CN110229896B

CN110229896B - Steap1在卵巢癌诊断、治疗和预后中的应用

Info

Publication number: CN110229896B
Application number: CN201910492395.4A
Authority: CN
Inventors: 陈洁; 张捷; 刘晓燕; 王来城; 尹秀秀; 王甜甜; 解洁; 孙佳丽
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2039-06-06
Also published as: CN110229896A

Abstract

本发明提供STEAP1在卵巢癌诊断、治疗和预后中的应用，本发明经研究发现，STEAP1在卵巢癌中发挥癌基因的作用，且STEAP1的高表达与卵巢癌的恶性表型和患者不良预后呈正相关；STEAP1可以促进卵巢癌细胞的增殖、抑制其凋亡。STEAP1可以通过促进EMT的进程，促进卵巢癌细胞的侵袭和转移。表明STEAP1是一种参与卵巢癌发生发展的致癌基因，可作为卵巢癌的生物标记物和治疗靶点，具有良好的实际应用之价值。

Description

STEAP1在卵巢癌诊断、治疗和预后中的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及STEAP1在卵巢癌诊断、治疗和预后中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但卵巢癌的死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，而且卵巢肿瘤位于盆腔内部不易早期发现，卵巢癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30％，大多数已扩散到子宫，双侧附件，大网膜及盆腔各器官，其五年生存率徘徊在25％～30％之间。对于卵巢癌的治疗目前以手术、放疗、化疗等综合治疗为主，但晚期肿瘤的侵袭转移和预后不良仍是难以解决的问题。基因治疗、靶向治疗作为肿瘤治疗的新生代模式日益受到重视，分子靶向药物进入体内能够特异地选择致癌位点，杀伤肿瘤细胞，而不会波及周围正常的组织细胞，因此分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。与传统化疗药物相比，分子靶向药物具有特异性强、疗效明显、副作用少等优点。但目前对于卵巢癌的治疗还没有发现特有效的特异性标记物，对于浸润转移的分子机制也缺乏一定的了解。因此，阐明卵巢癌浸润转移的机制，寻找有效靶向药物抑制侵袭和转移，对充分改善患者预后至关重要。

前列腺6-跨膜上皮抗原(6-transmembrane epithelial antigen of prostate,STEAP)家族包括4个成员，命名为STEAP1，STEAP2，STEAP3和STEAP4。他们都有一个共同的6-跨膜域，参与离子转运。STEAP1在晚期前列腺癌中首次被克隆出来，在人类前列腺癌中高表达，并在多种癌症中表达上调，然而，发明人发现，其临床意义和在癌细胞的作用仍然并不清楚，特别是其在卵巢癌中的作用鲜有研究。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供STEAP1在卵巢癌诊断、治疗和预后中的应用。具体的，经研究发现，STEAP1在卵巢癌中发挥癌基因的作用，且STEAP1的高表达与卵巢癌的恶性表型和患者不良预后呈正相关；STEAP1可以促进卵巢癌细胞的增殖、抑制其凋亡。STEAP1可以通过促进EMT的进程，促进卵巢癌细胞的侵袭和转移，上述研究表明STEAP1是一种参与卵巢癌发生发展的致癌基因，可作为卵巢癌的生物标记物和治疗靶点。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供STEAP1基因及其表达产物在制备用于诊断、检测、监测或预测卵巢癌的进展的产品中的应用。

所述产品能够通过检测STEAP1基因和/或STEAP1基因表达产物的表达水平来诊断检测、监测或预测卵巢癌的进展；所述卵巢癌的进展包括卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移、卵巢癌细胞凋亡和/或卵巢癌细胞集落形成；

其中，所述STEAP1基因及其表达产物均可为人源。

本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测卵巢癌的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测卵巢癌样品中STEAP1的转录的物质；或基于免疫检测方法检测卵巢癌样品中STEAP1表达产物情况的物质。

更进一步的，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述用于诊断、检测、监测或预测卵巢癌的进展的组合物。

本发明的第三个方面，提供抑制STEAP1基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(a)-(e)至少一种中的应用：

(a)制备用于抑制卵巢癌细胞增殖的产品；

(b)制备用于抑制卵巢癌细胞迁移的产品；

(c)制备用于抑制卵巢癌细胞侵袭的产品；

(d)制备用于促进卵巢癌细胞凋亡的产品；

(e)制备用于抑制卵巢癌细胞集落形成的产品。

本发明的第四个方面，提供一种用于治疗卵巢癌的药物组合物，其包含抑制STEAP1基因及其表达产物和/或活性降低的物质。

在本发明中，“治疗”指的是能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭、集落形成、和/或促进卵巢癌细胞凋亡。

本发明有益效果：本发明首次证明了STEAP1在卵巢癌中发挥癌基因的作用，且STEAP1的高表达与卵巢癌的恶性表型和患者不良预后呈正相关；STEAP1可以促进卵巢癌细胞的增殖、抑制其凋亡。同时，STEAP1可以通过促进EMT的进程，促进卵巢癌细胞的侵袭和转移。因此STEAP1可作为卵巢癌的生物标记物和治疗靶点，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中STEAP1在卵巢癌中高表达，与患者预后密切相关图；其中，图1A为STEAP1在正常卵巢上皮表达免疫组化结果图(×200)；图1B为STEAP1在正常卵巢间质表达免疫组化结果图(×200)；图1C为STEAP1在卵巢良性肿瘤上皮表达免疫组化结果图(×200)；图1D为STEAP1在卵巢良性肿瘤间质表达免疫组化结果图(×200)；图1E为STEAP1在高分化卵巢癌组织表达免疫组化结果图(×200)；图1F为STEAP1在低分化卵巢癌组织表达免疫结果图(×200)；图1G为公共数据库Kaplan-Meier plotter的分析高表达STEAP1的卵巢癌患者与低表达STEAP1的卵巢癌患者预后图。

图2为本发明实施例1中卵巢癌细胞迁移和侵袭能力检测相关图；其中，图2A为四种卵巢癌细胞Transwell小室细胞迁移实验结果图；图2B为四种卵巢癌细胞Transwell小室细胞侵袭实验结果；图2C为四种卵巢癌细胞迁移实验和侵袭实验平均穿透微孔膜细胞数统计图。*P<0.05。

图3为本发明实施例1中STEAP1在卵巢癌细胞中的表达相关图；其中，图3A为采用细胞爬片检测STEAP1在四种卵巢癌细胞中的表达图(×200)；图3B为采用real time RT-qPCR技术检测四种卵巢癌细胞STEAP1表达图；图3C为采用Western blotting检测四种卵巢癌细胞STEAP1表达图。

图4为本发明实施例1中慢病毒介导的方式降低或者增加STEAP1在卵巢癌细胞系ES-2或OVCAR-3中的表达相关图。其中图4A为采用细胞爬片检测未转染组、阴性对照组和RNA干扰组中STEAP1 mRNA和蛋白的表达图；试验结果为图4D，(×200)；图4B为采用realtime RT-qPCR技术检测未转染组、阴性对照组和RNA干扰组中STEAP1 mRNA和蛋白的表达图；试验统计结果见图4E，*P<0.05；图4C为采用Western blotting检测未转染组、阴性对照组和RNA干扰组中STEAP1 mRNA和蛋白的表达图，试验结果见图4F。

图5为本发明实施例1中慢病毒介导的方式降低或者增加STEAP1的表达对卵巢癌细胞增殖和集落形成能力的影响相关图；其中，图5A为不同处理组的卵巢癌细胞系ES-2和OVCAR-3生长曲线图；图5B为同处理组的卵巢癌细胞系ES-2和OVCAR-3平板克隆结果图。*P<0.05。

图6为本发明实施例1中慢病毒介导的方式降低或者增加STEAP1的表达对卵巢癌细胞生长周期和凋亡的影响图；其中，图6A为STEAP1表达降低导致S期阻滞，抑制卵巢癌细胞的增殖图；图6B为STEAP1的表达增加则通过增加S期细胞比例，促进卵巢癌细胞的增殖图；图6C为STEAP1表达降低导致凋亡细胞比例增加，诱导卵巢癌细胞的凋亡图；图6D为STEAP1的表达增加则导致凋亡细胞比例减少，抑制卵巢癌细胞的凋亡图。

图7为本发明实施例1中慢病毒介导的方式降低或者增加STEAP1的表达对卵巢癌细胞系ES-2或OVCAR-3细胞侵袭和迁移能力的影响相关图；其中，图7A为RNA干扰后，采用Boyden小室迁移实验验证卵巢癌细胞系ES-2迁移能力图；图7B为RNA干扰后，采用Boyden小室侵袭实验验证卵巢癌细胞系ES-2侵袭能力图；图7C为RNA干扰后，采用Boyden小室迁移实验验证卵巢癌细胞系OVCAR-3迁移能力图；图7D为RNA干扰后，采用Boyden小室侵袭实验验证卵巢癌细胞系OVCAR-3侵袭能力图；图7E为STEAP1降表达抑制卵巢癌细胞侵袭和迁移能力；STEAP1表达增加促进卵巢癌细胞侵袭和迁移能力图。*P<0.05。

图8为本发明实施例1中慢病毒介导的方式降低或者增加STEAP1的表达对裸鼠异种皮下移植瘤生长的影响相关图；其中，裸鼠颈背部皮下接种相同数量的细胞，连续观察8周，图8A为STEAP1的降表达可明显抑制高侵袭卵巢癌细胞系ES-2的裸鼠皮下移植瘤的生长；STEAP1的表达增加可显著促进低侵袭卵巢癌细胞系OVCAR-3的裸鼠皮下移植瘤的生长相关图；*P<0.05；图8B为STEAP1降表达组形成的皮下移植瘤与阴性对照组实物图；以及STEAP1过表达组形成的皮下移植瘤与阴性对照组实物图。

图9为本发明实施例1中慢病毒介导的方式降低或者增加STEAP1的表达对EMT相关基因的影响相关图；其中，图9A为慢病毒转染后，采用Western blotting检测EMT相关基因的表达图；图9B为慢病毒转染后，采用real time RT-qPCR检测EMT相关基因的表达图。*P<0.05。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

目前鲜有关于STEAP1在卵巢癌中的表达的文献报道，且STEAP1促进卵巢癌进展的潜在机制尚未得到充分阐明。

有鉴于此，发明人经研究发现，STEAP1在卵巢癌组织和细胞系中的表达上调，STEAP1的高表达与卵巢癌高临床分期、高组织学分级、淋巴结转移阳性和患者预后不良呈正相关。通过慢病毒感染和细胞体内外功能实验，进一步证实STEAP1在卵巢癌发生发展中的作用：促进卵巢癌细胞生长、抑制凋亡，促进EMT进程，进而促进卵巢癌细胞侵袭和转移。

基于上述研究，本发明的一个具体实施方式中，提供STEAP1基因及其表达产物在制备用于诊断、检测、监测或预测卵巢癌的进展的产品中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述产品能够通过检测STEAP1基因和/或STEAP1基因表达产物的表达水平来诊断检测、监测或预测卵巢癌的进展；所述卵巢癌的进展包括卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移、卵巢癌细胞凋亡和/或卵巢癌细胞集落形成。

本发明的又一具体实施方式中，所述STEAP1基因及其表达产物均可为人源。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测卵巢癌的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测卵巢癌样品中STEAP1的转录的物质；或基于免疫检测方法检测卵巢癌样品中STEAP1表达产物情况的物质。

本发明的又一具体实施方式中，采用Northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测卵巢癌样品中STEAP1的转录；采用ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片检测卵巢癌样品中STEAP1表达产物情况；

本发明的又一具体实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述用于诊断、检测、监测或预测卵巢癌的进展的组合物。

本发明的又一具体实施方式中，提供抑制STEAP1基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(a)-(e)至少一种中的应用：

(a)制备用于抑制卵巢癌细胞增殖的产品；

(b)制备用于抑制卵巢癌细胞迁移的产品；

(c)制备用于抑制卵巢癌细胞侵袭的产品；

(d)制备用于促进卵巢癌细胞凋亡的产品；

(e)制备用于抑制卵巢癌细胞集落形成的产品。

本发明的又一具体实施方式中，所述STEAP1可通过调控上皮间质转换(EMT)影响影响卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力；具体的，当STEAP1过表达后，会导致上皮标记物E-cadherin表达水平降低，而间充质标记物N-cadherin和Vimentin的表达水平均增高，同时，转录因子Snail、Slug和Twist的表达水平也增高，从而促进EMT进程，从而促进卵巢癌细胞的侵袭和转移。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于治疗卵巢癌的药物组合物，其包含抑制STEAP1基因及其表达产物和/或活性降低的物质；

对于抑制STEAP1基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括STEAP1蛋白特异的抗体、针对STEAP1 mRNA的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA、shRNA；进一步的，所述抗体为人抗体。

本发明的又一具体实施方式中，“治疗”指的是能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭、集落形成、和/或促进卵巢癌细胞凋亡。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物剂型为可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒等。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

1.1.1组织标本来源

本研究自2007年1月至2016年12月，共收集山东省齐鲁医院和省立医院594例人卵巢组织标本，包括65例正常卵巢组织、145例卵巢良性肿瘤和384例上皮性卵巢癌组织标本(浆液性囊腺癌142例，粘液性囊腺癌137例，子宫内膜样癌105例)。所有卵巢癌患者均按FIGO分期系统进行临床分期，FIGO I期73例、II期105例、FIGOIII期和IV期206例。所有患者均未接受术前放疗或化疗。这项研究得到了山东大学医学伦理委员会的批准，并在患者知情同意下进行。

1.1.2细胞来源

卵巢癌细胞系ES-2、SKOV-3、CAOV-3、OVCAR-3购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞在DMEM/F-12、10％胎牛血清和1％青霉素链霉素溶液的完全培养基中常规培养。

1.1.3主要试剂

鼠抗人STEAP1抗体(Abcam公司)；胎牛血清、DMEM/F12培养基、青霉素链霉素溶液、胰蛋白酶(Gibco公司)；生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；real time RT-qPCR试剂盒(TaKaRa生物技术公司)；Annexin V-PE/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)；MUSE细胞周期检测试剂盒(Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法(IHC)和免疫细胞化学法(ICC)

对于IHC，石蜡包埋组织切片二甲苯梯度脱蜡，枸橼酸盐缓冲液高压修复2分钟促进抗原修复。对于ICC，取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，离心制备细胞悬液，接种于覆盖盖玻片的24孔培养板中，37℃和5％CO₂条件下培养24h，取出盖玻片，95％乙醇固定30分钟。IHC和ICC的剩余步骤相同，采用标准的链霉菌生物素蛋白-过氧化物酶(SP)染色法，具体步骤详见说明书。采用半定量评分系统来评估STEAP1在卵巢组织和细胞中的表达情况。根据染色强度和组织切片或细胞爬片中阳性细胞的比例对染色结果进行评分和分级。染色强度分为4级：完全阴性计0分；淡黄色略高于背景为弱阳性，计1分；棕黄色明显高于背景为阳性，计2分；强阳性计3分，呈棕色。阳性细胞数分为5级：按照阳性细胞数为0％计0分、1％～25％计1分、26％～50％计2分、51％～75％计3分、76％～100％计4分。总评分为染色强度评分和阳性细胞数评分之和(0～7分)。为了便于统计，总计分<4被认为是低表达，≥4被认为是高表达。所有的组织切片和细胞爬片均由两名研究人员进行盲评估，如果出现分数差异，则通过讨论达成一致。

1.2.2Kaplan-Meier plotter公共数据库分析

Kaplan-Meier plotter(KM Plotter,http://kmplot.com/analysis/)公共数据库可以从GEO、EGA和TCGA数据库中，下载基因表达数据以及患者无复发和整体生存信息，由PostgreSQL服务器处理，能够评估54675个基因对21种癌症患者生存的影响。本研究利用Kaplan-Meier Plotter公共数据库，分析STEAP 1的表达与卵巢癌患者预后的关系。

1.2.3real time RT-qPCR

采用Trizol法，按照试剂说明书提取RNA，利用酶标仪测定RNA浓度和纯度；取1μg总RNA根据逆转录试剂盒操作说明书逆转录合成cDNA；按照SYBR Primescrip real timeRT-PCR试剂盒说明书配置反应体系。引物序列由Takara生物技术有限公司设计和合成，见表1。以ACTB为内参照，2﹣^ΔΔCt法分析基因相对表达水平。实验重复3次。

表1 real time RT-qPCR引物序列

1.2.4 Western blotting

取对数生长期细胞，按照1:100的比例将PMSF和RIPA裂解液加入后于冰上充分裂解30分钟，每6分钟振荡一次，12000rpm离心30分钟，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按照上样量40μg加样，10％SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜，置于5％脱脂奶粉中，室温摇床封闭1小时。分别加STEAP1一抗(1:1000)、β-actin一抗(1:2000)，4℃摇床过夜。次日，孵育二抗(1:5000)，室温摇床孵育1小时，ECL法显影，Image J对条带进行灰度值分析。

1.2.5慢病毒转染

RNA干扰慢病毒载体和过表达慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。RNA干扰慢病毒载体转染高侵袭卵巢癌细胞ES-2；过表达慢病毒载体转染低侵袭卵巢癌细胞OVCAR-3。取对数生长期细胞，接种于24孔培养板中，37℃和5％CO₂条件下孵育24h。为了获得较高的病毒感染效率和较低的细胞毒性，将MOI值(multiplicity of infection，感染时病毒数量与细胞数之比)设为100。将慢病毒、培养基、助感染试剂(Polybrene)和感染增强剂(ENi.S.)加入24孔培养板中，设置空白组进行对照，常规培养12h后，用完全培养基代替病毒混合物。72h后在荧光显微镜下观察转染效率。Real time RT-qPCR和Westernblotting检测，过表达组或降表达组、阴性对照组和未转染组中，STEAP1的mRNA和蛋白表达差异，验证转染效果。

1.2.6生长曲线法

取对数生长期细胞，接种于24孔培养板中，每孔细胞数为1×10⁴个，每种细胞设置3个复孔，置于细胞培养箱中常规培养，次日起，平均每天取3孔进行细胞计数，连续记录7天。以细胞培养时间为横坐标，以日细胞均数为纵坐标，对数据进行整理，绘制生长曲线。实验重复三次。

1.2.7平板克隆形成实验

细胞克隆形成能力取决于接种后存活并形成克隆的贴壁细胞数。取对数生长期细胞，接种于6孔培养板中，每孔500个细胞。轻轻摇动培养板，使细胞均匀分布。细胞在5％CO₂和37℃孵育条件下培养2～3周。当肉眼可见克隆出现时，细胞培养终止。4％多聚甲醛固定15分钟，GIMSA染色10～30分钟。用肉眼直接计数细胞克隆数。实验重复三次。

1.2.8细胞周期检测

取对数生长期细胞，在离心管中调整细胞密度至5×10⁵/ml，缓慢加入5ml预冷的70％乙醇，-20℃固定过夜。次日取出，加入300μl细胞周期检测试剂，室温避光染色30分钟，使用Muse细胞分析仪检测。

1.2.9细胞凋亡检测

取对数生长期细胞，1×Annexin V Binding Buffer调整细胞密度至1×10⁶/ml，取100μl细胞悬液于新EP管中，加入Annexin V-PE、7-AAD荧光染料各5μl，放置室温避光反应15分钟，加入400μl 1×Annexin V Binding Buffer，200目滤网过滤至流式细胞仪专用玻璃管中，流式细胞仪检测，检测数据使用BD FACSDiva8.0.1和SPSS 21.0软件分析。

1.2.10 Transwell小室细胞迁移和侵袭实验

Transwell小室又称为Boyden小室，是一个由8.0μm孔径微孔膜隔开的两个室，是研究细胞迁移和侵袭能力的常用工具。在趋化因子的作用下，上室的细胞可以通过微孔膜进入下室，通过比较不同细胞穿过微孔膜的数量，可以确定不同细胞的迁移或侵袭能力。Transwell迁移试验：上室加入200μl细胞悬液(2×10⁵个细胞)，下室加入600μl NIH3T3细胞无血清条件培养液作为趋化因子，5％CO₂和37℃条件下培养24h，取出小室，棉签拭去上室内未穿过的细胞，95％乙醇固定微孔膜30分钟，结晶紫染色10分钟。倒置显微镜下计数穿过微孔膜的细胞数量。Transwell侵袭试验：用Matrigel胶包被微孔膜形成具有生物活性的三维基质，模拟细胞基底膜的结构、物理性质和功能。Matrigel胶-20℃保存，4℃保持液态，室温下快速凝固，预冷的无血清培养基1:5稀释Matrigel胶原液，取50μl稀释液均匀铺在上室的微孔膜上，37℃孵育1小时，聚合凝固。剩余步骤与Transwell迁移试验一致，常规培养24h后，对微孔膜进行固定和染色，并在倒置显微镜下计数穿过包被Matrigel胶微孔膜的细胞数。

1.2.11裸鼠移植瘤模型的建立

所有裸鼠(4周龄；体重17～19克)，通过简单随机分组的方式分为过表达组和阴性对照组，以及RNA干扰组和阴性对照组，每组各5只。每只裸鼠颈背部皮下接种相同数量的细胞(1/10⁷个)，饲养于SPF(specific pathogen-free)级环境中(温度20～26℃；湿度40～60％；12/12-h光/暗循环；自由获取食物和水)2个月。定期观察裸鼠的肿瘤生长状况和一般情况，CO₂安乐死方法处死所有裸鼠。游标卡尺测量肿瘤大小，根据公式V(mm³)＝长度(mm)×宽²(mm²)×0.5计算肿瘤体积。本次动物实验获得山东大学动物保护和使用委员会批准，并符合所有的监管指南。

1.2.12统计学分析

SPSS 24.0软件进行数据分析，实验结果中两样本间的差异比较使用t检验分析，多样本间差异比较使用单因素方差分析，SNK检验用于进一步两两比较。P<0.05，差异有统计学意义。

2结果

2.1 STEAP1在卵巢组织中的表达

STEAP1在卵巢癌中表达上调，明显高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中的表达，且染色主要集中在细胞膜与细胞质。STEAP1在正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤中的高表达率分别为12.3％(8/65)和28.3％(41/145)，明显低于卵巢癌组织中的高表达率71.1％(273/384)，差异具有统计学意义(P＜0.01)。STEAP1在卵巢癌组织中的表达情况与细胞分化程度、肿瘤临床分期以及有无淋巴结转移等临床病理特征有关：STEAP1在低分化癌组织中的高表达率(89.7％)明显高于中、高分化癌组织(51.9％，P<0.05)；STEAP1表达强度随肿瘤临床分期的增加而增加(Ⅰ期45.2％，Ⅱ期67.6％，Ⅲ-Ⅳ期82.0％，P<0.05)；STEAP1表达增加与淋巴结转移阳性呈正相关(P<0.05)。结果见表2和图1A-F。利用公共数据库Kaplan-MeierPlotter分析STEAP1的表达与卵巢癌患者预后的关系，结果显示：STEAP1低表达卵巢癌患者的预后明显好于STEAP1高表达的卵巢癌患者[HR＝1.19(1.04-1.35)，logrank P＝0.011]，STEAP1的高表达提示患者预后不良，结果见图1G。

表2：STEAP1表达与卵巢癌临床病理特征的关系

2.2卵巢癌细胞系ES-2、SKOV-3、CAOV-3、OVCAR-3迁移和侵袭能力的检测

Transwell小室细胞迁移和侵袭实验检测四种卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力，结果显示：无论是迁移实验还是侵袭实验，ES-2、SKOV-3细胞穿过微孔膜的细胞数远高于CAOV-3、OVCAR-3，ES-2细胞穿过最多；CAOV-3、OVCAR-3细胞穿过微孔膜的细胞数远低于ES-2、SKOV-3，其中OVCAR-3细胞穿过最少；Transwell小室结果说明ES-2、SKOV-3的迁移和侵袭能力远高于CAOV-3、OVCAR-3，四种卵巢癌细胞中ES-2侵袭能力最强，OVCAR-3侵袭能力最弱。结果见图2。

2.3 STEAP1在卵巢癌细胞系ES-2、SKOV-3、CAOV-3、OVCAR-3中的表达

细胞爬片(图3A)、real time RT-qPCR(图3B)和Western blotting(图3C)结果均显示：无论是蛋白水平还是mRNA水平，STEAP1在卵巢癌细胞系ES-2中表达最高，在OVCAR-3中表达最低，STEAP1的表达在卵巢癌细胞系中从高到低依次为ES-2、SKOV-3、CAOV-3、OVCAR-3，STEAP1的表达与卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力呈正相关。

2.4慢病毒介导的RNA干扰及过表达转染效率的验证

细胞爬片、real time RT-qPCR和Western blotting实验，分别从蛋白水平和mRNA水平验证了转染效率，三者结果均显示慢病毒介导的RNA干扰沉默STEAP1表达后，STEAP1在高侵袭能力的卵巢癌细胞系ES-2中表达降低；慢病毒介导的STEAP1过表达后，STEAP1在低侵袭能力的卵巢癌细胞系OVCAR-3中表达升高。阴性对照组和未转染组差异无统计学意义。结果见图4。

2.5 STEAP1降表达和过表达对卵巢癌细胞增殖和集落形成能力的影响

生长曲线和平板克隆形成实验结果显示：STEAP1降表达组的细胞增殖速度和克隆形成数量，明显低于阴性对照组和未转染组，阴性对照组和未转染组差异无统计学意义，STEAP1降表达明显抑制高侵袭能力的卵巢癌细胞系ES-2的细胞增殖能力和集落形成能力；而STEAP1过表达组的细胞增殖速度和克隆形成数量，明显高于阴性对照组和未转染组，阴性对照组和未转染组差异无统计学意义，STEAP1的表达增加显著促进低侵袭能力的卵巢癌细胞系OVCAR-3的细胞增殖能力和集落形成能力，结果见图5。

2.6 STEAP1降表达和过表达对卵巢癌细胞生长周期和凋亡的影响

细胞周期结果显示：STEAP1降表达组S期细胞的占比(10.2％)明显低于阴性对照组(26.6％)，出现S期阻滞，STEAP1的降表达可以抑制卵巢癌细胞的增殖能力，结果见图6A。STEAP1过表达组S期细胞的占比(29.0％)明显高于阴性对照组(15.0％)，细胞增殖加快，STEAP1的过表达可以促进卵巢癌细胞的增殖能力，结果见图6B。Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪细胞凋亡分析结果显示：STEAP1降表达组凋亡细胞(早期凋亡细胞Q4和晚期凋亡细胞Q2之和)的比例为19.7％，明显高于阴性对照组8.1％，STEAP1降表达可显著诱导卵巢癌细胞的凋亡，结果见图6C。STEAP1过表达组凋亡细胞(Q4+Q2)的比例为16.3％，明显低于阴性对照组27.6％，STEAP1表达增加可显著抑制卵巢癌细胞的凋亡，结果见图6D。

2.7 STEAP1降表达和过表达对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响

Transwell小室细胞迁移和侵袭实验结果显示：RNA干扰抑制STEAP1表达后，无论是迁移实验(图7A)还是侵袭实验(图7B)，STEAP1降表达组细胞穿过微孔膜的细胞数显著减少，明显少于阴性对照组和未转染组，阴性对照组和未转染组差异无统计学意义；同样，慢病毒介导的STEAP1过表达后，无论是迁移实验(图7C)还是侵袭实验(图7D)，STEAP1过表达组细胞穿过微孔膜的细胞数显著增加，明显多于阴性对照组和未转染组，阴性对照组和未转染组差异无统计学意义。STEAP1的降表达可明显抑制高侵袭卵巢癌细胞系ES-2的细胞侵袭和迁移能力。STEAP1过表达可显著促进低侵袭卵巢癌细胞系OVCAR-3的细胞侵袭和迁移能力(图7E)。

2.8 STEAP1降表达和过表达对裸鼠异种皮下移植瘤生长的影响

所有裸鼠随机分为过表达组和阴性对照组，以及RNA干扰组和阴性对照组，每组各5只。每只裸鼠颈背部皮下接种相同数量的细胞，连续观察8周，结果显示：STEAP1的降表达可明显抑制高侵袭卵巢癌细胞系ES-2的裸鼠皮下移植瘤的生长；STEAP1的表达增加可显著促进低侵袭卵巢癌细胞系OVCAR-3的裸鼠皮下移植瘤的生长，结果见图8A。STEAP1降表达组形成的皮下移植瘤的体积明显低于阴性对照组；STEAP1过表达组形成的皮下移植瘤的体积明显高于阴性对照组，结果见图8B。

2.9 STEAP1降表达或过表达对上皮间质转换(EMT)相关基因的影响

上皮间质转换(EMT)是上皮细胞失去细胞极性和细胞粘附，获得迁移能力和侵袭性成为间充质细胞的过程。EMT在各种肿瘤的转移过程中起着至关重要的作用。Transwell小室细胞迁移和侵袭实验结果显示，STEAP1会影响卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力，因此，我们猜测STEAP1可能会影响EMT关键基因的表达。Western blotting(图9A)和real timeRT-qPCR(图9B)实验结果显示，RNA干扰抑制STEAP1的表达后，卵巢癌细胞ES-2的上皮标记物E-cadherin表达水平增高，而间充质标记物N-cadherin和Vimentin的表达水平均降低，同时，转录因子Snail、Slug和Twist(抑制E-cadherin转录从而调节EMT过程)的表达水平也降低，阴性对照组和未转染组差异无统计学意义，STEAP1的降表达可以抑制EMT进程，从而抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移；慢病毒介导的方式外源性强制STEAP1过表达后，卵巢癌细胞OVCAR-3的上皮标记物E-cadherin表达水平降低，而间充质标记物N-cadherin和Vimentin的表达水平均增高，同时，转录因子Snail、Slug和Twist的表达水平也增高，阴性对照组和未转染组差异无统计学意义，STEAP1过表达可以促进EMT进程，从而促进卵巢癌细胞的侵袭和转移。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> STEAP1在卵巢癌诊断、治疗和预后中的应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

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<212> DNA

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<212> DNA

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cgaatggatg aaagacccat cc 22

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<212> DNA

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<400> 9

gctccctctt cctctccata cc 22

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<400> 10

aagtcctgtg gggctgatgt 20

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ctgtccattt tctccttctc tgg 23

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<212> DNA

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<400> 15

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

ctaagtcata gtccgcctag aagca 25

Claims

1.抑制STEAP1基因表达的物质在如下（a）-（e）至少一种中的应用：

（a）制备用于抑制卵巢癌细胞增殖的产品；

（b）制备用于抑制卵巢癌细胞迁移的产品；

（c）制备用于抑制卵巢癌细胞侵袭的产品；

（d）制备用于促进卵巢癌细胞凋亡的产品；

（e）制备用于抑制卵巢癌细胞集落形成的产品。