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WO2016060520A1 - 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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WO2016060520A1
WO2016060520A1 PCT/KR2015/010983 KR2015010983W WO2016060520A1 WO 2016060520 A1 WO2016060520 A1 WO 2016060520A1 KR 2015010983 W KR2015010983 W KR 2015010983W WO 2016060520 A1 WO2016060520 A1 WO 2016060520A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
composition
hdac
stem cells
inhibitor
Prior art date
Application number
PCT/KR2015/010983
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English (en)
French (fr)
Inventor
황동연
Original Assignee
차의과학대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 차의과학대학교 산학협력단 filed Critical 차의과학대학교 산학협력단
Publication of WO2016060520A1 publication Critical patent/WO2016060520A1/ko

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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • a composition for differentiating stem cells into neural progenitor cells and a method using the same is provided.
  • hESCs human embyonic stem cells
  • hiPSCs human induced pluripotent stem cells
  • hESCs differentiate into specific cells or tissues
  • the hESCs aggregate together to form an embryoid body (EB) and then differentiate into cells or tissues.
  • EB embryoid body
  • NPCs neural precursor cells
  • EBs rounded cell embryos
  • the embryos are attached to the bottom of the culture vessel and adhered to the neural progenitor cells while adherent culture.
  • compositions for differentiation of stem cells into neural progenitor cells are provided.
  • One aspect provides a composition for differentiation of stem cells into neural precursor cells (NPCs) comprising inhibitors of histone deacetylases (HDACs).
  • NPCs neural precursor cells
  • HDACs histone deacetylases
  • the HDAC can be, for example, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, Sirtuin, Sir2, or a combination thereof.
  • the inhibitor may be an HDAC protein activity inhibitor or an HDAC gene expression inhibitor.
  • HDAC protein activity inhibitors are also called histone deacetylase inhibitors (HDAC inhibitors; HDIs) and can be, for example, small molecule compounds, anti-HDAC antibodies or antigen binding fragments thereof.
  • the small molecule compounds are for example 4- (dimethylamino) -N- [6- (hydroxyamino) -6-oxohexyl] -benzamide, FK228, MS275, RG2833, CI994, ITF2357, Droxinostat, MC1568, SB939, ACY1215, PCI34051, SB939, JNJ-26481585, JNJ-26481585, or a combination thereof.
  • the HDAC gene expression inhibitor may be, for example, a chemical compound, an antisense oligonucleotide specific for HDAC, a small interfering RNA (siRNA), an aptamer, or a combination
  • stem cell refers to a totipotent cell, a pluripotent cell, or a multipotent cell, which can differentiate into any kind of cell.
  • Stem cells can be differentiated into cells of a specific tissue as undifferentiated cells.
  • Stem cells may be embryonic stem cells (ESCs), adult stem cells, or induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • the embryonic stem cells are cultured in vitro by extracting the inner cell mass from the blastocyst embryo just before the fertilized egg implants in the mother's uterus.
  • the adult stem cells are undifferentiated cells in which only a very small amount is present in each tissue of the body and refers to cells that replace dead cells or damaged tissues.
  • the induced pluripotent stem cell refers to a cell which induces pluripotency, such as an embryonic stem cell, by injecting a cell differentiation-related gene into a differentiated somatic cell and returning it to a cell stage before differentiation.
  • the induced pluripotent stem cells may be, for example, human feeder free-iPSCs (hFF-iPSCs) or urine-iPSCs.
  • the neural progenitor cell refers to a cell having a marker factor of neural progenitor cells and capable of producing various neuronal cells after differentiation.
  • pluripotent stem cells can be differentiated into certain types of progenitor cells (e.g., neural progenitor cells), and then to specific cells (e.g., neurons, glial cells, etc.). Can be.
  • progenitor cells e.g., neural progenitor cells
  • specific cells e.g., neurons, glial cells, etc.
  • the composition may further include insulin, transferrin, sodium selenite, or a combination thereof.
  • Insulin is a peptide hormone secreted from ⁇ cells on the islet of Langerhans.
  • Transferrin is a type of ⁇ globulin that binds to two molecules of trivalent iron ions absorbed in the serum, and is an iron transporting protein that supplies iron necessary for cell proliferation or hemoglobin production to cells through transferrin receptors.
  • Sodium selenite is an inorganic compound having the formula Na 2 SeO 3 .
  • the composition may be a medium.
  • the composition may further include, for example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, glutamine, or a combination thereof.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Another aspect provides the step of culturing stem cells in the presence of HDAC inhibitors to differentiate stem cells into neural progenitor cells.
  • the stem cells, HDACs, HDAC inhibitors, neural progenitor cells, and differentiation are as described above.
  • the stem cells can be cultured in the presence of an inhibitor at a final concentration of 0.01 nM to 3 ⁇ M, 0.1 nM to 2 ⁇ M, or 0.2 to 1 ⁇ M.
  • the method can be cultured in an attachment culture in which the stem cells are attached to the bottom of the culture dish and cultured.
  • stem cells may form an embryoid body, which is a cell mass formed by agglomerating balls in the early stage of cell division. Therefore, it may not form an embryo.
  • the method may culture stem cells in a culture dish in which polypeptide is immobilized to attach and culture the stem cells to the culture dish.
  • the polypeptide may be a single protein or protein complex.
  • the single protein can be, for example, vitronectin.
  • the protein complex may be MATRIGEL TM (BD Biosciences).
  • the method may culture the stem cells in the presence of additional insulin, transferrin, sodium selenite, or a combination thereof.
  • additional insulin transferrin, sodium selenite, or a combination thereof.
  • insulin, transferrin, sodium selenite, or a combination thereof may be included in the stem cell culture medium.
  • the incubation time of stem cells may vary depending on the culture conditions.
  • stem cells can be cultured for example for 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days.
  • the method may further comprise differentiating differentiated neural progenitor cells into nervous system cells.
  • Differentiating neural progenitor cells into neural cells may be performed by methods known in the art.
  • differentiated neural progenitor cells can be cultured in the presence of basic fibroblast growth factor (bFGF) to differentiate neural progenitor cells into neuronal cells.
  • the nervous system cell may be a nerve cell or a glioma cell.
  • Neurons, also called neurons are cells that transmit stimulation and excitement of the nervous system.
  • Glial cells refer to cells that supply substances necessary for nerve cells and create a chemical environment suitable for the activity of nerve cells.
  • the glial cells may be, for example, astrocytes, oligoendrocytes, microglia, ependymal cells, or Schwann cells.
  • a composition for differentiating stem cells into neural progenitor cells and a method of using the same may be used as a composition for treating brain or neurological diseases.
  • the composition may be a cell therapy.
  • the brain or nervous system diseases include Parkinson's disease, neuralgia, arthritis, headache, schizophrenia, epilepsy, stroke, insomnia, dementia, depression, dyskinesia, Alzheimer's disease, lewy body dementia, Lou Gehrig's disease, multiple sclerosis ), Multiple system atrophy, Huntington's disease, Tourette's syndrome, anxiety, learning and memory impairment, various neurodegenerative disorders, bipolar disorder, autism, attention deficit hyperactivity disorder And diseases that appear in the brain or nervous system due to reduced or abnormal function of the nervous system such as ADHD).
  • composition for differentiation of stem cells into neural progenitor cells comprising an HDAC inhibitor according to one aspect and a method of using the same, it is possible to efficiently differentiate into neural progenitor cells in a short time without forming embryoid bodies from the stem cells.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of induction of differentiation into neural progenitor cells by attaching and cultured hPSC in the presence of HDAC isotype inhibitors.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of flow cytometry showing the percentage (%) of cells expressing Sox1, which is a neural precursor cell when hESCs were differentiated in the presence of HDAC isotype inhibitors.
  • Figure 3 is a schematic diagram of induction of differentiation into neural progenitor cells by attaching and cultured hPSC in the presence of HDAC isotype-specific siRNA
  • Figure 4 is the HDAC mRNA for siRNA when hESC is cultured in the presence of siRNA specific to HDAC This graph shows the relative amounts.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of flow cytometry showing the percentage (%) of cells expressing Sox1 in hPSCs cultured in the presence of siRNA that inhibits the expression of HDAC1 or HDAC4. A random sequence siRNA was used as a negative control.
  • HDAC histone deacetylase
  • HDAC isotype-specific inhibitors (Selleck Chemicals, Huston, TX, USA) of Table 1 dissolved in DMSO (Sigma-Aldrich) were added to the cell culture, and hESC was added at 5 ° C. and 5% CO 2 . Incubated for days. The dose was administered at least an IC 50 value or more within the range where no cytotoxicity was observed for each HDAC isotype to be inhibited. For example, CI994 was administered at 1 ⁇ M with 1 ⁇ M of HDAC1 and 2, while the IC 50 was 1.2 ⁇ M of HDAC3 with minimal effect. In addition, Droxinostat was treated with 2 ⁇ M to suppress HDAC8 but less effect on HDAC6, so that Droxinostat was treated with 2 ⁇ M.
  • DMSO Sigma-Aldrich
  • HDAC Isotype HDAC Inhibitors IC 50 Dosage HDAC 1,2,3 CI994 HDAC1: 0.57 ⁇ M HDAC2: 0.9 ⁇ M HDAC3: 1.2 ⁇ M 1 ⁇ M HDAC 6 and 8 Droxinostat HDAC6: 2.47 ⁇ M HDAC8: 1.46 ⁇ M 2 ⁇ M HDAC 4,5,7,9 MC1568 220 nM 300 nM HDAC 6 Rocilinostat (ACY1215) (selective inhibitor) 5 nM 20 nM HDAC 8 PCI34051 (Selective Inhibitor) 10 nM 20 nM
  • Example 1.1 flow cytometry was performed to confirm whether the cells cultured in the presence of HDAC isotype inhibitors were neural progenitor cells.
  • differentiated cells in the presence of HDAC isotype specific inhibitors in Example 1.1 were added to one well of a 12 well plate and accutase (Life Technologies) was added. Incubate for 5 minutes to make the cells single cells, then centrifuge (200xg, 5 minutes) to obtain the cells, add 2% (v / v) paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) to the cells and at room temperature Cells were fixed by incubation for minutes.
  • HDAC1 inhibitors As a result of the flow cytometry, the percentage (%) of cells expressing Sox1 in cells cultured in the presence of HDAC isotype inhibitors is shown in FIG. 2. As shown in FIG. 2, it was confirmed that HDAC1 inhibitors, HDAC2 inhibitors, HDAC6 inhibitors, and HDAC11 inhibitors induce differentiation into Sox1 + cells (HDAC1 inhibitors: 71.7%, HDAC2 inhibitors: 85.2%, HDAC6 inhibitors: 43% , HDAC11 inhibitor: 58.3%).
  • Example 2 Histone Deacetylase About siRNA Human pluripotency when administered Stem cells Confirmation of whether induction of differentiation into neural progenitor cells under adherent culture conditions
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA was administered to hESCs to inhibit the expression of HDAC1 or HDAC4. Random polynucleotide sequences were used as negative controls.
  • Negative control sense strand 5'-agcguguagcuagcagaggtt-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • HDAC1 siRNA sense strand 5'-gcuucaaucuaacuaucaatt-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • HDAC4 siRNA sense strand 5'-agcguguagcuagcagaggtt-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • siRNA and Visufect samples for delivering them into cells were prepared by Serin Bioscience, Inc. (Seolin Bioscience, seongnam, Korea).
  • hESCs were prepared as described in Example 1.1, and hESCs were incubated for 5 days at 37 ° C. and 5% CO 2 . As shown in FIG. 3, the prepared siRNA was added to the culture medium once every 24 hours while hESC was incubated (arrow; siRNA addition).
  • the amount of target mRNA was confirmed by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) method.

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Abstract

히스톤 디아세틸라제의 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 이에 의하면, 줄기 세포로부터 배아체를 형성하지 않고 빠른 시간 내에 효율적으로 신경 전구 세포로 분화시킬 수 있다.

Description

줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법
줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
인간 배아 줄기 세포(human embyonic stem cell; hESC)와 인간 유도 만능 줄기 세포(human induced pluripotent stem cell; hiPSC)는 거의 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성을 갖기 때문에, 그의 특성을 이용하여 부상이나 질병 등으로 조직이 손상되었을 때, 배아 줄기 세포를 원하는 조직으로 분화시켜 그 조직을 재생하는데 이용할 수 있다.
hESC를 특정 세포 또는 조직으로 분화시키는 경우, hESC가 서로 뭉쳐 배아체(embryoid body; EB)를 형성한 다음 세포 또는 조직으로 분화한다. 예를 들어, hESC를 신경 전구 세포(neural precursor cell; NPC)로 분화시키는 경우, hESC가 뭉쳐서 자란 콜로니를 잘게 부수어 부유 배양(suspension culture)을 하게 되면 둥근 세포 덩어리인 배아체(EB)가 형성되고, 배아체를 다시 배양 용기 바닥에 붙여 부착 배양(adherent culture)하면서 신경 전구 세포로 분화를 유도하게 된다.
그러나, 배아체를 형성하는 과정 때문에, hESC를 분화시키는데 시간과 노력이 많이 소요되고 대량으로 분화시키기 어려워서 hESC를 임상적으로 사용하기 어려운 문제가 있다.
따라서, hESC를 부유 배양하여 배아체를 형성하지 않고 빠르고 간단한 방법으로, hESC의 분화를 유도하는 방법을 개발하는 것이 필요하다.
줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물을 제공한다.
줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase; HDAC)의 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포(neural precursor cell; NPC)로의 분화용 조성물을 제공한다.
히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase; HDAC)는 히스톤의 N-아세틸 리신(lysine) 아미노산으로부터 아세틸기(O=C-CH3)를 제거하는 효소를 말한다. HDAC는 리신 디아세틸라제(lysine deacetylase; KDAC)라고도 불린다. HDAC는 예를 들면 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, 시르투인(sirtuin), Sir2, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 저해제는 HDAC 단백질 활성 저해제 또는 HDAC 유전자 발현 저해제일 수 있다. HDAC 단백질 활성 저해제는 히스톤 디아세틸라제 저해제(HDAC inhibitor; HDI)로도 불리고, 예를 들어 소분자 화합물, 항-HDAC 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 소분자 화합물은 예를 들어 4-(디메틸아미노)-N-[6-(히드록시아미노)-6-옥소헥실]-벤즈아미드, FK228, MS275, RG2833, CI994, ITF2357, Droxinostat, MC1568, SB939, ACY1215, PCI34051, SB939, JNJ-26481585, JNJ-26481585, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 HDAC 유전자 발현 저해제는 예를 들어, 화합물(chemical compound), HDAC에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 앱타머, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "줄기 세포(stem cell)"는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전능성 세포(totipotent cell), 만능성 세포(pluripotent cell), 또는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포(multipotent cell)를 의미하고, 줄기 세포는 미분화 세포로서 특정 조직의 세포로 분화될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)일 수 있다. 상기 배아 줄기 세포는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 말한다. 상기 성체 줄기 세포는 신체 각 조직에 극히 소량만이 존재하는 미분화된 세포로서 죽은 세포나 손상된 조직을 대체하는 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)는 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌려, 배아 줄기 세포처럼 만능성을 유도한 세포를 말한다. 상기 유도 만능 줄기 세포는 예를 들면 인간 영양 세포 비함유 유도 만능 줄기세포(human feeder free-iPSC; hFF-iPSC) 또는 뇨-유도 만능 줄기세포(urine-iPSC)일 수 있다.
상기 신경 전구 세포는 신경 전구 세포의 표식 인자를 가지며 분화 후에 각종 신경계 세포를 만들 수 있는 세포를 말한다.
용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 전능성, 만능성, 또는 다능성 줄기세포는 특정 형태의 전구 세포(예를 들어, 신경 전구 세포)로 분화될 수 있고, 그 뒤 특정 세포(예를 들어, 신경 세포, 신경교세포 등)으로 분화될 수 있다.
상기 조성물은 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 인슐린은 이자의 랑게르한스 섬의 β 세포에서 분비되는 펩티드 호르몬이다. 트랜스페린은 β 글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2 분자의 3가 철 이온과 결합하여 세포 증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린 수용체를 매개로 하여 철을 세포 내로 공급하는 철 운반 단백질이다. 소듐 셀레니트는 화학식 Na2SeO3를 갖는 무기 화합물이다.
상기 조성물은 배지일 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지, Ham's F12 배지, 글루타민, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 줄기 세포를 HDAC 저해제의 존재 하에서 배양하여 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 단계를 제공한다.
상기 줄기 세포, HDAC, HDAC 저해제, 신경 전구 세포, 및 분화는 전술한 바와 같다.
상기 줄기 세포는 최종 농도 0.01 nM 내지 3 μM, 0.1 nM 내지 2 μM, 또는 0.2 내지 1 μM의 저해제의 존재 하에서 배양될 수 있다.
상기 방법은 줄기 세포를 배양 접시의 바닥에 부착시켜서 배양하는 부착 배양(attachment culture)으로 배양할 수 있다. 줄기 세포를 부유 배양(suspension culture)하는 경우 세포 분열 초기에 줄기 세포들이 공 모양으로 뭉쳐 형성된 세포 덩어리인 배아체(embryoid body)를 형성할 수 있으나, 일 양상에 의한 방법에 따르면 줄기 세포를 부착 배양하므로 배아체를 형성하지 않을 수 있다.
상기 방법은 줄기 세포를 배양 접시에 부착 및 배양시키기 위해 폴리펩티드가 고정된 배양 접시에서 줄기 세포를 배양할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단일 단백질 또는 단백질 복합체일 수 있다. 상기 단일 단백질은 예를 들면 비트로넥틴(vitronectin)일 수 있다. 상기 단백질 복합체는 마트리겔(MATRIGEL™)(BD Biosciences)일 수 있다.
상기 방법은 줄기 세포를 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합의 추가적인 존재 하에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합은 줄기 세포 배양 배지에 포함될 수 있다.
상기 방법에서 줄기 세포의 배양 시간은 배양 조건에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 줄기 세포를 예를 들어 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 또는 12일 동안 배양할 수 있다.
상기 방법은 분화된 신경 전구 세포를 신경계 세포로 분화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 신경 전구세포를 신경계 세포로 분화시키는 단계는 당해 기술 분야에서 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 분화된 신경 전구 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)의 존재 하에서 배양하여 신경 전구 세포를 신경계 세포로 분화시킬 수 있다. 상기 신경계 세포는 신경 세포(nerve cell) 또는 신경교세포(neuroglia cell)일 수 있다. 신경 세포는 뉴런(neuron)으로도 불리고, 신경계의 자극과 흥분을 전달하는 세포를 말한다. 신경교세포는 신경 세포에 필요한 물질을 공급하고 신경 세포의 활동에 적합한 화학적 환경을 조성하는 세포를 말한다. 상기 신경교세포는 예를 들어, 성상세포(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte), 소교세포(microglia), 뇌실막 세포(ependymal cell), 또는 슈반 세포(Schwann cell)일 수 있다.
일 양상에 따른 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용하는 방법에 따라 분화된 신경 전구 세포, 신경 세포, 또는 신경교세포는 뇌 또는 신경계 질환에 대한 치료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 세포 치료제일 수 있다. 상기 뇌 또는 신경계질환은 파킨슨병, 신경통, 관절염, 두통, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 불면증, 치매, 우울증, 디스키네시아, 알츠하이머 질환, 루이체(lewy body) 치매, 루게릭병, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 다계통 위축(multiple system atrophy), 헌팅톤병, 뚜렛 증후군, 불안, 학습 및 기억 손상, 각종 퇴행성 신경질환, 조울증(bipolar disorder), 자폐증(autism), 주의력 결핍 과잉행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder; ADHD) 등의 신경계의 기능 감소 또는 이상으로 인하여 뇌 또는 신경계에 나타나는 질환을 포함한다.
일 양상에 따른 HDAC 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화용 조성물 및 이를 이용하는 방법에 따르면, 줄기 세포로부터 배아체를 형성하지 않고 빠른 시간 내에 효율적으로 신경 전구 세포로 분화시킬 수 있다.
도 1은 HDAC 이소타입 별 저해제의 존재 하에서 hPSC를 부착 배양하여 신경 전구 세포로의 분화를 유도하는 모식도이다.
도 2는 HDAC 이소타입 별 저해제의 존재 하에서 hESC를 분화시켰을 때 신경전구세포인 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 나타내는 유세포 분석(Flow cytometry) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 HDAC 이소타입 별 siRNA가 존재 하에서 hPSC를 부착 배양하여 신경 전구 세포로의 분화를 유도하는 모식도이고, 도 4는 HDAC에 특이적인 siRNA의 존재하에서 hESC를 배양한 경우 siRNA에 대한 HDAC mRNA의 상대적인 양을 나타내는 그래프이다.
도 5는 HDAC1 또는 HDAC4의 발현을 저해하는 siRNA의 존재 하에서 배양된 hPSC에서 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 나타내는 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 음성 대조군으로 무작위적 서열의 siRNA를 사용하였다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 부착 배양 조건 하에서 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화를 촉진하는 히스톤 디아세틸라제 저해 화합물의 확인
1.1. 부착 배양 조건 하에서 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화를 촉진하는 히스톤 디아세틸라제 저해 화합물의 스크리닝
히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase; HDAC)의 이소타입에 따른 저해제가 부착 배양(adherent culture) 조건 하에서 인간 만능 줄기 세포(human pluripotent stem cell; hPSC)를 신경 전구 세포(neural precursor cell; NPC)로 의 분화를 촉진하는지 여부를 확인하기 위해, HDAC의 이소타입별 저해제의 존재 하에서 hPSC를 배양하였다(도 1).
구체적으로, H9 hESC(WiCell Research Institute, Inc. Madison, WI, U.S.A.)를 배양액에서 배양하여 수득한 콜로니를 약 20개의 세포 덩어리로 나누고, 각각의 세포 덩어리를 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 12-웰 플레이트에 접종하였다. 접종된 세포에 DMEM/F12(Life Technologies), 1x GlutaMAX™(Life Technologies), 및 10 ㎍/㎖ 인슐린(Sigma-Aldrich), 9 ㎍/㎖ 트랜스페린(Sigma-Aldrich), 및 14 ng/㎖ 소듐 셀레니트(Sigma-Aldrich)로 이루어진 배지(ITS 배지)를 첨가하였다.
DMSO(Sigma-Aldrich)에 용해시킨 하기 표 1의 HDAC 이소타입별 저해제(Selleck Chemicals, Huston, TX, U.S.A.)를 세포 배양액에 첨가하고, 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5 일 동안 배양하였다. 투여량은 저해하고자 하는 HDAC 이소타입별 세포독성이 나타나지 않는 범위 내에서 적어도 IC50 값 이상으로 투여하였다. 예를 들어, CI994는 1 μM 을 사용하여 HDAC1과 2의 효과는 갖게 하면서 IC50가 1.2 μM인 HDAC3의 효과는 적도록, CI994를 1 μM로 투여를 하였다. 또한, 드록시노스타트(Droxinostat)는 2 μM으로 처리를 하여 HDAC8은 억제하지만 HDAC6에 대한 영향이 적도록,드록시노스타트를 2 μM로 처리하였다.
표 1
HDAC 이소타입 HDAC 저해제 IC50 투여량
HDAC 1,2,3 CI994 HDAC1: 0.57 μMHDAC2: 0.9 μMHDAC3: 1.2 μM 1 μM
HDAC 6 및 8 드록시노스타트 HDAC6: 2.47 μMHDAC8: 1.46 μM 2 μM
HDAC 4,5,7,9 MC1568 220 nM 300 nM
HDAC 6 록시리노스타트(Rocilinostat, ACY1215) (선택적 저해제) 5 nM 20 nM
HDAC 8 PCI34051 (선택적 저해제) 10 nM 20 nM
1.2. HDAC 이소타입 별 저해제의 존재 하에서 배양된 hESC 세포의 유세포 분석
실시예 1.1에서 HDAC 이소타입 별 저해제의 존재 하에서 배양된 세포가 신경 전구 세포인지 확인을 하기 위해 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다.
유세포 분석을 위해, 실시예 1.1에서 HDAC 이소타입 별 저해제의 존재 하에서 분화된 세포를 12웰 플레이트의 한 개 웰에 첨가하고, accutase(Life Technologies)를 가하였다. 5 분 동안 인큐베이션하여 세포를 단일 세포로 만든 후, 원심분리(200xg, 5 분)하여 세포를 수득하고, 세포에 2%(v/v) 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)를 첨가하고 상온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정하였다. 0.1%(v/v) TRITON™ X-100(Sigma-Aldrich)를 포함하는 2%(v/v) 정상 혈청/1xPBS(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 세포에 첨가하고, 상온에서 30 분 동안 인큐베이션하여 고정을 블로킹하였다. 신경 전구 세포 표지로서 신경외배엽 세포의 표지인 Sox1 단백질을 발현하는 세포(Sox1+ 세포)의 비율을 분석하기 위해서 피코에리트린(phycoerythrin; PE)-표지된 항-Sox1 모노클로날 항체(1:20 희석)(BD Biosciences)를 사용하여 면역염색하였다. 면역염색된 세포는 BD FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences, Sparks, MD, USA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
유세포 분석의 결과로서, HDAC 이소타입 별 저해제의 존재 하에서 배양된 세포에서 Sox1을 발현하는 세포의 비율(%)을 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, HDAC1 저해제, HDAC2 저해제, HDAC6 저해제, 및 HDAC11 저해제가 Sox1+ 세포로의 분화를 많이 유도한다는 것을 확인하였다(HDAC1 저해제: 71.7%, HDAC2 저해제: 85.2%, HDAC6 저해제: 43%, HDAC11 저해제: 58.3%).
실시예 2. 히스톤 디아세틸라제에 대한 siRNA 투여시 인간 만능 줄기 세포가 부착 배양 조건 하에서 신경 전구 세포로 분화를 유도하는지 여부의 확인
HDAC의 발현을 저해하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)를 투여한 경우, hESC가 부착 배양 조건 하에서 신경 전구 세포로 분화가 유도되는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, siRNA를 hESC에 투여하여 HDAC1 또는 HDAC4의 발현을 억제시켰다. 음성 대조군으로 무작위적인(random) 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하였다.
음성 대조군: 센스 가닥 5'-agcguguagcuagcagaggtt-3' (서열번호 1)
안티센스 가닥 5'-ccucugcuagcuacacgcutt-3' (서열번호 2)
HDAC1 siRNA: 센스 가닥 5'-gcuucaaucuaacuaucaatt-3' (서열번호 3)
안티센스 가닥 5'-uugauaguuagauugaagctt-3' (서열번호 4)
HDAC4 siRNA: 센스 가닥 5'-agcguguagcuagcagaggtt-3' (서열번호 5)
안티센스 가닥 5'-uugauaguuagauugaagctt-3' (서열번호 6)
상기 siRNA와 이들을 세포 내로 전달하는 Visufect 시료는 서린바이오사이언스사(Seolin Bioscience, seongnam, Korea)에서 제작하였다.
hESC는 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 준비하고, 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건 하에서 hESC를 5 일 동안 배양하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, hESC를 배양하면서 배양액에 상기 제작된 siRNA를 hESC에 24 시간마다 한번씩 6회 첨가하였다(화살표; siRNA 첨가).
상기 siRNA가 표적 mRNA의 수준을 감소시키는지를 확인하기 위해, 표적 mRNA의 양을 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR; qRT-PCR) 방법으로 확인하였다.
각 siRNA의 존재 하에서 배양한 hESC를 수득하고, hESC로부터 NucleoSpin RNA II kit(MACHEREY-NAGEL GmbH, Duren, Germany)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 총 RNA를 ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 cDNA로 변환시켰다.
정량적 실시간-PCR을 위해 하기 표 2의 폴리뉴클레오티드 서열의 프라이머를 사용하였다.
표 2
표적 유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
HDAC1 5'-tgatattcaccatggtgacggc-3'(서열번호 7) 5'-gcctcataggactcgtcatcaa-3'(서열번호 8)
HDAC4 5'-gcagcaactgcagatgaacaag-3'(서열번호 9) 5'-ctcttcctcatcgctctcaatg-3'(서열번호 10)
GAPDH 5'-gtggacctgacctgccgtct-3'(서열번호 11) 5'-ggaggagtgggtgtcgctgt-3'(서열번호 12)
정량적 실시간-PCR을 위해 StepOnePlus™ Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Life Technologies)을 이용하고, 95℃에서 40 초, 55℃ 내지 63℃에서 30 초, 및 72℃에서 1 분을 1 사이클로 하여 40 사이클을 반복하고, 72℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 시료 간의 mRNA 양의 비교를 위해 GAPDH를 이용하여 표준화(normalization)하였다. 음성 대조군으로부터 수득된 세포의 HDAC1 mRNA 및 HDAC4 mRNA의 양과 비교하여, HDAC1 siRNA 또는 HDAC4 siRNA를 처리하였을 때 감소된 HDAC1 mRNA 및 HDAC4 mRNA의 양을 비율을 산출하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 각 siRNA들은 타겟 mRNA의 양을 약 80% 감소시키는 것을 확인하였다.
한편, siRNA의 존재 하에서 배양한 hESC가 신경 전구 세포로 분화되었는지 확인하기 위해, 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 Sox1을 발현하는 세포를 유세포 분석을 수행하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, HDAC1의 발현을 저해하는 siRNA를 처리한 경우에는 약 88.2%의 세포가 Sox1을 발현하였다. HDAC4의 발현을 저해하는 siRNA를 처리한 경우에는 Sox1을 발현하는 세포의 비율이 음성 대조군과 유사하였다. 따라서 HDAC1의 발현을 저해하는 경우, hESC는 신경 전구 세포로 분화가 유도됨을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase; HDAC)의 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경 전구 세포(neural precursor cell; NPC)로의 분화용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 HDAC는 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 저해제는 HDAC 단백질 활성 저해제 또는 HDAC 유전자 발현 저해제인 것인 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 HDAC 단백질 활성 저해제는 소분자 화합물, 항-HDAC 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 소분자 화합물은 CI994, ITF2357, Droxinostat, MC1568, SB939, ACY1215, PCI34051, SB939, JNJ-26481585, JNJ-26481585, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 HDAC 유전자 발현 저해제는 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 앱타머, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기 세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 조성물.
  9. 줄기 세포를 HDAC 저해제의 존재 하에서 배양하여 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화시키는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 줄기 세포를 부착 배양하는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 줄기 세포를 단일 단백질 또는 단백질 복합체가 코팅된 배양 접시에서 배양하는 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은 줄기 세포를 인슐린(insulin), 트랜스페린(transferrin), 소듐 셀레니트(sodiume selenite), 또는 이들의 조합의 추가적인 존재 하에서 배양하는 것인 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은 줄기 세포를 3 일 내지 12 일 동안 배양하는 것인 방법.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은 분화된 신경 전구 세포를 신경계 세포로 분화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 신경계 세포는 신경 세포 또는 신경교세포인 것인 방법.
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