CN110241245A - 检测黄瓜细菌性角斑病基因的kasp引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，特别是指检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物及其应用。黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL在323的位置存在一处SNP位点，本发明基于该SNP位点开发了KASP引物、包含该KASP引物的试剂盒。本发明的KASP引物及含有KASP引物的试剂盒可用于鉴定黄瓜是否含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因，区分抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和感黄瓜细菌性角斑病黄瓜。本申请所提供的分子标记可对黄瓜植株在苗期大通量地进行快速、准确的抗病性鉴定，从而提高育种效率、节约育种成本、加快育种进程。

Description

检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，特别是指检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物及其应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)是国际上第三大蔬菜作物，在中国的种植面积居世界首位。黄瓜细菌性角斑病(Angular leaf spot,ALS)是黄瓜生产中最具毁灭性的世界性病害之一。在我国随着温室种植面积的日益扩大，黄瓜细菌性角斑病成为温室黄瓜生产的最严重的病害之一，严重影响果实的品质和产量，导致严重的经济损失，因此选育抗病品种就显得十分重要。

细菌性角斑病是由丁香假单胞杆菌黄瓜细菌角斑病致病变种(Pseudom onassyringae pv.Lachrymans，psl)引起的叶部病害，但也会对黄瓜植株叶柄、茎蔓和瓜条造成危害。细菌性角斑病病原菌可附着于黄瓜种子内外传播给下一代，也可寄生在土壤中成为翌年的初侵染源。细菌性角斑病典型的症状是叶片上有水渍状且受叶脉限制的黄色病斑，叶片背面病斑处常有白色菌脓，病斑对向太阳会有晕圈，后期叶片会坏死；果实发病初为水渍状，逐渐变成褐色凹陷病斑，龟裂，分泌出白色黏液，最终使得果实变得畸形。黄瓜发生细菌性角斑病危害后通常减产30％-50％，严重时损失高达50％-60％，有的甚至绝收。因此培育和推广抗细菌性角斑病的黄瓜品种是最有效的方法。

近年来基于DNA序列多态性的分子标记收到国内外育种行业的高度重视，利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行选择不受环境影响，选择结果可靠，而且在聚合有利性状时可以在回交渗透过程中通过遗传背景选择，减少连锁累赘、加速育种进程。因此，通过现代分子生物学手段开发控制黄瓜重要性状的分子标记，对黄瓜育种具有重要意义。

目前黄瓜遗传育种中常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、CAPS、SNP等。随着黄瓜基因的克隆基于黄瓜功能基因开发的功能标记也逐渐得到应用。尽管这些功能标记在黄瓜功能基因检测方面已经得到部分应用，但是操作过程繁琐复杂，需要酶切、电泳，耗费时间长，并且检测效率低。在育种过程中，广大育种人员筛选大量后代材料，需要较高成本，花费较长的时间，难以满足生产需要。因此，建立一种快速、高效、便捷的检测方法非常必要。

KASP技术(竞争性等位基因特异性PCR)是目前国际上主流的基因分型方法之一，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP和特定位点上的InDel进行精准的双等位基因判断。引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3’端为等位基因变异碱基，5’端添加通用荧光接头序列，下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。

KASP的特异性引物通常采用24bp-26bp，会有更高的特异性，对比常规酶切电泳准确率高；只需常规PCR扩增，所需时间短；无需昂贵的双色标记探针，灵活性超强；最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增；快速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。

其主要操作步骤如下：

1、含有SNP位点的等位基因-1和-2作为模板；

2、针对等位基因SNP位点设计特异性引物：两个正向引物和一个通用反向引物；

3、两条正向引物5’端分别连有特异性的检测引物序列，可与荧光标记结合；

4、提取待测样品的基因组DNA为模板；

5、PCR扩增，对扩增产物进行荧光信号扫描，数据分析。

KASP技术具有灵活、便宜、准确的特点，已被广泛应用于各个领域。目前，还未发现应用于黄瓜细菌性角斑病检测上的KASP标记。

申请人检索的专利文献包括：

公开号为CN107130047A的专利文献中公开了一种用于检测黄瓜细菌性角斑病菌的分子标记及其应用，其主要技术思路是：所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1-2；P2，SEQ ID NO.3-4；P3，SEQ ID NO.5-6。(1)所述分子标记适用于检测黄瓜种子中细菌性角斑病菌；(2)所述分子标记具有特异性好、灵敏度高、稳定性好的优点。上述专利文献存在的问题一是提供的是检测黄瓜细菌性角斑病菌的分子标记，其中检测的是样本是否携带黄瓜细菌性角斑病病菌，或者检测植物是否被细菌角斑病病菌侵染。并不能检测待测的材料是否携带黄瓜细菌性角斑病抗性基因，也不能判定待测材料对黄瓜细菌性角斑病的抗感情况。二是采用的是常规PCR进行检测，需要进行三轮PCR扩增，费时长且成本高；对DNA样本要求高，需用CTAB法提取全基因组DNA进行PCR扩增，操作复杂，花费时间比较长；然后进行凝胶电泳对结果进行判定，其准确性对比KASP的荧光检测相对较低。

公开号为CN102181522A中公开了一种黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物，其主要技术思路是所述引物的核苷酸序列如序列表PSL-F&PSL-R所示。检测黄瓜细菌性角斑病菌的方法以样品菌液或者植物提取DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增结束后用凝胶电泳可检测到179bp的扩增片段。上述专利文献存在的问题一是该专利检测的是样本是否携带黄瓜细菌性角斑病病菌，或者检测植物是否被细菌角斑病病菌侵染。并不能检测待测的材料是否携带黄瓜细菌性角斑病抗性基因，也不能判定待测材料对黄瓜细菌性角斑病的抗感情况；二是采用的是常规的PCR进行检测，对DNA样本要求高，需要提取全基因组DNA进行PCR扩增，然后进行凝胶电泳对结果进行判定，其准确性对比KASP的荧光检测相对较低；三是对黄瓜细菌性角斑病病菌的侵染数量有一定的要求，存在一定的局限性。

发明内容

本发明的目的提供一种检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物及其应用，可以用于鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL及黄瓜是否含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL，区分抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和感黄瓜细菌性角斑病，区分纯合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和杂合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜，进而能够培育和筛选出抗细菌性角斑病的黄瓜品种。

本发明的整体技术构思是：

检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物，所述KASP引物序列包含：

正向引物CsPSL-F1：5’-CAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，其序列如SEQ No.1；

正向引物CsPSL-F2：5’-CAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’，其序列如SEQ No.2；

所述正向引物CsPSL-F1和正向引物CsPSL-F2分别连接有不同的标签序列。

在合成KASP引物时，所述正向引物CsPSL-F1的5′端加上标签序列A，标签序列A为：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，其序列如SEQ No.6；所述正向引物CsPSL-F2的5′端加上标签序列B，标签序列B为：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，其序列如SEQ No.7。

所述KASP引物序列为：

正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，其序列如SEQ No.3；

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’，其序列如SEQ No.4；

所述KASP引物序列还包含：

反向引物：5’-CTTTCTTCCATTCTCCTACCACTTC-3’，其序列如SEQ No.5。

用于鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因的试剂盒，包含上述KASP引物。

用于鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因的试剂盒，其中还包含：

标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，其序列如SEQ No.6；

标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，其序列如SEQ No.7；

所述两种标签序列分别与不同的荧光基团相连接；所述两种标签序列的互补序列，其分别与相同的淬灭基团相连接；所述荧光基团分别为FAM荧光基团及HEX荧光基团，所述淬灭基团为BHQ淬灭基团。

检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物或用于鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因的试剂盒在如下a-f至少一种中的应用：

a、鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL；

b、鉴定黄瓜是否含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL；

c、区分抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和感黄瓜细菌性角斑病；

d、区分纯合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和杂合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜；

e、黄瓜育种；

f、黄瓜细菌性角斑病防控。

检测黄瓜含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因的应用，是利用检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物或用于鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因的试剂盒扩增待检测的黄瓜样品，检测和分析扩增产物。

区分抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和感黄瓜细菌性角斑病黄瓜的应用，是利用检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物或用于鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因的试剂盒扩增待鉴定的黄瓜样品，检测和分析扩增产物。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

利用本申请提供的KASP引物及试剂盒，相比现有技术可对黄瓜植株在苗期进行快速、准确的抗病性鉴定，大大降低苗期人工接种的工作量，其应用可提高育种效率、节约育种成本、加快育种进程。该分子标记可应用于黄瓜种质资源、各类亲本、杂交种等材料的鉴定。

附图说明

图1为黄瓜细菌性角斑病标记的分型结果。

图中横坐标和纵坐标数值均表示信号值；I处圆点为黄瓜感病材料9930的扩增信号；II处圆点为黄瓜杂合抗病材料9930-GY14-F1的扩增信号；III处圆点为黄瓜抗病材料GY14的扩增信号；靠近原点处的灰色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。

图2为鉴定抗黄瓜细菌性角斑病病黄瓜和感黄瓜细菌性角斑病病黄瓜的分型结果。

图中横坐标和纵坐标数值均表示信号值；I处圆点为黄瓜感病材料的扩增信号；II处圆点为黄瓜杂合抗病材料的扩增信号；III处圆点为黄瓜抗病材料的扩增信号；靠近原点处的灰色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本发明的说明书所做出的等效手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂(武汉市景肽生物科技有限公司)等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的黄瓜材料：黄瓜感病材料9930、黄瓜抗病材料GY14和9930-GY14-F1，社会公众可从河北省农林科学院经济作物研究所生物技术室获得，以重复本实验。

单核苷酸多态性(SNP)标记技术，属于新一代标记技术，是个体间最常见的遗传变异形式，常出现的单核苷酸多态性有碱基的替换、碱基的插入和缺失，是植物复杂性状遗传研究的理想分子标记。

KASP(竞争性等位基因特异性PCR，Kompetitive Allele Specific PCR)是近几年发展起来的一项基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDel的新技术。该技术是由英国LGC公司发布，可在广泛的基因组DNA样品中对SNPs和特定位点上的InDels进行非常准确的双等位基因评分，该实验方法具有高度的稳定性和准确性，同时支持个体重复实验和高通量研究。

KASP基因分型方法操作简单，只需要将特异的KASP Primer mix和通用的KASPMaster mix加入到含有DNA样本的PCR反应孔中，进行PCR扩增，最终结果采用荧光检测仪进行PCR产物分析即可。

本发明基于KASP技术，提供了可用于高通量鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因的KASP引物，包括特异性扩增引物和通用引物，结合应用条件严格的Touchdown PCR方法，建立了应用高通量标记检测平台鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因的方法。

具体地，申请人基于之前的研究，根据黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL在323的位置存在一处SNP位点。

申请人根据可用于KASP标记开发的SNP位点需满足的要求(基因型在323bp不同；邻近无其他SNP位点，位于非SNP密集区域；避免连续AT、GC含量高等序列复杂区域)，经过大量实验针对第323位(A/G)SNP位点筛选确定出特异性引物(正向引物)和通用引物(反向引物)。

在具体实施方案中，本申请所提供的正向引物包含正向引物CsPSL-F1：5’-CAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，和正向引物CsPSL-F2：5’-CAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’，二者的最后一位碱基即为对应的SNP位点，并且在正向引物的5’端分别接有不同的标签序列(通用接头序列)，如标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，和标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。

例如，本申请所提供的正向引物为1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’。其中下划线所示序列为添加的标签序列。

在具体实施方案中，本申请所提供的反向引物在满足产物要求(50bp-80bp)的前提下序列可变。例如，本申请所提供的反向引物为：5’-CTTTCTTCCATTCTCCTACCACTTC-3’。

进一步地，在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒还包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，其中，荧光探针A的序列与标签序列A的序列相同，为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，在其5’末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列与标签序列B相同，为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，在其5’末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列与标签序列A的序列互补，为5’-CTTCCACTGGTTCAAGTACGA-3’，其序列如SEQ No.8，在其3’末端连接淬灭基团BHA；淬灭探针B的序列与标签序列B互补，为5’-CTTCCAGCCTCAGTTGCCTAA-3’，其序列如SEQ No.9，在其3’末端连接淬灭基团BHA。

例如，上述的荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B可来自景肽生物公司的PARMS(PRO2.0)试剂盒。

本发明所提供的可准确稳定地鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL的KASP引物或包含该KASP引物的试剂盒，可用于鉴定黄瓜是否含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因，并且作为共显性标记进一步区分纯合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和杂合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜，从而进行黄瓜育种以及黄瓜细菌性角斑病防控等。

在实施方案中，本发明提供了鉴定黄瓜是否含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因的方法，其包括利用本发明提供的KASP引物来扩增待鉴定的黄瓜样品，并检测和分析扩增产物。

在具体实施方案中，当KASP物包含：正向引物，例如正向引物1：5’-GAAGGTGACCAA GTTCATGCTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’以及反向引物：5’-CTTTCTTCCATTCTCCTACCACTTC-3’。若仅检测到FAM荧光，则待鉴定的黄瓜样品不含黄瓜细菌性角斑病抗性基因；若仅检测到HEX荧光或者同时检测到HEX荧光和FAM荧光，则待鉴定的黄瓜样品含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因。

在具体实施方案中，当KASP引物包含:正向引物，例如正向引物1：5’-GAAGGTGACC AAGTTCATGCTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’以及反向引物：5’-CTTTCTTCCATTCTCCTACCACTTC-3’，若仅检测到FAM荧光，则待鉴定的黄瓜样品不含黄瓜细菌性角斑病抗性基因；若仅检测到HEX荧光，则待鉴定的黄瓜样品含有纯合的黄瓜细菌性角斑病抗性基因；同时检测到FAM荧光和HEX荧光，则待鉴定的黄瓜样品含有杂合的黄瓜细菌性角斑病抗性基因。

在具体实施方案中，所述黄瓜样品选自叶片、根、茎、花、种子和果实中的任一种。

在另一具体实施方案中，本发明提供了区分抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和感黄瓜细菌性角斑病黄瓜的应用，其包括利用本发明提供的KASP引物或者试剂盒扩增待鉴定的黄瓜样品，分析扩增产物。

在具体实施方案中当KASP引物包含：正向引物，例如正向引物1：5’-GAAGGTGACCA AGTTCATGCTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’以及反向引物：5’-CTTTCTTCCATTCTCCTACCACTTC-3’，若仅检测到FAM荧光，则待鉴定的黄瓜样品为感黄瓜细菌性角斑病黄瓜；若仅检测到HEX荧光或者同时检测到HEX荧光和FAM荧光，则待鉴定的黄瓜样品为抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜。

在具体实施方案中，当KASP引物包含：正向引物，例如正向引物1：5’-GAAGGTGACC AAGTTCATGCTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’以及反向引物：5’-CTTTCTTCCATTCTCCTACCACTTC-3’，若仅检测到FAM荧光，则待鉴定的黄瓜样品为感黄瓜细菌性角斑病黄瓜；若仅检测到HEX荧光，则待鉴定的黄瓜样品为纯合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜；或者，若同时检测到HEX荧光和FAM荧光，则待鉴定的黄瓜样品为杂合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜。

在具体实施方案中，所述黄瓜样品选自黄瓜植株的叶片、根、茎、花、种子和果实等的任一种。

以下实施例仅用于说明而非限制本发明范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW，Molecularcloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

KASP标记的开发

比较分析CsPSL和CsPSL323两个等位基因的序列。其中，CsPSL是不抗病的等位基因，CsPSL323是抗病的等位基因，并且两者在323bp的位置存在一处SNP位点。

可用于KASP标记开发的SNP位点需满足如下要求：CsPSL与CsPSL323基因型不同；邻近无其他SNP位点，位于非SNP密集区域；避免连续AT、GC含量高等序列复杂区域。

因此在第323位A/G位点为唯一选择目标；此位点中CsPSL的基因型为A，CsPSL323的基因型为G。

针对上述位点设计引物，其序列为(其中下划线所示序列为添加的标签序列)：

第323位A/G：

正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’；

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’；

反向引物：5’-CTTTCTTCCATTCTCCTACCACTTC-3’。

引物的测试结果见图1。

实施例2

分子标记的扩增

本实施例中所使用的材料为已知的抗黄瓜细菌性角斑病材料GY14和感黄瓜细菌性角斑病材料9930。

使用碱煮法提取黄瓜叶片中的基因组DNA，提取所得DNA溶液浓度为10-50ng/μl，保存于-20℃。

使用KASP-PARMS试剂盒(景肽生物公司)配置PCR反应体系，反应总体积为10μl，包括：2X PARMS PCR Mix，5μl；DNA提取液(10-50ng/μl)，1μl；正向引物CsPSL-F1，0.15μl(10pmol/μl)；正向引物CsPSL-F2，0.15μl(10pmol/μl)；反向引物CsPSL-R，0.4μl(10pmol/μl)；以及ddH2O，4.3μl。设置三个技术重复。

PCR反应程序为：94℃15分钟；94℃20秒，65℃(每循环下降0.8℃)1分钟，10个循环；94℃20秒，57℃1分钟，28个循环。

实施例3

检测分析扩增产物

使用Tecan Infinite M200型多功能酶标仪对PCR产物进行基因分型，利用SNPDecoder在线数据分析软件(http://www.snpway.com/snpdecoder/)对数据进行分析，其中设定FAM荧光信号靠近横轴，HEX荧光信号靠近纵轴。

标记分型结果见图1。在图中横、纵坐标数值表示信号值；I处圆点为感病材料9930扩增信号(仅检测到FAM荧光信号)；III处圆点为抗病材料GY14扩增信号(仅检测到HEX荧光信号)；Ⅱ处圆点为杂合抗病材料GY14-9930-F1，同时检测到HEX荧光和FAM荧光；靠近原点处的灰色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。两种基因型的扩增信号分别与原点的连线夹角越接近于直角说明分型效果越好。

结果表明，CsPSL引物对GY14的扩增信号按预期靠近纵轴，对9930的扩增信号按预期靠近横轴，对9930-GY14-F1的扩增信号按预期处于中间位置，能很好的将三种基因型进行区分，设计成功。

实施例4

使用CsPSL鉴定抗病黄瓜和感病黄瓜

以申请人引进的高世代纯合抗病材料GY14为父本，感病材料9930为母本，二者杂交制备9930-GY14-F1。广泛搜集黄瓜种质资源209份(具体分型结果见表1至表3)。

采用如实施例2所述的方式，分别提取209株材料的DNA样本，使用CsPSL这一组引物进行PCR扩增，使用Tecan Infinite M200型多功能酶标仪对PCR产物进行基因分型，利用SNP Decoder在线数据分析软件对数据进行分析，其中设定FAM荧光信号靠近横轴，HEX荧光信号靠近纵轴。

检测分型结果显示，图2中III的单株数为27(仅检测到HEX荧光信号，为纯合的抗病材料)、检测带型同图2中II的单株数为13(同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号，为杂合的抗病材料)、检测带型同图2中I的单株数为169(仅检测到FAM荧光信号，为感病材料)、靠近原点处的灰色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。

上述结果表明，所设计的引物均能够准确的对抗病黄瓜和感病黄瓜进行鉴定。

表1为鉴定抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜材料(编号1-70)的分型结果。

表2为鉴定抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜材料(编号71-140)的分型结果

表3为鉴定抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜材料(编号141-209)的分型结果

序列表

<110> 河北省农林科学院经济作物研究所

<120> 检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物及其应用

<130> none

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> an Artificial Sequence

<400> 1

caaggatggt ataattggct tca 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> an Artificial Sequence

<400> 2

caaggatggt ataattggct tcg 23

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> An Artificial Sequence

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tcaaggatgg tataattggc ttca 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> An Artificial Sequence

<400> 4

gaaggtcgga gtcaacggat tcaaggatgg tataattggc ttcg 44

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> An Artificial Sequence

<400> 5

ctttcttcca ttctcctacc acttc 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> An Artificial Sequence

<400> 6

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> An Artificial Sequence

<400> 7

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> An Artificial Sequence

<400> 8

cttccactgg ttcaagtacg a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> An Artificial Sequence

<400> 9

cttccagcct cagttgccta a 21

Claims (13)

1.检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物，其特征在于所述KASP引物序列包含：

正向引物CsPSL-F1：5’-CAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，其序列如SEQ No.1；

正向引物CsPSL-F2：5’-CAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’，其序列如SEQ No.2；

所述正向引物CsPSL-F1和正向引物CsPSL-F2分别连接有不同的标签序列。

2.根据权利要求1所述的检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物，其特征在于在合成KASP引物时，所述正向引物CsPSL-F1的5′端加上标签序列A，标签序列A为：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，其序列如SEQ No.6；所述正向引物CsPSL-F2的5′端加上标签序列B，标签序列B为：GAAGGTCGGAGTCAACGG ATT，其序列如SEQ No.7。

3.根据权利要求2所述的检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物，其特征在于所述KASP引物序列为：

正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCA-3’，其序列如SEQNo.3；

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGGATGGTATAATTGGCTTCG-3’，其序列如SEQNo.4。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物，其特征在于所述KASP引物序列还包含：

反向引物：5’-CTTTCTTCCATTCTCCTACCACTTC-3’，其序列如SEQ No.5。

5.用于鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因的试剂盒，其特征在于包含权利要求1至4中任一项所述的KASP引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于其中还包含：

标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，其序列如SEQ No.6；

标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，其序列如SEQ No.7；

所述两种标签序列分别与不同的荧光基团相连接；所述两种标签序列的互补序列，其分别与相同的淬灭基团相连接；所述荧光基团分别为FAM荧光基团及HEX荧光基团，所述淬灭基团为BHQ淬灭基团。

7.根据权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-6所述的试剂盒在鉴定黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL中的应用。

8.根据权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-6所述的试剂盒在鉴定黄瓜是否含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL中的应用。

9.根据权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-6所述的试剂盒在区分抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和感黄瓜细菌性角斑病中的应用。

10.根据权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-6所述的试剂盒在区分纯合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和杂合的抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜中的应用。

11.根据权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-6所述的试剂盒在黄瓜育种中的应用。

12.根据权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-6所述的试剂盒在黄瓜细菌性角斑病防控中的应用。

13.根据权利要求8或9中任一项所述的应用，其特征在于是利用试剂盒扩增待检测的黄瓜样品，检测和分析扩增产物。