CN110295145B - 一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液及培养方法 - Google Patents
一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液及培养方法 Download PDFInfo
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本发明提供了一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液，培养液包括神经细胞基础培养基，为神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的B27营养因子、0.5％～5％的双抗‑青霉素/链霉素、0.5％～5％的谷氨酰胺、0.5％～5％的丙酮酸钠、0.5％～1.5％的胎牛血清、2.5ug/mL～3.5ug/mL重组Shh蛋白。本发明培养得到的细胞能够增殖传代，Shh信号通路处于激活表达状态，致瘤性未受到影响，能够承受‑80℃冻存，可贴壁分化，从而为研究髓母细胞瘤发生发展的分子机制以及Shh信号通路调控分子机制提供了独特的细胞模型，以及高通量筛选化疗药物提供了重要的工具。
Description
技术领域
本发明属于组织细胞培养技术领域，具体涉及一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液及培养方法。
背景技术
髓母细胞瘤(Medulloblastoma，简称MB)是儿童中最常见的恶性脑肿瘤，它主要出现在小脑中，并能迅速扩散到中枢神经系统中，通常认为，MB至少包括4种亚型，分别为Wnt亚型、Shh亚型、第三亚型和第四亚型。4种亚型中，Shh亚型约占人髓母细胞瘤的30％，由Shh信号通路的异常活化而引起。
星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类胶质细胞，对神经元的发育和功能起支持作用。近年来星形胶质细胞在脑肿瘤中的作用也得到一定程度上的阐述：有报道发现星形胶质细胞在神经发育、成人神经形成区域以及脑损伤的情况下分泌Shh配体。在髓母细胞瘤中，星形胶质细胞通过分泌Shh蛋白促进肿瘤细胞的增殖(Liu,Yongqiang,etal."Astrocytes promote medulloblastoma progression through hedgehogsecretion."Cancer research 77.23(2017):6692-6703.)。
由于易于培养保存，细胞株被广泛用于癌症的研究中。但是，研究表明，目前仍缺乏有效的Shh-MB体外细胞模型。目前用于髓母细胞瘤基础研究或临床前研究的细胞株中的Shh信号通路都呈失活状态。用遗传学手段在小鼠小脑中颗粒神经元前体细胞中敲除Shh通路的抑制性蛋白Patched(Ptch1)后，小鼠的脑中形成髓母细胞瘤。该模型目前被广泛地用于髓母细胞瘤的基础研究以及临床前研究中。然而，研究表明，用传统贴壁培养手段所培养的上述肿瘤细胞在体外Shh通路逐渐失活，使得肿瘤细胞逐渐停止增殖，这给髓母细胞瘤的基础研究及相应药物筛选带来了很大的困难。广泛采用的贴壁培养所采用的培养基为DMEM/10％FCS(Sasai,Ken,et al."Shh pathway activity is down-regulated incultured medulloblastoma cells:implications for preclinical studies."Cancerresearch 66.8(2006):4215-4222.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种易于体外培养且能够增殖传代，培养后的髓母细胞瘤细胞的Shh信号通路处于激活表达状态且致瘤性未受到影响的体外培养脑肿瘤细胞的培养液及培养方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液，所述的培养液包括神经细胞基础培养基、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的B27营养因子、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的双抗-青霉素/链霉素、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的谷氨酰胺、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的丙酮酸钠、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～1.5％的胎牛血清、重组Shh(Sonic hedgehog)蛋白。其中，所述的重组Shh蛋白的添加量为每1mL所述的神经细胞基础培养基加入2.5ug～3.5ug。
优选地，所述的重组Shh蛋白的添加量为每1mL所述的神经细胞基础培养基加入2.7ug～3.3ug。
进一步优选地，所述的重组Shh蛋白的添加量为每1mL所述的神经细胞基础培养基加入2.8ug～3.2ug。
优选地，所述的胎牛血清的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.8％～1.2％。
进一步优选地，所述的胎牛血清的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.9％～1.1％。
优选地，所述的B27营养因子的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的1％～3％，所述的双抗-青霉素/链霉素的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～1.5％，所述的谷氨酰胺的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～1.5％，所述的丙酮酸钠的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～1.5％。
进一步优选地，所述的B27营养因子的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的1.5～2.5％，所述的双抗-青霉素/链霉素的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.9％～1.1％，所述的谷氨酰胺的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.9％～1.1％，所述的丙酮酸钠的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.9％～1.1％。
本发明的另一个目的是提供一种所述的培养液在脑肿瘤细胞的体外培养中的应用。
优选地，所述的脑肿瘤细胞为髓母细胞瘤细胞。
优选地，所述的体外培养的方法为悬浮培养。
优选地，所述的脑肿瘤细胞在所述的培养液中的细胞接种密度为3×105～5×105个/mL。
本发明的第三个目的是提供一种脑肿瘤细胞的体外培养方法，将处理后的脑肿瘤细胞接种至上述培养液中进行悬浮培养。
优选地，控制细胞接种密度为3×105～5×105个/mL。
优选地，所述的脑肿瘤细胞为髓母细胞瘤细胞。
优选地，将从小鼠小脑中提取的髓母细胞瘤组织在36℃～38℃下采用消化液消化20～40min，然后用胰酶抑制剂终止消化，然后经滤膜过滤，离心后获得所述的处理后的脑肿瘤细胞，其中，每10mL所述的消化液中的成分如下：90U～110U的木瓜蛋白酶、1mg～3mg的半胱氨酸以及2400U～2600U的DNA酶。
本发明中，进行悬浮培养的培养条件为细胞培养的常规条件。
本发明的第四个目的是提供一种采用所述的体外培养方法培养获得的肿瘤细胞球。
本发明的第五个目的是提供一种传代肿瘤球细胞，将所述的肿瘤细胞球采用消化酶消化获得。
本发明的第六个目的是提供一种所述的肿瘤细胞球的冻存方法，采用冻存液对所述的肿瘤细胞球进行冻存，所述的冻存液包括质量比为8～10:1的血清和二甲亚砜，可冻存温度为-80℃。
本发明中，我们将从小鼠中提取出的肿瘤细胞用本发明中的培养液培养的细胞均称为原代细胞；将培养液培养后的细胞经消化液消化得到的细胞以及该细胞继续培养后的细胞称为传代细胞。
采用本发明的培养液及培养方法培养的脑肿瘤细胞会聚集成球状，我们称之为肿瘤细胞球，使得该肿瘤细胞球能够长时间的存活及增殖传代。
本发明采用体外悬浮培养，无须使用多聚赖氨酸(Poly-D-Lysine,，简称PDL)包被，培养方法简单易行。
采用本发明的培养液及培养方法进行体外培养时，细胞中的Shh信号通路保持活化状态，更方便于脑肿瘤临床前研究。其次，肿瘤细胞在上述的培养液及培养方法中可大量增殖，易于获得大量的细胞进行脑肿瘤的基础研究及药物筛选。
采用本发明的培养液及培养方法培养的原代细胞及传代细胞均保持成瘤性，将分离的肿瘤球单个细胞或者肿瘤细胞球消化后的细胞再次注射到小鼠小脑后又能够长出髓母细胞瘤。此方法，也能够让我们在不改变肿瘤细胞致肿瘤性的情况下，保存原代MB细胞和传代的MB细胞。
另外，本发明的肿瘤细胞球可传代、可冻存且可贴壁分化，贴壁分化时采用多聚赖氨酸包被。
本发明为研究髓母细胞瘤发生发展的分子机制，以及高通量筛选针对髓母细胞瘤的化疗药物提供了重要的工具。同时，也为研究Shh信号通路调控分子机制提供了独特的细胞模型。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的培养液和培养方法培养得到的细胞能够增殖传代，Shh信号通路处于激活表达状态，致瘤性未受到影响，能够承受-80℃冻存，可贴壁分化，从而为研究髓母细胞瘤发生发展的分子机制，以及高通量筛选针对髓母细胞瘤的化疗药物提供了重要的工具。同时，也为研究Shh信号通路调控分子机制提供了独特的细胞模型。
本发明的培养方法简单易行，无需使用多聚赖氨酸包被。
附图说明
图1为加入Shh蛋白培养3天后每毫升培养液中的肿瘤球细胞数量对比图；
图2为不同培养液下培养3天后肿瘤球细胞的形成情况对比图；
图3为不同培养液下培养4天的每毫升培养液中的肿瘤球细胞数量对比图；
图4为MTT测定不同培养液中分别培养2天、3天、4天的的细胞活力值对比图；
图5为针对体外培养4天的肿瘤球所进行的免疫细胞化学Ki67/Zic1蛋白荧光图；
图6为针对体外培养4天的肿瘤球所进行免疫细胞化学Tuj 1蛋白荧光图；
图7为培养的肿瘤细胞QPCR基因表达检测结果图；
图8为注射成瘤的免疫缺陷小鼠脑肿瘤图；
图9为传代后形成的肿瘤细胞球；
图10为复苏后的肿瘤细胞球。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚，结合附图和实施例对本发明做进一步说明，应当理解，本实施例并不用于限定本发明的保护范围。本发明中未详细描述的方法和条件为本领域的常规条件。
实施例1
实验动物：条件性敲除转基因鼠Ptch1fl/fl Mice、Math1-Cre Mice、CB17/SCIDMice，购于Jackson实验室，所有实验用动物均符合SPF级(Specific Pathogen Free，无特定病原体)，所有动物处理操作均经过合法有效批准；免疫缺陷小鼠(CB17/SCID Mice)，颅内注射移植采用小鼠脑立体定位仪(KOPF,Nikon SMZ1000)和5ul微量进样器(上海高鸽)。
细胞培养：
(1)、原代髓母细胞瘤细胞均从上述条件性敲除成年小鼠小脑中提取，小鼠小脑髓母细胞瘤组织采用消化液消化，消化液成分(10ml)：100U的木瓜蛋白酶(Papain，Worthington Biochemical,LS003126)、2mg的半胱氨酸(L-cysteine,Sigma)以及2500U的DNA酶(DNase,Sigma,D4527)，37℃水浴消化30分钟。胰酶抑制剂(Sigma,Roche,109878)终止消化后，获得单细胞悬液过70um滤膜(Fisherbrand)，离心后获得处理后的髓母细胞瘤细胞。
(2)、将步骤(1)得到的处理后的髓母细胞瘤细胞按细胞接种密度4×105个/mL的接种量加入培养液中重悬，可在10cm培养皿或六孔板进行悬浮培养，培养条件为细胞培养的常规条件(37℃/CO2/O2恒温培养箱)，在肿瘤球细胞形成的4天内不需要更换或者补充培养液，肿瘤球细胞体积不宜过大，一般培养至5天，可进行消化传代继续培养。培养液(即NB-Shh-B27-1％FBS)：神经细胞基础培养基(Neurobasal medium简称NB,Invitrogen)、每1mL神经细胞基础培养基加入3ug重组Shh蛋白(ab75431,abcam)、占神经细胞基础培养基质量的2％的B27营养因子(Invitrogen)、占神经细胞基础培养基质量的1％的双抗-青霉素/链霉素(Pen/Strep，Invitrogen)、占神经细胞基础培养基质量的1％的谷氨酰胺(L-glutamine,Invitrogen)、占神经细胞基础培养基质量的1％的丙酮酸钠(Na-Pyrurate,Invitrogen)、占神经细胞基础培养基质量的1％的胎牛血清(Fetal Bovine SerumPremium,简称FBS,Atlanta Biologicals,S11150)。
对比例1
大致与实施例1相同，区别仅在于实施例1中培养液中不添加重组Shh蛋白(培养液即NB-B27-1％FBS)。
对比例2
大致与实施例1相同，区别仅在于实施例1中培养液中的胎牛血清的添加量占神经细胞基础培养基质量的3％(即NB-Shh-B27-3％FBS)。
对比例3
大致与实施例1相同，区别在于：培养液为神经干细胞培养基(NeuroCult BasalMedium,Mouse,Stem Cell Technologies)，含有占神经干细胞培养基质量的10％的增殖添加物(Proliferation Supplement，Mouse，Stem Cell Technologies,05701)，20ng/ml的EGF(Epidermal Growth Factor,Stem Cell Technologies,78006)，10ng/ml的FGF(Fibroblast Growth Factor,Stem Cell Technologies,78003)(即NSC media)。
对比例4
大致与实施例1相同，区别在于：培养液为普通基础培养液DMEM(LifeTechnologies,Gibco,11995073)，含有占普通基础培养基质量的10％的胎牛血清(即DMEM-10％FBS)。
检测与数据
1、比较实施例1与对比例1至4的培养条件下的肿瘤球细胞的形成情况及细胞活力，其中，图1从左至右依次为采用对比例1、实施例1的培养液培养3天后肿瘤球细胞形成数量情况；图2为不同培养液下培养3天后肿瘤球细胞的成球数量及肿瘤球大小，其中，左上图为实施例1的培养液的培养情况，右上图为对比例2的培养液的培养情况，左下图为对比例3的培养液的培养情况，右下图为对比例4的培养液的培养情况；图3为不同培养液下培养4天的每毫升培养液中的肿瘤球细胞数量情况，其中，四根柱子从左至右分别代表实施例1的培养液的培养情况、对比例2的培养液的培养情况、对比例3的培养液的培养情况、对比例4的培养液的培养情况；图4为MTT测定不同培养液中分别培养2天、3天、4天的细胞活力值情况，其中，NB-1％FBS表示的是实施例1的培养情况，NB-3％FBS表示的是对比例2的培养情况，NSC media表示的是对比例3的培养情况，实施例1培养4天的细胞活率明显高于比例3的细胞活率值。其中，细胞活力测定采用MTT法(MTT，商品名噻唑蓝，化学名3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)，测定方法如下：球细胞消化、离心、计数并确保各实验组细胞密度相同后，每孔各加入10ul MTT(5mg/ml)，每组3个复孔，37℃/CO2/O2恒温培养箱孵育4小时后，离心去除MTT，加入100ul二甲亚砜，放入培养箱2小时以充分溶解结晶体，酶标仪(model NO.IMark 15580)595nm测定吸光度。
从图1至图4可见，从肿瘤球细胞的形成数量和细胞活力上分析比较，实施例1培养的原代MB肿瘤球细胞效果最佳，而对比例1至4的培养效果不佳。
2、按照实施例1的方法培养4天，免疫细胞化学及细胞生物学分析：一抗：Ki67(1:500，Abcam)，Tuj 1(1:500，Abcam)，Zic1(1:500，Abcam)；二抗：羊抗鼠Alexa Fluor-594anti-Mouse IgG(1:200)、羊抗兔Alexa Fluor-594anti-Rabbit IgG(1:200)，采用常规SP免疫细胞化学方法染色，所有免疫荧光细胞样品的拍摄均采用荧光倒置显微镜拍摄(Nikon Eclipse Ti Microscope)，结果见图5、图6。从图5、图6可以看出肿瘤球中的细胞表达细胞增殖标志物Ki67蛋白，表达小脑细胞的标志物Zic1蛋白和表达神经元的标志物Tuj1蛋白。说明，在该培养条件下的肿瘤细胞球仍具有其原有的神经特性、增殖性。
3、按照实施例1的方法培养2至4天，按照传统贴壁培养的方法培养1至2天，其中，传统贴壁培养方法为：先PDL包被孔板，后NB-Shh-B27/1％FBS培养液重悬，并置于37℃/CO2/O2恒温培养箱培养。该实验中为排除Shh蛋白及血清对Shh信号通路的可能影响，故培养液采用同成球培养下的培养液，即NB-Shh-B27/1％FBS，加入了Shh蛋白及FBS，然后用实时荧光定量-PCR(QPCR)的方法检测Shh信号通路中GLi1/Ptch2/Sfrp1基因的活化情况。
实时荧光定量PCR：通过Trizol试剂裂解提取细胞样品中的RNA，然后按照逆转录试剂盒Qiagen RT kit提供的标准操作进行逆转录合成cDNA，并进行定量PCR检测分析(BIORAD iCycler iQ system)。
一般认为，刚提取出的原代肿瘤细胞Shh信号通路为活化状态，与贴壁分化的肿瘤细胞及刚提取的原代肿瘤细胞相比，传统贴壁培养的原代肿瘤细胞在培养2天后shh信号通路靶基因的表达下调明显，shh信号通路逐渐失活，而肿瘤球细胞体外培养4天时，此三个基因的表达仍维持着较高水平，表明Shh信号通路处于激活状态，结果见图7，其中，0hr为刚提取的原代肿瘤细胞的基因活化情况；1days adherent culture为传统贴壁培养1天的基因活化情况；2days adherent culture为传统贴壁培养2天的基因活化情况；2days sphereculture为实施例1的方法培养2天的基因活化情况；4days sphere culture为实施例1的方法培养4天的基因活化情况。
4、按照实施例1的方法培养4天，将其分两组，第一组不作处理直接注射到CB17-SCID小鼠小脑，第二组使用消化酶Accutase，消化成单个细胞再注射到CB17-SCID小鼠小脑。可看到，两组细胞注射到小鼠小脑均产生髓母细胞瘤，说明此方法培养的髓母细胞瘤具有致瘤性，再次说明该肿瘤球细胞的培养方式可以用于抑制增殖等化疗药物的临床前研究。结果如图8注射成瘤的脑肿瘤图(左一为注射两周免疫缺陷小鼠颅内成瘤脑图，右二成瘤小脑的苏木精—伊红染色法(HE)染色切片图)及表1。
表1成瘤情况统计表
| 注射细胞类别 | 长肿瘤小鼠个数(只)/小鼠总量(只) | 成瘤率(％) |
| 肿瘤球细胞 | 3/3 | 100 |
| 消化后的单个肿瘤球细胞 | 3/3 | 100 |
5、使用消化酶：Accutase消化肿瘤球细胞成单细胞后可进行传代培养，图9为培养4天的肿瘤球细胞经消化传代后形成的第2代肿瘤球细胞。
6、使用冻存液：90％血清/10％二甲亚砜，肿瘤球细胞可在-80℃冰箱冻存，图10为-80℃冻存4天后进行成功复苏，生长第二天的肿瘤球细胞，说明该肿瘤球细胞具有低温保存的能力，而传统原代培养髓母细胞瘤细胞尚不能忍受低温冻存，这是原代成球培养的另一大优势。
Claims (8)
1.一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液，其特征在于：所述的培养液包括神经细胞基础培养基、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5%~5%的B27营养因子、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5%~5%的双抗-青霉素/链霉素、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5%~5%的谷氨酰胺、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5%~5%的丙酮酸钠、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5%~1.5%的胎牛血清、重组Shh蛋白；其中，所述的重组Shh蛋白的添加量为每1 mL所述的神经细胞基础培养基加入2.5 μ g~3.5 μg。
2.根据权利要求1所述的体外培养脑肿瘤细胞的培养液，其特征在于：所述的重组Shh蛋白的添加量为每1 mL所述的神经细胞基础培养基加入2.8μg~3.2μg。
3.根据权利要求1所述的体外培养脑肿瘤细胞的培养液，其特征在于：所述的胎牛血清的添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.8%~1.2%。
4.一种如权利要求1至3中任一项所述的培养液在脑肿瘤细胞的体外培养中的应用；所述的脑肿瘤细胞为髓母细胞瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的体外培养的方法为悬浮培养。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的脑肿瘤细胞在所述的培养液中的细胞接种密度为3×105~5×105个/mL。
7.一种脑肿瘤细胞的体外培养方法，其特征在于：将处理后的脑肿瘤细胞接种至权利要求1至3中任一项所述的培养液中进行悬浮培养；所述的脑肿瘤细胞为髓母细胞瘤细胞。
8.根据权利要求7所述的脑肿瘤细胞的体外培养方法，其特征在于：所述的处理后的脑肿瘤细胞的制备方法为：将从小鼠小脑中提取的髓母细胞瘤组织在36℃~38℃下采用消化液消化20~40min，然后用胰酶抑制剂终止消化，然后经滤膜过滤，离心后获得所述的处理后的脑肿瘤细胞,其中，每10mL所述的消化液中的成分如下：90U~110U的木瓜蛋白酶、1mg~3mg的半胱氨酸以及2400U~2600 U的DNA酶。
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