CN111057640A

CN111057640A - 一种原位研究细胞力学特性的实验装置

Info

Publication number: CN111057640A
Application number: CN201911247087.1A
Authority: CN
Inventors: 杨鹏飞; 苑曦宸
Original assignee: Northwestern Polytechnical University; Taicang Yangtze River Delta Research Institute of Northwestern Polytechnical University
Current assignee: Northwestern Polytechnical University; Taicang Yangtze River Delta Research Institute of Northwestern Polytechnical University
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2020-04-24

Abstract

本发明公开了一种结合荧光检测的可原位研究细胞力学特性的实验装置，包括加载模块、用于精确定量加载细胞所在的组织，使细胞产生适当的形变；控制模块，用于控制加载模块的加载幅度；信号反馈模块，用于实时监测加载载荷幅度及细胞所在组织的形变量；激光共聚焦显微镜，用于激发细胞胞内的荧光，观察细胞原位状态下的尺寸和三维形貌变化。本发明改变了传统方法中仅能体外培养条件下研究细胞力学特性的方法，结合激光共聚焦显微镜技术，建立了细胞力学特性研究的原位观测技术及实验平台，使获得更接近生理环境下的细胞力学行为成为可能，该发明可用于骨、关节软骨等多种组织活细胞原位力学特性的研究。

Description

一种原位研究细胞力学特性的实验装置

技术领域

本发明涉及一种原位研究细胞力学特性的实验装置。

背景技术

适当的力学环境是维持生物机体多个组织正常结构和功能的必要条件。正常生理状态下，机体组织承受来自外界和周边组织的复杂力学载荷。力学载荷传递至组织中的细胞，调节细胞的相关蛋白质合成、分解的代谢过程。在“力”这一物理信号转换成生物化学信号的过程中，细胞对力学载荷的正常响应在多种生理和病理过程中发挥关键作用。力学载荷引起的适当细胞形变有利于细胞的正常功能和代谢，细胞自身的力学特性对这一特性至关重要。

细胞的力学特性与其响应周边力学环境的过程密切相关。理解不同外界力学环境下细胞力学特性的变化有助于深入了解机体组织损伤、退化及修复的可能机制，从而针对性的开发和使用干预措施。

体内生理环境下多数细胞处于周边基质的包围中，目前细胞力学特性的研究大多基于体外培养的细胞，无法有效的模拟生理条件下基质渗透压、周边基质预应力等物理环境。脱离了生理环境的细胞可能无法完全表现其真实的力学特性。因此，利用体外培养细胞进行其力学特性的研究有很大的局限性。

目前进行细胞力学特性研究的技术大多基于细胞力学加载。单细胞力学研究的技术主要有微管吮吸、磁控加载、原子力显微、微柱阵列基底等技术，上述技术可结合荧光检测，在单细胞层次研究力学信号与生物学响应的关系。此外，细胞基底加载技术，如弹性基底技术、三维支架加载技术等，也常用于研究模拟生理环境下的多细胞的受力状态。然而，上述技术均基于分离细胞培养，无法实现原位细胞加载和原位观察细胞力学特性。

发明内容

针对现有技术中存在的局限，本发明的目的在于提供一种结合荧光检测的原位研究细胞力学特性的实验装置，可以实现原位对细胞进行力学加载的同时观察细胞力学特性，并研究细胞响应力学刺激的生物学效应。

本发明的一种结合荧光检测的原位研究细胞力学特性的实验装置包括：

加载模块，用于精确定量加载细胞所处的组织，使细胞产生适当的形变；

控制模块，用于控制加载模块的加载幅度；

信号反馈模块，用于实时监测加载载荷幅度及细胞所处组织的形变量；

激光共聚焦显微镜，用于激发细胞胞内的荧光，观察细胞原位状态下的尺寸和三维形貌变化。

优选地，所述加载模块包括：

加载执行单元，用于对实验样品施加精确定量的压力，由压电陶瓷驱动器、加载载荷定向组件，以及负重平衡调节组件组成，分别实现提供驱动力，固定载荷加载方向，以及平衡加载单元的负重；

压力检测单元，用于检测加载执行单元加载至样品的压力；

位移检测单元，用于检测加载执行单元加载压力时加载端的移动距离，即实验样品受压缩的距离；

样品固定单元，将骨骼或关节软骨等实验样品固定于加载模块；

生理环境维持单元，用于提供样品所需培养液、缓冲液或其他试剂，模拟实验样品所处的生理或病理环境；

优选地，所述加载模块包括：

压电陶瓷驱动器电压参数控制单元，以及信号输入控制计算机，用于控制加载执行单元中的压电陶瓷驱动器产生特定的推力加载实验样品；

优选地，所述信号反馈模块包括：

压力信号采集单元、位移信号采集单元以及信号采集储存计算机，分别采集处理加载模块中压力检测单元核位移检测单元采集的压力和位移信号；

优选地，所述激光共聚焦显微镜包括：

显微镜镜体、镜头，用于直接观察实验样品中细胞的荧光信号；

载物台，用于放置加载模块；

激光光源，用于产生激发细胞内荧光的激光；

计算机及信号控制采集单元，用于控制显微镜采集微弱的荧光信号，并进行图像数据分析、处理及三维重建工作。

本发明的优点如下：

本发明改变了传统方法中仅能体外分离培养条件下研究细胞力学特性的方法，结合激光共聚焦显微镜技术，建立了细胞力学特性研究的原位观测技术及实验平台，使获得更接近生理环境下的细胞力学行为成为可能，该发明可用于骨、关节软骨等多种组织活细胞原位力学行为的研究。

附图说明

图1为本发明原理示意图；

图2为本发明结构示意图；

图3为实施例中生理环境维持单元示意图；

图4为实施例中加载模块示意图。

1、控制模块；2、加载模块；3、信号反馈模块；4、激光共聚焦显微镜；11、加载模块后盖；12、加载模块外筒；13、位移检测单元；14、负重平衡调节组件；15、物镜；16、载物台；17、培养液、缓冲液或其他试剂；18、骨水泥；19、样品固定单元外壳；20、加载载荷定向组件；21、推杆；22：压电陶瓷驱动器；23、压力检测单元；24、软管；25、储液器； 26、蠕动泵；27、液体出口；28、液体进口；29、油层；30、玻璃窗口；31：加载模块前盖；

具体实施方式

如图1所示，本发明是一种可原位研究细胞力学特性的实验装置，由控制模块1、加载模块2、信号反馈模块3以及激光共聚焦显微镜4组成。

控制模块1由压电陶瓷输入电压控制单元和计算机组成。本实施例中压电陶瓷输入电压控制单元采用博实精密测控有限公司HPV压电陶瓷驱动电源，可输出正弦波、方波、锯齿波等波形，驱动电压幅度幅值为300V，其他波形由计算机编程控制压电陶瓷驱动电源。

如图2所示，加载模块2由加载执行单元、压力检测单元23、位移检测单元13、样品固定单元以及生理环境维持单元。加载执行单元由负重平衡调节组件14，加载载荷定向组件20 以及压电陶瓷驱动器22(PI，德国)组成。加载执行单元主体结构主要为不锈钢，包括加载模块后盖11、加载模块外筒12、加载模块前盖31、样品固定单元外壳19、；推杆21、液体出口27、液体进口28均为不锈钢制作。本实施例中负重平衡调节组件14为三个适度弹性的弹簧。均匀分布在柱状压电陶瓷驱动器22四周，通过圆孔穿过加载载荷定向组件20，上下分别连接加载模块后盖11和样品固定单元外壳19，用于平衡样品固定单元及实验样品的部分或全部重量。加载载荷定向组件20采用聚四氟乙烯材料，圆饼状结构，沿轴线方向中间开孔，周边外侧固定于加载模块外筒12上。加载执行单元推杆21穿过加载载荷定向组件20的中间孔，上侧连接压电陶瓷驱动器22，下侧连接样品固定单元外壳19，传递由压电陶瓷驱动器22产生的推力。压力检测单元23采用单轴压力传感器，上侧固定于加载模块后盖11，下侧连接压电陶瓷驱动器22。位移检测单元13采用差分可变电容位移传感器，上下分别连接加载模块后盖11和样品固定单元外壳19。样品固定单元由固定样品用的骨水泥18和样品固定单元外壳19组成。如图3所示，生理环境维持单元中软管24依次连接加载模块2的液体进口28、液体出口27、蠕动泵26以及储液器25。如图4所示，加载模块前盖31中间镶嵌固定有激光共聚焦显微镜4适用的玻璃窗口30，玻璃厚度0.17mm，直径2mm；

信号反馈模块3由压力信号采集单元、位移信号采集单元和计算机组成。本实施例中压力信号采集单元采用National Instrument数据信号采集卡以及计算机Labview信号采集程序进行采集；位移信号采集单元采用配合差分可变电容位移传感器使用的数据采集卡进行压力信号采集，输入计算机中相应的数据采集程序。

激光共聚焦显微镜4由显微镜单元和计算机及信号控制采集单元组成。本实施例中采用 Leica倒置激光共聚焦显微镜，工作物镜为40倍油镜。激发光源使用Argon激光光源(激发波长：488nm)。计算机及信号控制采集单元为Leica TCS SP5系统自带配置。

本实施例中，将冲洗干净的新鲜骨骼或关节软骨样品置于含钙黄绿素(8μM，激发：488 nm，发射：517nm)和羧基荧光素乙酰乙酸荧光染料(CFDA-SE，0.2mM，激发：492nm，发射：517nm)的无血清的培养液DMEM中，在21℃保持30分钟染色组织内的细胞。打开加载模块2的加载模块前盖31，将实验样品使用骨水泥18固定于样品固定单元外壳19中，实验样品中待观察侧朝向外侧，样品固定后，将加载模块前盖31盖回加载模块2，控制实验样品在样品固定单元外壳19中的高度，使实验样品尽量贴近玻璃窗口30。将固定有实验样品的加载模块2固定在激光共聚焦显微镜载物台16上，加载模块前盖31方向在下。使用软管24连接加载模块2的液体进口28、液体出口27、蠕动泵26以及储存有培养液、缓冲液或其他试剂17的储液器25，使适量DMEM培养液进入加载模块2并浸没实验样品。蠕动泵26 维持浸没实验样品的液体在生理环境维持单元中循环。将激光共聚焦显微镜40倍物镜15覆盖油膜29，调整载物台16使物镜15中心对准加载模块2的玻璃窗口30中心。调节镜头15 和玻璃窗口30之间的距离至可获得实验样品组织内细胞的清晰图像。

本实施例中，HPV压电陶瓷驱动电源控制压电陶瓷驱动器22产生适当推力，直至激光共聚焦显微镜4观察到实验样品和玻璃窗口30接触，此时清零压力检测单元23和位移检测单元13。压电陶瓷驱动器22此时产生的推力设为基准值。在基准值之上，控制压电陶瓷驱动器22分别产生压力0-10N的压力。信号反馈模块3中的数据信号采集卡以及计算机信号采集程序进行加载至样品的压力和样品固定单元外壳位移，结合实验样品的厚度，计算得出压力之下样品的形变量。通过反馈检测，确定实验样品形变幅度为10％、20％、30％及40％时需要的推力大小。控制压电陶瓷驱动器22加载静压力、频率为1Hz、10Hz的正弦波压力使实验样品形变幅度为10％、20％、30％及40％。压力加载至实验样品使样品基质和细胞产生形变。在该过程中的不同时间点，利用激光共聚焦显微镜4计算机及信号控制采集单元记录样品内不同深度细胞发出的荧光信号，获得细胞的荧光图片，进行细胞整体的三维重建，计算细胞在不同样品形变幅度的情况下长度、宽度以及体积的变化。结合细胞形变响应和施加的力学载荷，可得出生理或病理状态下细胞的力学特性变化。

Claims

1.一种原位研究细胞力学特性的实验装置，其特征在于，包括：

加载模块，用于精确定量加载细胞所处的组织，使细胞产生适当的形变；所述加载模块包括加载执行单元，用于对实验样品施加精确定量的压力，由压电陶瓷驱动器、加载载荷定向组件，以及负重平衡调节组件组成，分别实现提供驱动力，固定载荷加载方向，以及平衡加载单元的负重；压力检测单元，用于检测加载执行单元加载至样品的压力；位移检测单元，用于检测加载执行单元加载压力时加载端的移动距离，即实验样品受压缩的距离；样品固定单元，用于固定骨骼或关节软骨实验样品；生理环境维持单元，用于提供样品所需培养液、缓冲液或其他试剂，模拟实验样品所处的生理或病理环境；

控制模块，用于控制加载模块的加载幅度；所述控制模块包括压电陶瓷驱动器电压参数控制单元，以及信号输入控制计算机，用于控制加载执行单元中的压电陶瓷驱动器产生特定的推力加载实验样品；

信号反馈模块，用于实时监测加载载荷幅度及细胞所处组织的形变量；所述信号反馈模块包括压力信号采集单元、位移信号采集单元以及信号采集储存计算机，分别采集处理加载模块中压力检测单元核位移检测单元采集的压力和位移信号；

激光共聚焦显微镜，用于激发细胞胞内的荧光，观察细胞原位状态下的尺寸和三维形貌变化。所述激光共聚焦显微镜包括显微镜镜体、镜头、载物台、激光光源以及计算机及信号控制采集单元，显微镜镜头用于直接观察实验样品中细胞的荧光信号，载物台用于放置加载模块，激光光源用于产生激发细胞内荧光的激光，计算机及信号控制采集单元用于控制显微镜采集微弱的荧光信号，并进行图像数据分析、处理及三维重建工作；

将实验样品固定于加载模块后，控制模块控制加载执行单元对样品施加一定的压力，使样品基质及其内细胞产生形变；利用信号反馈模块获得样品承受的压力和形变量；同时激光共聚焦显微镜采集其聚焦细胞的图像采集工作。

2.如权利要求1所述的原位研究细胞力学特性的实验装置，其特征在于，所述生理环境维持单元包括储液器、输送液体的软管、以及循环液体用的蠕动泵。

3.如权利要求1所述的原位研究细胞力学特性的实验装置，其特征在于，所述加载模块能够实现加载频率0-20Hz的正弦波、锯齿波以及方波，并且可以通过计算机控制系统在加载过程中加入任意停歇间隔，加载载荷可在0-50N之间任意调节。