CN110684695A - 一株多黏类芽孢杆菌qzy-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉本发明属于微生物技术领域,具体涉及一株多黏类芽孢杆菌QZY‑1及其应用;其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M2019728;本发明提供了多黏类芽孢杆菌QZY‑1在溶解难溶态磷中和抑制病源微生物中的应用;还提供了多黏类芽孢杆菌QZY‑1在防治作物青枯病中的应用;还提供了一种包含有多黏类芽孢杆菌QZY‑1的生物防治制剂;本发明中多黏类芽孢杆菌QZY‑1对磷酸三钙和磷矿粉都具有显著的溶解能力,对植物病原菌(青枯菌和洋葱伯克氏菌)具有很强的抑制作用,对于研发植物病原微生物菌剂、微生物类肥料以及在土壤上推广示范等方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一株多黏类芽孢杆菌QZY-1及其应用。
背景技术
磷是作物生长最重要的元素之一。化学磷肥中能被作物直接吸收的有效磷易与土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等离子结合,转化为植物不可利用的难溶性磷酸盐,因此化学磷肥利用率很低,将土壤中难溶磷酸盐转化成植物吸收的有效磷是当前研究的热点,溶磷细菌可以将土壤中难溶态磷酸盐转化为有效磷,溶磷细菌对土壤磷素有效化过程有积极的作用;通过溶磷细菌的作用,对于提高化学磷肥的利用率,增加土壤中有效磷含量,减少磷素累积等方面都具积极的作用。溶磷细菌应用研究首先要有高效且安全的菌株资源。多黏类芽孢杆菌在微生物肥料生物安全通用技术准则(NY/T 1109-2017)附录A-菌种安全分级目录中属于第一级,免做毒理学方面的试验,属于安全类菌株。
黄壤在贵州分布最为广泛,全国25.3%的黄壤集中分布在贵州,其面积分别占贵州国土面积和土壤面积的41.9%和46.4%,是贵州主要的农业土壤类型,在贵州农业生产中发挥着重要的作用。目前该区域溶磷细菌方面的研究较少,高效安全的溶磷菌株资源缺乏,兼具溶磷和抑制病原细菌作用的菌株更是缺乏,因此从贵州中部农田土壤(黄壤)上筛选分离溶磷菌株,为该区域溶磷微生物的研究提供优质安全的菌株资源具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种多黏类芽孢杆菌QZY-1,其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M2019728。
本发明的多黏类芽孢杆菌QZY-1(Paenibacillus polymyxa QZY-1),从贵州黄壤农田中分离筛选出的,于2019年9月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),其地址为:中国.武汉.武汉大学;保藏编号为:CCTCC NO:M2019728。其具有以下生物学特性:在由下列成分的质量/体积份组成的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂15g,蒸馏水1000ml,培养液的PH值为7.0-7.2)上32℃恒温培养24小时,菌体形成大量芽孢,形成芽孢前菌体长杆状(1.0~1.2×2.1~3.0μm),排列为单个或成链(见图1),革兰氏阳性;培养3天,菌落形态为:菌落呈白色,半透明,表面光滑湿润,挑起有黏性(见图2);穿刺接种培养菌体在试管的培养基内云雾状扩散生长,表明有运动性。
本发明还提供多黏类芽孢杆菌QZY-1在溶解难溶态磷中的应用。
进一步的,多黏类芽孢杆菌QZY-1在溶解难溶态磷中的应用,所用溶磷能力测定培养基为葡萄糖10g,难溶态磷源5g,MgCl2 5g,(NH4)2SO4 0.1g,KCl 0.2g,MgSO4 0.25g,蒸馏水1000ml,固体培养基加20g琼脂,pH自然。
进一步的,所述难溶态磷源为磷酸三钙或磷矿粉或卵磷脂。
本发明还提供了多黏类芽孢杆菌QZY-1在制备有机肥添加剂、生物有机肥中的应用。
本发明还提供了多黏类芽孢杆菌QZY-1在抑制病源微生物中的应用。
本发明还提供了多黏类芽孢杆菌QZY-1在防治作物青枯病中的应用。
一种生物防治制剂,包括上述的多黏类芽孢杆菌QZY-1。
一种生物防治制剂,包括上述的多黏类芽孢杆菌QZY-1的菌种发酵液,所述菌种发酵液的制备方法,包括以下步骤:取保藏号为CCTCC NO:M2019728的多黏类芽孢杆菌QZY-1接种到灭菌后的发酵用培养基中,在32℃、160r/min条件下,培养24小时,得到发酵液;其中,多黏类芽孢杆菌QZY-1的保存与发酵培养基为,牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,蒸馏水1000ml,固体培养基加15g琼脂,pH调至7.0-7.2。
与现有技术相比本发明具有以下有益效果:
本发明中多黏类芽孢杆菌QZY-1,不需要做学毒理方面的试验,属于安全类菌株;该菌株对磷酸三钙和磷矿粉都具有显著的溶解能力,对植物病原菌(青枯菌和洋葱伯克氏菌)具有很强的抑制作用。对于研发植物病原微生物抑制剂、微生物类肥料以及在土壤上推广示范等方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为多黏类芽孢杆菌QZY-1牛肉膏蛋白胨培养基上32℃恒温培养24小时后的镜检图。
图2为多黏类芽孢杆菌QZY-1在平板上的菌落形态。
图3为本发明多黏类芽孢杆菌QZY-1的系统发育树。
图4为本发明实施例3多黏类芽孢杆菌QZY-1抑制青枯菌抑菌圈。
图5为本发明实施例3多黏类芽孢杆菌QZY-1抑制洋葱伯克氏菌抑菌圈。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
菌株的分离鉴定
从贵州黄壤农田中分离筛选得到本发明菌株,本发明菌株的形态学和分子生物学鉴定如下:
(1)菌株的形态及生理生化特征
本发明菌株在由下列成分的质量/体积份组成的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂15g,蒸馏水1000ml,培养液的PH值为7.0-7.2)上32℃恒温培养24小时,如图1所示,菌体形成大量芽孢,形成芽孢前菌体长杆状(1.0~1.2×2.1~3.0μm),排列为单个或成链,革兰氏阳性;培养3天,如图2所示,菌落形态为:菌落呈白色,半透明,表面光滑湿润,挑起有黏性;穿刺接种培养菌体在试管的培养基内云雾状扩散生长,表明有运动性;经生理生化鉴定,其特征见表1。
表1多黏类芽孢杆菌QZY-1的生理生化特征
检测指标 | 结果 | 检测指标 | 结果 |
硝酸盐还原 | + | 柠檬酸盐利用 | — |
接触酶 | + | 产吲哚 | — |
V-P测定 | + | 卵磷脂酶 | — |
甲基红(M.R) | + | 葡萄糖氧化发酵 | + |
淀粉水解 | + | 明胶液化 | + |
2%NaCl | + | 酪氨酸水解 | + |
5%NaCl | — | 氧化酶 | — |
琥珀酸盐利用 | — | 厌氧生长 | — |
H<sub>2</sub>S产生 | — | 有溶菌酶时生长 | + |
注:“+”表示该项指标为阳性;“—”表示该项指标为阴性。
(2)菌株的16S rDNA序列及分析
本发明菌株的16S rDNA基因序列长度为1489bp,序列如下:
将提取所得多黏类芽孢杆菌QZY-1的16S rDNA序列输入NCBI的GeneBank数据库中,与已知菌株的16S rDNA基因序列进行同源性比对,可知多黏类芽孢杆菌QZY-1的16SrDNA序列与多黏类芽孢杆菌的同源性最高,达到了100%(见表2)。
表2多黏类芽孢杆菌QZY-1的同源性比对结果
本发明多黏类芽孢杆菌QZY-1的系统发育树如图3所示。
实施例2
多黏类芽孢杆菌QZY-1溶磷能力的测定
1.培养基;(1)多黏类芽孢杆菌QZY-1溶磷能力测定培养基(NBRIP培养基):葡萄糖10g,难溶态磷源(磷酸三钙或磷矿粉)5g,MgCl2 5g,(NH4)2SO4 0.1g,KCl 0.2g,MgSO40.25g,蒸馏水1000ml,固体培养基加20g琼脂,pH自然;(2)多黏类芽孢杆菌QZY-1保存与发酵培养基:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,蒸馏水1000ml,固体培养基加15g琼脂,pH调至7.0-7.2。
2.溶磷细菌溶磷能力的测定方法:将筛选出的多黏类芽孢杆菌QZY-1接种到灭菌后的发酵用培养液中,在32℃、160r/min条件下,培养24小时,得到发酵液;将溶磷细菌发酵液按照1%的接种量接种于灭过菌的NBRIP液体培养基中,30℃、150r/min条件下振荡培养,将培养第7d的培养液于4℃,6000r/min的条件下离心5-8min,取上清液1ml用钼锑抗比色法测定有效磷含量,重复三次,同时设置未接菌的空白对照,菌株溶磷能力即为接菌培养液有效磷含量与空白对照的差值。溶磷能力的测定结果如表3所示。
表3QZY-1对难溶态磷酸盐(磷酸三钙、磷矿粉)溶解能力
由表3可见,本发明多黏类芽孢杆菌QZY-1具有较强的溶磷能力,可用于制备有机肥添加剂、生物有机肥中。
实施例3
多黏类芽孢杆菌QZY-1抑菌圈试验
1.植物病源细菌:辣椒青枯菌和洋葱伯克氏菌,辣椒青枯菌分离自感染青枯病的辣椒植株,洋葱伯克氏菌分离自农田土壤中
1.培养基
液体培养基:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0。
平板培养基:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,琼脂粉15g,蒸馏水1000ml,pH7.0。
2.用打孔器将质地均匀的滤纸打成6mm直径的圆片,灭菌后烘干放置在无菌培养皿中,
3.发酵液制备:将多黏类芽孢杆菌QZY-1和植物病源细菌分别接种到灭菌后的发酵用培养液中,在32℃、160r/min条件下,培养24小时,得到发酵液备用。
4.在已灭菌的培养皿中倒入20ml左右的平板培养基,水平静置凝固,接种0.1ml的植物病源微生物发酵液,涂布均匀后备用。
5.将灭菌后的圆片浸泡于QZY-1发酵液中,然后将圆片置于步骤4的平板中,在30℃恒温振荡箱中培养3-5天后取出,观察抑菌圈的大小。抑菌圈直径,如表4所示。
表4多黏类芽孢杆菌QZY-1抑菌圈直径
抑制青枯菌的实验,如图4所示,抑制洋葱伯克氏菌的实验如图5所示,可见,本发明多黏类芽孢杆菌QZY-1具有显著的抑制病源微生物的作用,可用于防治作物青枯病中,也可用于制备生物防治制剂。
<110>乔志伟
<120>一株多黏类芽孢杆菌QZY-1及其应用
<160>1
<210>1
<211>1489
<212>DNA
<213>多黏类芽孢杆菌QZY-1 (Paenibacillus polymyxa QZY-1)
<220>
<223>多黏类芽孢杆菌QZY-1 的16S rDNA
<400>1
TCAGGACGAA CGCTGGCGGC GTGCCTAATA CATGCAAGTC GAGCGGGGTT GATTAGAAGC 60
TTGCTTCTAA TCAACCTAGC GGCGGACGGG TGAGTAACAC GTAGGCAACC TGCCCACAAG 120
ACAGGGATAA CTACCGGAAA CGGTAGCTAA TACCCGATAC ATCCTTTTCC TGCATGGGAG 180
AAGGAGGAAA GACGGAGCAA TCTGTCACTT GTGGATGGGC CTGCGGCGCA TTAGCTAGTT 240
GGTGGGGTAA AGGCCTACCA AGGCGACGAT GCGTAGCCGA CCTGAGAGGG TGATCGGCCA 300
CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTAGGGA ATCTTCCGCA 360
ATGGGCGAAA GCCTGACGGA GCAACGCCGC GTGAGTGATG AAGGTTTTCG GATCGTAAAG 420
CTCTGTTGCC AGGGAAGAAC GTCTTGTAGA GTAACTGCTA CAAGAGTGAC GGTACCTGAG 480
AAGAAAGCCC CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGGG GCAAGCGTTG 540
TCCGGAATTA TTGGGCGTAA AGCGCGCGCA GGCGGCTCTT TAAGTCTGGT GTTTAATCCC 600
GAGGCTCAAC TTCGGGTCGC ACTGGAAACT GGGGAGCTTG AGTGCAGAAG AGGAGAGTGG 660
AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA TATGTGGAGG AACACCAGTG GCGAAGGCGA 720
CTCTCTGGGC TGTAACTGAC GCTGAGGCGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA 780
CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAAT GCTAGGTGTT AGGGGTTTCG ATACCCTTGG 840
TGCCGAAGTT AACACATTAA GCATTCCGCC TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA 900
AAGGAATTGA CGGGGACCCG CACAAGCAGT GGAGTATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG 960
AAGAACCTTA CCAGGTCTTG ACATCCCTCT GATCGGTCTA GAGATAGATC TTTCCTTCGG 1020
GACAGAGGAG ACAGGTGGTG CATGGTTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA 1080
GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATGCTTA GTTGCCAGCA GGTCAAGCTG GGCACTCTAA 1140
GCAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC GTCAAATCAT CATGCCCCTT 1200
ATGACCTGGG CTACACACGT ACTACAATGG CCGGTACAAC GGGAAGCGAA ATCGCGAGGT 1260
GGAGCCAATC CTAGAAAAGC CGGTCTCAGT TCGGATTGTA GGCTGCAACT CGCCTACATG 1320
AAGTCGGAAT TGCTAGTAAT CGCGGATCAG CATGCCGCGG TGAATACGTT CCCGGGTCTT 1380
GTACACACCG CCCGTCACAC CACGAGAGTT TACAACACCC GAAGTCGGTG GGGTAACCCG 1440
CAAGGGAGCC AGCCGCCGAA GGTGGGGTAG ATGATTGGGG TGAAGTCGT 1489
Claims (9)
1.多黏类芽孢杆菌QZY-1,其特征在于,其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M2019728。
2.权利要求1所述的多黏类芽孢杆菌QZY-1在溶解难溶态磷中的应用。
3.如权利要求2所述的多黏类芽孢杆菌QZY-1在溶解难溶态磷中的应用,所用溶磷能力测定培养基为葡萄糖10g,难溶态磷源5g,MgCl2 5g,(NH4)2SO4 0.1g, KCl 0.2g,MgSO40.25g, 蒸馏水1000ml,固体培养基加20g琼脂,pH自然。
4.如权利要求3所述的多黏类芽孢杆菌QZY-1在溶解难溶态磷中的应用,所述难溶态磷源为磷酸三钙或磷矿粉。
5.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌QZY-1在制备有机肥添加剂、生物有机肥中的应用。
6.权利要求1所述的多黏类芽孢杆菌QZY-1在抑制病源微生物中的应用。
7.权利要求1所述的多黏类芽孢杆菌QZY-1在防治作物青枯病中的应用。
8.一种生物防治制剂,包括权利要求1所述的多黏类芽孢杆菌QZY-1。
9.一种生物防治制剂,包括权利要求1所述的多黏类芽孢杆菌QZY-1的菌种发酵液,所述菌种发酵液的制备方法,包括以下步骤:取保藏号为CCTCC NO:M2019728的多黏类芽孢杆菌QZY-1接种到灭菌后的发酵用培养基中,在32℃、160 r/min条件下,培养24小时,得到发酵液;其中,多黏类芽孢杆菌QZY-1的保存与发酵培养基为, 牛肉膏3.0 g, 蛋白胨10.0g,NaCl 5.0 g,蒸馏水1000 ml,固体培养基加15 g琼脂,pH调至7.0-7.2。
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