CN112501299A

CN112501299A - 一种用于预测肝癌复发和转移的方法及应用

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Publication number: CN112501299A
Application number: CN202011423749.9A
Authority: CN
Inventors: 赵景民; 赵立华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2021-03-16

Abstract

本发明公开一种用于预测肝癌复发和转移的方法及应用。本发明利用高转移风险肝细胞癌患者及低转移风险肝细胞癌患者的组织表达芯片数据结合生物信息学方法分析发现脂质代谢基因LCAT与转移密切相关。进一步利用临床标本及功能验证表明，LCAT在临床标本中的表达情况与芯片数据一致，能够调控肝细胞癌的转移、预测高转移患者和用于预测患者复发。本发明为临床肝细胞癌转移风险的预测和预后提供了潜在的分子标志物，具有重要的实际应用价值。

Description

一种用于预测肝癌复发和转移的方法及应用

技术领域

本发明涉及原发性肝癌复发和转移相关的标志物，具体地涉及用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法以及用于预测肝癌转移或复发的方法。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)占原发性肝癌的85％，是世界上癌症相关死亡的主要原因之一。多种病因均可导致肝细胞癌的发生。总体来讲，50％以上的HCC是由于乙肝病毒的感染导致的，30％以上是由于丙肝病毒的感染引起的，剩余的大约15％的病例与非病毒因素相关，诸如酗酒、黄曲霉毒素、代谢性肝病以及非酒精性脂肪肝病等。国际癌症研究机构(IARC)最新资料表明，2018年全球肝癌新发人数超过84万，因肝癌导致的死亡人数约为78万；其中，约一半的肝癌新发病例发生在我国。手术切除仍是目前最有效、最普遍的治疗手段。恶性细胞的转移导致肝细胞癌极易复发，5年复发率高达50-80％，大部分复发发生在两年之内，即使在根治性手术切除后它的预后仍然很差，5年生存率在世界范围仅为5-6％。临床上肝细胞癌复发监测的主要手段是血清甲胎蛋白的监测，定期腹部超声和CT等。这些方法各具优点，但同时也各有某方面的不足。由于技术水平所造成的灵敏度和特异性不高以及诊断不明确，很可能会导致部分早期复发的肝细胞癌患者失去最佳的治疗时机。临床上也会采取一些预防性治疗措施防止肝细胞癌的复发，但这些预防性治疗不具备针对性，容易导致过度治疗，增加患者的经济负担和痛苦。上述现状充分表明，目前对HCC术后患者的转移风险、预后风险分层、及肿瘤复发风险预警，需要更准确的指标进行补充。运用分子生物学方法研究、鉴定有效的分子标志物，是辅助现有临床诊断、指导临床干预和癌变预警的关键手段之一。

HCC复发、转移是HCC预后差的主要原因。HCC早期复发和转移缺乏灵敏特异的预测手段。目前仅公开或报道了用于诊断或预测肝癌的多种分子标志物或其组合，但是可用于预测HCC复发和转移的分子标志物或组合仍然较为匮乏。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明通过临床标本及功能验证表明，卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶(Lecithin-cholesterol acyltransferase,LCAT)能够调控HCC的转移、预测高转移患者和用于预测患者复发。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容：

本发明的第一方面，提供一种用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法，其包括改变肝癌细胞内卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因表达水平的步骤。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法，所述调控为抑制肝癌细胞的增殖、迁移或侵袭，所述改造为增强卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因的表达水平。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法，所述卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因表达水平包括RNA表达水平或蛋白表达水平。

本发明的第二方面，提供一种用于预测肝癌转移或复发的方法，其包括以下步骤：

(1)利用试剂测量来自受试者的样品中卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因表达水平获得测量值的步骤；

(2)将所述测量值与阈值比较的步骤；和

(3)如果所述测量值低于所述阈值，则将受试者预测为肝癌转移或复发风险高，如果所述测量值高于所述阈值，则将受试者预测为肝癌转移或复发风险低。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，所述样品为肝癌组织，所述阈值为mRNA表达水平，且为(LCAT/ATCB 0.165)。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，所述受试者为甲胎蛋白阴性受试者。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，所述试剂包括用于检测卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因mRNA水平的引物和/或探针，或抗卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶抗体。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，所述测量值通过来自受试者的样品中卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因表达水平、TNM分期和血清甲胎蛋白水平来确定。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，测量值的计算通过列线图和网页计算器进行：(图5B、F网址为https://hcc-metastatic-risk.shinyapps.io/dynnomapp/)。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，所述受试者为病毒相关肝癌或非感染性肝癌患者。

本发明利用高转移风险HCC患者及低转移风险HCC患者的组织表达芯片数据结合生物信息学方法分析发现脂质代谢基因LCAT与转移密切相关。进一步利用临床标本及功能验证表明，LCAT在临床标本中的表达情况与芯片数据一致，能够调控HCC的转移、预测高转移患者和用于预测患者复发。本发明为临床HCC转移风险的预测和预后提供了潜在的分子标志物，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1基因聚类分析结果图。

图2不同非肿瘤肝组织及肝癌组织中LCAT基因的RNA表达。

图3LCAT的表达水平与术后复发的关系。

图4体外实验检测LCAT对细胞生长和转移的影响。

图5LCAT单分子或联合临床指标预测HCC转移效能的评估结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

[用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法]

本发明的第一方面，提供一种用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法，其包括改变肝癌细胞(优选体外肝癌细胞)内LCAT基因表达水平的步骤。

本发明的调控是指通过人为干预手段改变目标细胞特别是肝癌细胞内LCAT基因的自然表达水平。调控包括上调LCAT基因的表达，也包括下调LCAT基因的表达。优选地，本发明的调控是指上调LCAT基因的表达，从而抑制或防止肝癌细胞增殖、迁移或侵袭。

本发明中，人为干预手段可采用已知的手段，例如基因工程化手段。在下调LCAT基因表达的情况下，人为干预手段包括施加小分子抑制剂或基因工程化手段，其实例包括但不限于shRNA、siRNA、基因敲除、基因沉默等。在上调LCAT基因表达的情况下，人为干预手段包括将外源LCAT基因导入肝癌细胞内进行过表达，或在LCAT基因中引入增强子等的情况。

本发明，LCAT基因表达水平包括RNA水平和蛋白水平两个层次。本发明可以通过检测两个层次中的至少任意一个层次作为LCAT基因表达水平的基础。

[用于预测肝癌转移或复发的方法]

(1)利用试剂测量来自受试者的样品中LCAT基因表达水平获得测量值的步骤；

(2)将所述测量值与阈值比较的步骤；和

本发明中，样品是指来源于受试者的任何组织、细胞或其衍生物，其实例包括但不限于病发组织(特别是肝癌组织)、血液、血浆、血清、组织液等。

本发明中，测量值包括不仅以LCAT基因表达水平作为单指标的情况下获得的表达水平值，也包括以LCAT基因表达水平和其他指标组合情况下获得的分数值。在某些实施方案中，本发明的测量值为由LCAT基因表达水平、TNM分期和血清甲胎蛋白水平三个指标得到的分数值或称作预测转移风险值。在计算多指标的分数值时，可赋予各指标不同的权重值。在某一具体实施方案中，本发明的测量值通过列线图和网页计算器进行：(图5B、F网址为https://hcc-metastatic-risk.shinyapps.io/dynnomapp/)。

本发明中，阈值可以是一个具体的数值点，也可以是一个数值区间或范围。阈值通过大量肝癌转移临床数据统计获得。阈值可以是表示例如基因表达的绝对量的值，也可以是表示例如基因表达相对量的值。在某些实施方案中，本发明的阈值为由LCAT基因表达水平、TNM分期和血清甲胎蛋白水平三个指标得到的转移风险值，优选为0.5。

本发明中，用于测量来自受试者的样品中LCAT基因表达水平获得测量值的试剂可以是已知的试剂。例如可以是用于实时荧光PCR的试剂或免疫反应试剂。用于实时荧光PCR的试剂包括针对LCAT基因mRNA水平的引物和/或探针。其中只要引物和探针对于LCAT基因具有特异性，则不特别限定其序列，本领域技术人员可根据实际需要而自由设计。

本发明中，免疫试剂包括抗体或其修饰物、衍生物。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、纳米抗体、人源化抗体或者完全人类抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体修饰物包括化学修饰物以及抗体和其他材料的偶联物。其中，化学修饰物的实例包括但不限于抗体的乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、交联环化、二硫键化、脱甲基化、共价交联、半胱氨酸化、焦谷氨酸化、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解和磷酸化等。其中，偶联物的实例包括但不限于与纳米高分子材料、磁珠等的偶联物。

实施例

一、LCAT在高转移性的HCC组织中低表达

为了寻找可以用于预测HCC转移的分子标志物，我们从GEO数据库中下载了HCC芯片(GSE14520)的表达数据及临床资料(高转移风险患者107例，低转移风险患者114例及其配对正常肝组织)。为了能够用于早期HCC的转移预测，选取早期HCC患者，入组标准为：①小于5cm的单发性肿瘤；②BCLC分期为0或A；③TNM分期I期或II期；④肝功能较好且甲胎蛋白水平(<＝300ng/ml)较低。最终选取低转移风险患者肿瘤组织18例，高转移风险患者肿瘤组织11例以及非肿瘤肝组织11例。

利用R3.5.2软件提取在各组中表达变化最大的前1000个基因进行聚类分析，发现随着基因的连续变化，样本明显聚成三类(图1A)，用limma包比较高转移和非高转移样本，分析脂质代谢基因的差异，将条件设置为FDR<0.001，log2(FC)绝对值>2，以前在HCC转移中从未报道过的基因LCAT(图1B)被用于后续研究。

二、LCAT在HCC组织中低表达并可以用于预测患者的复发

1、实验材料来源及处理

HCC组织和非肿瘤肝组织来自解放军总医院第五医学中心病理中心，经病理诊断后收集中国人HCC患者(225例)、肝硬化患者(50例)及肝血管瘤患者(30例)的组织样本，所有样本均获得患者知情同意并遵照相关机构和国家的指导方针。将手术切除的组织样本切成两部分，一部分迅速用液氮冻存，用以提取RNA。另一部分经10％中性福尔马林溶液固定过夜，石蜡包埋切片，根据标准方案进行免疫组化分析。

2、临床组织中LCAT表达水平的检测

2.1蛋白质水平

通过免疫组织化学染色法检测6例HCC患者的HCC组织和配对癌旁肝组织样本中LCAT的蛋白表达水平，实验重复三次。将经10％福尔马林溶液固定、石蜡包埋并切片得到的5微米厚的HCC组织和非肿瘤肝组织样本切片进行免疫组织化学染色分析。

具体操作步骤如下：脱蜡，再水化，柠檬酸修复液(pH值6.0)高压锅中3分钟进行抗原修复。用3％过氧化氢处理10分钟，封闭内源性过氧化物酶活性，接着用正常山羊血清封闭30分钟。将LCAT抗体(Abcam公司，货号为ab109417)按1:150稀释后与样本切片在4℃下孵育过夜，洗去LCAT抗体，将辣根过氧化物酶标记的二抗体(北京中山金桥生物技术有限公司产品，货号为PV9000)稀释后与样本切片在室温下孵育30分钟。最后，样本切片经DAB(北京中山金桥生物技术有限公司产品，货号为ZLI-9018)染色观察。结果显示HCC组织中的LCAT表达水平明显低于配对正常肝组织(图1C)。

2.2RNA表达水平

通过实时定量RT-PCR方法检测30例肝血管瘤患者的正常肝组织、50例肝硬化组织及225例HCC患者(其中已发生转移的HCC患者8例，二次手术的复发患者6例)的HCC组织和非肿瘤肝组织中LCAT基因的RNA表达水平，实验重复三次。

用DNA/RNA/蛋白提取试剂盒(Qiagen产品，货号为80004)提取临床组织总RNA，并利用Ultrospec 5300分光光度计(GE公司)对RNA的量和纯度进行测定；用DNA酶I(NEB公司产品，货号为M0303S)从组织总RNA中除去基因组DNA，以2μg总RNA为模板用PrimerScriptTMMaster Mix(TaKaRa公司，货号为RR036A)合成cDNA第一链，利用ABI7500实时定量PCR仪进行扩增。检测LCAT基因的RNA表达水平的引物为：

5’-TGGCTCCTCAATGTGCTCTTCC-3’；

5’-AAGTCCTCTGTCTTGCGGTAGC-3’；

内参为β-actin，引物为：

5’-CTGGCACCACACCTTCTACAATGA-3’；

5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3’。

利用ABI7500实时定量PCR仪(ABI公司)检测LCAT基因的RNA表达水平的扩增条件为：95℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，共40个循环。

结果显示，与正常肝及肝硬化组织相比，LCAT在HCC组织中显著下调(图2A)；与无转移的HCC组织及非癌肝组织相比，LCAT mRNA表达水平在伴随肝外转移的HCC组织中表达量显著降低(图2B)。HCC组织中LCAT mRNA的表达量显著低于配对的癌旁肝组织(图2C)，且易复发的HCC组织及复发性的HCC中的表达量显著低于无复发HCC(图2D)，伴随着瘤体直径增加(图2E)和分化程度的降低(图2F)LCAT的表达显著降低，并且LCAT的降低不依赖于肝病背景(图2G)，表明HCC患者的癌组织中LCAT基因的mRNA在HCC中广谱性地低表达且与HCC的转移、复发呈负相关。

3、LCAT的表达水平与HCC患者的早期辅助诊断及复发预测

对于单个分子或诊断模型效能评价的方法为建立受试者工作特征(receiveroperating characteristic，ROC)曲线，通过计算曲线下面积(Area Under Curve)来判断诊断能力。我们利用临床HCC组织标本及配对正常肝组织中的LCAT mRNA的表达水平进而进行分析。结果显示，LCAT诊断甲胎蛋白阳性HCC(95例)的AUC为0.976，诊断甲胎蛋白阴性HCC(90例)的AUC为0.977(图3A)，在小于3cm的小HCC(78例)的诊断中AUC为0.9489(图3B)，表明LCAT在辅助诊断HCC特别是甲胎蛋白阴性的HCC患者及微小HCC具有较好的参考价值。

为了研究LCAT的表达水平与术后复发的关系，将TCGA数据库和GEO数据库(GSE14520)中的HCC的表达数据和生存数据进行下载，探索LCAT mRNA表达水平与患者无复发生存期之间的关系。依据LCAT基因的表达水平，将两个数据库中的HCC患者分为两组，即LCAT高表达组和LCAT低表达组，利用Kaplan-Meier及Log-rank检验研究LCAT高表达与低表达细胞癌患者之间无复发生存时间的差异。两组数据均显示：LCAT低表达患者无复发生存时间显著短于LCAT高表达患者(图3C、D)。结果表明，LCAT mRNA表达水平可以用于HCC患者的术后复发预测。

三、LCAT调控肝癌细胞系的增殖、迁移与侵袭

1、材料准备

低转移HCC细胞系HepG2、高转移HCC细胞系Huh-7及慢病毒包装细胞系293FT均购于中科院上海细胞库，转染试剂Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent购自Invitrogen公司，MEM和DMEM培养基及胎牛血清购自GIBCO公司，Transwell小室购自Costar公司(货号：3422)，Matrigel胶购自CORNING公司(货号：356234)；shRNA敲降载体pGIPZ及CRISPR/Cas9三质粒激活系统lenti-sgRNA(MS2)-EF1A，lenti-dCAS-VP64与lenti-MS2-P65-HSF1均购自addgene公司；用于载体构建的内切酶，T4连接酶及高保真PCR聚合酶购自NEB公司。敲降载体通用引物为：

5’-CGCGGATCCATATCCCTTATCCTCTGGCTGCTGGAGGCTTGCTGAAG GCTGTATGCTG-3’和

5’-ACGGAATTCATATCCCTTATCCTCTGGCTGCTGGAGGCTTGCTGAAG GCTGTATGCTG-3’

用于敲降LCAT的shRNA寡核苷酸序列为：5’-TGCTGAAGGCTGTATGCTGTCCAGTTCACCACATCTGGTTGTTTTGG CCACTGACTGAC-3’和

5’-AGTAACAGGCCTTGTGTCCTGTCCAGTTCACCATCTGGTTGTCAGT CAGTGGCCAAAAC-3’，

用于激活LCAT表达sgRNA引物序列为：

5’-CACCGCCTGAGGCTGTGCCCCTTTC-3’，和5’-AAACGAAAGGGGCACAGCCTCAGGC-3’。

2、质粒构建

(1)pGIPZ敲降载体的构建

1)shRNA表达原件的构建

5μL上游通用引物(10μM)

5μL下游通用引物(10μM)

10μL敲降寡核苷酸序列(各100μM)

50μL 2x PCR MIX

加H₂O至100μl，PCR仪扩增35个循环，胶回收，测浓度。

2)shRNA表达原件及pGIPZ质粒酶切

2μg pGIPZ/shRNA表达原件

1μL EcoRI

1μL BamHI

2μL 10x buffer

加H₂O定容至20μL，金属浴37℃酶切过夜，胶回收。

3)连接

1μL T4 DNA连接酶

1μL 10x DNA连接buffer

2μL酶切后的pGIPZ

6μL酶切后的shRNA表达原件

室温连接4-6小时，转化，挑克隆，摇菌，测序，质粒去内毒素抽提备(2)Cas9激活质粒的构建

1)引物退火形成双链

1μL上游引物(100μM)

1μL下游引物(100μM)

8μL H₂OPCR仪95℃5min，缓慢降温至室温1小时，1:200稀释退火产物。

2)质粒酶切

2μg lenti-sgRNA(MS2)-EF1A

1μL BsmBI

2μL 10x buffer

加H₂O定容至20μL，金属浴37℃酶切过夜，胶回收。

3)连接

1μL T4 DNA连接酶

1μL 10x DNA连接buffer

2μL酶切后的lenti-sgRNA(MS2)-EF1A

6μL退火引物产物

室温连接4-6小时，转化，挑克隆，摇菌，测序，质粒去内毒素抽提备用。

3、慢病毒包装

(1)将生长旺盛的293FT细胞接种至10cm培养皿中。当细胞长至60-80％汇合度时换新鲜的DMEM培养液8ml，换液1-4h后开始进行转染。

(2)将质粒取出解冻，并按照下面的体系进行混合(单个10cm培养皿293FT细胞的用量)

慢病毒表达载体 10μg

psPAX2 6μg

pMD2.G 4μg

(3)将混合的质粒用无血清的DMEM培养液稀释至400μl，混匀备用。

(4)将30μl转染试剂用无血清的DMEM培养液稀释至400μl，混合均匀，室温放置5min。

(5)将稀释好的转染试剂和稀释好的质粒加在一起成为转染工作液，轻轻混匀，室温放置15min。

(6)将转染工作液再次轻轻混匀，逐滴加入细胞培养皿中，轻轻混匀培养液。

(7)转染后36h收集培养皿中的培养液，并换入8ml新鲜DMEM培养液，将收集的培养液放入4℃冰箱密封保存。

(8)换液36h后再次收集培养皿中的培养液，将此次收集的培养液与上次收集的培养液混匀，分装后保存于-80℃或直接用于感染细胞。

3、病毒感染

将生长至40-50％汇合度的HepG2及Huh-7细胞系培养液弃去，将新鲜的培养液与病毒液按1:1混合均匀后加入培养皿中，24小时后换新鲜培养液，在培养48h后用含抗生素的培养液进行为期两周的药物筛选，筛选后的细胞用于后续实验。筛选后的细胞抽提细胞总RNA，逆转录成cDNA，实时定量PCR检测LCAT的改变。

结果显示：与对照组相比HepG2感染LCAT shRNA敲降载体后表达下降了近95％；Huh-7感染LCAT CRISPR/Cas9激活载体后表达量增加了近40倍。以上结果表明，细胞系感染慢病毒包装的敲降载体及激活载体后可以高效地下调和上调LCAT的表达，结果可靠可以用于进行后续实验。

4、LCAT对肝癌细胞系生长的影响

采用细胞克隆形成的方法检测LCAT对肝癌细胞系生长和生存的影响，将抗生素筛选后的HepG2及Huh-7细胞胰酶消化、细胞计数仪计数后接种于6孔板中，每孔接种3000个细胞，隔天换液，培养10天后将培养液弃去，用4％多聚甲醛固定5min，PBS洗三次，0.1％结晶紫染色10分钟，PBS洗三次后拍照计数。

采用细胞克隆形成实验检测LCAT对细胞体外生长的影响，结果表明在HepG2细胞中抑制LCAT的表达显著促进细胞的生长(图4A)，而在Huh-7细胞中激活LCAT的表达后能够抑制细胞的生长与生存(图4B)。

5、LCAT对肝癌细胞系迁移及侵袭能力的影响

将血清饥饿的稳定转染细胞株用胰酶消化后PBS洗3次，细胞计数仪计数将细胞浓度调制5x10⁵/mL，接种于24孔Transwell小室中，每孔的细胞量为150μl，对于侵袭实验，小室中预先加入50μl BD Matrigel胶，下室加入800μl含10％胎牛血清的培养液，置于培养相中培养36h，将小室中的液体吸去并用棉棒轻轻擦干，用4％多聚甲醛固定5min，PBS洗三次，0.1％结晶紫染色10分钟，PBS洗三次后拍照计数。

结果表明在HepG2细胞中抑制LCAT的表达显著促进细胞的迁移和侵袭能力(图4A)，而在Huh-7细胞中激活LCAT的表达后能够显著抑制细胞的迁移与侵袭能力(图4B)。

四、LCAT单分子或联合临床指标预测HCC转移效能的评估

鉴于LCAT与HCC转移的临床相关性以及对肝癌细胞系迁移、侵袭的调控作用，我们进一步研究了LCAT单个分子或联合临床指标预测HCC转移的可能性。我们从GEO数据库中下载HCC(GSE14520)表达数据和相关临床数据，获得数据集(包括107例高转移HCC患者和114例低转移患者)，进而进行转移预测效能的分析并且与病理诊断中常用的转移标志物及发表论文中潜在标志物进行比较，ROC曲线显示，LCAT预测HCC转移的AUC为0.728，优于其他标志物(见图5A)，表明LCAT在预测HCC转移方面具有较好的参考价值。

多因素logistic分析表明LCAT是一个不依赖于临床指标的转移独立风险因素，利用R3.5.3结合LCAT、TNM分期及血清甲胎蛋白水平进行逻辑回归建模，为了防止模型过度拟合，我们采用留一交叉验证的方式进行建模。同时为了简单直观的计算病人的转移风险利用rms包构建了预测转移风险的列线图(图5B)。ROC曲线表明，模型对HCC转移具有较高的预测效能(AUC＝0.787)(图5C)，利用重抽样的方式对该模型的诊断效能进行验证，依然得到很高的诊断效能(AUC＝0.777)，随后我们利用校准曲线检测了该模型的精确度，结果显示预测结果与实际情况高度吻合(图5D)。利用rmda包进行决策曲线分析，结果表明预测转移风险位于16％-81％这个区间时采取预防性治疗在临床上取得的净获益大于将术后患者全部采取预防性治疗或全部不采取预防性治疗取得的净获益(图5E)，表明我们的联合诊断模型能够很好的用于HCC术后转移风险的评估和预测并且在临床上是有效的。最后，为了便于临床应用我们开发了网页计算器(图5F，网址为：https://hcc-metastatic- risk.shinyapps.io/dynnomapp/)，辅助医生快速准确地制定临床策略。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims

1.一种用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法，其特征在于，包括改变肝癌细胞内卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因表达水平的步骤。

2.根据权利要求1所述的用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法，其特征在于，所述调控为抑制肝癌细胞的增殖、迁移或侵袭，所述改变为增强卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因的表达水平。

3.根据权利要求1所述的用于在体外调控肝癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法，其特征在于，所述卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因表达水平包括RNA表达水平或蛋白表达水平。

4.一种用于预测肝癌转移或复发的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将所述测量值与阈值比较的步骤；和

5.根据权利要求4所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，其特征在于，所述样品为肝癌组织，所述阈值为mRNA表达水平，且为(LCAT/ATCB 0.165)。

6.根据权利要求4所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，其特征在于，所述受试者为甲胎蛋白阴性受试者。

7.根据权利要求4所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，其特征在于，所述试剂包括用于检测卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因mRNA水平的引物和/或探针，或抗卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶抗体。

8.根据权利要求4所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，其特征在于，所述测量值通过来自受试者的样品中卵磷脂-胆甾醇乙酰转移酶基因表达水平、TNM分期和血清甲胎蛋白水平来确定。

9.根据权利要求8所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，其特征在于，测量值的计算通过列线图和网页计算器进行。

10.根据权利要求4所述的用于预测肝癌转移或复发的方法，其特征在于，所述受试者为病毒相关肝癌或非感染性肝癌患者。