CN112501255A - 一种多位点miRNA联合检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多位点miRNA联合检测方法，包括：1)针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针连接；3)使用通用引物对步骤2)中产生的连接产物进行扩增；4)使用特异性磁性微珠对步骤3)产物片段进行杂交；5)使用链霉亲和素标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；6)检测步骤5)产物荧光信号并进行数据分析。本发明的方法无需进行逆转录，节省成本，降低损失；特异性好，可区分单个碱基；可实现多重检测，以及适用于各领域多位点miRNA的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于miRNA检测技术领域，涉及一种多位点miRNA联合检测方法。
背景技术
miRNA已经作为肝癌的血液学分子标志物加入《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》。该规范指出，目前基于循环miRNA模型的肝癌检测试剂盒已经由多家医院验证，并获得国家药物监督管理局三类医疗器械注册证，进入临床应用。
此外，在冰冻组织、福尔马林固定组织或石蜡包埋的临床组织样本中，miRNA也都表达出较高的稳定性，更进一步表明其作为诊断性分子标记物具有巨大潜能。但是由于miRNA本身碱基数过少，使得探针碱基序列的选择受限。并且不同miRNA具有不同的最适杂交温度，在相同的杂交条件下，往往会引起很大程度的错配杂交，从而限制了不同miRNA的高效识别。另外，miRNA序列还存在高度相似性，所以检测的特异性往往也难以保证。
目前常见的miRNA检测方法分为直接检测和间接检测两个类别。直接检测方法主要基于荧光、比色、电化学等方法，这些方法可以直接检测miRNA的水平和表达，但是灵敏度较低，且难以区分序列相近的同源miRNA。间接检测方法主要包括Northern Blot、微阵列芯片、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)等检测方法。其中Northern Blot和微阵列芯片方法敏感性较差，对起始miRNA量的需求也较大。相比之下，qRT-PCR是目前检测miRNA最灵敏、最有效的方法。
该方法虽然在一定程度上克服了大部分miRNA检测方法的缺陷，但是还存在着以下几点问题：首先，TaqMan探针虽然检测灵敏度较高，但是针对每种miRNA的设计不仅成本过高，技术上也很具有挑战性。其次，该方法不能在同一个反应孔进行miRNA的多重检测，而单miRNA位点的检测对于疾病诊断的敏感性和特异性相对较低。再加上该方法的检测成本较高，这些缺点都限制了该方法的广泛应用和对临床的转化。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种多位点miRNA联合检测方法。可应用于各领域多位点miRNA的定量检测，包括但不限于癌症筛查、疾病诊断、科学研究等。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种多位点miRNA联合检测方法，包括以下步骤：
1)设计并合成5′端带有生物素标记的上游通用引物和下游通用引物；针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针：探针A和探针B，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；
探针A：5′端开始依次为：上游通用引物序列——与miRNA的3′端8-14个碱基反向互补序列；
探针B：5′端开始依次为：磷酸化标记——与miRNA的5′端8-14个碱基反向互补序列——特异性tag序列——下游通用引物反向互补序列；
2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针A和探针B连接；
3)使用通用引物对步骤2)中产生的连接产物进行扩增；
4)使用特异性磁珠对步骤3)产物片段进行杂交；
5)使用链霉亲和素标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；
6)检测步骤5)产物荧光信号并进行数据分析。
优选地，步骤1)中，进行杂交的条件为：80-90℃，2-5min，缓慢降至室温，保持2-4h，形成多个杂化双链。
优选地，步骤2)中，所述连接酶选自T4 DNA连接酶或T4 RNA连接酶或SplintR DNA连接酶。
优选地，步骤2)中，连接条件为：16-37℃，15-60min-过夜。
优选地，步骤3)中，扩增反应条件为：预变性95℃2min，热循环95℃15s，50℃30s，72℃40s，25个循环，最后延伸72℃5min。
优选地，步骤4)中，所述特异性磁珠耦联有特异性核酸序列，每种磁珠上带有不同的标记，可以与特定的PCR产物结合。
优选地，步骤4)中，进行杂交的条件为：85-100℃，60-120s；25-40℃，10-20min。
优选地，步骤5)中，进行荧光标记的反应条件为：25-37℃，10-30min。
优选地，上述方法还包括通过以下方法判断待测样本中是否还有目的miRNA：若检测值大于阴性对照检测值3倍，则待测样本中含有目的片段，否则为不含有目的片段。
优选地，上述方法还包括通过以下方法进行待测样本中miRNA定量：以10倍梯度稀释的已知浓度的目的片段标准品检测结果制作标准曲线，将待测样本检测结果带入公式，计算待测样本中目的miRNA片段的含量。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1.无需进行逆转录，节省成本，降低损失。
2.特异性好，可区分单个碱基(具体可参见实施例3)。
3.可实现多重检测(具体可参见实施例4)。
本发明所述的方法可应用于各领域多位点miRNA的定量检测，包括但不限于癌症筛查、疾病诊断、科学研究等。
附图说明
图1是本发明多miRNA位点联合检测方法的流程示意图。
图2是本发明实施例2miR-122标准品检测结果。
图3是本发明实施例2miR-122标准曲线。
图4是本发明实施例3hsa-let-7c-5p特异性检测结果。
图5是本发明实施例4结直肠癌样本多重检测结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中各个步骤，如未有特殊说明，均可采用本领域现有材料及常规技术手段来实现。
实施例1.检测方法建立
1.设计两条通用引物(引物F、引物R)，均为非人源序列，且经过序列比对，不与已知的人源DNA及RNA序列相通，或相似超过4个连续碱基；通用引物F的5′端带有生物素标记。
2.通用引物序列长度为18-25bp，TM值为55-65℃。
3.根据待检测miRNA序列，按照如下原则，设计2条特异性探针——探针A、探针B：
探针A，长度25-40nt，核酸序列从5′端到3′端依次是通用引物序列F和与miRNA的3′端8-14个碱基反向互补的序列A′；
探针B，长度40-60nt，核酸序列从5′端到3′端依次为与miRNA的5′端8-14个碱基反向互补序列B′，特异性tag序列C以及通用引物R反向互补序列R′，探针B5′端有磷酸化修饰。
4.检测原理：
反应原理如图1所示，第一步，室温(18-28℃)条件下，特异性探针A和特异性探针B与目的miRNA片段结合；第二步，使用连接酶，将与同一个目的片段结合的两条探针连接成为一条长片段；第三步，加入通用引物F\R对连接产物进行扩增，得到扩增产物；第四步，扩增产物与带有特异性序列C′标记的磁珠杂交，并加入SAPE对序列上的生物素进行标记；第五步，使用液相芯片分析系统对上述产物进行检测分析。
其中，本发明全部实施例中，
连接酶及10×连接酶buffer采用Thermo ScientificTM T4 DNA Ligase，EL0011；
PCR反应预混液采用Qiagen HotStar Taq 2×master mix，203443；
杂交液配方：0.4M NaCl，0.2M Tris，0.016％Triton X-100，pH＝8.0，4℃保存；
磁珠采用MagPlex-TAG Microspheres，
显色反应液配方：每80μl杂交液中加入1μl SAPE，厂家：Moss SAPE-001G75，Life
S-886。
5.检测步骤：
1)取1μl待检测miRNA作为模板，向反应体系中加入：0.5μl探针A，0.5μl探针B，1μl10×连接酶buffer，补水至10μl；
2)上述反应体系在PCR仪中进行杂交反应，程序为：85℃2min，缓慢降温至22℃，保持2h；
3)取2μl产物，加入1μl连接酶，2μl10×连接酶buffer，补水至20μl；
4)上述反应体系在PCR仪中进行连接反应，程序为：25℃60min，65℃10min；
5)取10μl产物，加入25μlPCR反应预混液，1μl引物F，1μl引物R，补水至50μl；
6)上述反应体系在PCR仪中进行PCR扩增反应，程序为：预变性95℃2min，热循环95℃15s，50℃30s，72℃40s，25个循环，最后延伸72℃5min；
7)向96孔板中加入10μl产物，30μl杂交液，3μl磁珠，补水至50μl，封膜，在PCR仪中进行反应，程序为：90℃，80s；30℃，20min；
8)杂交反应结束后，将96孔板置于磁力架上2min，吸弃上清，加入25μl显色反应液，封膜，在PCR仪中进行反应，程序为：37℃，10min；
9)显色反应结束后，从PCR仪取下立即置于磁力板上静置60s，弃去上清。加入50μl杂交液(该步骤中采用和步骤7)相同的杂交液)，震荡混匀20-30s，置于磁力板静置60s后弃去上清，重复1次。加入杂交液75μl，震荡混匀30s；
10)上机检测。
6.待测样本中是否还有目的miRNA的判断标准如下：
若检测值大于阴性对照检测值3倍，则待测样本中含有目的片段，否则为不含有目的片段。
7.待测样本中miRNA定量的方法如下：
以10倍梯度稀释的已知浓度的目的片段标准品检测结果制作标准曲线，将待测样本检测结果带入公式，计算待测样本中目的miRNA片段的含量。
实施例2.hsa-miR-122-5p标准品检测
1.引物探针设计及合成
合成hsa-miR-122-5p标准品，序列如下：
hsa-miR-122-5p:UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQ ID NO：1)
合成通用引物，序列如下：
通用引物F：biotin-CCAGATAAGGGTGTTATG(SEQ ID NO：2)，其中biotin表示生物素修饰；
通用引物R：GAATGGGCGGATTGCCT(SEQ ID NO：3)
根据实施例1中的设计原则，设计并合成探针A、探针B，序列如下：
hsa-miR-122-5p-A：tcaaCCAGATAAGGGTGTTATGCAAACACCATTG(SEQ ID NO：4)
hsa-miR-122-5p-B：
P-TCACACTCCATTAACAACTTATACAAACACAAACAGGCAATCCGCCCATTCagcgag(SEQ IDNO：5)，其中P表示磷酸化修饰。
2.mir-122标准品检测
标准品干粉加无酶水溶解后，稀释至1015拷贝/ml，之后10倍梯度连续稀释标准品，取107拷贝/ml-1011拷贝/ml分别标记为TD5-TD1作为标准品模板，取TD3标准品与TD4标准品各10μl混合均匀作为待测样本(标记为S，理论浓度为：5.5×108拷贝/ml)。
按照下述步骤进行检测：
1)取1μl各浓度的标准品、阴性对照及待测样本作为模板，向各反应体系中加入：0.5μl探针hsa-miR-122-5p-A，0.5μl探针hsa-miR-122-5p-B，1μl10×连接酶buffer，补水至10μl；
2)上述反应体系在PCR仪中进行杂交反应，程序为：85℃2min，缓慢降温至22℃，保持2h；
3)取2μl产物，加入1μl连接酶，2μl10×连接酶buffer，补水至20μl；
4)上述反应体系在PCR仪中进行连接反应，程序为：25℃30min，65℃10min；
5)取10μl产物，加入25μlPCR反应预混液，1μl引物F，1μl引物R，补水至50μl；
6)上述反应体系在PCR仪中进行PCR扩增反应，程序为：预变性95℃2min，热循环95℃15s，50℃30s，72℃40s，25个循环，最后延伸72℃5min；
7)向96孔板中加入10μl产物，30μl杂交液，3μl磁珠，补水至50μl，封膜，在PCR仪中进行反应，程序为：90℃，80s；37℃，20min；
8)杂交反应结束后，将96孔板置于磁力架上2min，吸弃上清，加入25μl显色反应液，封膜，在PCR仪中进行反应，程序为：37℃，10min；
9)显色反应结束后，从PCR仪取下立即置于磁力板上静置60s，弃去上清。加入50μl杂交液，震荡混匀20-30s，置于磁力板静置60s后弃去上清，重复1次。加入杂交液75μl，震荡混匀30s；
10)使用luminex 200进行上机检测。
3.实验结果如图2所示，NC为阴性对照，梯度稀释样本检测结果均大于其检测值3倍，证明能够检测到目的miRNA，根据梯度稀释标准品检测结果制作标准曲线：如图3所示，公式：y＝160.44ln(x)-2111.9，根据公式计算得到样本浓度为：5.71×108拷贝/ml，与实际浓度相符。
实施例3.检测特异性分析
1.按照实施例1说明的方法，进行探针设计及合成
合成hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p标准品，序列如下：
hsa-let-7a-5p:UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO：6)
hsa-let-7b-5p:UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU(SEQ ID NO：7)
hsa-let-7c-5p:UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU(SEQ ID NO：8)
根据实施例1中的设计原则，设计并合成hsa-let-7c-5p的探针A、探针B，
序列如下：
hsa-let-7c-5p-A：tcaaCCAGATAAGGGTGTTATGAACCATACAAC(SEQ ID NO：9)
hsa-let-7c-5p-B：
P-CTACTACCTCACAATTTACATTTCACTTTCTTATCAGGCAATCCGCCCATTCagcgag(SEQ IDNO：10)，其中P表示磷酸化修饰。
2.Hsa-let-7c-5p特异性检测
hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p标准品干粉分别加无酶水溶解后，稀释至1015拷贝/ml，10倍梯度稀释标准品，均取1010拷贝/ml作为标准品模板，使用hsa-let-7c-5p-A、hsa-let-7c-5p-B分别检测三种样本。
按照下述步骤进行检测：
1)取1μl上述模板，向反应体系中加入：0.5μl探针hsa-let-7c-5p-A，0.5μl探针hsa-let-7c-5p-B，1μl10×连接酶buffer，补水至10μl；
2)上述反应体系在PCR仪中进行杂交反应，程序为：85℃2min，缓慢降温至22℃，保持2h；
3)取2μl产物，加入1μl连接酶，2μl10×连接酶buffer，补水至20μl；
4)上述反应体系在PCR仪中进行连接反应，程序为：25℃30min，65℃10min；
5)取10μl产物，加入25μlPCR反应预混液，1μl引物F，1μl引物R，补水至50μl；
6)上述反应体系在PCR仪中进行PCR扩增反应，程序为：预变性95℃2min，热循环95℃15s，50℃30s，72℃40s，25个循环，最后延伸72℃5min；
7)向96孔板中加入10μl产物，30μl杂交液，3μl磁珠，补水至50μl，封膜，在PCR仪中进行反应，程序为：90℃，80s；37℃，20min；
8)杂交反应结束后，将96孔板置于磁力架上2min，吸弃上清，加入25μl显色反应液，封膜，在PCR仪中进行反应，程序为：37℃，10min；
9)显色反应结束后，从PCR仪取下立即置于磁力板上静置60s，弃去上清。加入50μl杂交液，震荡混匀20-30s，置于磁力板静置60s后弃去上清，重复1次。加入杂交液75μl，震荡混匀30s。
10)使用luminex 200进行上机检测。
3.实验结果如图4所示，NC为阴性对照，hsa-let-7c-5p结果大于NC检测值3倍而hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p结果均小于NC检测值3倍，证明探针组合hsa-let-7c-5p-A、hsa-let-7c-5p-B能够特异性的检测到hsa-let-7c-5p，而不能检测仅有1个碱基差异的片段，证明该方法特异性较好。
实施例4.多重检测分析
1.血浆样本miRNA提取：
使用天根生化科技(北京)有限公司生产的血清/血浆miRNA提取分离试剂盒(DP503)，按照说明书方法，对5个结直肠癌患者及5个健康对照血浆(来自合作医院的患者及健康人血浆样本，已签署知情同意书，且样本经过测序验证)进行miRNA提取。
2.按照实施例1说明的方法，进行探针设计及合成。
合成hsa-miR-191-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-577标准品，序列如下：
hsa-miR-191-5p:CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG(SEQ ID NO：11)
hsa-miR-194-5p:UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA(SEQ ID NO：12)
hsa-miR-182-5p:UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU(SEQ ID NO：13)
hsa-miR-141-3p:UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG(SEQ ID NO：14)
hsa-miR-10a-5p:UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG(SEQ ID NO：15)
hsa-miR-577:UAGAUAAAAUAUUGGUACCUG(SEQ ID NO：16)
设计并合成探针A、探针B，序列如下：
hsa-miR-191-5p-A：
tcaaCCAGATAAGGGTGTTATGCAGCTGCTTTTG(SEQ ID NO：17)
hsa-miR-191-5p-B：
P-GGATTCCGTTGACATCAAATTCTTTCAATATCTTCAGGCAATCCGCCCA
TTCagcgag(SEQ ID NO：18)，其中P表示磷酸化修饰
hsa-miR-194-5p-A：
tcaaCCAGATAAGGGTGTTATGTCCACATGGAG(SEQ ID NO：19)
hsa-miR-194-5p-B：
P-TTGCTGTTACAACTTACAATAACTACTAATACTCTAGGCAATCCGCCCATTCagcgag(SEQ IDNO：20)，其中P表示磷酸化修饰
hsa-miR-182-5p-A：
tcaaCCAGATAAGGGTGTTATGAGTGTGAGTTCT(SEQ ID NO：21)
hsa-miR-182-5p-B：
P-ACCATTGCCAAAACACTCATTTAACACTATTTCATTAGGCAATCCGCCCATTCagcgag(SEQ IDNO：22)，其中P表示磷酸化修饰
hsa-miR-141-3p-A：
tcaaCCAGATAAGGGTGTTATGCCATCTTTAC(SEQ ID NO：23)
hsa-miR-141-3p-B：
P-CAGACAGTGTTCAATTTACATTTCACTTTCTTATCAGGCAATCCGCCCATTCagcgag(SEQ IDNO：24)，其中P表示磷酸化修饰
hsa-miR-10a-5p-A：
tcaaCCAGATAAGGGTGTTATGCACAAATTCG(SEQ ID NO：25)
hsa-miR-10a-5p-B：
P-GATCTACAGGGTATTTACAAATCTAATCACACTATACAGGCAATCCGCCCATTCagcgag(SEQ IDNO：26)，其中P表示磷酸化修饰
hsa-miR-577-A：
tcaaCCAGATAAGGGTGTTATGCAGGTACCAA(SEQ ID NO：27)
hsa-miR-577-B：
P-TATTTTATCTATTAACAACTTATACAAACACAAATCAGGCAATCCGCCCATTCagcgag(SEQ IDNO：28)，其中P表示磷酸化修饰。
3.多重检测
各种标准品干粉分别加无酶水溶解后，按1：1比例混合并稀释至1014拷贝/ml，按照实施例2中的方法，分别配制每种标准品的梯度稀释液。使用稀释后各组分浓度均为1010拷贝/ml的标准品及提取的结直肠癌患者\健康人血浆样本中的miRNA作为模板，将所有探针按相同浓度混合，作为多重检测探针，按照下述步骤进行检测：
1)取10μl上述模板，向反应体系中加入：2μl探针，2μl10×连接酶buffer，补水至20μl；
2)上述反应体系在PCR仪中进行杂交反应，程序为：85℃2min，缓慢降温至22℃，保持2h；
3)取10μl产物，加入1μl连接酶，2μl10×连接酶buffer，补水至20μl；
4)上述反应体系在PCR仪中进行连接反应，程序为：25℃30min，65℃10min；
5)取10μl产物，加入25μlPCR反应预混液，3μl引物F，3μl引物R，补水至50μl；
6)上述反应体系在PCR仪中进行PCR扩增反应，程序为：预变性95℃2min，热循环95℃15s，50℃30s，72℃40s，25个循环，最后延伸72℃5min；
7)向96孔板中加入10μl产物，30μl杂交液，3μl磁珠，补水至50μl，封膜，在PCR仪中进行反应，程序为：90℃，80s；37℃，20min；
8)杂交反应结束后，将96孔板置于磁力架上2min，吸弃上清，加入25μl显色反应液，封膜，在PCR仪中进行反应，程序为：37℃，10min；
9)显色反应结束后，从PCR仪取下立即置于磁力板上静置60s，弃去上清。加入50μl杂交液，震荡混匀20-30s，置于磁力板静置60s后弃去上清，重复1次。加入杂交液75μl，震荡混匀30s；
10)使用luminex 200进行上机检测。
4.实验结果如图5所示，NC为阴性对照，PC为阳性对照，阳性对照几个位点的检测结果均大于其对应值NC值的3倍，证明该方法可以同时进行多个位点的检测；5个患者样本均有不少于2个位点为阳性，而健康对照均为阴性，证明该方法能够较好地将结直肠癌样本区分出来。
序列表
<110> 昂凯生命科技（苏州）有限公司
<120> 一种多位点miRNA联合检测方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagataagg gtgttatg 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaatgggcgg attgcct 17
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaaccagat aagggtgtta tgcaaacacc attg 34
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcacactcca ttaacaactt atacaaacac aaacaggcaa tccgcccatt cagcgag 57
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ugagguagua gguuguaugg uu 22
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaaccagat aagggtgtta tgaaccatac aac 33
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctactacctc acaatttaca tttcactttc ttatcaggca atccgcccat tcagcgag 58
<210> 11
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caacggaauc ccaaaagcag cug 23
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uguaacagca acuccaugug ga 22
<210> 13
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24
<210> 14
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
uacccuguag auccgaauuu gug 23
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
uagauaaaau auugguaccu g 21
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcaaccagat aagggtgtta tgcagctgct tttg 34
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggattccgtt gacatcaaat tctttcaata tcttcaggca atccgcccat tcagcgag 58
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcaaccagat aagggtgtta tgtccacatg gag 33
<210> 20
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgctgttac aacttacaat aactactaat actctaggca atccgcccat tcagcgag 58
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcaaccagat aagggtgtta tgagtgtgag ttct 34
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
accattgcca aaacactcat ttaacactat ttcattaggc aatccgccca ttcagcgag 59
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcaaccagat aagggtgtta tgccatcttt ac 32
<210> 24
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cagacagtgt tcaatttaca tttcactttc ttatcaggca atccgcccat tcagcgag 58
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcaaccagat aagggtgtta tgcacaaatt cg 32
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gatctacagg gtatttacaa atctaatcac actatacagg caatccgccc attcagcgag 60
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcaaccagat aagggtgtta tgcaggtacc aa 32
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tattttatct attaacaact tatacaaaca caaatcaggc aatccgccca ttcagcgag 59
Claims (10)
1.一种多位点miRNA联合检测方法，包括以下步骤：
1)设计并合成5′端带有生物素标记的上游通用引物F和下游通用引物R；针对每个目的miRNA序列设计合成一对特异性单链DNA探针：探针A和探针B，与相对应的待检测miRNA片段进行杂交，形成多个杂化双链；
探针A：5′端开始依次为：上游通用引物序列——与miRNA的3′端8-14个碱基反向互补序列；
探针B：5′端开始依次为：磷酸化标记——与miRNA的5′端8-14个碱基反向互补序列——特异性tag序列——下游通用引物反向互补序列；
2)使用连接酶将步骤1)形成的杂化双链中的探针A和探针B连接；
3)使用通用引物对步骤2)中产生的连接产物进行扩增；
4)使用特异性磁珠对步骤3)产物片段进行杂交；
5)使用链霉亲和素标记的荧光染料对步骤4)产物进行荧光标记；
6)检测步骤5)产物荧光信号并进行数据分析。
2.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤1)中，进行杂交的条件为：80-90℃，2-5min，缓慢降至室温，保持2-4h。
3.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述连接酶选自T4 DNA连接酶或T4 RNA连接酶或SplintR DNA连接酶。
4.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤2)中，连接条件为：16-37℃，15-60min-过夜。
5.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤3)中，扩增反应条件为：预变性95℃2min，热循环95℃15s，50℃30s，72℃40s，25个循环，最后延伸72℃5min。
6.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述特异性磁珠耦联有特异性核酸序列，每种磁珠上带有不同的标记，可与特定的PCR产物结合。
7.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤4)中，进行杂交的条件为：85-100℃，60-120s；25-40℃，10-20min。
8.根据权利要求1所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，步骤5)中，进行荧光标记的反应条件为：25-37℃，10-30min。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，还包括通过以下方法判断待测样本中是否还有目的miRNA：若检测值大于阴性对照检测值3倍，则待测样本中含有目的片段，否则为不含有目的片段。
10.根据权利要求1-8任意一项所述的一种多位点miRNA联合检测方法，其特征在于，还包括通过以下方法进行待测样本中miRNA定量：以10倍梯度稀释的已知浓度的目的片段标准品检测结果制作标准曲线，将待测样本检测结果带入公式，计算待测样本中目的miRNA片段的含量。
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