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CN110498834A - 一种依替巴肽固相制备的方法 - Google Patents

一种依替巴肽固相制备的方法 Download PDF

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CN110498834A
CN110498834A CN201810465869.1A CN201810465869A CN110498834A CN 110498834 A CN110498834 A CN 110498834A CN 201810465869 A CN201810465869 A CN 201810465869A CN 110498834 A CN110498834 A CN 110498834A
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eptifibatide
thick peptide
peptide
resin
fmoc
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张文治
姜勇伟
杨俊�
袁建成
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Hanyu Pharmaceutical (Wuhan) Co., Ltd.
Hybio Pharmaceutical Co Ltd
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Hybio Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种制备依替巴肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成依替巴肽线形肽‑树脂：采用固相合成树脂，通过Fmoc固相合成法逐步偶联合成依替巴肽线性肽‑树脂；(2)裂解树脂得依替巴肽线性粗肽：将依替巴肽线性肽‑树脂进行裂解，得到依替巴肽线性粗肽；(3)依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽：将依替巴肽线性粗肽以水溶解，并调节pH值至6.9以下，加入氧化剂进氧化反应或者在空气中进行自然氧化得到依替巴肽粗肽；(4)精肽的制备：依替巴肽粗肽溶液柱层析纯化得到依替巴肽精肽。本发明的方法成二硫键效率高，绿色环保。

Description

一种依替巴肽固相制备的方法
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种依替巴肽的固相制备方法。
背景技术
依替巴肽(Eptifibatide)是一种含一个巯基丙酸和六个氨基酸残基的环肽，它的分之式：C35H49N11O9S2，它的序列是：
Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2(二硫键)
依替巴肽由美国COR Therapeutic公司研发，1998年在美国上市，用于急性冠脉综合症的治疗。通过抑制凝血因子Ⅰ，与血小板糖蛋白Ⅱb/IIIa受体结合，从而抑制血小板聚集。在临床应用中，对不稳定型心绞痛、急性心肌梗死、冠状动脉介入等心血管疾病的治疗均显示了良好疗效。目前，心血管疾病逐年增加已成为现代社会对人类健康威胁严重的常见病之一，依替巴肽作为多肽类心血管系统药物，具有药效高、毒副作用低等优点，得到临床的广泛应用，且需求量逐年增加。
从目前公开的文献看，依替巴肽的生产方法包括固相合成法或液相合成法。
中国专利CN 101538316B公开了一种以Fmoc-Cys(Acm)-OH、 Mpa(Acm)-OH作为起始原料，以Sieber树脂为固相载体合成侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂，然后进行树脂固相氧化，得到侧链全保护氧化肽 Eptifibatide-Sieber树脂，此方法虽简便，但操作步骤较多、具体过程繁琐，且收率较低；专利CN 1858060与专利CN101838308 A均公开了先通过固相合成依替巴肽线性肽肽树脂，然后裂解得到线性肽后，经液相中直接氧化形成二硫键，但此类方法所得的粗肽中均存在大量的多聚体杂质，这些多聚体杂质不仅造成原料成本的大量浪费，而且不易纯化除去，影响产品收率。CN103450346公布了采用液相法逐步合成依替巴肽的方法，该专利操作步骤繁杂、需要Pa/C催化、中间体难以提纯、粗肽纯度低、液相氧化时多聚体杂质较多等一系列缺点，不适合工业化生产。
CN 105001304A公布了一种利用新型氧化还原体系制备依替巴肽的技术方案，该专利采用Fmoc固相合成法合成依替巴肽线性肽，首先将线性肽溶液用DTT还原，然后调节溶液pH 7.0-9.0，加入空气，H2O2，DMSO，I2氧化剂这四种氧化剂中的任意一种进行氧化形成分子内二硫键，即得依替巴肽粗肽产品；最后HPLC纯化得依替巴肽精肽。
发明内容
本发明制备依替巴肽采用固相合成得到依替巴肽树脂，三氟乙酸裂解后得到依替巴肽线性粗肽，将线性粗肽按工艺要求溶解后调pH至4.0-6.9，加入空气， H2O2，DMSO，I2氧化剂这四种氧化剂中的任意一种进行氧化形成分子内二硫键，即得依替巴肽粗肽产品；最后HPLC纯化得依替巴肽精肽。
本发明与CN 105001304A的区别有两点：一是线性粗肽氧化前本发明不需要加入DTT还原，二是线性粗肽氧化时的pH值不同，本发明使用的pH值为 4.0-6.9，而CN105001304A要求的pH值为7.0-9.0。
相比传统液相氧化工艺产生大量的二聚体杂质，本发明人意外的发现采用酸性环境的本申请的技术方案几乎不产生二聚体。这样不仅使固相合成总收率由传统氧化工艺22％-28％提高至45％-55％，而且减少了纯化时需要过滤除去多聚体杂质的操作，缩短一至两天的纯化时间，从而缩短了整个生产周期一至两天，对于工业化生产具有巨大的优势。
本发明提供一种制备依替巴肽合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成依替巴肽线形肽-树脂
采用固相合成树脂，通过Fmoc固相合成法逐步偶联合成依替巴肽线性肽- 树脂；
(2)裂解树脂得依替巴肽线性粗肽
将依替巴肽线性肽-树脂进行裂解同时脱除侧链保护基，得到依替巴肽线性粗肽；
(3)依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
将依替巴肽线性粗肽以水溶解，并调节pH值至6.9以下，加入氧化剂进氧化反应或者在空气中进行自然氧化得到依替巴肽粗肽；
(4)精肽的制备
依替巴肽粗肽溶液柱层析纯化得到依替巴肽精肽。
在本发明的技术方案中，步骤(1)中在固相合成树脂上依次偶联Fmoc保护的氨基酸，并脱除Fmoc保护基后偶联下一Fmoc保护氨基酸，所述依次偶联的Fmoc保护的氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har(pbf)-OH、Mpr-OH。
在本发明的技术方案中，步骤(1)中的Fmoc固相合成法为以DIC/HOBT 作为偶联体系，采用体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液作为偶联溶剂，进行偶联。
在本发明的技术方案中，步骤1)中的固相合成树脂为氨基固相合成树脂，具体地，所述氨基树脂选自Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide AM树脂中的任意一种。
在本发明的技术方案中，步骤1)中脱除Fmoc保护的试剂为20％DBLK。
在本发明的技术方案中，步骤(2)中的裂解反应采用的裂解液由以下体积百分比的组分组成：三氟乙酸TFA 85％-90％，1,2-乙二硫醇EDT 0％-10％，水 H2O 0％-10％，苯甲醚PhOMe 0％-10％，其中组分EDT、H2O、PhOMe中至少两个不同时为0。
在本发明的技术方案中，步骤(3)中的液相氧化反应是在pH 4.0-6.9的条件下进行。
在本发明的技术方案中，步骤(3)中的液相氧化反应依替巴肽线性粗肽的溶度为1g/L-5g/L。
在本发明的技术方案中，步骤(3)中液相氧化反应氧化剂为空气，H2O2， DMSO，I2中的任意一种或几种的组合。
在本发明的技术方案中，步骤(4)中层析纯化方法为以反相HPLC纯化、脱盐得依替巴肽精肽溶液；浓缩、冻干后得精肽。
本发明还提供了一种依替巴肽直链多肽生成二硫键成环的合成方法，将 Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2以水溶解，并调节pH值至6.9以下，加入氧化剂进氧化反应或者在空气中进行自然氧化得到依替巴肽。
在本发明中，英文缩写如下所示。
有益效果
1.固相合成相比于液相合成具有操作简单，三废较少，环境友好，线性粗肽氧化时几乎没有多聚体杂质产生，收率高，适合工业化生产等优点。
2.本专利相比其他固相合成专利，具有操作步骤简单，几乎无多聚体杂质产生、总收率由传统氧化工艺22％-28％提高至45％-55％，生产周期缩短1-2天等巨大优点。
具体实施方式
实施例1：合成依替巴肽树脂
称取替代度Sub0为0.2-0.8mmol/g的Fmoc-Rink Amide Resin W0克,并计算其反应规模N(N＝Sub0×W0，mmol)，加入到固相反应柱中，加入适量DMF，鼓氮气搅拌5-30分钟，重复三次。加入20％DBLK脱Fmoc保护15分钟+15 分钟。并用适量DMF洗涤树脂。
称取摩尔数为3N的Fmoc-Cys(Trt)-OH、HOBT，用适量的体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液溶解完全，0-10℃下加入摩尔数为3N DIC，搅拌5min，将反应液转移至固相反应柱中，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽序，依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har(pbf)-OH、Mpr-OH。反应结束后用甲醇洗涤树脂三次，每次5-10分钟，树脂真空干燥24h，得到依替巴肽树脂。
实施例2：合成依替巴肽树脂
称取替代度Sub0为0.2-0.8mmol/g的Fmoc-Rink Amide MBHA Resin W0克,并计算其反应规模N(N＝Sub0×W0，mmol)，加入到固相反应柱中，加入适量DMF，鼓氮气搅拌5-30分钟，重复三次。加入20％DBLK脱Fmoc保护15分钟+15分钟。并用适量DMF洗涤树脂。
称取摩尔数为3N的Fmoc-Cys(Trt)-OH、HOBT，用适量的体积比为1:1的 DCM和DMF混合溶液溶解完全，0-10℃下加入摩尔数为3N DIC，搅拌5min，将反应液转移至固相反应柱中，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽序，依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har(pbf)-OH、Mpr-OH。反应结束后用甲醇洗涤树脂三次，每次5-10分钟，树脂真空干燥24h，得到依替巴肽树脂。
实施例3：合成依替巴肽树脂
称取替代度Sub0为0.2-0.8mmol/g的Fmoc-Rink Amide AM Resin W0克, 并计算其反应规模N(N＝Sub0×W0，mmol)，加入到固相反应柱中，加入适量DMF，鼓氮气搅拌5-30分钟，重复三次。加入20％DBLK脱Fmoc保护15 分钟+15分钟。并用适量DMF洗涤树脂。
称取摩尔数为3N的Fmoc-Cys(Trt)-OH、HOBT，用适量的体积比为1:1的 DCM和DMF混合溶液溶解完全，0-10℃下加入摩尔数为3N DIC，搅拌5min，将反应液转移至固相反应柱中，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽序，依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har(pbf)-OH、Mpr-OH。反应结束后用甲醇洗涤树脂三次，每次5-10分钟，树脂真空干燥24h，得到依替巴肽树脂。
实施例4：裂解同时脱除侧链保护基得依替巴肽线性粗肽
将实施例1-实施例3得到的依替巴肽树脂，加入到反应器中，按1g肽树脂需要使用10ml裂解液的比例配制裂解液。裂解液的组分为：三氟乙酸TFA 85％-90％，1,2-乙二硫醇EDT 0％-10％，水H2O 0％-10％，苯甲醚PhOMe 0％-10％，其中组分EDT、H2O、PhOMe中至少两个不同时为0。将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2-3小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA 洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到裂解液10倍体积的无水乙醚中沉淀，离心，再用适量无水乙醚洗涤固体，真空干燥12h，得到依替巴肽线性粗肽Wg，线性粗肽收率75％-85％，线性粗肽纯度80％-85％。MS＝834.0[M+]
实施例5：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例6：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例7：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例8：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例9：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例10：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例11：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例12：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例13：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例14：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例15：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例16：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用1000ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例17：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例18：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例19：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例20：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例21：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例22：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例23：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例24：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例25：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例26：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例27：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例28：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例29：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例30：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例31：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例32：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例33：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例34：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例35：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例36：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例37：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例38：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至4.0-5.0，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例39：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至5.0-6.0，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例40：依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用200ml纯化水溶解完全。用冰醋酸调pH 至6.0-6.9，加入100ml DMSO进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于 5％，室温搅拌进行氧化反应，停止反应转移至下一步纯化工序。
实施例5-实施例40所得依替巴肽粗肽纯度为80％-90％，氧化转化率为 80％-95％。MS＝832.0[M+]
实施例41：采用传统氧化工艺得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用稀氨水调pH 至7.1-7.5，加入0.5ml 30％双氧水，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。反应时析出大量的黄色粘稠物，此粘稠物即为氧化反应的杂质多聚体。
实施例42：采用传统氧化工艺得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用稀氨水调pH 至7.1-7.5，加入100ml DMSO进行氧化反应，室温搅拌进行氧化反应，HPLC 检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。反应时析出大量的黄色粘稠物，此粘稠物即为氧化反应的杂质多聚体。
实施例43：采用传统氧化工艺得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用稀氨水调pH 至7.1-7.5，加入I2/DMF饱和溶液(I2的摩尔数为线性粗肽的5-10倍)，室温搅拌进行氧化反应，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。反应时析出大量的黄色粘稠物，此粘稠物即为氧化反应的杂质多聚体。
实施例44：采用传统氧化工艺得到依替巴肽粗肽
取实施例4所得线性粗肽1g，用500ml纯化水溶解完全。用稀氨水调pH 至7.1-7.5，室温下搅拌，进行空气中自然氧化，HPLC检测至线性粗肽纯度小于5％，停止反应转移至下一步纯化工序。反应时析出大量的黄色粘稠物，此粘稠物即为氧化反应的杂质多聚体。
实施例41-实施例44所得依替巴肽粗肽纯度为70％-80％，氧化转化率为 40％-50％。MS＝832.0[M+]
实施例45：精肽的制备
取实施例5-实施例40所得粗肽溶液减压过滤除去不溶物后，采用RP-HPLC 系统，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，常规0.1％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于99.0％精肽。旋转蒸发浓缩，冻干得到依替巴肽精肽，HPLC纯度大于99.0％，纯化收率70％-80％，总收率 45％-55％。MS＝830.0[M+]
实施例46：采用传统工艺液相氧化精肽的制备
取实施例41-实施例44所得粗肽溶液减压过滤除去不溶物后，采用RP-HPLC系统，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，常规0.1％TFA/ 乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于99.0％精肽。旋转蒸发浓缩，冻干得到依替巴肽精肽，HPLC纯度大于99.0％，纯化收率70％-80％，总收率 22％-28％。MS＝830.0[M+]。

Claims (10)

1.一种制备依替巴肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成依替巴肽线形肽-树脂
采用固相合成树脂，通过Fmoc固相合成法逐步偶联合成依替巴肽线性肽-树脂；
(2)裂解树脂得依替巴肽线性粗肽
将依替巴肽线性肽-树脂进行裂解同时脱除侧链保护基，得到依替巴肽线性粗肽；
(3)依替巴肽线性粗肽液相氧化得到依替巴肽粗肽
将依替巴肽线性粗肽以水溶解，并调节pH值至6.9以下，加入氧化剂进氧化反应或者在空气中进行自然氧化得到依替巴肽粗肽；
(4)精肽的制备
依替巴肽粗肽溶液柱层析纯化得到依替巴肽精肽。
2.一种依替巴肽直链多肽生成二硫键成环的合成方法，将Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2以水溶解，并调节pH值至6.9以下，加入氧化剂进氧化反应或者在空气中进行自然氧化得到依替巴肽。
3.根据权利要求1或2所述的合成方法，步骤(3)中的液相氧化反应是在pH 4.0-6.9的条件下进行。
4.根据权利要求1或2所述的合成方法，步骤(3)中的液相氧化反应依替巴肽线性粗肽的溶度为1g/L-5g/L。
5.根据权利要求1或2所述的合成方法，步骤(3)中液相氧化反应氧化剂为空气，H2O2，DMSO，I2中的任意一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的合成方法，步骤(1)中的Fmoc固相合成法为以DIC/HOBT作为偶联体系，采用体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液作为偶联溶剂，进行偶联。
7.根据权利要求1所述的合成方法，步骤(1)中的固相合成树脂为氨基固相合成树脂，具体地，所述氨基树脂选自Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide AM树脂中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的合成方法，步骤(1)中在固相合成树脂上依次偶联Fmoc保护的氨基酸，并脱除Fmoc保护基后偶联下一Fmoc保护氨基酸，所述依次偶联的Fmoc保护的氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Har(pbf)-OH、Mpr-OH。
9.根据权利要求1所述的合成方法，步骤(2)中的裂解反应采用的裂解液由以下体积百分比的组分组成：三氟乙酸TFA 85％-90％，1,2-乙二硫醇EDT 0％-10％，水H2O 0％-10％，苯甲醚PhOMe 0％-10％，其中组分EDT、H2O、PhOMe中至少两个不同时为0。
10.根据权利要求1所述的合成方法，步骤(4)中层析纯化方法为以反相HPLC纯化、脱盐得依替巴肽精肽溶液；浓缩、冻干后得精肽。
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