60 tacaaggccc gtgatcccca cagtggccac tttgtggccc tcaagagtgt gagagtcccc 120 aatggaggag gaggtggagg aggccttccc atcagcacag ttcgtgaggt ggctttactg 180 aggcgactgg aggcttttga gcatcccaat gttgtccggc tgatggacgt ctgtgccaca 240 tcccgaactg accgggagat caaggtaacc ctggtgtttg agcatgtaga ccaggaccta 300 aggacatatc tggacaaggc acccccacca ggcttgccag ccgaaacgat caaggatctg 360 atgcgccagt ttctaagagg cctagatttc cttcatgcca attgcatcgt tcaccgagat 420 ctgaagccag agaacattct ggtgacaagt ggtggaacag tcaagctggc tgactttggc 480 ctggccagaa tctacagcta ccagatggca cttacacccg tggttgttac actctggtac 540 cgagctcccg aagttcttct gcagtccaca tatgcaacac ctgtggacat gtggagtgtt 600 ggctgtatct ttgcagagat gtttcgtcga aagcctctct tctgtggaaa ctctgaagcc 660 gaccagttgg gcaaaatctt tgacctgatt gggctgcctc cagaggatga ctggcctcga 720 gatgtatccc tgccccgtgg agcctttccc cccagagggc cccgcccagt gcagtcggtg 780 gtacctgaga tggaggagtc gggagcacag ctgctgctgg aaatgctgac ttttaaccca 840 cacaagcgaa tctctgcctt tcgagctctg cagcactctt atctacataa ggatgaaggt 900 aatccggagt ga 912 <210> 15 <211> 303 <212> PRT <213> Homo sapiens CDK4 R24C protein <400> 15 Met Ala Thr Ser Arg Tyr Glu Pro Val Ala Glu Ile Gly Val Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Cys Asp Pro His Ser Gly His Phe Val 20 25 30 Ala Leu Lys Ser Val Arg Val Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Leu Pro Ile Ser Thr Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Arg Arg Leu Glu 50 55 60 Ala Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Met Asp Val Cys Ala Thr 65 70 75 80 Ser Arg Thr Asp Arg Glu Ile Lys Val Thr Leu Val Phe Glu His Val 85 90 95 Asp Gln Asp Leu Arg Thr Tyr Leu Asp Lys Ala Pro Pro Pro Gly Leu 100 105 110 Pro Ala Glu Thr Ile Lys Asp Leu Met Arg Gln Phe Leu Arg Gly Leu 115 120 125 Asp Phe Leu His Ala Asn Cys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu 130 135 140 Asn Ile Leu Val Thr Ser Gly Gly Thr Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly 145 150 155 160 Leu Ala Arg Ile Tyr Ser Tyr Gln Met Ala Leu Thr Pro Val Val Val 165 170 175 Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu Gln Ser Thr Tyr Ala 180 185 190 Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Met Phe 195 200 205 Arg Arg Lys Pro Leu Phe Cys Gly Asn Ser Glu Ala Asp Gln Leu Gly 210 215 220 Lys Ile Phe Asp Leu Ile Gly Leu Pro Pro Glu Asp Asp Trp Pro Arg 225 230 235 240 Asp Val Ser Leu Pro Arg Gly Ala Phe Pro Pro Arg Gly Pro Arg Pro 245 250 255 Val Gln Ser Val Val Pro Glu Met Glu Glu Ser Gly Ala Gln Leu Leu 260 265 270 Leu Glu Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Ser Ala Phe Arg 275 280 285 Ala Leu Gln His Ser Tyr Leu His Lys Asp Glu Gly Asn Pro Glu 290 295 300 <210> 16 <211> 912 <212> DNA <213> Homo sapiens CDK4 R24C mRNA <400> 16 atggctacct ctcgatatga gccagtggct gaaattggtg tcggtgccta tgggacagtg 60 tacaaggcct gtgatcccca cagtggccac tttgtggccc tcaagagtgt gagagtcccc 120 aatggaggag gaggtggagg aggccttccc atcagcacag ttcgtgaggt ggctttactg 180 aggcgactgg aggcttttga gcatcccaat gttgtccggc tgatggacgt ctgtgccaca 240 tcccgaactg accgggagat caaggtaacc ctggtgtttg agcatgtaga ccaggaccta 300 aggacatatc tggacaaggc acccccacca ggcttgccag ccgaaacgat caaggatctg 360 atgcgccagt ttctaagagg cctagatttc cttcatgcca attgcatcgt tcaccgagat 420 ctgaagccag agaacattct ggtgacaagt ggtggaacag tcaagctggc tgactttggc 480 ctggccagaa tctacagcta ccagatggca cttacacccg tggttgttac actctggtac 540 cgagctcccg aagttcttct gcagtccaca tatgcaacac ctgtggacat gtggagtgtt 600 ggctgtatct ttgcagagat gtttcgtcga aagcctctct tctgtggaaa ctctgaagcc 660 gaccagttgg gcaaaatctt tgacctgatt gggctgcctc cagaggatga ctggcctcga 720 gatgtatccc tgccccgtgg agcctttccc cccagagggc cccgcccagt gcagtcggtg 780 gtacctgaga tggaggagtc gggagcacag ctgctgctgg aaatgctgac ttttaaccca 840 cacaagcgaa tctctgcctt tcgagctctg cagcactctt atctacataa ggatgaaggt 900 aatccggagt ga 912 <210> 17 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens CDK4 N-terminal fragment protein (1-102 amino acids) <400> 17 Met Ala Thr Ser Arg Tyr Glu Pro Val Ala Glu Ile Gly Val Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Arg Asp Pro His Ser Gly His Phe Val 20 25 30 Ala Leu Lys Ser Val Arg Val Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Leu Pro Ile Ser Thr Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Arg Arg Leu Glu 50 55 60 Ala Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Met Asp Val Cys Ala Thr 65 70 75 80 Ser Arg Thr Asp Arg Glu Ile Lys Val Thr Leu Val Phe Glu His Val 85 90 95 Asp Gln Asp Leu Arg Thr 100 <210> 18 <211> 306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens CDK4 N-terminal fragment mRNA <400> 18 atggctacct ctcgatatga gccagtggct gaaattggtg tcggtgccta tgggacagtg 60 tacaaggccc gtgatcccca cagtggccac tttgtggccc tcaagagtgt gagagtcccc 120 aatggaggag gaggtggagg aggccttccc atcagcacag ttcgtgaggt ggctttactg 180 aggcgactgg aggcttttga gcatcccaat gttgtccggc tgatggacgt ctgtgccaca 240 tcccgaactg accgggagat caaggtaacc ctggtgtttg agcatgtaga ccaggaccta 300 aggaca 306 <210> 19 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against MRS <400> 19 cuaccgcugg uuuaacauuu cguuu 25 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against p16INK4a <400> 20 cgcaccgaau aguuacggu 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA against MRS (sequence as DNA) <400> 21 ggcgaaactc ttggatcta 19 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRS forward primer <400> 22 gaggatggga aattctctaa gagccg 26 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRS reverse primer <400> 23 ttggttgcca tgtcgagata tggtgaggat act 33 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK4 forward primer <400> 24 atggctacct ctcgatatga gcca 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDK4 reverse primer <400> 25 tcactccgga ttaccttcat cctt 24

Claims

(a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 서열번호 1의 MRS(methionyl-tRNA synthetase) 아미노산 서열 중 1 내지 266번째 아미노산을 포함하지 않는 단편과 서열번호 13 또는 15의 CDK4(cyclin-dependent kinase 4) 아미노산 서열 중 1 내지 102번째 아미노산을 포함하는 단편을 접촉시키는 단계;
(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 MRS 단편과 CDK4 단편의 결합을 측정하는 단계;
(c) 시험 물질 존재하에서의 MRS 단편과 CDK4 단편의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 MRS 단편과 CDK4 단편의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 MRS 단편과 CDK4 단편의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계;
(d) MRS 단편과 CDK4 단편의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및
(e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 항암제 스크리닝 방법은 상기 (d)와 (e) 사이에
(1) 시험 물질을 CDK4를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
(2) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CDK4 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 대조군 세포와 비교하여 CDK4 단백질 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 p16^INK4a를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 MRS의 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 596번째 라이신을 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 CDK4의 단편은 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제는 메치오닌 아미노산 유사체, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 천연추출물 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 p16^INK4a를 발현하지 않는 암인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장암, 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 자궁경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 경구암, 중피종, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 신장암, 위암, 피부암, 기저세포암, 흑색종, 편평세포암종, 구강편평세포암종, 대장직장암, 교모세포종, 자궁내막암 및 악성뇌교종으로 이루어진 군에서 선택된 암인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제8항 중 어느 한 항의 Boc-S-trityl-L-homocysteine, Fmoc-DL-selenomethionine, Fmoc-DL-ethionine, Fmoc-Sec(Mob)-OH(FSMO), Fmoc-α-methyl-DL-methionine, 서열번호 19 또는 21로 표시되는 염기서열을 포함하는 siRNA, shRNA 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 스크리닝 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
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