CN111676236A - 一种重组flod蛋白的大肠杆菌表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体方案是先利用大肠杆菌表达系统高效表达重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)，然后纯化蛋白和酶活性的测定。本发明构建的FLOD表达体系，提供了原核生物表达稳定性好的重组果糖赖氨酸氧化酶FLOD表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导发酵表达、两步纯化及鉴定后获得高纯度可溶性的目标重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)。本方法所采用的大肠杆菌表达系统，具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所表达的重组果糖赖氨酸氧化酶FLOD纯度高，温度和pH稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体是指一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法。
背景技术
一项我国全国性的调查研究结果：目前中国的糖尿病患者已达到了9200万。这一数字使中国超越印度成为全球糖尿病人数最多的国家。而且，我国还有1.48亿糖尿病患者。作为一种慢性、终身性的疾病，糖尿病不仅会给患者带来生理和心理的痛苦，还会给国家和个人带来巨大的经济负担。随着糖尿病患者人数的增加，血糖检测的试剂也随之增加，降低血糖检测成本可缓解国家和患者的经济负担。
人体内葡萄糖与血清蛋白N-末端可发生非酶促糖基化反应，且90％糖基化反应发生在血清蛋白第189位赖氨酸，形成高分子酮胺结构，总称为糖化血清蛋白。90％以上糖化血清蛋白是糖化血清白蛋白(Glycated Albumin，GA)，因此糖化血清白蛋白可反映糖化血清蛋白总体水平。
糖化白蛋白是反映过去2-3周平均血糖水平的一项指标，比血糖检测“金标准”糖化血红蛋白周期短。果糖赖氨酸氧化酶催化糖化氨基酸变成葡萄糖酮醛、氨基酸和双氧水。在此催化反应液中，加入对白蛋白有特异性的蛋白酶，发生作用从糖化白蛋白(Glycatedalbumin)生成其次，注入糖化氨基酸氧化酶从糖化氨基酸生成葡萄糖酮醛、氨基酸和双氧水。双氧水在TOOS和4AAP的混合溶液中，定量地变化成蓝紫色色素。通过测定此蓝紫色色素的吸光度而定量从糖化白蛋白生成的糖化氨基酸。
目前文献报道的果糖赖氨酸氧化酶大多酶活性和产量较低，很难实现工业化，亟待改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术缺点，提供一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，所述表达方法包括重组表达载体构建、转化、目标蛋白诱导表达，步骤如下：
(1)将FLOD基因插入到表达载体pET28a的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET28a-FLOD；
(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌株；
(3)对重组菌株进行诱导，表达FLOD蛋白。
进一步的，所述FLOD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，所述FLOD蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步的，针对FLOD蛋白的纯化包括以下步骤：
(4)诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，高速离心获得细胞破碎液上清；
(5)Ni-NTA树脂经过平衡液平衡后，将上清液过Ni-NTA树脂纯化，纯化后进行脱盐获得重组FLOD酶洗脱液；
(6)脱盐后收集蛋白溶液，冻干处理，即得FLOD蛋白干粉。
进一步的，步骤(5)所述平衡液组成为：25mM PBS，pH 7.4，150mM NaCl，2mg/LFAD；
进一步的，步骤(5)所述洗脱液组成为：20mM PBS，pH 7.4，150mM NaCl，500mM咪唑，2mg/L FAD。
本发明具有如下优点：本发明构建的FLOD表达体系，提供了原核生物表达稳定性好的重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导发酵表达、两步纯化及鉴定后获得高纯度可溶性的目标重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)。本发明提供了一种活性稳定、表达量较高的工程菌株，纯化脱盐后的重组FLOD，可用于体外诊断试剂盒的开发。本方法所采用的大肠杆菌表达系统，具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所表达的重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)纯度高，温度和pH稳定性好等优点。
附图说明
图1为工程菌菌落PCR验证图；
图2为重组FLOD可溶性表达SDS-PAGE验证图；
图3为重组FLOD纯化、脱盐后的SDS-PAGE验证图；
图4为重组FLOD热稳定性实验；
图5为重组FLOD在不同pH缓冲液中酶活性的测定；
图6为重组FLOD与病人样本血清在生化仪中的反应图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明使用限制性内切酶购自北京索莱宝科技有限公司，Ni+树脂购自sigma，其他试剂未特别注明来源的均购自上海生工生物工程股份有限公司。基因及引物合成来自于北京生物工程生物科技有限公司。实验操作未详述的，均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。
其中，图1中M：1kb marker；1：以NdeI-FLOD-F/XhoI-FLOD-R为引物进行PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。
其中，图2中M：蛋白marker，1：LB培养基发酵后破碎全菌；2：TB培养基发酵后破碎全菌；3：LB培养基发酵后破碎上清；4：TB培养基发酵后破碎上清。
其中，图3中M：蛋白marker，1：1号工程菌纯化后样品；2：2号工程菌纯化后样品；3：1号工程菌脱盐后样品；4：2号工程菌脱盐后样品。
重组FLOD表达和纯化：
实施例1：pET28a-FLOD表达载体质粒及BL21-FLOD工程菌株的构建；
(1)首先根据FLOD氨基酸序列(SEQ ID No.1)进行大肠杆菌表达密码子偏好性优化，并由基因公司合成获得FLOD基因片段，序列如SEQ ID No.2所示，目的片段两端酶切位点分别为NdeI和XhoI；
(2)以包含合成基因的质粒为模板，用上、下游引物NdeI-FLOD-F(SEQ ID No.3)和XhoI-FLOD-R(SEQ ID No.4)将FLOD基因克隆，经琼脂糖凝胶电泳后，胶纯化回收PCR产物。用NdeI和XhoI分别双酶切pET28a表达载体质粒和FLOD基因PCR纯化回收产物，胶回收后用Solution I连接酶将两片段连接。16℃反应4-6h后，连接产物加入到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，42℃反应1min 30s，冰浴2min，加入1mL LB液体培养基，250rpm，37℃孵育1h。4000rpm离心收集菌体，去除800μL上清后重悬菌体，涂布卡那霉素抗性的LB培养基平板，37℃培养过夜。挑取单菌落至5mL LB液体培养基中，250rpm，37℃过夜培养。菌落PCR鉴定阳性克隆后进行测序分析，如图1所示。提取测序正确的阳性转化子质粒备用，命名为pET28a-FLOD。
菌落PCR引物设计如下：
上游引物NdeI-FLOD-F：GGAATTCCAT ATGATGGCTCCGTCTAAC
(SEQ ID No.3)；
下游引物引物XhoI-FLOD-R：CCGCTCGAGCAGCTGACCACGAGA
(SEQ ID No.4)；
(3)FLOD蛋白大肠杆菌表达菌株的获得：将测序正确的pET28a-FLOD表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，菌落PCR验证转化子，最终获得重组FLOD基因的大肠杆菌工程菌BL21-FLOD。
实施例2：FLOD蛋白的诱导发酵表达、纯化及脱盐
(1)FLOD蛋白的诱导表达：挑取构建好的BL21-FLOD工程菌单菌落至5mL LB培养基中37℃培养过夜，按2％接种量转接新鲜TB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8后诱导、诱导温度为16℃，诱导时间18-22h。最终8000rpm离心20min收集菌体，收集菌体破碎后通过SDS-PAGE分析是否可溶性表达，SDS-PAGE结果见附图2。
(2)FLOD蛋白的纯化：用裂解缓冲液buffer A(25mM PBS，pH 7.4，150mM NaCl，2mg/L FAD)将上述所得菌体重悬，加入终浓度30μg/m的溶菌酶和1％PMSF，冰浴30min后超声破碎，12000rpm离心20min，收集上清。上清过膜后，将其加入到Ni+树脂亲和层析柱，再用5个柱体积的清洗液buffer B(20mM PBS，pH 7.4，150mM NaCl，10mM咪唑，2mg/L FAD)洗涤柱子，最后用5个柱体积的洗脱液buffer C(20mM PBS，pH 7.4，150mM NaCl，500mM咪唑，2mg/L FAD)缓冲液洗脱，FLOD蛋白纯化电泳图如图3所示。
(3)重组蛋白脱盐：利用4倍柱体积PBS(pH 7.4)缓冲液平衡脱盐柱；蛋白洗脱液按照脱盐柱柱体积30％上样，上样后利用PBS洗脱，通过AKT自动收样器收集样品。脱盐后，利用0.5M NaOH溶液处理脱盐柱，最后用PBS将脱盐柱中的碱液洗涤干净并保存。通过SDS-PAGE分析蛋白脱盐结果，取样制备样品，上样量15μL，SDS-PAGE结果见附图3。
(4)获得FLOD蛋白干粉：向经过纯化、脱盐后的FLOD蛋白溶液中添加冻干保护剂(5g/L甘露醇)并分装到冻干瓶中，将FLOD蛋白水溶液冻干备用。
实施例3：重组FLOD蛋白鉴定。将最终得到的FLOD蛋白经12％SDS-PAGE电泳确定纯度及分子量，如图3所示，在50kDa附近有一条明显的条带。经BCA试剂盒测定蛋白浓度，最终计算1L菌液可得约80mg。
实施例4：重组FLOD酶活性的测定
(1)试剂C、试剂B、试剂D按照体积比17：1：1添加至“d＝1.0cm”的石英比色皿中，充分混匀，记录555nm处的吸光度OD555，37℃温育反应至2min；记录60-120s内OD555的变化ΔA。试剂C：POD、4AAP混合溶液；试剂B：TOOS溶液；试剂D：赖氨酸、葡萄糖混合溶液，pH 7.0。
(2)在120s时，加入20μL酶稀释液，充分混合均匀，37℃温育4min(240s)；记录第4-5min(240-300s)内OD555的变化，并计算每分钟吸光值变化ΔAb/min。
(3)重复7.4.1中(1)-(2)步骤，用20μL稀释酶液代替20μL酶稀释液测定酶液吸光度变化(ΔAs/min)
(4)酶活的计算公式：测定酶活(U/L)＝1530*ΔA/min。
上述实验所用的缓冲液是PBS(pH8.0，0.1M)。试剂C：POD、1U/mL，4-AA 1mg/mL；试剂B：TOOS溶液，5mg/mL；试剂D：赖氨酸、64mg/mL，葡萄糖、30mg/mL。
实施例5：重组FLOD酶热稳定性的测定
经纯化后的重组FLOD酶分别置于pH4.3、5.0、6.0柠檬酸钠缓冲液(0.1M)，pH7.4、8.0PBS缓冲液(0.05M)，pH9.0、10.2Tris-HCl(0.025M)条件下孵育18h。
取步骤(1)中处理后的酶各20μL，于37℃反应4min.
检测555nm处吸光度。
所述反应液为：PBS缓冲液，0.1M，pH 8.0。试剂C：POD、1U/mL，4-AA 1mg/mL；试剂B：TOOS溶液，5mg/mL；试剂D：赖氨酸、64mg/mL，葡萄糖、30mg/mL。结果显示，此重最酶的最适温度为40℃，测定结果见图4。
实施例6：pH稳定性测定
(1)经纯化后的重组FLOD酶置于30.0℃，37.0℃，40.0℃，46.0℃，50.0℃，53.0℃条件下孵育25分钟。
(2)取步骤(1)中处理后的酶各20μL，于37℃反应4min.
(3)检测555nm处吸光度。
所述反应液为：PBS缓冲液，0.1M，pH 8.0；试剂C：POD、1U/mL，4-AA 1mg/mL；试剂B：TOOS溶液，5mg/mL；试剂D：赖氨酸、64mg/mL，葡萄糖、30mg/mL。结果显示，此重最酶的最适pH为8.0，测定结果见图5。
实施例7：重组FLOD与病人样本血清的反应
病人样本血清样本，加入蛋白酶K消化后，使糖基化位点暴露出来、有利于和果糖赖氨酸氧化酶结合。经过消化后的血清样本，以6uL消化后血清样本加入12U/mL重组FLOD的量在生化仪中反应，重组FLOD将糖化果糖赖氨酸氧化成葡萄糖酮醛、氨基酸和双氧水；在37℃下，双氧水在TOOS和4AAP的混合溶液中，使得反应体系逐渐变成蓝紫色；通过测定紫光吸光度，从而定量糖化白蛋白生成糖化氨基酸，测定结果见图6。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQ ID No.1
<110>北京达成生物科技有限公司
<120>一株表达具有耐酸碱性重组果糖赖氨酸氧化酶的菌株
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>446
<212>PRT
<213>Aspergillus fischeri
<400>1
SEQ ID No.2
<110>北京达成生物科技有限公司
<120>一株表达具有耐酸碱性重组果糖赖氨酸氧化酶的菌株
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1338
<212>DNA
<213>Aspergillus fischeri
<400>1
Claims (6)
1.一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于，所述表达方法包括重组表达载体构建、转化、目标蛋白诱导表达，步骤如下：
(1)将FLOD基因插入到表达载体pET28a的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET28a-FLOD；
(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌株；
(3)对重组菌株进行诱导，表达FLOD蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于：所述FLOD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于：所述FLOD蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于，所述FLOD蛋白的纯化包括以下步骤：
(4)诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，高速离心获得细胞破碎液上清；
(5)Ni-NTA树脂经过平衡液平衡后，将上清液过Ni-NTA树脂纯化，纯化后进行脱盐获得重组FLOD酶洗脱液；
(6)脱盐后收集蛋白溶液，冻干处理，即得FLOD蛋白干粉。
5.根据权利要求4所述的一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于，步骤(5)所述平衡液组成为：25mM PBS，pH 7.4，150mM NaCl，2mg/L FAD。
6.根据权利要求4所述的一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于，步骤(5)所述洗脱液组成为：20mM PBS，pH 7.4，150mM NaCl，500mM咪唑，2mg/L FAD。
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