CN110684696B - 一株巨大芽孢杆菌qzy-3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌QZY‑3及其应用；巨大芽孢杆菌QZY‑3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019717；本发明提供一种菌种发酵液的制备方法；本发明还提供巨大芽孢杆菌QZY‑3在溶解难溶态磷中及促进作物生长中的应用；本发明中巨大芽孢杆菌QZY‑3对无机难溶态磷(磷酸三钙、磷矿粉)和有机难溶态磷(卵磷脂)都具有显著的溶解能力，对小麦幼苗和油菜幼苗具有极其显著的促生作用。对于研发微生物促生菌剂、微生物类肥料以及在土壤上推广示范等方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株巨大芽孢杆菌QZY-3及其应用。
背景技术
磷是作物生长最重要的元素之一。化学磷肥中能被作物直接吸收的有效磷易与土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等离子结合，转化为植物不可利用的难溶性磷酸盐，因此化学磷肥利用率很低，将土壤中难溶磷酸盐转化成植物吸收的有效磷是当前研究的热点，溶磷细菌可以将土壤中难溶态磷酸盐转化为有效磷，溶磷细菌对土壤磷素有效化过程有积极的作用；通过溶磷细菌的作用，对于提高化学磷肥的利用率，增加土壤中有效磷含量，减少磷素累积等方面都具积极的作用。溶磷细菌应用研究首先要有高效且安全的菌株资源。巨大芽孢杆菌在微生物肥料生物安全通用技术准则(NY/T 1109-2017)附录A-菌种安全分级目录中属于第一级，免做毒理学方面的试验，属于安全类菌株。
黄壤在贵州分布最为广泛，全国25.3％的黄壤集中分布在贵州，其面积分别占贵州国土面积和土壤面积的41.9％和46.4％，是贵州主要的农业土壤类型，在贵州农业生产中发挥着重要的作用。目前该区域溶磷细菌方面的研究较少，高效安全的溶磷菌株资源缺乏，因此从贵州中部农田土壤(黄壤)上筛选分离溶磷菌株，为该区域溶磷微生物的研究提供优质安全的菌株资源具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种巨大芽孢杆菌QZY-3，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019717。
本发明的巨大芽孢杆菌QZY-3(Bacillus megaterium QZY-3),从贵州黄壤农田中分离筛选出的，于2019年9月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO：M2019717。其具有以下生物学特性：在由下列成分的质量/体积份组成的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，培养液的PH值为7.0-7.2)上32℃恒温培养24小时，菌体形成大量芽孢，形成芽孢前菌体长杆状(1.2～1.5×2.8～4.0μm)，排列为单个或成链(见图1)，革兰氏阳性；培养3天，菌落形态为：菌落较大且呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明(见图2)；穿刺接种培养菌体在试管的培养基内云雾状扩散生长，表明有运动性。
本发明还提供一种菌种发酵液的制备方法，包括以下步骤：取保藏号为CCTCC NO：M2019717的巨大芽孢杆菌QZY-3接种到灭菌后的发酵用培养基中，在32℃、160r/min条件下，培养24小时，得到发酵液；其中巨大芽孢杆菌QZY-3的保存与发酵培养基为,牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g，蒸馏水1000ml，固体培养基加15g琼脂，pH调至7.0-7.2。
本发明还提供巨大芽孢杆菌QZY-3在溶解难溶态磷中的应用。
进一步的，巨大芽孢杆菌QZY-3在溶解难溶态磷中的应用，所用溶磷能力测定培养基为葡萄糖10g，难溶态磷源5g，MgCl2 5g，(NH4)2SO4 0.1g，KCl 0.2g，MgSO4 0.25g，蒸馏水1000ml，固体培养基加20g琼脂，pH自然。
进一步的，所述难溶态磷源为磷酸三钙或磷矿粉或卵磷脂。
本发明还提供了巨大芽孢杆菌QZY-3在促进作物生长中的应用。
本发明还提供了一种促进作物生长的制剂，包括上述的巨大芽孢杆菌QZY-3或菌种发酵液。
本发明还提供了所述巨大芽孢杆菌QZY-3在在制备有机肥添加剂、生物有机肥中的应用。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果：
本发明中巨大芽孢杆菌QZY-3，不需要做学毒理方面的试验，属于安全类菌株；该菌株对无机难溶态磷(磷酸三钙、磷矿粉)和有机难溶态磷(卵磷脂)都具有显著的溶解能力，对小麦幼苗和油菜幼苗具有极其显著的促生作用。对于研发微生物促生菌剂、微生物类肥料以及在土壤上推广示范等方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明巨大芽孢杆菌QZY-3牛肉膏蛋白胨培养基上32℃恒温培养24小时后的镜检图。
图2为巨大芽孢杆菌QZY-3在平板上的菌落形态。
图3为本发明巨大芽孢杆菌QZY-3的系统发育树。
图4为实施例3小麦幼苗生长对比图之一。
图5为实施例3小麦幼苗生长对比图之二。
图6为实施例3油菜幼苗生长对比图之一。
图7为实施例3油菜幼苗生长对比图之二。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
菌株的分离鉴定
从贵州黄壤农田中分离筛选得到本发明菌株，本发明菌株的形态学和分子生物学鉴定如下：
(1)菌株的形态及生理生化特征
本发明菌株在由下列成分的质量/体积份组成的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，培养液的PH值为7.0-7.2)上32℃恒温培养24小时，如图1所示，菌体形成大量芽孢，形成芽孢前菌体长杆状(1.2～1.5×2.8～4.0μm)，排列为单个或成链；革兰氏阳性；培养3天，如图2所示，菌落形态为：菌落较小且呈圆形，乳黄色，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明；穿刺接种培养菌体在试管的培养基内云雾状扩散生长，表明有运动性；经生理生化鉴定，其特征见表1。
表1巨大芽孢杆菌QZY-3的生理生化特征
| 检测指标 | 结果 | 检测指标 | 结果 |
| 硝酸盐还原 | + | 柠檬酸盐利用 | + |
| 接触酶 | + | 苯丙氨酸脱氨酶 | + |
| V-P测定 | — | 产吲哚 | + |
| 甲基红(M.R) | + | 卵磷脂酶 | + |
| 淀粉水解 | + | 葡萄糖氧化发酵 | + |
| 耐盐性和需盐性 | 明胶液化 | + | |
| 2％NaCl | + | 酪氨酸水解 | + |
| 5％NaCl | + | 氧化酶 | + |
| 7％NaCl | + | 厌氧生长 | — |
| 10％NaCl | — | 有溶菌酶时生长 | — |
注：“+”表示该项指标为阳性；“—”表示该项指标为阴性。
(2)菌株的16S rDNA序列及分析
本发明菌株的16S rDNA基因序列长度为1485bp，序列如下：
将本发明巨大芽孢杆菌QZY-3的16S rDNA序列输入NCBI的GeneBank数据库中，与已知菌株的16S rDNA基因序列进行同源性比对，可知巨大芽孢杆菌QZY-3的16S rDNA序列与巨大芽孢杆菌的同源性最高，达到了100％，见表2。
表2巨大芽孢杆菌QZY-3的同源性比对结果
本发明巨大芽孢杆菌QZY-3的系统发育树如图3所示。
实施例2
巨大芽孢杆菌QZY-3溶磷能力的测定
1.培养基；(1)巨大芽孢杆菌QZY-3溶磷能力测定培养基(NBRIP培养基)：葡萄糖10g，难溶态磷源(磷酸三钙或磷矿粉或卵磷脂)5g，MgCl2 5g，(NH4)2SO4 0.1g，KCl 0.2g，MgSO4 0.25g，蒸馏水1000ml，固体培养基加20g琼脂，pH自然；(2)巨大芽孢杆菌QZY-3保存与发酵培养基：牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g，蒸馏水1000ml，固体培养基加15g琼脂，pH调至7.0-7.2。
2.溶磷能力的测定方法：将筛选出的巨大芽孢杆菌QZY-3接种到灭菌后的发酵用培养液中，在2℃、160r/min条件下，培养24小时，得到发酵液；将巨大芽孢杆菌QZY-3发酵液按照1％的接种量接种于灭过菌的NBRIP液体培养基中，28℃、150r/min条件下振荡培养，将培养第7d的培养液于4℃，6000r/min的条件下离心5-8min，取上清液1ml用钼锑抗比色法测定有效磷含量，重复三次，同时设置未接菌的空白对照，菌株溶磷能力为接菌培养液有效磷含量与空白对照的差值。溶磷能力的测定结果如表3所示。
表3巨大芽孢杆菌QZY-3对难溶态磷酸盐(磷酸三钙、磷矿粉、卵磷脂)溶解能力
由表3可见，本发明巨大芽孢杆菌QZY-3具有较强的溶磷能力，可用于制备有机肥添加剂、生物有机肥中。
实施例3
巨大芽孢杆菌QZY-3促进作物幼苗(油菜和小麦)生长试验
1.发酵液制备：将本发明巨大芽孢杆菌QZY-3接种到灭菌后的发酵用培养液中，在32℃、160r/min条件下，培养24小时，得到发酵液，将发酵液与无菌水按照1:10的比例稀释后备用，同时设置不接菌的灭菌培养液作为对照，按照1:10的比例稀释。
2.油菜促生试验方法：取直径为90mm的培养皿平板9个，每个平板上铺一层薄的纸巾，用无菌水湿润，每个平板放置油菜种子30粒，放置在28℃条件下培养并不间断补充无菌水至发芽，将未发芽的种子去除，9个平板平均分成三组，第一组每个平板加10ml稀释后的巨大芽孢杆菌QZY-3发酵液，第二组每个平板加10ml无菌水，第三组每个平板加稀释后的不接菌的灭菌培养液10ml，继续放置在28℃条件下培养并不间断补充无菌水，15d后观察生长情况，并从每个平板上随机抽取5株幼苗测定其长度，结果见图6、图7及表4。
3.小麦促生试验方法：取直径为90mm的培养皿平板9个，每个平板上铺一层薄的纸巾，用无菌水湿润，每个平板放置油菜种子10粒，放置在28℃条件下培养并不间断补充无菌水至发芽，将未发芽的种子去除，9个平板平均分成三组，第一组每个平板加10ml稀释后的QZY-3发酵液，第二组每个平板加10ml无菌水，第三组每个平板加稀释后的不接菌的灭菌培养液10ml，继续放置在28℃条件下培养并不间断补充无菌水，15d后观察生长情况，并从每个平板上随机抽取5株幼苗测定其长度，结果见图4、图5及表5。
表4巨大芽孢杆菌QZY-3对油菜幼苗促生试验结果
注:表中同一列中不同的小写字母表示在0.05水平下的显著差异(即p<0.05)，下同
由图6、图7及表4可知，本发明巨大芽孢杆菌QZY-3对促进油菜幼苗的生长具有显著的作用。
表5巨大芽孢杆菌QZY-3对小麦幼苗促生试验结果
由图4、图5及表5可知，本发明巨大芽孢杆菌QZY-3对促进小麦幼苗的生长具有显著的作用。综上所述，本发明巨大芽孢杆菌QZY-3可用于制备促进作物生长的制剂。
<110>乔志伟
<120>一株巨大芽孢杆菌QZY-3及其应用
<160>1
<210>1
<211>1485
<212>DNA
<213>巨大芽孢杆菌QZY-3(Bacillus megaterium QZY-3)
<220>
<223>巨大芽孢杆菌QZY-3的16S rDNA
<400>1
GGCTCAGGAT GAACGCTGGC GGCGTGCCTA ATACATGCAA GTCGAGCGAA CTGATTAGAA 60
GCTTGCTTCT ATGACGTTAG CGGCGGACGG GTGAGTAACA CGTGGGCAAC CTGCCTGTAA 120
GACTGGGATA ACTTCGGGAA ACCGAAGCTA ATACCGGATA GGATCTTCTC CTTCATGGGA 180
GATGATTGAA AGATGGTTTC GGCTATCACT TACAGATGGG CCCGCGGTGC ATTAGCTAGT 240
TGGTGAGGTA ACGGCTCACC AAGGCAACGA TGCATAGCCG ACCTGAGAGG GTGATCGGCC 300
ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTAGGG AATCTTCCGC 360
AATGGACGAA AGTCTGACGG AGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGCTTTC GGGTCGTAAA 420
ACTCTGTTGT TAGGGAAGAA CAAGTACGAG AGTAACTGCT CGTACCTTGA CGGTACCTAA 480
CCAGAAAGCC ACGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGT GGCAAGCGTT 540
ATCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGCGCGCGC AGGCGGTTTC TTAAGTCTGA TGTGAAAGCC 600
CACGGCTCAA CCGTGGAGGG TCATTGGAAA CTGGGGAACT TGAGTGCAGA AGAGAAAAGC 660
GGAATTCCAC GTGTAGCGGT GAAATGCGTA GAGATGTGGA GGAACACCAG TGGCGAAGGC 720
GGCTTTTTGG TCTGTAACTG ACGCTGAGGC GCGAAAGCGT GGGGAGCAAA CAGGATTAGA 780
TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGATGA GTGCTAAGTG TTAGAGGGTT TCCGCCCTTT 840
AGTGCTGCAG CTAACGCATT AAGCACTCCG CCTGGGGAGT ACGGTCGCAA GACTGAAACT 900
CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT CGAAGCAACG 960
CGAAGAACCT TACCAGGTCT TGACATCCTC TGACAACTCT AGAGATAGAG CGTTCCCCTT 1020
CGGGGGACAG AGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG 1080
TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTTAGT TGGGCACTCT 1140
AAGGTGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC 1200
TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGATGGTACA AAGGGCTGCA AGACCGCGAG 1260
GTCAAGCCAA TCCCATAAAA CCATTCTCAG TTCGGATTGT AGGCTGCAAC TCGCCTACAT 1320
GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT 1380
TGTACACACC GCCCGTCACA CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGT GGAGTAACCG 1440
TAAGGAGCTA GCCGCCTAAG GTGGGACAGA TGATTGGGTG AAGTC 1485
Claims (7)
1.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) QZY-3，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019717。
2.一种菌种发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取保藏号为CCTCC NO：M2019717的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)QZY-3接种到灭菌后的发酵用培养基中，在32℃、160 r/min条件下，培养24小时，得到发酵液；其中巨大芽孢杆菌QZY-3的保存与发酵培养基为，牛肉膏3.0 g， 蛋白胨10.0g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1000 ml，固体培养基是前述液体培养基的基础上添加15 g琼脂，pH调至7.0-7.2。
3.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) QZY-3在溶解难溶态磷中的应用，所述难溶态磷源为磷酸三钙或磷矿粉或卵磷脂。
4.如权利要求3所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) QZY-3在溶解难溶态磷中的应用，所用溶磷能力测定培养基为葡萄糖10g，难溶态磷源5g，MgCl2 5g，(NH4)2SO40.1g， KCl 0.2g，MgSO4 0.25g， 蒸馏水1000ml，固体培养基是前述液体培养基的基础上添加20 g琼脂，pH自然。
5.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) QZY-3在促进小麦和油菜幼苗生长中的应用。
6.一种促进作物生长的制剂，包括权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) QZY-3或权利要求2所述的菌种发酵液的制备方法所制备的菌种发酵液。
7.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) QZY-3在制备有机肥添加剂、生物有机肥中的应用。
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