CN110638837B - 蜂胶提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，本发明提供的蜂胶提取物的制备方法包括：将蜂胶毛胶碎料采用70％以上的乙醇水溶液进行提取，制备蜂胶粗提物；将蜂胶粗提物进行冷冻处理，然后分散于乙醇的70％以上的乙醇水溶液中，制备蜂胶浓缩液；将蜂胶浓缩液与硅胶进行混合，使得蜂胶浓缩液中的活性成分吸附到硅胶粉上，制备硅胶吸附粉；将硅胶吸附粉依次采用第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂进行固‑液萃取，收集第三萃取剂部位，制备蜂胶浸膏；其中，第一萃取剂为石油醚，第二萃取剂为丙酮和石油醚按体积比小于2:1的比例进行混合的混合溶剂，第三萃取剂为丙酮和石油醚按体积比为(2‑4):1的比例进行混合的混合溶剂；将蜂胶浸膏进行脱色处理。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种蜂胶提取物及其制备方法和应用。
背景技术
蜂胶是由工蜂将采自杨树、柳树、松树等植物的幼芽和愈伤组织分泌的树脂与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶黏性天然物质。中外研究结果表明，蜂胶作为一种应用历史悠久的天然药品和保健品，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、清除自由基、促进组织再生、辅助降血糖和降血脂等药理学作用，而具广泛生物学活性的黄酮类化合物是蜂胶中含量最高、种类最为丰富的一大类化合物，且其含量之高和种类之多是其它天然产物不可比拟的。
蜂胶的生物学活性是由其多种化学成分相互作用的结果。然而，蜂胶的化学成分及其复杂，目前已知有300多种成分，包含树脂、蜂蜡、黄酮、多酚、萜烯、酯类、挥发油等，且受植物来源、蜂种等因素影响，这给蜂胶中活性成分的分离纯化及研究应用带来较大困难，导致蜂胶提取物中黄酮类化合物等活性成分的含量偏低的问题，例如：白杨树可低至2％，高良姜素可低至1％，咖啡酸苯乙酯可低至0.5％等。同时，现有文献报道的制备工艺得到的高含量蜂胶总黄酮仅以克计，基本停留在实验室阶段，且在硅胶柱层析工艺中，需要耗费较多的例如氯仿、苯、乙酸乙酯等毒性溶剂，并不具备产业化大生产条件。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种蜂胶提取物的制备方法，旨在解决现有蜂胶提取物制备工艺所存在的活性成分含量低且不适于产业化大生产等问题。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制得的蜂胶提取物和应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种蜂胶提取物的制备方法，包括以下步骤：
提供蜂胶毛胶，将所述蜂胶毛胶进行粉碎，获得蜂胶毛胶碎料；
将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液进行提取，收集提取液进行浓缩，获得蜂胶粗提物；
将所述蜂胶粗提物进行冷冻处理，然后分散于乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中，过滤，将滤液浓缩，获得蜂胶浓缩液；
提供硅胶，将所述蜂胶浓缩液与所述硅胶进行混合，使得所述蜂胶浓缩液中的活性成分吸附到所述硅胶粉上，干燥，获得硅胶吸附粉；
将所述硅胶吸附粉依次采用第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂进行固-液萃取，收集第三萃取剂部位，浓缩，获得蜂胶浸膏；其中，所述第一萃取剂为石油醚，所述第二萃取剂为丙酮和石油醚按体积比小于2:1的比例进行混合的混合溶剂，所述第三萃取剂为丙酮和石油醚按体积比为(2-4):1的比例进行混合的混合溶剂；
将所述蜂胶浸膏进行脱色处理，过滤，将滤液浓缩，获得蜂胶精提物。
本发明提供的蜂胶提取物的制备方法中，将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液进行提取，以富集蜂胶中的活性成分如黄酮类化合物；然后，将蜂胶粗提物进行冷冻处理，以析出蜂胶粗提物中残留的蜂蜡，并通过分散在乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中来分离去除蜂蜡，避免残留的蜂蜡影响后续总黄酮活性成分的分离纯化，促进提取物中总黄酮活性成分的进一步富集；接着，将蜂胶浓缩液与硅胶混合吸附，使得所述蜂胶浓缩液中的活性成分吸附到所述硅胶粉上，并采用不同体积比的石油醚-丙酮系统对硅胶吸附粉进行固液萃取，收集体积比为(2-4):1的丙酮-石油醚萃取部位，浓缩获得蜂胶浸膏，方法简单，可实现百公斤级别的蜂胶提取物的规模化生产；之后，再对蜂胶浸膏进行脱色处理。经检测，通过上述方法制得的蜂胶精提物中的总黄铜活性成分含量高达98.1％，且活性成分明确，可很好地应用于制备保健食品、药品和美容原料，使用安全。
另一方面，本发明提供了一种蜂胶提取物，由上述制备方法制得，且所述蜂胶提取物中的活性成分包括白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素。
本发明提供的蜂胶提取物，由上述制备方法制得，纯度高达98.1％，且其活性成分主要包括白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素等黄酮类化合物，活性成分明确，可广泛应用于制备保健食品、药品和美容原料，使用安全。
又一方面，本发明提供了前述制备方法或上述蜂胶提取物在制备保健食品、药品和美容原料中的应用。
由上述制备方法制得的蜂胶提取物，纯度高达98.1％，且其活性成分主要包括白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素等黄酮类化合物，活性成分明确，具有广泛生物学活性，可应用于制备保健食品、药品和美容原料等功能产品。
附图说明
图1为测试例中蜂胶提取物活性成分的HPLC检测结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
一种蜂胶提取物的制备方法，包括以下步骤：
S01、提供蜂胶毛胶，将所述蜂胶毛胶进行粉碎，获得蜂胶毛胶碎料；
S02、将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液进行提取，收集提取液进行浓缩，获得蜂胶粗提物；
S03、将所述蜂胶粗提物进行冷冻处理，然后分散于乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中，过滤，将滤液浓缩，获得蜂胶浓缩液；
S04、提供硅胶，将所述蜂胶浓缩液与所述硅胶进行混合，使得所述蜂胶浓缩液中的活性成分吸附到所述硅胶粉上，干燥，获得硅胶吸附粉；
S05、将所述硅胶吸附粉依次采用第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂进行固-液萃取，收集第三萃取剂部位，浓缩，获得蜂胶浸膏；其中，所述第一萃取剂为石油醚，所述第二萃取剂为丙酮和石油醚按体积比小于2:1的比例进行混合的混合溶剂，所述第三萃取剂为丙酮和石油醚按体积比为(2-4):1的比例进行混合的混合溶剂；
S06、将所述蜂胶浸膏进行脱色处理，过滤，将滤液浓缩，获得蜂胶精提物。
具体地，步骤S01中，所述蜂胶毛胶为未经任何化学试剂提取处理的蜂胶毛料，可选自来源于多个产地例如黄山绩溪、安徽大别山金寨、河南平顶山、山西晋城等的蜂胶毛胶。
将所述蜂胶毛胶进行粉碎，以获得蜂胶毛胶碎料。将所述蜂胶毛胶进行粉碎的步骤可参考本领域的常规操作，如一些实施例中，将所述蜂胶毛胶进行冷冻粉碎，以解决蜂胶毛胶在常温下粉碎时出现的蜂胶发黏的问题。作为一种实施方式，将所述蜂胶毛胶进行粉碎的步骤中，将所述蜂胶毛胶在-10℃至-20℃下冷冻处理10-20小时，然后进行粉碎处理。在一些具体实施例中，冷冻处理的温度为-10℃、-11℃、-12℃、-13℃、-14℃、-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、-20℃，冷冻处理的时间为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20小时。如此，可促进蜂胶毛胶快速粉碎至合适尺寸。在一些实施例中，将所述蜂胶毛胶进行冷冻粉碎至40-100目数，以提高蜂胶提取物的提取效率。
具体地，步骤S02中，将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液进行提取，收集提取液进行浓缩，获得蜂胶粗提物。
将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液进行提取的步骤，可参考本领域的常规操作，例如采用搅拌提取、渗漉提取、超声提取、微波提取、浸泡提取等方法进行提取。将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液作为提取溶剂，可最大限度地提取蜂胶中的活性成分黄酮类化合物。在具体实施例中，所述乙醇水溶液中的乙醇的重量百分比浓度为70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
作为一种实施方式，将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液进行提取的步骤中，将所述蜂胶毛胶碎料和所述乙醇水溶液按照1g:(3-10)mL的料液比进行搅拌提取1-4次，每次提取2-3小时。在具体实施例中，所述蜂胶毛胶碎料和所述乙醇水溶液的料液比为按照1g:3mL、1g:4mL、1g:5mL、1g:6mL、1g:7mL、1g:8mL、1g:9mL、1g:10mL，通过控制蜂胶毛胶碎料和乙醇水溶液的料液比为上述范围，可有效地富集提取蜂胶毛胶中的黄酮类化合物，显著提高蜂胶提取物中黄酮类化合物的提取效率。在进一步实施例中，所述乙醇水溶液中的乙醇的重量百分比浓度优选为90％以上，经检测，将所述蜂胶毛胶碎料和所述乙醇水溶液按照1g:(3-10)mL的料液比进行搅拌提取，且所述乙醇水溶液中的乙醇的重量百分比浓度优选为90％以上时，由此得到的蜂胶粗提物中的总黄酮活性成分含量从蜂胶毛胶的6.86％上升到32.8％-56.2％。
收集提取液进行浓缩的步骤，可参考本领域的常规操作，例如将提取液进行减压真空浓缩。在一些实施例中，收集提取液进行浓缩的步骤中，采用旋转蒸发仪对提取液进行减压真空浓缩。在一些实施例中，收集提取液进行浓缩的步骤中，将提取液浓缩至相对密度为1.15-1.25mg/mL的流浸膏，在一些具体实施例中，制得的蜂胶粗提物的相对密度为1.15、1.20、1.25、1.24、1.22mg/mL。将提取液进行浓缩至具有上述相对密度范围的流浸膏状蜂胶粗提物，可促进后续步骤S03中更好地冷冻处理析出蜂蜡。
具体地，步骤S03中，将所述蜂胶粗提物进行冷冻处理，然后分散于乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中，过滤，将滤液浓缩，获得蜂胶浓缩液。
将所述蜂胶粗提物进行冷冻处理，可使得蜂胶粗提物中残留的蜂蜡在低温条件下析出，蜂蜡不溶于水，将析出有蜂蜡的蜂胶提取物分散于乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中，分离去除蜂蜡，避免残留的蜂蜡影响后续总黄酮活性成分的分离纯化，促进提取物中总黄酮活性成分的进一步富集。
作为一种实施方式，将所述蜂胶粗提物进行冷冻处理的步骤中，将所述蜂胶粗提物在-10℃至-20℃下冷冻处理20-24小时。在一些具体实施例中，所述冷冻处理的温度为-10℃、-11℃、-12℃、-13℃、-14℃、-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、-20℃，冷冻处理的时间为20、21、22、23、24小时，如此，可确保蜂胶粗提物中残留的蜂蜡可最大限度地被析出。
将所述蜂胶粗提物分散于乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中的步骤，可参考本领域的常规操作，例如采用机械搅拌或超声处理的方法将所述蜂胶粗提物均匀地分散于乙醇水溶液中。一些实施例中，将所述蜂胶粗提物采用超声处理的方法分散于乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中。一些实施例中，所述乙醇水溶液中的乙醇的重量百分比浓度为70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％、100％。
作为一种实施方式，将所述蜂胶粗提物分散于乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中的步骤中，将所述蜂胶粗提物与所述乙醇水溶液按照1g:(5-10)mL的料液比进行混合分散。在一些实施例中，所述蜂胶粗提物与所述乙醇水溶液的料液比为1g:5mL、1g:6mL、1g:7mL、1g:8mL、1g:9mL、1g:10mL。在一些实施例中，将所述蜂胶粗提物与所述乙醇水溶液按照1g:(5-10)mL的料液比进行超声处理。在一些实施例中，将所述蜂胶粗提物超声分散于乙醇的重量百分比浓度为70％-80％的乙醇水溶液中。
具体地，步骤S04中，提供硅胶，将所述蜂胶浓缩液与所述硅胶进行混合，使得所述蜂胶浓缩液中的活性成分吸附到所述硅胶粉上，干燥，获得硅胶吸附粉。
所述硅胶作为吸附剂，用于吸附所述蜂胶浓缩液中的化学成分，可选为本领域常规的硅胶材料，如一些实施例中，所述硅胶选为柱层析硅胶。
将所述蜂胶浓缩液与所述硅胶进行混合的步骤可参考本领域常规操作，例如一边搅拌一边逐次地将硅胶加入蜂胶浓缩液中，使得所述蜂胶浓缩液中的活性成分吸附到所述硅胶粉上。另外，所述干燥可参考本领域的常规干燥方法，例如，于室温下自然挥发混合物中的溶剂至干燥或采用浓缩的方法直接回收混合物中的溶剂，以获得硅胶吸附粉。
作为一种实施方式，将所述蜂胶浓缩液与所述硅胶进行混合的步骤中，在所述蜂胶浓缩液中加入所述蜂胶毛胶重量的20％-100％的硅胶进行混合均匀，使得蜂胶浓缩液中的化学成分可充分地被吸附到硅胶上，以提高蜂胶毛胶中黄酮类化合物活性成分的提取效率。在一些实施例中，所述蜂胶浓缩液中加入的硅胶用量为所述蜂胶毛胶重量的20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。在一些实施例中，所述蜂胶浓缩液的固液比为1g:2mL-1g:3mL，具体为1g:3mL、1g:2mL、1g:2.5mL，当蜂胶浓缩液的固液比低于1g:2mL时，容易导致部分蜂胶活性成分析出，与硅胶结合度降低，不利于纯化；当蜂胶浓缩液的固液比低于1g:3mL时，浓度太稀，费时费工，浪费大量乙醇，此外乙醇蒸发时带走蜂胶活性成分爬壁，损失较大。
具体地，步骤S05中，将所述硅胶吸附粉依次采用第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂进行固-液萃取，收集第三萃取剂部位，浓缩，获得蜂胶浸膏；其中，所述第一萃取剂为石油醚，所述第二萃取剂为丙酮和石油醚按体积比小于2:1的比例进行混合的混合溶剂，所述第三萃取剂为丙酮和石油醚按体积比为(2-4):1的比例进行混合的混合溶剂。
本发明实施例利用固液萃取的方法，采用石油醚-丙酮洗脱系统，并通过逐次调节石油醚-丙酮的比例，使得吸附到硅胶上的化合物能够按照极性由小到大逐渐解吸附到对应极性范围的萃取剂中，从而将目标成分黄酮类化合物高效率地富集到第三萃取剂部位。与现有常规的硅胶柱层析的方法相比，本发明实施例提供的方法操作简单，且不受硅胶柱层析的局限，可实现百公斤级别的蜂胶提取物的规模化生产。
将所述硅胶吸附粉依次采用第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂进行固-液萃取的步骤，可参考本领域的常规固-液萃取操作，为节省篇幅，此处不再一一赘述。
作为一种实施方式，将所述硅胶吸附粉依次采用第一萃取剂、第二萃取剂、第三萃取剂和第四萃取剂进行固-液萃取的步骤包括：
S041、将所述硅胶吸附粉和所述第一萃取剂按照1:(3-10)的体积比进行混合，搅拌提取1-3次，每次1-3小时，过滤，将滤渣自然挥干作为第一萃取物；
S042、将所述第一萃取物与所述第二萃取剂按照1:(3-10)的体积比进行混合，搅拌提取1-3次，每次1-3小时，过滤，将滤渣自然挥干作为第二萃取物；
S043、将所述第二萃取物与所述第三萃取剂按照1:(3-10)的体积比进行混合，搅拌提取1-3小时，每次1-3小时，合并搅拌提取后的第三萃取剂。
其中，步骤S041中，将所述硅胶吸附粉和所述第一萃取剂按照1:(3-10)的体积比进行混合，可使得硅胶吸附粉中吸附的部分极性与第一萃取剂极性相近的化合物解吸附到第一萃取剂中，实现对硅胶吸附粉上的杂质的第一次纯化分离。在一些实施例中，所述硅胶吸附粉和所述第一萃取剂的体积比为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10。
步骤S042中，将所述第一萃取物与所述第二萃取剂按照1:(3-10)的体积比进行混合，可使得硅胶吸附粉中吸附的部分极性与第二萃取剂极性相近的化合物解吸附到第二萃取剂中，实现对硅胶吸附粉上的杂质的第二次纯化分离。在一些实施例中，所述第一萃取物和所述第二萃取剂的体积比为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10。在一些实施例中，所述第二萃取剂中的丙酮和石油醚的体积比为1:1、1:2、1:3、1:4。
在进一步的实施例中，将所述第一萃取物与所述第二萃取剂按照1:(3-10)的体积比进行混合的步骤包括：
将所述第一萃取物与丙酮和石油醚的体积比为1:(2-4)的混合溶剂按照1:(3-10)的体积比进行混合，搅拌提取1-3次，每次1-3小时，过滤，取滤渣；然后，将滤渣与丙酮和石油醚的体积比为1:1的混合溶剂按照1:(3-10)的体积比进行混合，搅拌提取1-3次，每次1-3小时，过滤，取滤渣自然挥干得到第二萃取物。
如此，可减少提取物中残留的杂质对活性成分提取带来的影响，以进一步提高后续步骤S043中第三萃取剂部位中黄酮类化合物的富集量，从而提高黄酮类化合物活性成分的提取效率。
步骤S043中，第三萃取剂为丙酮和石油醚按体积比为(2-4):1的比例进行混合的混合溶剂，其极性与黄酮类化合物的极性相近，将所述第二萃取物与所述第三萃取剂按照1:(3-10)的体积比进行混合，可富集硅胶吸附粉中的黄酮类化合物到第三萃取剂中。在一些实施例中，所述第二萃取物和所述第三萃取剂的体积比为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10。在一些实施例中，所述第三萃取剂中的石油醚和丙酮的体积比为1:2、1:3、1:4。
具体地，步骤S05中，将所述蜂胶浸膏进行脱色处理，过滤，将滤液浓缩，获得蜂胶精提物。
将所述蜂胶浸膏进行脱色处理的步骤可参考本领域的常规操作，例如采用活性炭吸附、大孔树脂吸附或化学试剂吸附等方法进行脱色处理。
作为一种实施方式，将所述蜂胶浸膏分散于乙醇的重量百分比浓度为60％-95％的乙醇水溶液中，进行超声处理。相对于其他现有脱色处理工艺，本发明实施例采用乙醇的重量百分比浓度为60％-95％的乙醇水溶液进行超声处理，操作简便，脱色效率高，可实现百公斤级别的蜂胶提取物的脱色纯化。在具体实施例中，所述乙醇水溶液的乙醇的重量百分比浓度为60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％。进一步实施例中，所述超声处理的时间为30min。进一步实施例中，将所述蜂胶浸膏分散于乙醇的重量百分比浓度为60％-95％的乙醇水溶液的步骤之前，将所述蜂胶浸膏进行粉碎处理，以提高脱色效率。
综上，本发明实施例提供的蜂胶提取物的制备方法中，将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液进行提取，以富集蜂胶中的活性成分如黄酮类化合物；然后，将蜂胶粗提物进行冷冻处理，以析出蜂胶粗提物中残留的蜂蜡，并通过分散在乙醇的重量百分比浓度为70％以上的乙醇水溶液中来分离去除蜂蜡，避免残留的蜂蜡影响后续总黄酮活性成分的分离纯化，促进提取物中总黄酮活性成分的进一步富集；接着，将蜂胶浓缩液与硅胶混合吸附，使得所述蜂胶浓缩液中的活性成分吸附到所述硅胶粉上，并采用不同体积比的石油醚-丙酮系统对硅胶吸附粉进行固液萃取，收集体积比为1:(2-4)的石油醚-丙酮萃取部位，浓缩获得蜂胶浸膏，方法简单，可实现百公斤级别的蜂胶提取物的规模化生产；之后，再对蜂胶浸膏进行脱色处理。经检测，通过上述方法制得的蜂胶精提物中的总黄铜活性成分含量高达98.1％，且活性成分明确，可很好地应用于制备保健食品、药品和美容原料，使用安全。
基于上述技术方案，本发明实施例还提供了一种蜂胶提取物及其用途。
相应地，一种蜂胶提取物，由上述制备方法制得，且所述蜂胶提取物中的活性成分包括白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素。
本发明实施例提供的蜂胶提取物，由上述制备方法制得，纯度高达98.1％，且其活性成分主要包括白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素等黄酮类化合物，活性成分明确，可广泛应用于制备保健食品、药品和美容原料，使用安全。
作为一种实施方式，所述蜂胶提取物中，所述白杨素的重量百分含量为18％-23％，所述松属素的重量百分含量为12％-17％，所述高良姜素的重量百分含量为7％-12％，所述咖啡酸苯乙酯的重量百分含量为6％-11％，所述山奈酚的重量百分含量为9％-14％，所述短叶松素的重量百分含量为7％-12％，所述金合欢素的重量百分含量为4％-9％。相对于现有工艺制得的蜂胶提取物，由本实施例的方法制得的蜂胶提取物中白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素等黄酮类化合物的含量均显著提高。
相应地，前述制备方法或上述蜂胶提取物在制备保健食品、药品和美容原料中的应用。
由上述制备方法制得的蜂胶提取物，纯度高达98.1％，且其活性成分主要包括白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素等黄酮类化合物，活性成分明确，具有广泛生物学活性，可应用于制备保健食品、药品和美容原料等功能产品。
进一步地，基于上述技术方案，本发明实施例还提供了一种用于检测由上述制备方法制得的蜂胶提取物的方法，其可有效分离蜂胶提取物中的白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素等活性成分，使其达到基线分离，实现定性、定量地检测供试品溶液中的活性成分。
相应的，一种蜂胶提取物的检测方法，所述蜂胶提取物的活性成分包括：白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素；
A、所述蜂胶提取物的检测方法包括以下步骤：
B、将所述蜂胶提取物溶解于溶剂中，制备供试品溶液；
C、将所述供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，得到所述蜂胶提取物活性成分的定性定量检测结果；
其中，所述高效液相色谱的条件为：十八烷基硅烷键合硅胶柱；以乙腈为流动性A，以磷酸水溶液为流动性B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：
在一些实施例中，所述供试品溶液中所述蜂胶提取物的浓度为0.02-0.08mg/L。
在一些实施例中，将所述蜂胶提取物溶解于溶剂的步骤中，所述溶剂包括：醇、醇水溶液、乙腈、乙腈水溶液和磷酸水溶液中的至少一种。其中，所述醇包括但不限于甲醇、乙醇等。
在一些实施例中，所述磷酸水溶液中的磷酸的重量百分比浓度为0.01％-0.20％。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例一种蜂胶提取物的制备方法的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。
实施例1
本实施例制备了一种蜂胶提取物，具体包括以下步骤：
S11、取产自安徽黄山绩溪、品质均一的蜂胶毛胶，清洗除去物理性杂质，于-15℃下冷冻10小时，获得冷冻蜂胶毛胶；在2℃-10℃下取约1kg的冷冻蜂胶毛胶，粉碎成粗粉，获得蜂胶毛胶碎料；
S12、按照1g：5mL的料液比，将蜂胶毛胶碎料采用95％乙醇进行搅拌提取3次，每次提取2小时，过滤，合并滤液，将滤液采用旋转蒸发仪浓缩至流浸膏状，获得蜂胶粗提物(25℃下的相对密度：1.15)；
S13、将步骤S12制得的蜂胶粗提物在-15℃下冷冻24小时，按照1g:5mL的料液比，室温下加入75％乙醇进行超声提取，过滤分离乙醇提取液和蜂蜡杂质沉淀，将上述乙醇提取液进行浓缩回收乙醇，获得蜂胶浓缩液(25℃下的固液比为1g:3mL)；
S14、在步骤S13制得的蜂胶浓缩液中加入600g硅胶，混合均匀后采用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，抽干至粉体完全干燥，研磨至均匀细粉，获得硅胶吸附粉；
S15、采用沸点为60-90℃的石油醚作为第一萃取剂，在步骤S14制得的硅胶吸附粉中加入5倍体积的第一萃取剂，搅拌4h，过滤，将滤渣自然挥干作为第一萃取物；
采用石油醚-丙酮(3:1，vol/vol)作为第二萃取剂，在第一萃取物中加入5倍体积的第二萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第二萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:1，vol/vol)作为第三萃取剂，在第二萃取物中加入5倍体积的第三萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第三萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:3，vol/vol)作为第四萃取剂，在第三萃取物中加入5倍体积的第四萃取剂，搅拌提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪浓缩滤液至干燥，获得蜂胶浸膏；
S16、将蜂胶浸膏粉碎成细粉，加蜂胶浸膏3倍体积的65％乙醇，超声30min，进行脱色，过滤，将滤渣真空减压干燥5小时，得到蜂胶精提物105g，其色泽呈淡黄至黄色。
实施例2
本实施例制备了一种蜂胶提取物，具体包括以下步骤：
S21、取产自安徽大别山金寨、品质均一的蜂胶毛胶，清洗除去物理性杂质，于-20℃下冷冻15小时，获得冷冻蜂胶毛胶；在2℃-10℃下取约1kg的冷冻蜂胶毛胶，粉碎成粗粉，获得蜂胶毛胶碎料；
S22、按照1g：8mL的料液比，将蜂胶毛胶碎料采用乙醇进行搅拌提取2次，每次提取3小时，过滤，合并滤液，将滤液采用旋转蒸发仪浓缩至流浸膏状，获得蜂胶粗提物(25℃下的相对密度：1.20)；
S23、将步骤S22制得的蜂胶粗提物在-18℃下冷冻20小时，按照1g:10mL的料液比，室温下加入80％乙醇进行超声提取，过滤分离乙醇提取液和蜂蜡杂质沉淀，将上述乙醇提取液进行浓缩回收乙醇，获得蜂胶浓缩液(25℃下的固液比为1g:2mL)；
S24、在步骤S23制得的蜂胶浓缩液中加入500g硅胶，混合均匀后采用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，抽干至粉体完全干燥，研磨至均匀细粉，获得硅胶吸附粉；
S25、采用沸点为60-90℃的石油醚作为第一萃取剂，在步骤S24制得的硅胶吸附粉中加入8倍体积的第一萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第一萃取物；
采用石油醚-丙酮(3:1，vol/vol)作为第二萃取剂，在第一萃取物中加入8倍体积的第二萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第二萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:1，vol/vol)作为第三萃取剂，在第二萃取物中加入8倍体积的第三萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第三萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:3，vol/vol)作为第四萃取剂，在第三萃取物中加入8倍体积的第四萃取剂，搅拌提取2次，每次3h，过滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪浓缩滤液至干燥，获得蜂胶浸膏；
S26、将蜂胶浸膏粉碎成细粉，加蜂胶浸膏3倍体积的75％乙醇，超声30min，进行脱色，过滤，将滤渣真空减压干燥6小时，得到蜂胶精提物115g，其色泽呈淡黄至黄色。
实施例3
本实施例制备了一种蜂胶提取物，具体包括以下步骤：
S31、取产自河南平顶山、品质均一的蜂胶毛胶，清洗除去物理性杂质，于-18℃下冷冻15小时，获得冷冻蜂胶毛胶；在2℃-10℃下取约1kg的冷冻蜂胶毛胶，粉碎成粗粉，获得蜂胶毛胶碎料；
S32、按照1g：10mL的料液比，将蜂胶毛胶碎料采用乙醇进行搅拌提取3次，每次提取3小时，过滤，合并滤液，将滤液采用旋转蒸发仪浓缩至流浸膏状，获得蜂胶粗提物(25℃下的相对密度：1.25)；
S33、将步骤S32制得的蜂胶粗提物在-18℃下冷冻24小时，按照1g:6mL的料液比，室温下加入80％乙醇进行超声提取，过滤分离乙醇提取液和蜂蜡杂质沉淀，将上述乙醇提取液进行浓缩回收乙醇，获得蜂胶浓缩液(25℃下的固液比为1g:2.5mL)；
S34、在步骤S33制得的蜂胶浓缩液中加入800g硅胶，混合均匀后采用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，抽干至粉体完全干燥，研磨至均匀细粉，获得硅胶吸附粉；
S35、采用沸点为60-90℃的石油醚作为第一萃取剂，在步骤S34制得的硅胶吸附粉中加入10倍体积的第一萃取剂，搅拌1h，过滤，将滤渣自然挥干作为第一萃取物；
采用石油醚-丙酮(3:1，vol/vol)作为第二萃取剂，在第一萃取物中加入10倍体积的第二萃取剂，搅拌1h，过滤，将滤渣自然挥干作为第二萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:1，vol/vol)作为第三萃取剂，在第二萃取物中加入10倍体积的第三萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第三萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:3，vol/vol)作为第四萃取剂，在第三萃取物中加入10倍体积的第四萃取剂，搅拌提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪浓缩滤液至干燥，获得蜂胶浸膏；
S36、将蜂胶浸膏粉碎成细粉，加蜂胶浸膏3倍体积的75％乙醇，超声30min，进行脱色，过滤，将滤渣真空减压干燥6小时，得到蜂胶精提物125g，其色泽呈淡黄至黄色。
实施例4
本实施例制备了一种蜂胶提取物，具体包括以下步骤：
S41、取产自山西晋城、品质均一的蜂胶毛胶，清洗除去物理性杂质，于-10℃下冷冻15小时，获得冷冻蜂胶毛胶；在2℃-10℃下取约1kg的冷冻蜂胶毛胶，粉碎成粗粉，获得蜂胶毛胶碎料；
S42、按照1g：10mL的料液比，将蜂胶毛胶碎料采用90％乙醇进行搅拌提取2次，每次提取2小时，过滤，合并滤液，将滤液采用旋转蒸发仪浓缩至流浸膏状，获得蜂胶粗提物(25℃下的相对密度：1.24)；
S43、将步骤S42制得的蜂胶粗提物在-18℃下冷冻20小时，按照1g:6mL的料液比，室温下加入80％乙醇进行超声提取，过滤分离乙醇提取液和蜂蜡杂质沉淀，将上述乙醇提取液进行浓缩回收乙醇，获得蜂胶浓缩液(25℃下的固液比为1g:2mL)；
S44、在步骤S43制得的蜂胶浓缩液中加入700g硅胶，混合均匀后采用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，抽干至粉体完全干燥，研磨至均匀细粉，获得硅胶吸附粉；
S45、采用沸点为60-90℃的石油醚作为第一萃取剂，在步骤S44制得的硅胶吸附粉中加入7倍体积的第一萃取剂，搅拌1h，过滤，将滤渣自然挥干作为第一萃取物；
采用石油醚-丙酮(3:1，vol/vol)作为第二萃取剂，在第一萃取物中加入7倍体积的第二萃取剂，搅拌1h，过滤，将滤渣自然挥干作为第二萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:1，vol/vol)作为第三萃取剂，在第二萃取物中加入7倍体积的第三萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第三萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:3，vol/vol)作为第四萃取剂，在第三萃取物中加入7倍体积的第四萃取剂，搅拌提取2次，每次3h，过滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪浓缩滤液至干燥，获得蜂胶浸膏；
S46、将蜂胶浸膏粉碎成细粉，加蜂胶浸膏3倍体积的95％乙醇，超声30min，进行脱色，过滤，将滤渣真空减压干燥6小时，得到蜂胶精提物112g，其色泽呈淡黄至黄色。
实施例5
本实施例制备了一种蜂胶提取物，具体包括以下步骤：
S51、取产自广东中山、品质均一的蜂胶毛胶，清洗除去物理性杂质，于-16℃下冷冻20小时，获得冷冻蜂胶毛胶；在2℃-10℃下取约1kg的冷冻蜂胶毛胶，粉碎成粗粉，获得蜂胶毛胶碎料；
S52、按照1g：5mL的料液比，将蜂胶毛胶碎料采用90％乙醇进行搅拌提取2次，每次提取3小时，过滤，合并滤液，将滤液采用旋转蒸发仪浓缩至流浸膏状，获得蜂胶粗提物(25℃下的相对密度：1.22)；
S53、将步骤S52制得的蜂胶粗提物在-18℃下冷冻24小时，按照1g:7mL的料液比，室温下加入80％乙醇进行超声提取，过滤分离乙醇提取液和蜂蜡杂质沉淀，将上述乙醇提取液进行浓缩回收乙醇，获得蜂胶浓缩液(25℃下的固液比为1g:2mL)；
S54、在步骤S53制得的蜂胶浓缩液中加入600g硅胶，混合均匀后采用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，抽干至粉体完全干燥，研磨至均匀细粉，获得硅胶吸附粉；
S55、采用沸点为60-90℃的石油醚作为第一萃取剂，在步骤S54制得的硅胶吸附粉中加入5倍体积的第一萃取剂，搅拌1h，过滤，将滤渣自然挥干作为第一萃取物；
采用石油醚-丙酮(3:1，vol/vol)作为第二萃取剂，在第一萃取物中加入5倍体积的第二萃取剂，搅拌1h，过滤，将滤渣自然挥干作为第二萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:1，vol/vol)作为第三萃取剂，在第二萃取物中加入5倍体积的第三萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第三萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:3，vol/vol)作为第四萃取剂，在第三萃取物中加入10倍体积的第四萃取剂，搅拌提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪浓缩滤液至干燥，获得蜂胶浸膏；
S56、将蜂胶浸膏粉碎成细粉，加蜂胶浸膏3倍体积的95％乙醇，超声30min，进行脱色，过滤，将滤渣真空减压干燥6小时，得到蜂胶精提物122g，其色泽呈淡黄至黄色。
实施例6
本实施例制备了一种蜂胶提取物，具体包括以下步骤：
S61、取产自山东泰山、品质均一的蜂胶毛胶，清洗除去物理性杂质，于-15℃下冷冻20小时，获得冷冻蜂胶毛胶；在2℃-10℃下取约1kg的冷冻蜂胶毛胶，粉碎成粗粉，获得蜂胶毛胶碎料；
S62、按照1g：10mL的料液比，将蜂胶毛胶碎料采用90％乙醇进行搅拌提取2次，每次提取3小时，过滤，合并滤液，将滤液采用旋转蒸发仪浓缩至流浸膏状，获得蜂胶粗提物(25℃下的相对密度：1.22)；
S63、将步骤S62制得的蜂胶粗提物在-18℃下冷冻24小时，按照1g:8mL的料液比，室温下加入80％乙醇进行超声提取，过滤分离乙醇提取液和蜂蜡杂质沉淀，将上述乙醇提取液进行浓缩回收乙醇，获得蜂胶浓缩液(25℃下的固液比为1g:2mL)；
S64、在步骤S63制得的蜂胶浓缩液中加入600g硅胶，混合均匀后采用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，抽干至粉体完全干燥，研磨至均匀细粉，获得硅胶吸附粉；
S65、采用沸点为60-90℃的石油醚作为第一萃取剂，在步骤S64制得的硅胶吸附粉中加入5倍体积的第一萃取剂，搅拌1h，过滤，将滤渣自然挥干作为第一萃取物；
采用石油醚-丙酮(3:1，vol/vol)作为第二萃取剂，在第一萃取物中加入5倍体积的第二萃取剂，搅拌1h，过滤，将滤渣自然挥干作为第二萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:1，vol/vol)作为第三萃取剂，在第二萃取物中加入5倍体积的第三萃取剂，搅拌2h，过滤，将滤渣自然挥干作为第三萃取物；
采用石油醚-丙酮(1:3，vol/vol)作为第四萃取剂，在第三萃取物中加入10倍体积的第四萃取剂，搅拌提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪浓缩滤液至干燥，获得蜂胶浸膏；
S66、将蜂胶浸膏粉碎成细粉，加蜂胶浸膏3倍体积的95％乙醇，超声30min，进行脱色，过滤，将滤渣真空减压干燥6小时，得到蜂胶精提物128g，其色泽呈淡黄至黄色。
测试例
取实施例1-6制得的蜂胶精提物，分别溶解于甲醇中，制备浓度为0.02-0.08mg/mL的供试品溶液；将供试品溶液采用HPLC进行检测，定性和定量检测供试品溶液中的活性成分，高效液相色谱的条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
柱温：30℃；
检测波长为289nm；
理论塔板数按乔松素峰计算应不低于3000；
以乙腈为流动性A，以磷酸的重量百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动性B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如表1所示：
表1
| 时间 | 流动相A | 流动相B |
| 0-55分钟 | 34％ | 66％ |
| 55-60分钟 | 100％ | 0 |
| 60-72分钟 | 66％ | 34％ |
通过HPLC检测，得到如表2和图1所示的蜂胶提取物活性成分的定性定量检测结果。如结果所示，蜂胶精提物中的白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素等活性成分均达到了基线分离，且这几种活性成分的总含量占蜂胶精提物重量的61.45％-98.1％。其中，白杨素为18％-23％，松属素为12％-17％，高良姜素为7％-12％，咖啡酸苯乙酯为6％-11％，山奈酚为9％-14％，短叶松素为7％-12％，金合欢素为4％-9％。
表2
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种蜂胶提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供蜂胶毛胶，将所述蜂胶毛胶进行粉碎，获得蜂胶毛胶碎料；
将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70%以上的乙醇水溶液按照所述蜂胶毛胶碎料和所述乙醇水溶液的比例为1 g : (3-10) mL的料液比进行提取1-4次，每次提取2-3小时，收集提取液进行浓缩，获得蜂胶粗提物；
将所述蜂胶粗提物在-10℃至-20℃下冷冻处理20-24小时，然后分散于乙醇的重量百分比浓度为70%以上的乙醇水溶液中，所述蜂胶粗提物与所述乙醇水溶液的料液比为1 g :(5-10) mL，过滤，将滤液浓缩，获得蜂胶浓缩液；
提供硅胶，将所述蜂胶浓缩液与所述硅胶进行混合，使得所述蜂胶浓缩液中的活性成分吸附到所述硅胶粉上，干燥，获得硅胶吸附粉；
将所述硅胶吸附粉依次采用第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂进行固-液萃取，收集第三萃取剂部位，浓缩，获得蜂胶浸膏；其中，所述第一萃取剂为石油醚，所述第二萃取剂为丙酮和石油醚按体积比小于2:1的比例进行混合的混合溶剂，所述第三萃取剂为丙酮和石油醚按体积比为 (2-4) : 1的比例进行混合的混合溶剂；
将所述蜂胶浸膏分散于乙醇的重量百分比浓度为60%-95%的乙醇水溶液中，进行超声处理，过滤，将滤液浓缩，获得蜂胶精提物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述蜂胶毛胶碎料采用乙醇的重量百分比浓度为70%以上的乙醇水溶液进行提取的步骤中，将所述蜂胶毛胶碎料和所述乙醇水溶液按照1 g : (3-10) mL的料液比进行搅拌提取1-4次，每次提取2-3小时。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的制备方法，其特征在于，将所述蜂胶浓缩液与所述硅胶进行混合的步骤中，在所述蜂胶浓缩液中加入所述蜂胶毛胶重量的20%-100%的硅胶进行混合均匀。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的制备方法，其特征在于，将所述硅胶吸附粉依次采用第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂进行固-液萃取的步骤包括：
将所述硅胶吸附粉和所述第一萃取剂按照1 : (3-10)的体积比进行混合，搅拌提取1-3次，每次1-3小时，过滤，将滤渣自然挥干作为第一萃取物；
将所述第一萃取物与所述第二萃取剂按照1 : (3-10)的体积比进行混合，搅拌提取1-3次，每次1-3小时，过滤，将滤渣自然挥干作为第二萃取物；
将所述第二萃取物与所述第三萃取剂按照1 : (3-10)的体积比进行混合，搅拌提取1-3小时，每次1-3小时，合并搅拌提取后的第三萃取剂。
5.一种蜂胶提取物，其特征在于，由权利要求1至4中任一项所述的制备方法制得，且所述蜂胶提取物中的活性成分包括白杨素、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、山奈酚、短叶松素和金合欢素。
6.根据权利要求5所述的蜂胶提取物，其特征在于，所述蜂胶提取物中，所述白杨素的重量百分含量为18%-23%，所述松属素的重量百分含量为12%-17%，所述高良姜素的重量百分含量为7%-12%，所述咖啡酸苯乙酯的重量百分含量为6%-11%，所述山奈酚的重量百分含量为9%-14%，所述短叶松素的重量百分含量为7%-12%，所述金合欢素的重量百分含量为4%-9%。
7.权利要求1至4中任一项所述的制备方法或权利要求5或6所述的蜂胶提取物在制备保健食品、药品和美容原料中的应用。
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