CN110972945A - 一种大叶蓝玉簪组织培养的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种大叶蓝玉簪组织培养的培养基及培养方法。本发明的组培方法包括无菌材料的获得、芽的诱导、增殖培养、生根培养和炼苗，其中增殖培养时采用高浓度激素、低浓度激素交替增殖，并采用高增殖比例扩繁，能够提高增殖比例，同时消除高浓度激素在植物体内积累造成的玻璃化，提高大叶蓝玉簪的增殖率，组培方法易于操作，能够大大降低生产成本，克服现有组培方法采用单一高浓度激素导致的苗玻璃化严重、愈伤组织大、愈伤组织硬难切割等问题。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种大叶蓝玉簪组织培养的培养基及培养方法。
技术背景
大叶蓝玉簪是多年生草本植物，株高120cm，叶聚生于基部，长而狭，边有细齿，圆锥花序大，羽毛状，银白色，国外著名的观赏草，用于园林绿化或岸边栽植。阳性，喜阳光充足、温暖湿润环境，亦耐寒；适应性强，不择土壤，既耐水湿，亦耐干旱，现在市场上需求量很大，目前国内关于大叶蓝玉簪组织培养研究的报道很多，但是存在增殖比例不稳定，扩繁转接时叶子长操作难，炼苗清洗难以及栽植难等，生产成本高的缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供了一种大叶蓝玉簪组织培养的培养基及培养方法。本发明采用高、低浓度激素交替增殖，高增殖比例扩繁，能够提高繁殖速度和苗的整齐度，并提高性状稳定性，从而建立更适合大叶蓝玉簪（大叶蓝玉簪花叶遗传不稳定）快速繁殖的工厂化生产体系。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种大叶蓝玉簪高激素浓度高增值比例的组织培养方法，其特征在于，该大叶蓝玉簪组织培养的培养基及培养方法具有以下特征：
一种大叶蓝玉簪组织培养的培养基，包括腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，其中，所述腋芽诱导培养基包括MS+6-BA2.5~3.5mg/L+NAA0.2~0.4mg/L，所述增殖培养基包括1/2MS+6-BA7.5~8.5 mg/L和1/2MS+6-BA 1.5~2.5 mg/L，所述生根培养基1/4MS+IBA0.3~0.7 mg/L。
一种大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，采用高低浓度激素交替增殖，高增殖比例扩繁，包括以下步骤：
（1）无菌材料的获得：选取新长出的嫩芽为外植体，去除外植体外面包裹的叶片，洗去表面杂质，切去伤口位置，用配制好的汞和吐温的混合溶液消毒6~10分钟后，用无菌水冲洗4~6次，将消完毒的外植体取小段接种到配制好的培养基上培养5~9天；所述混合溶液中含有质量分数0.08%~0.12%的汞。
（2）芽的诱导：将外植体接种到腋芽诱导培养基上7~15天后，腋芽部位开始膨大，出现绿色突起，15~25天后芽分生组织，再培养15~25天，小的不定芽长到2~3cm，将不定芽切下转入不定芽增殖培养基中进行增殖培养，确保不定芽生长迅速且无玻璃化不良现象，在培养基中生长发育良好；
（3）增殖培养：以MS培养基为基础培养基，将诱导的不定芽接种到增殖培养基上，培养25~30天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的增殖母苗；将增殖母苗转接到以MS培养基为基础培养基的增殖培养基上，培养25~30天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗；再将得到的增殖苗进行多次增殖培养，整个增殖培养过程中高、低浓度激素交叉循环使用，扩繁增殖系数8~12；
（4）生根培养：将增殖苗分成单株，高矮分开转接到生根培养基上，4~8天苗长出根原基，7~15天根3~4cm长，生根率95%~100%；
（5）炼苗：生根培养7~15天后，洗苗移栽，栽种在泥炭和珍珠岩的混合基质上，用遮阳率40%~75%的遮阳网遮阳5~9天，5~9后撤去遮阳网，从早上8:00到下午18:00，每20~40分钟喷水8~10秒钟，连续6~8天，以后每天早上浇水1~2次，每次8~12分钟，一直到商品苗出售。
所述腋芽诱导培养基包括MS+6-BA2.5~3.5mg/L+NAA0.25~0.35 mg/L。
所述增殖培养基包括MS+6-BA7~9mg/L和MS+6-BA1.5~2.5 mg/L。
所述生根培养基包括 1/4MS+IBA0.4~0.6 mg/L。
所述腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基还包括蔗糖28~32g/L、琼脂粉4~6g/L，培养基pH为5.6~5.9，培养温度23~25℃，光照2300~2700lx。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
现有的组培方法采用单一的高浓度激素提高增殖系数，但是高浓度激素累加会使得苗玻璃化严重，用低浓度激素增殖比例不高，苗叶子长，增殖转接困难，生根炼苗难。本发明采用高、低浓度激素交替增殖，高增殖比例扩繁，能够提高增殖比例，同时消除高浓度激素在植物体内积累造成的玻璃化，能够提高大叶蓝玉簪的增殖率，并且组培方法易于操作，能够大大降低生产成本。
实施例 1
一种大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，包括以下步骤：
（1）无菌材料的获得：选取新长出的嫩芽为外植体，去除外植体外面包裹的叶片，用洗洁精水浸泡1分钟洗去表面杂质，用流水冲洗干净，在超净工作台上用手术刀切去伤口位置，用配制好的0.08%升汞溶液加一滴吐温消毒10分钟后，用无菌水冲洗4次，将消完毒的外植体取小段接种到配制好的培养基上培养9天；
（2）芽的诱导：将外植体接种到腋芽诱导培养基MS+NAA0.3mg/L+6-BA 2.5mg/L上 15天后，腋芽部位开始膨大，出现绿色突起，25天后芽分生组织，再培养25天，小的不定芽长到2~3cm，将不定芽切下转入不定芽增殖培养基中进行增殖培养，确保不定芽生长迅速且无玻璃化不良现象，在培养基中生长发育良好；
（3）第一次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将诱导的不定芽接种到不定芽增殖培养基1/2MS+6-BA 7.5 mg/L上，培养30天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增殖系数9
（4）第二次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将增殖母苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 1.5 mg/L上，培养30天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增殖系数8；
（5）第三次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第二次增殖培养得到的增殖苗接种到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 7.5 mg/L上，培养30天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖苗，增殖系数9
（6）第四次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第三次增殖培养得到的增殖苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA1.5 mg/L上，培养30天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增殖系数8；
（7）生根培养：将增殖苗分成单株，高矮分开转接到生根培养基1/4MS+IBA0.3mg/L上，8天苗长出根原基，15天根3~4cm长，生根率95%；
（8）炼苗：生根培养15天后，洗苗移栽，栽种在进口泥炭和珍珠岩2:1的基质上，用遮阳率40%的遮阳网遮阳7天，保持空气湿度85%，连续7天，撤去遮阳网，以后每天早上浇水一次，保持空气湿度65%以上，一直到商品苗出售。
所述腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基还包括蔗糖28g/L、琼脂粉4g/L，培养基pH为5.6，培养温度23℃，光照2300lx。
实施例2
一种大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，包括以下步骤：
（1）无菌材料的获得：选取新长出的嫩芽为外植体，去除外植体外面包裹的叶片，用洗洁精水浸泡1分钟洗去表面杂质，用流水冲洗干净，在超净工作台上用手术刀切去伤口位置，用配制好的0.09%升汞溶液加一滴吐温消毒9分钟后，用无菌水冲洗5次，将消完毒的外植体取小段接种到配制好的培养基上培养8天；
（2）芽的诱导：将外植体接种到腋芽诱导培养基MS+NAA0.3mg/L+6-BA 2.75 mg/L上13天后，腋芽部位开始膨大，出现绿色突起，23天后芽分生组织，再培养23天，小的不定芽长到2~3cm，将不定芽切下转入不定芽增殖培养基中进行增殖培养，确保不定芽生长迅速且无玻璃化不良现象，在培养基中生长发育良好；
（3）第一次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将诱导的不定芽接种到不定芽增殖培养基1/2MS+6-BA 7.75 mg/L上，培养28天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增殖系数10；
（4）第二次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将增殖母苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 1.75mg/L上，培养28天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增殖系数8；
（5）第三次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第二次增殖培养得到的增殖苗接种到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 7.75 mg/L上，培养28天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增殖系数10；
（6）第四次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第三次增殖培养得到的增殖苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 1.75mg/L上，培养28天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增殖系数8；
（7）生根培养：将增殖苗分成单株，高矮分开转接到生根培养基1/4MS+IBA 0.4mg/L上，7天苗长出根原基，13天根3~4cm长，生根率95%；
（8）炼苗：生根培养13天后，洗苗移栽，栽种在进口泥炭和珍珠岩2:1的基质上，用遮阳率45%的遮阳网遮阳9天，保持空气湿度85%，连续7天，撤去遮阳网，以后每天早上浇水一次，保持空气湿度65%以上，一直到商品苗出售。
所述腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基还包括蔗糖29g/L、琼脂粉4.5g/L，培养基pH为5.7，培养温度23.5℃，光照2400lx。
实施例3
一种大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，包括以下步骤：
（1）无菌材料的获得：选取新长出的嫩芽为外植体，去除外植体外面包裹的叶片，用洗洁精水浸泡1分钟洗去表面杂质，用流水冲洗干净，在超净工作台上用手术刀切去伤口位置，用配制好的0.1%升汞溶液加一滴吐温消毒8分钟后，用无菌水冲洗5次，将消完毒的外植体取小段接种到配制好的培养基上培养8天；
（2）芽的诱导：将外植体接种到腋芽诱导培养基MS+NAA0.3mg/L+6-BA 3.0mg/L上 11天后，腋芽部位开始膨大，出现绿色突起，20天后芽分生组织，再培养20天，小的不定芽长到2~3cm，将不定芽切下转入不定芽增殖培养基中进行增殖培养，确保不定芽生长迅速且无玻璃化不良现象，在培养基中生长发育良好；
（3）第一次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将诱导的不定芽接种到不定芽增殖培养基1/2MS+6-BA 8mg/L上，培养27天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增殖系数12；
（4）第二次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将增殖母苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 2 mg/L上，培养27天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增殖系数11；
（5）第三次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第二次增殖培养得到的增殖苗接种到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 8mg/L上，培养27天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增殖系数12；
（6）第四次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第三次增殖培养得到的增殖苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 2 mg/L上，培养27天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增殖系数11；
（7）生根培养：将增殖苗分成单株，高矮分开转接到生根培养基1/4MS+IBA 0.50mg/L上，6天苗长出根原基，10天根3~4cm长，生根率100%；
（8）炼苗：生根培养10天后，洗苗移栽，栽种在进口泥炭和珍珠岩2:1的基质上，用遮阳率55%的遮阳网遮阳11天，保持空气湿度85%，连续11天，撤去遮阳网，以后每天早上浇水一次，保持空气湿度65%以上，一直到商品苗出售。
所述腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基还包括蔗糖30g/L、琼脂粉5g/L，培养基pH为5.8，培养温度24℃，光照2500lx。
实施例4
一种大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，包括以下步骤：
（1）无菌材料的获得：选取新长出的嫩芽为外植体，去除外植体外面包裹的叶片，用洗洁精水浸泡1分钟洗去表面杂质，用流水冲洗干净，在超净工作台上用手术刀切去伤口位置，用配制好的0.11%升汞溶液加一滴吐温消毒7分钟后，用无菌水冲洗5次，将消完毒的外植体取小段接种到配制好的培养基上培养6天；
（2）芽的诱导：将外植体接种到腋芽诱导培养基MS+NAA0.3mg/L+6-BA 3.25 mg/L上 9天后，腋芽部位开始膨大，出现绿色突起，19天后芽分生组织，再培养19天，小的不定芽长到2~3cm，将不定芽切下转入不定芽增殖培养基中进行增殖培养，确保不定芽生长迅速且无玻璃化不良现象，在培养基中生长发育良好；
（3）第一次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将诱导的不定芽接种到不定芽增殖培养基1/2MS+6-BA 8.25 mg/L上，培养26天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增值系数11；
（4）第二次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将增殖母苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 2.25 mg/L上，培养26天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增值系数10；
（5）第三次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第二次增殖培养得到的增殖苗接种到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 8.25 mg/L上，培养26天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增值系数11；
（6）第四次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第三次增殖培养得到的增殖苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 2.25 mg/L上，培养26天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增值系数10；
（7）生根培养：将增殖苗分成单株，高矮分开转接到生根培养基1/4MS+IBA0.6mg/L上，5天苗长出根原基，9天根3~4cm长，生根率100%；
（8）炼苗：生根培养9天后，洗苗移栽，栽种在进口泥炭和珍珠岩2:1的基质上，用遮阳率65%的遮阳网遮阳13天，保持空气湿度85%，连续13天，撤去遮阳网，以后每天早上浇水一次，保持空气湿度65%以上，一直到商品苗出售。
所述腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基还包括蔗糖31g/L、琼脂粉5.5g/L，培养基pH为5.9，培养温度24.5℃，光照2600lx。
实施例5
一种大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，包括以下步骤：
（1）无菌材料的获得：选取新长出的嫩芽为外植体，去除外植体外面包裹的叶片，用洗洁精水浸泡1分钟洗去表面杂质，用流水冲洗干净，在超净工作台上用手术刀切去伤口位置，用配制好的0.12%升汞溶液加一滴吐温消毒6分钟后，用无菌水冲洗6次，将消完毒的外植体取小段接种到配制好的培养基上培养5天；
（2）芽的诱导：将外植体接种到腋芽诱导培养基MS+NAA0.3mg/L+6-BA3.5 mg/L上 7天后，腋芽部位开始膨大，出现绿色突起， 15天后芽分生组织，再培养15天，小的不定芽长到2~3cm，将不定芽切下转入不定芽增殖培养基中进行增殖培养，确保不定芽生长迅速且无玻璃化不良现象，在培养基中生长发育良好；
（3）第一次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将诱导的不定芽接种到不定芽增殖培养基1/2MS+6-BA 8.5mg/L上，培养25天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增值系数11；
（4）第二次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将增殖母苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 2.5mg/L上，培养25天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增值系数11；
（3）第三次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第二次增殖培养得到的增殖苗接种到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 8.5mg/L上，培养25天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的培养基中的增殖母苗，增值系数11；
（4）第四次增殖培养：以1/2MS培养基为基础培养基，将第三次增殖培养得到的增殖苗转接到壮苗增殖培养基1/2MS+6-BA 2.5mg/L上，培养25天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗，增值系数11；
（7）生根培养：将增殖苗分成单株，高矮分开转接到生根培养基1/4MS+IBA 0.7mg/L上，4天苗长出根原基，7天根3~4cm长，生根率100%；
（8）炼苗：生根培养7天后，洗苗移栽，栽种在进口泥炭和珍珠岩2:1的基质上，用遮阳率75%的遮阳网遮阳15天，保持空气湿度85%，连续15天，撤去遮阳网，以后每天早上浇水一次，保持空气湿度65%以上，一直到商品苗出售。
所述腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基还包括蔗糖32g/L、琼脂粉6g/L，培养基pH为5.8，培养温度25℃，光照2700lx。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据本发明实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (6)
1.一种大叶蓝玉簪组织培养的培养基，其特征在于，包括腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，其中，所述腋芽诱导培养基包括 MS+6-BA 2.5~3.5 mg/L+NAA 0.2~0.4 mg/L，所述增殖培养基包括1/2MS+6-BA7.5~8.5 mg/L和1/2MS+6-BA 1.5~2.5 mg/L，所述生根培养基1/4MS+IBA0.3~0.7 mg/L。
2.一种大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，其特征在于，采用高低浓度激素交替增殖，高增殖比例扩繁，包括以下步骤：
（1）无菌材料的获得：选取新长出的嫩芽为外植体，去除外植体外面包裹的叶片，洗去表面杂质，切去伤口位置，用配制好的汞和吐温的混合溶液消毒6~10分钟后，用无菌水冲洗4~6次，将消完毒的外植体取小段接种到配制好的培养基上培养5~9天；所述混合溶液中含有质量分数0.08%~0.12%的汞。
（2）芽的诱导：将外植体接种到腋芽诱导培养基上7~15天后，腋芽部位开始膨大，出现绿色突起，15~25天后芽分生组织，再培养15~25天，小的不定芽长到2~3cm，将不定芽切下转入不定芽增殖培养基中进行增殖培养，确保不定芽生长迅速且无玻璃化不良现象，在培养基中生长发育良好；
（3）增殖培养：以MS培养基为基础培养基，将诱导的不定芽接种到增殖培养基上，培养25~30天后筛选出无根、基部从芽多且增殖比例、花叶增殖系数较高的增殖母苗；将增殖母苗转接到以MS培养基为基础培养基的增殖培养基上，培养25~30天后筛选出增殖比例和花叶增值率较高的增殖苗；再将得到的增殖苗进行多次增殖培养，整个增殖培养过程中高、低浓度激素交叉循环使用，扩繁增殖系数8~12；
（4）生根培养：将增殖苗分成单株，高矮分开转接到生根培养基上，4~8天苗长出根原基，7~15天根3~4cm长，生根率95%~100%；
（5）炼苗：生根培养7~15天后，洗苗移栽，栽种在泥炭和珍珠岩的混合基质上，用遮阳率40%~75%的遮阳网遮阳5~9天，5~9后撤去遮阳网，从早上8:00到下午18:00，每20~40分钟喷水8~10秒钟，连续6~8天，以后每天早上浇水1~2次，每次8~12分钟，一直到商品苗出售。
3.根据权利要求2所述的大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，其特征在于，所述腋芽诱导培养基包括MS+6-BA2.5~3.5mg/L+NAA0.25~0.35 mg/L。
4.根据权利要求 2 所述的大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，其特征在于，所述增殖培养基包括MS+6-BA7~9mg/L和MS+6-BA1.5~2.5 mg/L。
5.根据权利要求2所述的大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，其特征在于，所述生根培养基包括 1/4MS+IBA0.4~0.6 mg/L。
6.根据权利要求2所述的大叶蓝玉簪组织培养的培养方法，其特征在于，所述腋芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基还包括蔗糖28~32g/L、琼脂粉4~6g/L，培养基pH为5.6~5.9，培养温度23~25℃，光照2300~2700lx。
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