CN110121563A - 在边合成边测序中作为成像试剂的光保护混合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及如本发明所述的方法、组合物、装置、系统和试剂盒，其包含，但不限于，用于使用例如通过边合成边测序方法来确定核苷酸序列中核酸的身份的试剂和混合物。特别地，本发明提供了化合物的光保护混合物作为成像试剂以提高包括但不限于带有荧光标记物的核苷酸的荧光化合物的稳定性和储存的用途。

Description

在边合成边测序中作为成像试剂的光保护混合物

技术领域

本发明涉及如本发明所述的方法、组合物、装置、系统和试剂盒，其包含，但不限于，用于使用例如通过边合成边测序方法来确定核苷酸序列中核酸的身份的试剂和混合物。具体地，本发明提供了化合物的光保护混合物作为成像试剂以提高包括但不限于带有荧光标记物的核苷酸的荧光化合物的稳定性和储存的用途。

背景技术

在过去25年中，已经产生并保存在Genbank中的DNA序列信息的量呈指数性增长。传统的测序方法(例如，如Sanger测序)正在被下一代测序技术替代，该下一代测序技术使用边合成边测序(SBS)的形式，其中使用专门设计的核苷酸和DNA聚合酶以受控的方式来读取芯片结合的单链DNA模板的序列。为了获得高通量，几百万个这样的模板斑点在测序芯片上组成阵列，它们的序列单独地被读出并记录。

使用阵列进行DNA测序的系统是已知的(例如，Ju等人，美国专利号6,664,079)。然而，对于提高利用自动化测序对核酸序列进行测序的效率和/或试剂稳定性的方法和组合物一直存在着需求。

发明内容

本发明涉及如本发明所述的方法、组合物、装置、系统和试剂盒，其包含，但不限于，用于使用例如通过边合成边测序方法来确定核苷酸序列中核酸的身份的试剂和混合物。具体地，本发明提供了化合物的光保护试剂混合物作为成像试剂以提高包括但不限于带有荧光标记物的核苷酸的荧光化合物的稳定性和储存的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了化合物的光保护混合物(例如，鸡尾酒)，其在边合成边测序(SBS)中核苷酸掺入后的荧光团检测步骤期间作为成像试剂。在一个实施方案中，所述光保护混合物包含至少一种有效的抗氧化剂，诸如，但不限于，2,5-二羟基苯甲酸(龙胆酸(gentisic acid))；3,4-二羟基苯甲酸(原儿茶酸)或3,4-二羟基苯甲酸乙酯(原儿茶酸乙酯)，至少一种荧光猝灭抑制剂，诸如，但不限于，6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸(奎诺二甲基丙烯酸酯(trolox))，和至少一种自由基清除剂，诸如，但不限于，肉毒碱。

在一个实施方案中，本发明涉及一种掺入标记的核苷酸的方法，包括：a)提供：i)多种核酸引物和模板分子，ii)聚合酶，iii)成像试剂，所述成像试剂包含化合物的光保护混合物，和iv)多种核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物的至少一部分用标记物标记，所述标记物通过可裂解接头连接到碱基；b)将所述引物的至少一部分与所述模板分子的至少一部分杂交(例如，在高严格性条件下)，以产生杂交的引物；c)利用所述聚合酶将第一标记的核苷酸类似物掺入至所述杂交的引物的至少一部分中，以产生包含掺入的标记的核苷酸类似物的延伸引物；和d)在所述成像试剂的存在下将所述掺入的标记的核苷酸类似物成像。在一个实施方案中，所述成像试剂包含荧光猝灭抑制剂。在一个实施方案中，所述荧光猝灭抑制剂是奎诺二甲基丙烯酸酯。在一个实施方案中，所述光保护混合物包含至少一种抗氧化剂、至少一种猝灭抑制剂和至少一种自由基清除化合物。在一个实施方案中，所述抗氧化剂选自由下列各项组成的组：2,5-二羟基苯甲酸、原儿茶酸和原儿茶酸乙酯。在一个实施方案中，所述自由基清除化合物是肉毒碱。在一个实施方案中，所述方法进一步包括：e)利用所述聚合酶将第二核苷酸类似物掺入到所述延伸引物的至少一部分中。在一个实施方案中，所述标记是荧光标记物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种成像试剂，其包含至少一种抗氧化剂、至少一种荧光猝灭抑制剂和缓冲剂。在一个实施方案中，所述抗氧化剂包括选自由下列各项组成的组的化合物：2,5-二羟基苯甲酸、原儿茶酸和原儿茶酸乙酯。在一个实施方案中，所述成像试剂进一步包含自由基清除剂。在一个实施方案中，所述自由基清除剂是肉毒碱。在一个实施方案中，所述荧光猝灭抑制剂是奎诺二甲基丙烯酸酯。在一个实施方案中，所述缓冲剂是TRIS缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是HEPES缓冲剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括：i)第一容器，所述第一容器包含成像试剂，所述成像试剂包含至少一种抗氧化剂、至少一种荧光猝灭抑制剂和缓冲剂，和ii)第二容器，所述第二容器包含多种核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物的至少一部分用标记物标记，所述标记物通过可裂解接头连接到碱基。在一个实施方案中，所述成像试剂进一步包含自由基清除剂。在一个实施方案中，所述自由基清除剂是肉毒碱。在一个实施方案中，所述荧光猝灭抑制剂是奎诺二甲基丙烯酸酯。在一个实施方案中，所述缓冲剂是TRIS缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是HEPES缓冲剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种系统，所述体系包含：杂交到模板上的引物的溶液，所述溶液包含与可裂解的标记物连接的多种核苷酸类似物；和成像试剂，所述成像试剂包含至少一种抗氧化剂、至少一种荧光猝灭抑制剂和缓冲剂。在一个实施方案中，所述杂交的引物和所述模板被固定。在一个实施方案中，所述杂交的引物和所述模板在流动室中。在一个实施方案中，所述成像试剂进一步包含自由基清除剂。在一个实施方案中，所述自由基清除剂是肉毒碱。在一个实施方案中，所述荧光猝灭抑制剂是奎诺二甲基丙烯酸酯。在一个实施方案中，所述缓冲剂是TRIS缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是HEPES缓冲剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种成像试剂，其包含：i)TRIS HCl缓冲剂；ii)浓度范围为约5-50mM的肉毒碱；iii)浓度范围为约5-15mM的奎诺二甲基丙烯酸酯；iv)浓度范围为约10-50mM的2,5二羟基苯甲酸；和v)浓度范围为约10-20mM的3,4-二羟基苯甲酸乙酯。

定义

为了有助于理解本发明，下面对一些术语进行了定义。本文定义的术语具有本发明所属领域中普通技术人员所普遍理解的含义。术语诸如“一个”、“一种”和“这个/这种”不意在是指仅单一实体，而是还指多个实体，并且也包括其具体实例可以用于说明的一般类型。本文的术语用来描述本发明的具体实施方案，但其使用并非限制本发明，除了在权利要求中所概括的以外。

术语“约”当用于本文时，在任一种任意的测定测量值的情况下，均是指给定测量值的+/-5％。

术语“成像试剂”当用于本文时，是指能够增强标记发射强度和/或将荧光团检测提高至少一个数量级的化合物的混合物。虽然不意在将本发明限制于任何特定的机制，但相信本文所述的混合物增强信噪比，或减少光漂白和/或荧光团“闪烁”。可用于成像试剂中的一类化合物是荧光猝灭抑制剂。

术语“荧光猝灭抑制剂”当用于本文时，是指提高荧光标记的信号质量的一类化合物。不受任何机制的约束，相信此类化合物通过与通过非特异性光漂白现象导致荧光信号猝灭的氧化化合物反应而起作用。例如，一种此类化合物是奎诺二甲基丙烯酸酯(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸)。

术语“混合物”或“鸡尾酒”当用于本文时可互换，指一起形成成像试剂用于检测核苷酸序列内的标记的核苷酸类似物的目的的多种化合物(通常在溶液中，诸如缓冲溶液)。

术语“光保护”当用于本文时是指增强荧光化合物的稳定性和储存保存期的成像试剂混合物或鸡尾酒的最终结果。不受理论约束，相信它们通过保护免于下列作用而起作用：i)核苷酸荧光标记物的光漂白；ii)信号猝灭；和iii)辐射诱发的DNA光损伤和光致断裂。

术语“抗氧化化合物”当用于本文时是指抑制可以产生自由基的化学反应的分子。例如，除了某些酶(过氧化氢酶和超氧化物歧化酶)以外，许多维生素(例如，维生素E和维生素C)是天然存在的抗氧化剂。其他化学物质也具有这些特性，包括，但不限于，2,5-二羟基苯甲酸、原儿茶酸和/或原儿茶酸乙酯。

术语“自由基清除化合物”当用于本文时是指将杂质和不期望的反应产物(例如氧)移除或失活的分子。虽然自由基清除化合物具有抗氧化的最终结果，但相信它们通过与抗氧化化合物不同的机制发挥作用。例如，一种此类自由基清除化合物包括，但不限于，生育酚、肉毒碱和/或柚苷配基。虽然如此，已知一些自由基清除化合物具有其他生物化学活性，例如，抗氧化活性和单线态氧猝灭。

术语“缓冲剂”当用于本文时是指碱性盐和氢交换化合物(弱酸或弱碱)的混合物，所述混合物可以在宽范围的环境条件(例如，温度、盐分)下维持稳定的pH水平，包括氢离子浓度的变化。例如，此类缓冲剂可以包括，但不限于4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)缓冲剂和/或三(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)缓冲剂。

术语“接头”当用于本文时是指能够连接容易被裂解的标记和/或化学部分的任何分子(或分子集合体)。在一个实施方案中，接头的裂解可以产生有毒的自由基产物。例如，接头可以包括，但不限于二硫化物接头和/或叠氮化物接头。

术语“连接的”当用于本文时是指第一分子(例如，核酸)和第二分子(例如，标记分子)之间的相互作用。连接作用可以是可逆的或不可逆的。此类连接作用包括，但不限于，共价键合、离子键合、范德华力或摩擦力等。

“核酸序列”和“核苷酸序列”当用于本文时是指寡核苷酸或多核苷酸，及其片段或部分，并且指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链的或双链的，并且代表有义链或反义链。此类核酸可以包括，但不限于，cDNA、mRNA或其他核酸序列。

术语“分离的核酸”当用于本文时是指已经从其天然状态移出的任何核酸分子(例如，从细胞移出，且在优选的实施方案中，不含其他基因组核酸)。

在一些实施方案中，本发明涉及将核酸杂交在一起。这需要一定程度的互补性。当用于本文时，术语“互补的”或“互补性”关于通过碱基配对原则相关联的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(其是可互换的术语，指核苷酸的序列)使用。例如，序列“C-A-G-T”与序列“G-T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”或“全部的”。“部分的”互补性是其中一个或多个核酸碱基不根据碱基配对原则匹配的情况。核酸之间的“全部的”或“完全的”互补性是每一个核酸碱基都与另一个碱基根据碱基配对原则匹配的情况。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。

术语“同源性”和“同源的”当在本文中关于核苷酸序列使用时是指与其他核苷酸序列的互补性程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。与核酸序列部分互补的，即，“基本上同源的”核苷酸序列是至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸序列杂交的序列。对完全互补序列与靶序列的杂交的抑制可以使用在低严格性条件下的杂交测定(Southern或Northern印迹、溶液杂交等)来检验。基本上同源的序列或探针将竞争和抑制完全同源序列与靶序列在低严格性条件下的结合(即，杂交)。这并不是说低严格性的条件是允许非特异性结合的条件；低严格性条件要求两条序列彼此的结合是特异性的(即，选择性的)相互作用。可以通过使用甚至缺少部分程度的互补性(例如，小于约30％同一性)的第二靶标来测试非特异性结合的不存在；在缺少非特异性结合的情况下，探针将不与第二个不互补的靶标杂交。

低严格性条件包括相当于下述的条件：当采用长度为约500个核苷酸的探针时，在42℃在由5x SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调整至7.4)、0.1％SDS、5x Denhardt试剂{50x Denhardt每500ml含有:5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)}和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交，接着在42℃在包含5x SSPE、0.1％SDS的溶液中冲洗。还可以采用大量的等效的条件来包含低严格性条件；可以改变诸如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定等)以及盐和其他组分的浓度(例如，存在或缺少甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)以及杂交溶液的组分的因素，以产生不同于但等效于上面所列举的条件的低严格性杂交条件。另外，也可使用促进在高严格性条件下的杂交的条件(例如，增加杂交的温度和/或洗涤步骤，在杂交溶液中使用甲酰胺等)。

如本文所用，术语“杂交”关于互补核酸的配对来使用，所述配对使用其中核酸的链与互补链通过碱基配对连接在一起以形成杂交复合体的任何过程来进行。杂交和杂交的强度(即，核酸之间缔合的强度)受诸如下列的因素影响：核酸之间的互补性程度、涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm以及核酸内的G:C比。

如本文所用，术语“杂交复合体”是指两条核酸序列之间借助于互补的G和C碱基以及互补的A和T碱基之间形成氢键所形成的复合体；这些氢键可以进一步通过碱基堆积相互作用稳定化。两条互补的核酸序列以反向平行的构型氢键键合。杂交复合体可以在溶液中(例如，C0 t或R0 t分析)形成或在存在于溶液中的一条核酸序列和被固定在固相载体(例如，在Southern和Northern印迹、点印迹中所采用的尼龙膜或硝酸纤维素滤膜，或在原位杂交(包括FISH(荧光原位杂交))中所采用的载玻片)上的另一条核酸序列之间形成。

如本文所用，术语“Tm”用于指“解链温度”。解链温度是大量双链核酸分子中有一半解离成单链时的温度。如标准参考文献所示，当核酸处于1M NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估计值可以通过下面的等式来计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)。Anderson等人，“Quantitative Filter Hybridization”于:Nucleic Acid Hybridization(1985)。对于Tm的计算，更复杂的计算考虑结构特征以及序列特征。

如本文所用，术语“严格性”关于进行核酸杂交所采用的温度、离子强度以及其他化合物诸如有机溶剂的存在的条件来使用。“严格性”典型地在约Tm至低于Tm约20℃至25℃的范围内发生。“严格的杂交”可以用来鉴定或检测相同的多核苷酸序列或鉴定或检测相似的或相关联的多核苷酸序列。例如，当在严格条件下在杂交反应中采用片段时，促进含有独特序列(即，是非同源的区域或含有小于约50％同源性或互补性的区域)的片段的杂交。可选地，当使用“弱”或“低”严格性条件时，利用源自遗传上多样的生物体(即，例如，在此类生物体之间互补序列的频率通常很低)的核酸可以发生杂交。

如本文所用，术语“可扩增的核酸”用于指可以通过任意扩增方法扩增的核酸。设想“可扩增的核酸”通常包括“样品模板”。

如本文所用，术语“样品模板”或(更简单地)“模板”是指来源于被分析目的靶序列的存在的样品的核酸。相反，“背景模板”用于指不同于样品模板的核酸，其可以存在于样品中或可以不存在于样品中。背景模板大部分经常是无意中产生的。其可以是遗留物的结果，或者其可以是由于寻求从样品中被纯化掉的核酸污染物的存在引起的。例如，来自不同于要被检测的那些生物体的生物体的核酸可以在测试样品中作为背景存在。

“扩增”被定义为产生额外拷贝的核酸序列并通常使用聚合酶链式反应执行。Dieffenbach C.W.和G.S.Dveksler(1995)于:PCR Primer，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，Plainview，N.Y。

如本文所用，术语“聚合酶链式反应”("PCR")是指K.B.Mullis的美国专利号4,683,195和4,683,202的方法，上述专利通过引用并入本文中，上述专利记载了在不需要克隆或纯化的情况下增加基因组DNA混合物中靶序列的节段的浓度的方法。所需靶序列的扩增节段的长度通过两个寡核苷酸引物关于彼此的相对位置来确定，并且因此，此长度是可控的参数。由于该方法的复制方面，该方法称作“聚合酶链式反应”(下文称为“PCR”)。因为靶序列的所需扩增节段成为混合物中占优势的序列(就浓度而言)，它们被认为是“PCR扩增的”。利用PCR，能够将基因组DNA中单一拷贝的特定靶序列通过几种不同的方法(例如，与标记的探针杂交；掺入生物素化的引物，接着通过抗生物素蛋白-酶缀合检测；将32P-标记的脱氧核苷酸三磷酸(诸如dCTP或dATP)掺入到扩增的节段)扩增到可检测到的水平。除了基因组DNA以外，任意的寡核苷酸序列可以利用适当组的引物分子来扩增。具体地，通过PCR方法本身形成的扩增节段本身是用于后续PCR扩增的有效模板。

如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸，无论是天然存在于纯化的限制性消化产物中还是合成制备的，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成(即，在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶的存在下并在合适的温度和pH下)的条件时其能够充当合成的起始点。引物优选是单链的从而在扩增中实现最大效率，但可以可选地是双链的。如果是双链，则引物在被用于制备延伸产物之前首先被处理从而使其链分开。优选地，引物是寡聚脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长从而在诱导剂的存在下引起延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。

如本文所用，术语“探针”是指寡核苷酸(即，核苷酸的序列)，无论是天然存在于纯化的限制性消化产物中还是通过合成、通过重组或通过PCR扩增制备，其能够与另一目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链的或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。设想本发明中使用的任意探针将利用任意的“报告分子”标记使得在任意检测系统中可检测到，所述检测系统包括，但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定法)、荧光、放射性和发光系统。本发明并不意在限于任何特定的检测系统或标记物。

术语“标记物”或“可检测的标记物”当在本文中使用时是指可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测到的任何组合物。这样的标记物包括用于利用标记的链霉抗生物素蛋白缀合物染色的生物素、磁珠(例如，)、荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物、碱性磷酸酶和在ELISA中普遍使用的其他酶)和比色标记物诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠子。教导此类标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241(全部均通过引用并入本文)。

在优选的实施方案中，标记物典型地为荧光标记物且连接到核苷酸的碱基。对于胞嘧啶和胸腺嘧啶，连接通常连接至5-位。对于其他碱基，形成脱氮衍生物并且标记物连接到脱氮-腺嘌呤或脱氮-鸟嘌呤的7-位。

本发明中设想的标记物可以通过许多方法检测。例如，放射性标记物可以使用摄影胶片或闪烁计数器检测，荧光标志物可以使用光检测器检测发射光来检测。酶标记物典型地通过向酶提供底物并检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，且比色标记物通过简单地看到有色标记物来检测。

术语“发光”和/或“荧光”当在本文中使用时是指任何从物体、化学物品和/或化合物发射电磁辐射(光)的过程。发光和/或荧光来自于从激发态“驰豫”到较低态并相应的释放光子形式的能量的体系。这些态可以是电子态、电子振动态、旋转态或三种态中的任意组合。引起发光的跃迁可以通过以化学方式释放体系中储存的能量或从外来来源向体系加入能量来刺激。能量的外来来源可以是多种类型，包括，但不限于，化学、热、电、磁、电磁、物理或任何其他能够使体系被激发成高于基态的态的类型。例如，系统可以通过吸收光的光子，通过被置于电场中，或通过化学氧化-还原反应来激发。在发光期间发射的光子的能量可以在低能量微波辐射到高能量x-射线辐射的范围内。典型地，发光是指在UV辐射至IR辐射范围内的光子。

附图说明

图1呈现了常规成像缓冲剂构造和光保护缓冲剂构造之间的比较工作流程。

图1A:用于常规成像缓冲剂试剂盒构造的示例性工作流程。

图1B:包含新的和改进的裂解和成像缓冲剂耗材的光保护成像缓冲剂试剂盒构造。

图2呈现了示例性的数据，其显示了在常规成像缓冲剂和光保护成像缓冲剂7B之间SBS度量是相当的。

图3呈现了示例性的数据，其显示了每个SBS运行轮次后在常规成像缓冲剂和光保护成像缓冲剂7B之间可比较的测序读取长度分布。

图3A:运行轮次8.3

图3B：运行轮次8.5

图3C：运行轮次8.6

图3D:运行轮次8.41(重测)

图4呈现了示例性数据，其显示每个SBS运行轮次后在常规成像缓冲剂和光保护成像缓冲剂7B之间的原始错误点迹。

图4A:运行轮次8.3

图4B:运行轮次8.5

图4C:运行轮次8.6

图4D:运行轮次8.41(重测)

图5呈现了示例性数据，其显示了在常规成像缓冲剂(IB_基线)和光保护成像缓冲剂SC-P version 9的三种(3)形式之间的平均读取长度数据比较。

图6呈现了示例性数据，其显示了在常规成像缓冲剂(IB_基线)和光保护成像缓冲剂SC-P version 9的三种(3)形式之间的原始错误点迹数据比较。

图6A:光保护成像缓冲剂SC-P 9。

图6B:光保护成像缓冲剂SC-P 9B。

图6C:光保护成像缓冲剂SC-P 9C。

图7呈现了示例性数据，其显示了成像缓冲剂中较低的离子和芳香族化合物浓度对核苷酸信号驻留的影响。

图8呈现了示例性数据，其显示使用SC-P9C成像试剂与基线IB相比在测序运行轮次中的原始错误率。

图9呈现了示例性数据，其显示使用利用HEPES缓冲剂或TRIS缓冲剂配成的SC-P9C成像试剂与基线IB相比在测序运行轮次中的原始错误率。

图9A:使用HEPES缓冲剂的结果。

图9B:使用TRIS缓冲剂的结果。

图10呈现了示例性数据，其显示在101x基因集(蓝色)和BRCA基因集(红色)两者中肉毒碱浓度对MFST数据输出的影响。

图11呈现了示例性数据，其显示在101x基因集(蓝色)和BRCA基因集(红色)两者中肉毒碱浓度对百分比完美参数的影响。

图12呈现了示例性数据，其显示在101x基因集(蓝色)和BRCA基因集(红色)两者中肉毒碱浓度对平均读取长度的影响。

图13呈现了示例性数据，其显示在101x基因集(蓝色)和BRCA基因集(红色)两者中肉毒碱浓度对百分比错误率的影响。

图14呈现了示例性数据，其显示在101x基因集(蓝色)和BRCA基因集(红色)两者中肉毒碱浓度对原始错误率的影响。

图14A:SC-9 IB和SC9B IB与参照IB相比。

图14B:SC-9D IB与参照IB相比。

图15呈现了示例性数据，其显示在101x基因集(蓝色)和BRCA基因集(红色)两者中肉毒碱浓度对读取长度分布的影响。

图15A:SC-9 IB和SC9B IB与参照IB相比。

图15B:SC-9D IB与参照IB相比。

图16呈现了示例性数据，其显示在101x基因集(蓝色)和BRCA基因集(红色)两者中肉毒碱浓度对核苷酸信号驻留的影响。

具体实施方式

本发明涉及如本发明所述的方法、组合物、装置、系统和试剂盒，其包含，不限于，用于使用例如通过边合成边测序方法来确定核苷酸序列中核酸的身份的试剂和混合物。具体地，本发明提供了化合物的光保护混合物作为成像试剂以提高包括但不限于带有荧光标记物的核苷酸的荧光化合物的稳定性和储存的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了包含光保护混合物的组合物，其在边合成边测序(SBS)期间作为成像试剂。在一个实施方案中，方法包括在荧光团检测步骤期间发生成像。在一个实施方案中，方法包括在掺入核苷酸后发生成像。在一个实施方案中，光保护混合物包括诸如但不限于下列的化合物：肉毒碱；6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸(奎诺二甲基丙烯酸酯)；2,5-二羟基苯甲酸(龙胆酸)；3,4-二羟基苯甲酸(原儿茶酸)；3,4-二羟基苯甲酸乙酯(原儿茶酸乙酯)、4-羟基肉桂酸、3,4-二羟基苯丙烯酸、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、硫辛酸和/或乙酰基-肉毒碱。

在一个实施方案中，本发明提供了测序150bp读取长度的方法。还提供了包括但不限于下列的其他显著的附加益处：改良的制造、储存和质量控制过程；通过用户友好的试剂盒构想和工作流程提高了可用性；由于递送单一组分溶液，不需要通过新一代测序平台流体学混合各个组分，因此提高了设备可靠性。

I.边合成边测序(SBS)

在一个实施方案中，本发明提供了通过自动化边合成边测序仪器(例如，新一代测序平台)执行的一系列方法步骤。参见美国专利号9,145,589，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，所述仪器包括大量的试剂容器。每个试剂容器具有分配在所述容器内的特异性反应试剂以支持SBS过程，例如：

在一个实施方案中，SBS方法包括在不同的工作站进行不同的步骤。作为实例，每个工作站与特定的步骤相关联。不限于特定的定式，用于这些步骤和相关联的试剂的一些实施例显示如下：

1)延伸A试剂：包含可逆的末端标记的核苷酸和聚合酶。延伸A的一种组成可以为如下的组成：

2)延伸B试剂：包含可逆的末端未标记的核苷酸和聚合酶，但缺少标记的核苷酸类似物。延伸B的一种组成可以为如下的组成：

3)洗涤溶液1，含有洗涤剂(例如，聚山梨醇酯20)柠檬酸盐缓冲剂(例如，盐水)

4)裂解试剂：一种裂解溶液组成可以为如下的组成：

5)洗涤溶液2，含有洗涤剂(例如，聚山梨醇酯20)三(羟基甲基)-氨基甲烷(Tris)缓冲剂。

II.常规的成像溶液

目前用作成像试剂的一种酶制剂(IB)包含四种组分。这四种组分包括HEPES缓冲剂、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和奎诺二甲基丙烯酸酯，并且在支持SBS方法之前需要混合在一起形成两种单独的溶液。这两种溶液在整个测序过程中保持分开，以防止葡萄糖氧化酶和葡萄糖过早地与氧反应导致酶体系的降解和H₂O₂的清除。这两种最终溶液在SBS期间在每一成像步骤通过混合阀混合然后引入至流动室。这种类型的成像方法步骤的使用，尽管是有效的，但在几个方面提出了挑战，包括，但不限于：i)制造过程的稳定性；ii)由于结构复杂的外切/内切规格范式而要保持质量控制；iii)由于复杂的试剂盒构造和工作流程导致的使用困难；iv)由于混合阀的可靠性问题而导致的由于递送体积失效模式所引起的有限的设备可靠性。如本文所见，常规的或基线成像试剂(IB)用于本发明公开的光保护混合物成像试剂的各个实施方案的性能测试基准。

III.光保护成像溶液

在一个实施方案中，用于SBS方法的有效的成像溶液和缓冲剂制剂包含确保曝光期间的光保护作用的分子组分。不受理论约束，相信它们防止三种主要现象：i)核苷酸荧光标记物的光漂白；ii)信号猝灭；iii)辐射诱发的DNA光损伤和光致断裂。成像溶液可以被配制成酶体系或混合物，其包含多种化学物质混合物，诸如包含，但不限于，分子氧“池”、抗氧化剂/自由基清除剂和单线态氧猝灭剂的混合物。这些混合物中的一些组分还提供在长期保存时针对成像溶液氧化应激和降解的额外保护作用。

尽管不需要理解本发明的机制，但相信“混合物”或“鸡尾酒”方式最适合用于配制长保存期的成像溶液，因为其最好地支持了各种各样的与产品设计稳固性相关的功能方面，其范围从功能性能和制剂稳定性到工艺性、可用性和保存。

在一个实施方案中，本发明提供了在边合成边测序(SBS)中在核苷酸掺入后的荧光团检测步骤期间作为成像试剂的光保护混合物。这些光保护混合物成像试剂包含有效的抗氧化剂，诸如，但不限于，2,5-二羟基苯甲酸(龙胆酸)；3,4-二羟基苯甲酸(原儿茶酸)或3,4-二羟基苯甲酸乙酯(原儿茶酸乙酯)，荧光猝灭抑制剂，诸如，但不限于，6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸(奎诺二甲基丙烯酸酯)，和自由基清除剂(例如，肉毒碱)，抗氧化剂和/或单线态氧猝灭剂。

在一个实施方案中，所述光保护鸡尾酒包括混合物(例如，成像试剂SC-P 7B)，所述混合物包含下列组分：

在一个实施方案中，所述光保护鸡尾酒包括混合物(例如，成像试剂SC-P 9C)，所述混合物包含下列组分：

通过上面那些举例的光保护鸡尾酒混合物被设计具有下列特性：包括，但不限于，光保护、稳定性、公艺性、长保存期保存和可用性。这些混合物也设计用于与现成的测序试剂盒(即，1.1测序试剂盒)相兼容。具体地，已经发现在长期保存生物流体和功能缓冲剂后肉毒碱诱导氧化应激减少并保留化学活性和/或生物学功能。不受理论约束，肉毒碱可以由于减少由分子(包括，但不限于，氧、过氧自由基或单线态氧)引起的氧化应激而可想象地支持复杂的分子混合物的保存改善。尽管不需要理解本发明的机制，但相信诸如肉毒碱的化合物即使在作为制剂长期保存时仍保留其保护特性，包括但不限于分子还原状态和针对化学键断裂(例如，辐射致或光致断裂)的稳定性。

本文给出的数据证明了化合物的各种光保护成像混合物作为成像试剂的潜力疑问。另外地，对于所有组分验证了与SBS设备硬件完全兼容，如从在测序结束时对设备和液体废物两者的检查所观察到的那样。本发明公开的光保护混合物成像试剂的改进利用比较的测序工作流程来举例说明。

例如，预期的用于光保护混合物成像试剂的试剂盒构造显示为保存在与-20℃保存条件相容的试剂盒盒子中的单组分耗材。参见图1。与本发明公开的光保护成像试剂的试剂盒构造(图1B)相反，用于常规成像试剂的试剂盒构造(图1A)的比较工作流程证明了增加的复杂性。尽管不需要理解本发明的机制，但相信本发明公开的光保护成像试剂的试剂盒构造通过减少试剂盒和工作流程中所需的组分数目而极大地提高了在SBS方法期间的可用性。

测试如本发明所提供的光保护成像试剂的长读取长度测序性能(例如，约150bp)。这些测试中的一些进行了157次循环测序以及光保护混合物成像试剂与常规成像试剂(例如，基线IB试剂)的头对头比较。使用Gene Reader设备和两种类型的DNA文库(即，NA12878/101X基因集和NA12878/BRCA基因集)进行研究。分析测序度量以提供比较性系统性能指标，例如，原始错误率、平均读取长度、输出(Gb)。

例如，使用根据实施例II制备的光保护成像缓冲剂试剂SC-P 7B来进行GDP4测试。使用APF试验方案v2运行测试，该APF试验方案v2包括157次循环和利用SP101x基因集的130个小区(tile)。执行的4个运行轮次中的一个(例如，8.41)被认为是无效的并被重测(标注为“**)。可以看出在所有测序度量中常规成像试剂(基线IB)和光保护成像试剂SC-P 7B是相当的。参见图2和表1。

表1:相当的测序度量：常规IB(基线)与SC-P 7B IB相比。

这些数据表明，滞后(lag)的度量显示了在两种成像试剂之间仅有统计学上相关的差异，当利用光保护成像试剂SC-P 7B测试时，有30％更低的滞后。当在两种成像试剂之间测试时在四个运行轮次中的读取长度分布是相当的。参见图3A-3D。当在两种成像试剂之间测试时在四个运行轮次中的原始错误点迹也是相当的。参见图4A-4D。

还使用根据实施例III制备的示例性的光保护成像试剂9CV2T的各种实施方案进行测试。制备三种不同形式的9CV2T试剂。尽管不需要理解本发明的机制，但相信这些试剂中的至少一种导致了提高的信号驻留。例如，9CV2T成像试剂的三种测试形式包括：

或

和

在这三种SC-P version 9CV2T成像试剂与常规IB试剂之间采用137次循环的测序方案使用痘苗病毒(Vaccinia virus，VACV)株TianTan TP03基因组进行基础测序度量的比较。参见表2。

表2:SC-P Version 9 IB和常规IB(IB_基线)之间测序度量的比较。

在这些SC-P version 9CV2T成像试剂和基线成像试剂之间关于平均读取长度观察到相对的等同性。参见图5。对于SC-P version 9CV2T成像试剂和基线成像试剂之间的原始数据点迹也观察到了这样的等同性。参见图6A-C。这些数据证明降低离子化合物和芳香族化合物(例如，分别是肉毒碱和原儿茶酸)的浓度确实提高信号驻留。参见图7。尽管不需要理解本发明的机制，但相信这个观察结果可能是由于信号猝灭减少所产生的，信号猝灭通常产生自荧光团和光保护缓冲剂中的芳香族/离子种类之间的相互作用。

在对BRCA基因集的157次循环的非-APF/88小区试验方案中使用SC-P9C成像试剂(运行轮次8.17；8.24；8.26)。测序度量与参照成像IB进行比较。参见表3。

数据证明在HEPES缓冲剂中配制的SC-P 9C成像试剂超过了在Tris HCl中配制的SC-P 9C成像试剂。相似地，使用HEPES缓冲剂与Tris HCl相比原始错误率较小，且更类似于基线IB。参见图9A和9B。

这些数据证明就信号稳定性和质量而言，采用原儿茶酸乙酯的光保护成像试剂优于采用2,5-二羟基苯甲酸的光保护成像试剂。尽管不需要理解本发明的机制，但相信信号稳定性和质量在测序性能质量中起作用。尽管如此，基于2,5-二羟基苯甲酸和基于原儿茶酸的鸡尾酒化学物质(即，分别为SC-P 7B和SC-P 9C)期望就长读取长度测序的比较性能而言竞争性地进行基准测试。然而，从制造的角度来看，具有原儿茶酸乙酯的光保护成像试剂由于具有制备制剂的更好的灵活性和成本有效性，因此可以比具有2,5-二羟基苯甲酸的光保护成像试剂更优选。

进行进一步的研究以确定降低光保护成像试剂中的肉毒碱浓度(例如，在约50mM至5mM之间)是否影响测序性能。测试的光保护肉毒碱成像试剂(例如，SC-P9、SC-P9B和SC-P9C)的组成如下：

测序运行轮次(8.17、8.24、8.26)设置包括对于参照和/或基线IB试剂以及光保护IB试剂使用样品NA12878/101X(ID:TP03)或NA12878/BRCA(ID:DHMG02)进行132次循环。数据显示基于平均读取长度和信号驻留，15mM肉毒碱提供了最佳的工作浓度。参见表5。

具体地，在101x基因集和BRCA基因集两者中减小的肉毒碱浓度均以浓度依赖性方式减小了数据输出(MFST)。参见图10。此输出数据在百分比完美参数与参照IB试剂相比无改变的条件下采集。参见图11。然而，当光保护成像试剂含有肉毒碱时，发现平均读取长度全部都较低。参见图12。尽管如此，当与参照IB试剂比较时，包含肉毒碱的光保护成像试剂对百分比错误率没有影响。参见图13。然而，就原始错误率参数而言，在具有不同的肉毒碱浓度的光保护成像试剂之间存在差异。例如，SC-9 IB试剂(50mM肉毒碱)和SC-9B IB试剂(15mM肉毒碱)具有与参照IB试剂类似的原始错误率。参见图14A。然而，SC-9D IB试剂(5mM肉毒碱)与参照IB试剂相比，显示出较高的原始错误率。参见图14B。对测试的成像试剂之间的读取长度分布观察到此数据模式。SC-9 IB试剂(50mM肉毒碱)和SC-9B IB试剂(15mM肉毒碱)具有类似于参照IB试剂的读取长度分布。参见图15A。然而，SC-9D IB试剂(5mM肉毒碱)显示出与参照IB试剂相比偏向于早期循环且稍低的读取长度分布。参见图15B。在肉毒碱的存在下所有核苷酸的信号驻留均降低，如较低肉毒碱浓度的光保护IB试剂(例如，SC-9B，15mM)具有最好的信号驻留所示。参见图16。

总体上，本文给出的数据表明，光保护SC-P 7B IB试剂和SC-P 9C IB试剂表现类似于常规的成像缓冲剂试剂(例如，基线IB)，并且得出了与现有技术的基因读数仪兼容的平均读取长度最低要求。具体地，数据表明，与现有技术基因读数仪的约110-130bp的最佳扫描范围相比，本文所提供的光保护成像缓冲剂试剂在扫描约110bp的平均读取长度时是有效的。

试验部分

实施例I

光保护成像制剂的稳定性和保存

测试了使用Tris HCl作为基础缓冲剂，如本文所述的各种光保护成像混合物中的组分针对成像溶液制剂中的沉淀和褪色的可溶性和稳定性。已经发现对于各种组分的最适浓度窗如下：肉毒碱(5-50mM)；奎诺二甲基丙烯酸酯(5-15mM)；2,5-二羟基苯甲酸(10-50mM)；和3,4-二羟基苯甲酸乙酯(原儿茶酸乙酯)(10-20mM)。

实施例II

光保护成像试剂SC-P 7B的组成和配制

下面的实施例描述了约二百(200)毫升成像试剂的制备，预计所述成像试剂支持4FC/157次循环的SBS方法。

·50mM Tris缓冲剂:121.4g/mol＝1.21g(Sigma:Cat#T1378-1kg)

·50mM L-肉毒碱:197.66g/mol＝1.98g(Sigma:Cat#C0283-100G)

·15mM奎诺二甲基丙烯酸酯:250.29g/mol＝0.75g(Sigma:Cat#238813-5G)

·50mM 2,5-二羟基苯甲酸：176.1g/mol＝1.76g(Sigma:G5129-10G)

1.将Tris碱溶于180mL milliQ水中。

2.将奎诺二甲基丙烯酸酯添加到来自步骤1的Tris缓冲剂。

3.将L-肉毒碱添加到上述溶液中。

4.添加2,5-二羟基苯甲酸钠盐水合物并溶解。

5.检查pH:～4

6.用10M NaOH溶液将pH调整至7.8。

7.用milliQ水将总体积补足200mL。

8.滤器灭菌。

9.将成像缓冲剂分到2个锥形管(每个约25mL等分试样)中用于单个FC GR运行轮次。

实施例III

光保护成像试剂9CV2T的组成和配制

下面的实施例描述了约二百(200)毫升成像试剂的制备。

·50mM Tris缓冲剂:121.4g/mol＝0.607g(Sigma:Cat#T1378-1kg)

·15mM L-肉毒碱:197.66g/mol＝0.296g(Sigma:Cat#C0238-100G)

·15mM奎诺二甲基丙烯酸酯:250.29g/mol＝0.375g(Sigma:Cat#238813-5G)

·10mM原儿茶酸乙酯：182.17g/mol＝182.17mg(Sigma:Cat#E24859-5G)

1.将Tris碱溶于75mL milliQ水中。

2.添加奎诺二甲基丙烯酸酯并完全溶解。

3.添加原儿茶酸。

4.添加L-肉毒碱并完全溶解。

5.检查pH:

6.用10M NaOH将pH调整至8.5。

7.任选：声波降解直至充分混合。

8.用milliQ水将总体积补足100mL。

9.滤器灭菌。

实施例IV

光保护成像试剂9CV2H的组成和配制

下面的实施例描述了约一百(100)毫升成像试剂的制备。

·100mM HEPES:238.3gr/mol＝2.39g(Sigma:Cat#H4034)

·15mM L-肉毒碱:197.66g/mol＝0.296g(Sigma:Cat#C0283-100G)

·15mM奎诺二甲基丙烯酸酯:250.29g/mol＝0.375g(Sigma:Cat#238813-5G)

·10mM原儿茶酸乙酯：182.17g/mol＝.182g(Sigma:Cat#E24859-5G)

1升100mM HEPES

23.9g HEPES

溶于MilliQ水中——终体积为1升

pH调整至7.0。

1.获得75mL HEPES缓冲剂(见下)。

2.添加奎诺二甲基丙烯酸酯并完全溶解。

3.添加原儿茶酸。

4.添加L-肉毒碱并完全溶解。

5.检查pH:～5。

6.用10M NaOH将pH调整至7.5。

7.任选：声波降解直至充分混合。

8.用milliQ水将总体积补足100mL。

9.滤器灭菌。

Claims (30)

1.一种掺入标记的核苷酸的方法，所述方法包括：

a)提供：

i)多种核酸引物和模板分子，

ii)聚合酶，

iii)成像试剂，所述成像试剂包含化合物的光保护混合物，和

iv)多种核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物的至少一部分用标记物标记，所述标记物通过可裂解接头连接到碱基；

b)将所述引物的至少一部分与所述模板分子的至少一部分杂交，以产生杂交的引物；

c)利用所述聚合酶将第一标记的核苷酸类似物掺入至所述杂交的引物的至少一部分中，以产生包含掺入的标记的核苷酸类似物的延伸引物；和

d)在所述成像试剂的存在下将所述掺入的标记的核苷酸类似物成像。

2.权利要求1所述的方法，其中所述光保护混合物包含至少一种荧光猝灭抑制剂。

3.权利要求2所述的方法，其中所述至少一种荧光猝灭抑制剂是奎诺二甲基丙烯酸酯。

4.权利要求1所述的方法，其中所述光保护混合物进一步包括至少一种抗氧化剂和至少一种自由基清除化合物。

5.权利要求4所述的方法，其中所述至少一种抗氧化剂选自2,5-二羟基苯甲酸、原儿茶酸和原儿茶酸乙酯。

6.权利要求4所述的方法，其中所述至少一种自由基清除化合物是肉毒碱。

7.权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括步骤(e)：利用所述聚合酶将第二核苷酸类似物掺入到所述延伸引物的至少一部分中。

8.权利要求1所述的方法，其中所述标记物是荧光标记物。

9.一种成像试剂，其包含至少一种抗氧化剂、至少一种荧光猝灭抑制剂和缓冲剂。

10.权利要求9所述的成像试剂，其中所述至少一种抗氧化剂包含选自下组的化合物：2,5-二羟基苯甲酸、原儿茶酸和原儿茶酸乙酯。

11.权利要求9所述的成像试剂，其进一步包含至少一种自由基清除剂。

12.权利要求11所述的成像试剂，其中所述至少一种自由基清除剂是肉毒碱。

13.权利要求9所述的成像试剂，其中所述荧光猝灭抑制剂是奎诺二甲基丙烯酸酯。

14.权利要求9所述的成像试剂，其中所述缓冲剂是TRIS缓冲剂。

15.权利要求9所述的成像试剂，其中所述缓冲剂是HEPES缓冲剂。

16.一种试剂盒，其包括：

i)第一容器，所述第一容器包含成像试剂，所述成像试剂包含至少一种抗氧化剂、至少一种荧光猝灭抑制剂和缓冲剂，和

ii)第二容器，所述第二容器包含多种核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物的至少一部分用标记物标记，所述标记物通过可裂解接头连接到碱基。

17.权利要求16所述的试剂盒，其中所述第一容器进一步包含至少一种自由基清除剂。

18.权利要求17所述的试剂盒，其中所述至少一种自由基清除剂是肉毒碱。

19.权利要求16所述的试剂盒，其中所述至少一种荧光猝灭抑制剂是奎诺二甲基丙烯酸酯。

20.权利要求16所述的试剂盒，其中所述缓冲剂是TRIS缓冲剂。

21.权利要求16所述的试剂盒，其中所述缓冲剂是HEPES缓冲剂。

22.一种系统，其包括：

杂交到模板上的引物的溶液，所述溶液包含与可裂解的标记物连接的多种核苷酸类似物，和

成像试剂，所述成像试剂包含至少一种抗氧化剂、至少一种荧光猝灭抑制剂和缓冲剂。

23.权利要求22所述的系统，其中所述杂交的引物和所述模板被固定。

24.权利要求22所述的系统，其中所述杂交的引物和所述模板在流动室中。

25.权利要求22所述的系统，其中所述成像试剂进一步包含至少一种自由基清除剂。

26.权利要求25所述的系统，其中所述至少一种自由基清除剂是肉毒碱。

27.权利要求22所述的系统，其中所述至少一种荧光猝灭抑制剂是奎诺二甲基丙烯酸酯。

28.权利要求22所述的系统，其中所述缓冲剂是TRIS缓冲剂。

29.权利要求22所述的系统，其中所述缓冲剂是HEPES缓冲剂。

30.一种成像试剂，包含：

i)TRIS HCl缓冲剂；

ii)浓度范围为约5-50mM的肉毒碱；

iii)浓度范围为约5-15mM的奎诺二甲基丙烯酸酯；

iv)浓度范围为约10-50mM的2,5-二羟基苯甲酸；和

v)浓度范围为约10-20mM的3,4-二羟基苯甲酸乙酯。