CN110114476B - 一种基于单荧光染料的测序方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种基于单荧光染料的测序方法。此外，还提供了一种经修饰的核苷和核苷酸以及包含所述核苷和/或核苷酸的试剂盒，其特别适合用于所述的测序方法。此外，还提供了所述核苷、核苷酸和试剂盒用于测序的用途。
Description
技术领域
本发明涉及核酸测序领域。特别地，本发明提供了一种基于单荧光染料的测序方法。此外，本发明还提供了一种经修饰的核苷和核苷酸以及包含所述核苷和/或核苷酸的试剂盒，其特别适合用于本发明所述的测序方法。此外，本发明还提供了所述核苷、核苷酸和试剂盒用于测序的用途。
背景技术
DNA测序技术包括以桑格(Sanger)测序法为代表的第一代DNA测序技术与以Illumina Hiseq2500,Roche 454,ABI Solid，BGISEQ-500等为代表的第二代DNA测序技术。桑格测序法具有实验操作简单、结果直观准确和实验周期短等特点，在对检测结果时效性要求很高的临床基因突变检测以及基因分型等领域有着广泛的应用。然而，桑格测序法的缺点是通量小、成本高，这限制了其在大规模基因测序中的应用。
第二代DNA测序技术与第一代DNA测序技术相比，具有测序通量大、成本低、自动化程度高和单分子测序的特点。以Hiseq2500V2的测序技术为例，其一个实验流程可以产生10-200G碱基的数据，平均每个碱基的测序成本不到桑格测序法的测序成本的1/1000，并且所获得的测序结果可通过计算机直接进行处理和分析。因此，第二代DNA测序技术非常适合于大规模测序。
目前已开发的第二代DNA测序技术主要涉及，边连接边测序(sequencing byligation,SBL)技术和边合成边测序(sequencing by synthesis,SBS)技术。这些测序技术的典型实例包括，Applied Biosystems公司开发的SOLiD测序法，Complete Genomics自主开发的组合探针锚定连接法(cPAL)和华大基因开发的组合探针锚定合成法(cPAS)，Illumina公司和Solexa technology公司合作开发的Illumina测序法等等。在这些测序方式中，Illumina和Complate Genomics采用了检测光信号的方法，为了实现4种碱基(A、T/U、C和G)的鉴别和区分，通常需要使用4种荧光染料来分别对这4种碱基进行标记。在这种情况下，为了读取各个碱基携带的荧光信号，测序装置必须配备至少2种单色激发光源和至少2个相机，这导致测序装置的制造成本昂贵且体积巨大。
已有研究报道，可通过使用2种荧光染料来实现对4种碱基的鉴别和区分(SaraGoodwin,et.al.Nature Reviews Genetics 17,333-351(2016))。例如，Illumina公司开发的NextSeq测序系统和Mini-Seq测序系统即使用了基于双荧光染料的测序方法。在此类测序方法中，通过2种荧光染料的不同组合来实现4种碱基的鉴别和区分。例如，可通过用第一荧光染料标记碱基A，用第二荧光染料标记碱基G，用第一和第二荧光染料同时标记碱基C，且不对碱基T/U进行标记，从而区分四种碱基。在此类测序方法中，测序装置仅需要一个相机，但仍然需要配备至少2种单色激发光源。因此，使用2种荧光染料的测序装置的制造成本和体积仍然相对较高。此外，与使用4种荧光染料的测序方法相比，基于双荧光染料的测序方法的测序质量明显下降，这主要是因为将双色荧光与单色荧光进行区分的难度较大，准确性有所下降。
而三代测序仪中Oxford Nanopore的测序仪因为其测序原理的不同使其测序仪本身非常小，甚至可以被携带至太空之后进行测序实验，相对于巨大的二代测序仪，三代展示了其在这方面的优越性，但是三代测序仪的错误率较高，限制了其应用价值，因此，需要开发新的测序方法，以进一步降低测序装置的制造成本和体积，并且确保高测序质量。
发明概述
为了解决上述技术问题，本申请的发明人开发了一种新的测序方法，其使用一种荧光染料，或者在同一激发条件下能够发出同样荧光信号的两种荧光染料，来区分4种碱基。由此，用于实施本发明测序方法的测序装置仅需配备一个激发光源和一个相机，从而大大降低了测序装置的制造成本和体积。例如，用于本发明测序方法的测序装置甚至可以方便地随身携带，用于即时/现场检测。此外，本发明的测序方法具有与基于4种荧光染料的测序方法相当的高测序质量，可用于各种测序应用中。
因此，在一个方面，本发明提供了一种对核酸分子进行测序的方法，其包括以下步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及四种化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系；其中，所述四种化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物，并且具有碱基互补配对能力；并且，所述四种化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基(-OH)被保护基团保护；并且，第一化合物和第三化合物不能发出荧光信号(例如不携带荧光基团)，第二化合物能够发出荧光信号(例如携带荧光基团)，第四化合物不能发出荧光信号，或者能够发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，携带荧光基团，所述荧光基团与第二化合物中的荧光基团相同，或所述荧光基团与第二化合物中的荧光基团结构不同，但二者具有相同或实质相同的发射光谱)；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)若第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(ii)若第四化合物不能发出荧光信号，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，对第四化合物进行修饰，使之携带荧光基团，所述荧光基团与第二化合物的荧光基团相同，或者与第二化合物的荧光基团相比具有相同的发射光谱)；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，对第三化合物进行修饰，使之携带荧光基团，所述荧光基团与第二化合物的荧光基团相同，或者与第二化合物的荧光基团相比具有相同的发射光谱)，并且能够去除第四化合物的荧光信号(例如，去除第四化合物上的荧光基团，或者淬灭由第四化合物上的荧光基团发出的荧光信号)；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够去除并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光信号，如果存在的话；和
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述四种化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
任选地，所述方法还包括下述步骤(11)：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在本发明的方法中，如果在步骤(4)中，第一化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于第一化合物本身不携带荧光基团，并且不受步骤(6)中的所述处理的影响，因此，在步骤(5)和(7)中将检测不到荧光信号。
如果在步骤(4)中，第二化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于第二化合物本身携带荧光基团，并且不受步骤(6)中的所述处理的影响，因此，在步骤(5)和(7)中将都检测到荧光信号。
如果在步骤(4)中，第三化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于第三化合物本身不携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测不到荧光信号；并且(ii)由于第三化合物经历了步骤(6)的所述处理，而能够发出荧光信号，因此，在步骤(7)中将检测到荧光信号。
如果在步骤(4)中，第四化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于第四化合物本身携带荧光基团或者在步骤(5)中经过处理而携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测到荧光信号；并且(ii)由于第四化合物经历步骤(6)的所述处理，而丧失了荧光信号，因此，在步骤(7)中将检测不到荧光信号。
因此，在某些优选的实施方案中，根据步骤(5)和(7)的检测结果来确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，其中，
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为第一化合物；
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为第二化合物；
当步骤(5)的检测结果为所述双链体不发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为第三化合物；并且
当步骤(5)的检测结果为所述双链体发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为第四化合物；
任选地，基于碱基互补配对原则，根据步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，确定待测序的核酸分子的相应位置处的碱基类型。
在某些示例性实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5b各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；
R7a为能够发出荧光信号的荧光基团(Dye1)，或者能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团，或者结合配对的一个成员；
并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R5b与R7a之间还存在能够进行第三生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，R7a为Dye1，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(ii)第四化合物不能发出荧光信号，R7a为能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团，或者结合配对的一个成员，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R7a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同的荧光基团)的试剂(例如结合配对的另一个成员，或者能够与R7a进行第二生物正交连接反应的化合物)发生特异性相互作用/特异性结合或者发生第二生物正交连接反应；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的结合配对的另一个成员具有下述结构：R7b-L-Dye1；其中，R7b为结合配对的另一个成员，L独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱；或者
所述携带荧光基团的能够与R7a进行第二生物正交连接反应的化合物具有下述结构：R7b-L-Dye1；其中，R7b为能够与R7a进行第二生物正交连接反应的基团，L独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的结构不同但发射光谱相同的荧光基团)的试剂发生第一生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使第四化合物中的R5b发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第三正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1发出的荧光信号；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a或R4b连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些示例性实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a(i)是第二结合配对的一个成员，同时是第三结合配对的一个成员；或者
(ii)只是第三结合配对的一个成员；并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物不能发出荧光信号，R6a为第二结合配对的一个成员，同时是第三结合配对的一个成员，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；(ii)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，R6a只是第三结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1或还连接有-L3-Dye1，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员特异性结合，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使第四化合物中的R6a与携带淬灭基团的第三结合配对的另一个成员特异性结合，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号，其中，
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R5b-L5-Dye3；其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L5独立地为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且与第二化合物包含的荧光基团结构相同，或者结构不同但具有相同的发射光谱；并且
所述携带淬灭基团的第三结合配对的另一个成员具有下述结构：R6c-L6-Que；其中，R6c为第二结合配对的另一个成员，L6独立地为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a、R4b或R4c连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
R6a(i)是第一结合配对的一个成员，同时是第二结合配对的一个成员；或者
(ii)只是第二结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物不能发出荧光信号，R6a为第一结合配对的一个成员，同时是第二结合配对的一个成员，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第一结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第一结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；(ii)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，R6a只是第二结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂发生第一生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使第四化合物中的R6a与携带淬灭基团的第二结合配对的另一个成员特异性结合，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号；其中，
所述携带淬灭基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6c-L'-Que；其中，R6c为第二结合配对的另一个成员，L'独立地为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a、R4b或R4c连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为能够发出荧光信号的荧光基团(Dye1)，能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团，和/或第二结合配对的一个成员；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c和R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，R6a为Dye1，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(ii)第四化合物不能发出荧光信号，R6a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团，或者第二结合配对的一个成员，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员，或者能够与R6a进行第一生物正交连接反应的化合物)发生特异性相互作用/特异性结合或者发生第一生物正交连接反应；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L’-Dye1；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L’独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；或者
所述携带荧光基团的能够与R6a进行第一生物正交连接反应的化合物具有下述结构：R6b-L’-Dye1；其中，R6b为能够与R6a进行第一生物正交连接反应的基团，L’独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员特异性结合，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使第四化合物中的R4c发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1发出的荧光信号；其中，
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R5b-L-Dye2；其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且与第二化合物包含的荧光基团相同，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a或R4b连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些示例性实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为第二结合配对的一个成员，任选地，R6a为Dye1或者还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物不能发出荧光信号，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；同时，R6b是第三结合配对的一个成员；
(ii)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员特异性结合，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使R6b与第三结合配对的另一成员R6c之间发生特异性相互作用/特异性结合，使R6b与R6a的结合物解离，从而使第四化合物失去荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号；其中，
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R5b-L5-Dye3；其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L5独立地为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且与第二化合物包含的荧光基团结构相同，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a、R4b或R4c连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
R6a为第一结合配对的一个成员，任选地，R6a为Dye1或者还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物不能发出荧光信号，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第一结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第一结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；同时，R6b是第二结合配对的一个成员；
(ii)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂发生第一生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使R6b与第二结合配对的另一成员R6c之间发生特异性相互作用/特异性结合，使R6b与R6a的结合物解离，从而使第四化合物失去荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号；其中，
所述携带淬灭基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6c-L'-Que；其中，R6c为第二结合配对的另一个成员，L'独立地为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a、R4b或R4c连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含如上文所定义的四种化合物。在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含四种化合物(即，第一、第二、第三和第四化合物)，其中：
所述四种化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物，且具有碱基互补配对能力；并且，
所述四种化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基(-OH)被保护基团保护；并且，所述保护基团能够被去除；
所述第一化合物和第三化合物不能发出荧光信号(例如不携带荧光基团)，所述第二化合物能够发出荧光信号，所述第四化合物不能发出荧光信号，或者能够发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，携带荧光基团，所述荧光基团与第二化合物中的荧光基团相同，或所述荧光基团与第二化合物中的荧光基团结构不同，但二者具有相同或实质相同的发射光谱)；并且，
所述第三化合物经处理后能够发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，使第三化合物携带与第二化合物相同的荧光基团，或者使第三化合物携带与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)；
若所述第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，所述第四化合物经处理后能够去除自身的荧光信号(例如，去除自身的荧光基团，或者淬灭由自身的荧光基团发出的荧光信号)；
若所述第四化合物不能发出荧光信号，则所述第四化合物经第一处理后能够发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，使第四化合物携带与第二化合物相同的荧光基团，或者使第四化合物携带与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)；并且，所述第四化合物经第二处理后能够去除自身的荧光信号(例如，去除自身的荧光基团，或者淬灭由自身的荧光基团发出的荧光信号)。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含：用于从样品中提取核酸分子的试剂和/或装置；用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
附图简述
图1显示了实验例1中获得的实验照片1和2的比较结果。
图2显示了实验例2中获得的实验照片1和2的比较结果。
图3显示了实验例3中获得的实验照片1和2的比较结果。
图4显示了实验例4中获得的实验照片1和2的比较结果。
序列信息
本发明涉及的序列的信息提供于下表中：
发明详述
在本发明中，除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同意思。在本发明的实施方案中，可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，下文仅仅是描述了例示性的适合的方法和材料。将所有公开出版物、专利申请、专利和其它参考文献并入本文作为参考。此外，所述材料、方法和实施例仅仅是示范性的而非限制性的。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“支持物”是指允许核酸稳定附着的任何材料(固体或半固体)，例如乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺凝胶、金薄层、玻璃和硅片等。在一些示例性实施方案中，所述支持物是光学透明的，例如玻璃。如本文中所使用的，“稳定附着”是指，核酸分子与支持物之间的连接足够强，从而核酸分子不会因各种反应或处理(例如聚合反应、生物正交切割反应、生物正交连接反应和洗涤处理)所使用的条件而脱离支持物。
如本文中所使用的，术语“连接”意欲涵盖任何形式的连接，例如共价连接和非共价连接。在某些示例性实施方案中，核酸分子优选地通过共价方式与支持物相连接。
如本文中所使用的，术语“片段化”是指，将大的核酸片段(例如大的DNA片段)转变成小的核酸片段(例如小的DNA片段)的过程。在某些实施方案中，术语“大的核酸片段”意欲涵盖大于5kb，大于10kb，大于25kb的核酸分子(例如DNA)，例如大于500kb，大于1Mb，大于5Mb或更大的核酸分子(例如DNA)。
如本文中所使用的，术语“末端补齐”是指，将具有悬突末端的核酸分子的末端补齐，形成具有钝末端的核酸分子的过程。
在本文中，术语“接头”和“接头序列”可互换使用。如本文中所使用的，术语“接头”和“接头序列”是指，在核酸分子的5'和/或3'端人为引入的一段寡核苷酸序列。接头通常可包含一个或多个用于实现特定功能的区域。由此，当在核酸分子的5'和/或3'端人为引入接头时，接头将能够实现所述特定功能，从而利于后续应用。例如，接头可包含一个或多个引物结合区，以便于引物的结合。在一些示例性实施方案中，所述接头可包含一个或多个引物结合区，例如能够与用于进行扩增的引物杂交的引物结合区，和/或能够与用于测序反应的引物杂交的引物结合区。在某些优选实施方案中，所述接头包含，能够与通用引物杂交的通用接头序列，例如，能够与通用扩增引物和/或通用测序引物杂交的通用接头序列。由此，可方便地通过使用通用扩增引物和/或通用测序引物，对携带有接头的核酸分子进行扩增和/或测序。在一些示例性实施方案中，所述接头还可包含标签或标签序列。
在本文中，术语“标签”和“标签序列”可互换使用。如本文中所使用的，术语“标签”和“标签序列”是指，在核酸分子的5'和/或3'端人为引入的、具有特定碱基序列的一段寡核苷酸序列。标签通常用于鉴别/区分核酸分子的来源。例如，可在不同来源的核酸分子中分别引入不同的标签，由此，当这些不同来源的核酸分子混合在一起时，可通过各个核酸分子上携带的独特标签序列，准确地确定每一个核酸分子的来源。根据实际需要，标签序列可以具有任意长度，例如2-50bp，例如2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50bp。
如本文中所使用的，术语“杂交”通常是指，严紧条件下的杂交。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。为了举例说明的目的，所述严紧条件包括例如，中度严紧条件(例如，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，然后在0.2×SSC/0.1％SDS中于约50-65℃下进行一次或多次洗涤)；高度严紧条件(例如，在6×SSC中约45℃下杂交，然后在0.1×SSC/0.2％SDS中于约68℃下进行一次或多次洗涤)；以及本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件(参见例如Ausubel,F.M.等编,1989,Current Protocols in MolecularBiology,第1卷,Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&Sons,Inc.,纽约，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。
如本文中所使用的，表述“含有溶液相和固相的反应体系”是指，本发明的反应体系既包含支持物以及连接于支持物的物质(固相)，又包含溶解于溶液/溶剂中的物质(溶液相)。相应地，表述“移除反应体系的溶液相”是指，将反应体系中的溶液以及其包含的物质(溶液相)移除，而仅保留反应体系中的支持物以及连接于支持物的物质(固相)。在本发明的背景中，连接于支持物的物质(固相)可包括，待测序的核酸分子，生长的核酸链，和/或由待测序的核酸分子和生长的核酸链形成的双链体。
如本文中所使用的，术语“引物”是指，含有能与互补序列杂交并引发特异性聚合反应的寡核苷酸序列。在通常情况下，选择/设计引物的序列，以使其对互补序列具有最大杂交活性，而对其他序列具有非常低的非特异性杂交活性，从而尽可能减少非特异性扩增。设计引物的方法是本领域技术人员公知的，并且可用商业化的软件(例如Primer Premierversion 6.0，Oligo version 7.36等)来执行。
如本文中所使用的，术语“聚合酶”是指，能够进行核苷酸聚合反应的酶。此类酶能够按照碱基互补配对原则，在生长的核酸链的3'端引入与模板核酸相应位置的核苷酸配对的核苷酸。
如本文中所使用的，表述“A、(T/U)、C和G”意欲涵盖两种情况：“A、T、C和G”和“A、U、C和G”。因此，表述“所述四种化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物”意欲表示，所述四种化合物分别为核苷酸A、T、C和G的衍生物，或者分别为核苷酸A、U、C和G的衍生物。
如本文中所使用的，表述“化合物具有碱基互补配对能力”是指，化合物能够按照碱基互补配对原则，与对应的碱基配对并形成氢键。按照碱基互补配对原则，碱基A能够与碱基T或U配对，碱基G能够与碱基C配对。因此，当具有碱基互补配对能力的化合物为核苷酸A的衍生物时，其将能够与碱基T或U配对；当具有碱基互补配对能力的化合物为核苷酸T或U的衍生物时，其将能够与碱基A配对；当具有碱基互补配对能力的化合物为核苷酸C的衍生物时，其将能够与碱基G配对；当具有碱基互补配对能力的化合物为核苷酸G的衍生物时，其将能够与碱基C配对。
如本文中所使用的，表述“羟基(-OH)被保护基团保护”是指，游离羟基(-OH)中的H被保护基团(P)取代，形成受保护的羟基(-OP)。在某些优选的实施方案中，保护基团(P)能够被去除，从而，受保护的羟基(-OP)能再次转化为游离的羟基(-OH)。
如本文中所使用的，术语“结合配对”意指，能够通过特异性非共价作用而相互作用的一对分子(即，两个成员)。在通常情况下，结合配对的两个成员依赖于彼此的三维结构，而实现特异性相互作用(即，特异性识别和结合)。典型的结合配对包括例如，抗原(例如小分子抗原)-抗体、半抗原-抗体、激素-受体、配体-受体、核酸链-互补核酸链、底物-酶、底物类似物-酶、抑制剂-酶、糖-植物凝集素、生物素-抗生物素蛋白(例如，亲和素和链酶亲和素)、地高辛和地高辛抗体，以及5位溴代去氧鸟苷和其抗体等。
如本文中所使用的，术语“特异性相互作用/结合”是指，两个分子间的非随机的相互作用/结合反应，例如抗体和其所针对的抗原之间的相互作用。在某些实施方式中，结合配对的两个成员之间存在特异性相互作用是指，结合配对的一个成员以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合另一个成员。
如本文中所使用的，术语“KD”是指结合配对的两个成员相互作用的解离平衡常数，其用于描述两个成员之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，两个成员之间的结合越紧密，两个成员之间的亲和力越高。通常，结合配对的一个成员以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合另一个成员。可使用各种已知的方法来测定结合配对的两个成员的结合亲和力，例如，使用表面等离子体共振术(SPR)来进行测定。
如本文中所使用的，术语“生物正交反应”是指，可以在生物体(例如活的细胞或组织)内发生，而不影响生物体自身的生化反应的化学反应。生物正交反应在生理条件下具有很强的活性和选择性，其底物和/或反应机理在生物体中少见或者没有，因此对生物体内的活性分子保持良好的惰性，可以不被打扰地在生物体内进行。生物正交反应可用于对生物大分子或活性小分子进行标记，可在分子成像、药物筛选等方面得到应用。
如本文中所使用的，术语“生物正交切割反应”是指，底物中的反应性基团经历共价键的断裂而生成产物的生物正交反应。可用作生物正交切割反应的化学反应包括但不限于：Ru-催化的脱烯丙基反应，Pd-催化的脱炔丙基反应，Cu-催化的脱炔丙基反应，特异性的IED-DA–引发的“点击-裂解”反应(specific IED-DA–induced‘click and release’reaction)，SPAAC引发的芳基叠氮还原反应(strain-promoted alkene-azidecycloaddition–induced aryl azide reduction)。
如本文中所使用的，术语“生物正交连接反应”是指，底物中的反应性基团经历共价键的形成而生成产物的生物正交反应。可用作生物正交连接反应的化学反应包括但不限于：施陶丁格连接反应(Staudinger Ligation)，一价铜离子催化的叠氮与炔基的环加成反应(Cu catalyzed azide-alkyne cycloaddition,AAC)，环张力驱动的叠氮与炔基的环加成反应(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition,SPAAC)，逆电子需求的狄尔斯—阿尔德反应(inverse electron-demand Diels-Alder reaction(IEDDA))，Pd-催化的Suzuki交叉偶联反应(palladium-mediated Suzuki cross-coupling)，巯基和巯基衍生物的二硫键形成反应。
如本文中所使用的，术语“反应性基团”是指，能够发生化学反应的基团。表述“能够发生生物正交连接反应的反应性基团”是指，所述反应性基团能够与另一反应性基团(互补基团)进行生物正交连接反应，并在两个反应性基团之间形成共价键，导致包含这两个反应性基团的不同化合物之间或同一化合物的不同部分之间产生共价连接。表述“能够发生生物正交切割反应的反应性基团”是指，所述反应性基团能够进行生物正交切割反应，并导致所述反应性基团或其部分从包含该反应性基团的化合物上断裂或脱离。
如本文中所使用的，术语“环烯亚基”既包括环烯烃上同一个碳原子消除两个氢原子得到的二价基团，也包括环烯烃上两个碳原子各消除一个氢原子得到的二价基团。
如本文中所使用的，都表示反式环辛烯。
(一)测序方法
本申请的发明人开发了一种新的测序方法，其使用一种荧光染料来区分4种碱基。
因此，在一个方面，本发明提供了一种对核酸分子进行测序的方法，其包括以下步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及四种化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系；其中，所述四种化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物，并且具有碱基互补配对能力；并且，所述四种化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基(-OH)被保护基团保护；并且，第一化合物和第三化合物不能发出荧光信号(例如不携带荧光基团)，第二化合物能够发出荧光信号(例如携带荧光基团)，第四化合物不能发出荧光信号，或者能够发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，携带荧光基团，所述荧光基团与第二化合物中的荧光基团相同，或所述荧光基团与第二化合物中的荧光基团结构不同，但二者具有相同或实质相同的发射光谱)；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)若第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(ii)若第四化合物不能发出荧光信号，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，对第四化合物进行修饰，使之携带荧光基团，所述荧光基团与第二化合物的荧光基团相同，或者与第二化合物的荧光基团相比具有相同的发射光谱)；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，对第三化合物进行修饰，使之携带荧光基团，所述荧光基团与第二化合物的荧光基团相同，或者与第二化合物的荧光基团相比具有相同的发射光谱)，并且能够去除第四化合物的荧光信号(例如，去除第四化合物上的荧光基团，或者淬灭由第四化合物上的荧光基团发出的荧光信号)；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够去除并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光信号，如果存在的话；和
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述四种化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
任选地，所述方法还包括下述步骤(11)：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
核酸分子
在本发明的方法中，待测序的核酸分子可以是任何目的核酸分子。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、或其任何组合。在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其类型的限制。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为DNA或RNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子可以为基因组DNA，线粒体DNA，叶绿体DNA，mRNA，cDNA，miRNA，或siRNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为线性的或者环状的。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为双链的或者单链的。例如，所述待测序的核酸分子可以为单链DNA(ssDNA)，双链DNA(dsDNA)，单链RNA(ssRNA)，双链RNA(dsRNA)，或者DNA和RNA的杂合体。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为单链DNA。在某些优选的实施方案中，所述待测序的核酸分子为双链DNA。
在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其来源的限制。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子可以获自任何来源，例如，任何细胞、组织或生物体(例如，病毒，细菌，真菌，植物和动物)。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子源自哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、啮齿类动物或犬科动物)、植物、鸟类、爬行类、鱼类、真菌、细菌或病毒。
从细胞、组织或生物体中提取或获得核酸分子的方法是本领域技术人员公知的。合适的方法包括但不限于乙醇沉淀法，氯仿抽提法等。关于此类方法的详细描述可参见例如，J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995。另外，还可使用各种商业化的试剂盒来从各种来源(例如细胞、组织或生物体)提取核酸分子。
在本发明的方法中，待测序的核酸分子不受其长度的限制。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的长度可以为至少10bp，至少20bp，至少30bp，至少40bp，至少50bp，至少100bp，至少200bp，至少300bp，至少400bp，至少500bp，至少1000bp，或者至少2000bp。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的长度可以为10-20bp，20-30bp，30-40bp，40-50bp，50-100bp，100-200bp，200-300bp，300-400bp，400-500bp，500-1000bp，1000-2000bp，或者超过2000bp。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子可具有10-1000bp的长度，以利于进行高通量测序。
在某些优选的实施方案中，在将核酸分子连接于支持物之前，可以对核酸分子进行预处理。此类预处理包括但不限于，核酸分子的片段化，末端的补齐，接头的添加，标签的添加，切口的修复，核酸分子的扩增，核酸分子的分离和纯化，以及其任何组合。
例如，在某些优选的实施方案中，为了获得具有合适长度的核酸分子，可以对核酸分子进行片段化处理。在本发明的方法中，可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行核酸分子(例如DNA)的片段化。例如，可通过酶学方法或机械方法进行片段化。所述机械方法可以是超声波或物理剪切。所述酶学方法可以通过用核酸酶(例如，脱氧核糖核酸酶)或限制性核酸内切酶消化来进行。在某些优选的实施方案中，所述片段化导致序列未知的末端。在某些优选的实施方案中，所述片段化导致序列已知的末端。
在某些优选的实施方案中，所述酶学方法使用DNA酶I来对核酸分子进行片段化。DNA酶I是一种非特异性剪切双链DNA(dsDNA)以释放5'磷酸化的二核苷酸、三核苷酸和寡核苷酸产物的通用酶。DNA酶I在含有Mn2+、Mg2+和Ca2+但不含其它盐的缓冲液中具有最佳活性，其通常用于将一个大的DNA基因组片段化成为小的DNA片段，随后所产生的小的DNA片段可用于构建DNA文库。
DNA酶I的剪切特性将导致DNA分子的随机消化(即，没有序列偏向性)，并且当在含有锰离子的缓冲液存在的情况下使用时，主要产生钝末端dsDNA片段(Melgar,E.和D.A.Goldthwait.1968.Deoxyribonucleic acid nucleases.II.The effects of metal on themechanism of action of deoxyribonuclease I.J.Biol.Chem.243:4409)。当使用DNA酶I处理基因组DNA时，可考虑以下三种因素：(i)所用酶的量(单位)；(ii)消化温度(℃)；和(iii)温育时间(分钟)。通常，可以在10℃-37℃之间，用DNA酶I消化大的DNA片段或全基因组DNA 1-2分钟，以产生具有合适长度的DNA分子。
因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，对目的核酸分子(待测序的核酸分子)进行片段化。在某些优选的实施方案中，通过酶学方法或机械方法对待测序的核酸分子进行片段化处理。在某些优选的实施方案中，使用DNA酶I对待测序的核酸分子进行片段化。在某些优选的实施方案中，通过超声处理来待测序的核酸分子进行片段化。在某些优选的实施方案中，经片段化的核酸分子的长度为50-2000bp，例如50-100bp，100-200bp，200-300bp，300-400bp，400-500bp，500-1000bp，1000-2000bp，50-1500bp，或50-1000bp。
双链核酸分子(例如dsDNA，基因组DNA)的片段化可产生具有钝末端的或长度为一个或两个核苷酸的悬突的核酸片段。例如，当用超声法或者DNA酶I处理基因组DNA(gDNA)时，其产物可包含具有钝末端或悬突的DNA片段。在这种情况下，可使用聚合酶将具有悬突的核酸分子的末端补齐，形成具有钝末端的核酸分子，以利于后续的应用(例如便于将经片段化的核酸分子与接头连接)。
因此，在某些优选的实施方案中，在对待测序的核酸分子(例如dsDNA)进行片段化后，用DNA聚合酶来处理经片段化的核酸分子，以产生具有钝末端的DNA片段。在某些优选的实施方案中，所述DNA聚合酶可以是任何已知的DNA聚合酶，例如T4DNA聚合酶，Pfu DNA聚合酶，Klenow DNA聚合酶。在某些情况下，Pfu DNA聚合酶的使用可能是有利的，这是因为PfuDNA聚合酶不仅能够补齐悬突部分形成钝末端，而且其具有3'-5'核酸外切酶活性，能够去除单核苷酸和双核苷酸突起，从而进一步增加具有钝末端的DNA片段的数量(Costa,G.L.和M.P.Weiner.1994a.Protocols for cloning and analysis of blunt-ended PCR-generated DNA fragments.PCR Methods Appl 3(5):S95；Costa,G.L.t A.Grafsky和M.P.Wemer.1994b.Cloning and analysis of PCR-generated DNA fragments.PCRMethods Appl 3(6):338；Costa,G.L.和M.P.Weiner.1994c.Polishing with T4or Pfupolymerase increases the efficiency of cloning of PCR products.Nucleic AcidsRes.22(12):2423)。
在某些优选的实施方案中，可以在待测序的核酸分子的5'和/或3'端引入接头。在一般情况下，接头为寡核苷酸序列，并且其可以是任何序列，任意长度。可用本领域熟知的方法选择具有合适长度和序列的接头。例如，连接于待测序的核酸分子末端的接头通常是长度为5-100个核苷酸(例如5-10bp，10-20bp，20-30bp，30-40bp，40-50bp，50-100bp)之间的相对较短的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述接头可具有引物结合区。此类引物结合区可与引物发生退火或杂交，从而可用于引发特异性聚合酶反应。在某些优选的实施方案中，所述接头具有一个或多个引物结合区。在某些优选的实施方案中，所述接头具有能够与用于进行扩增的引物杂交的一个或多个区域。在某些优选的实施方案中，所述接头具有能够与用于测序反应的引物杂交的一个或多个区域。在某些优选的实施方案中，在待测序的核酸分子的5'端引入接头。在某些优选的实施方案中，在待测序的核酸分子的3'端引入接头。在某些优选的实施方案中，在待测序的核酸分子的5'端和3'端引入接头。在一些实施方案中，所述接头包含，能够与通用引物杂交的通用接头序列。在一些实施方案中，所述接头包含，能够与通用扩增引物和/或通用测序引物杂交的通用接头序列。
在某些优选的实施方案中，可以在待测序的核酸分子中引入标签序列，或者可以在上文所述的接头中引入标签序列。标签序列是指具有特定碱基序列的一段寡核苷酸。根据实际需要，标签序列可以具有任意长度，例如2-50bp，例如2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50bp。在某些优选的实施方案中，使每个待测序的核酸分子均带上含特定序列的标签序列，以利于区分每个待测序的核酸分子的来源。在某些优选的实施方案中，可直接在待测序的核酸分子的5'和/或3'端引入标签序列。在某些优选的实施方案中，可在接头中引入标签序列，然后再将接头连接至待测序的核酸分子的5'和/或3'端。标签序列可以位于接头序列的任何位置，例如接头序列的5'和/或3'端。在某些优选的实施方案中，接头包含引物结合区和标签序列。在某些进一步优选的实施方案中，所述引物结合区包含可被通用引物识别的通用接头序列，并且优选地，标签序列可位于引物结合区的3'端。
在某些优选的实施方案中，使用不同的标签序列来标记/区分来自不同来源的核酸分子。在此类实施方案中，优选地，将相同的标签序列引入相同来源的核酸分子，并且针对每一种核酸来源，使用一种独特的标签序列。随后，可将不同来源的核酸分子组合在一起，构成文库，并通过各个核酸分子上所携带的独特标签序列来鉴别/区分文库中的各个核酸分子的来源。
可通过本领域熟知的方法(例如，PCR或连接反应)，将待测序的核酸分子与接头或标签序列相连接。例如，如果待测序的核酸分子的一部分序列是已知的，那么，可使用适当的PCR引物(其含有接头序列以及能够特异性识别待测序的核酸分子的序列)通过PCR对待测序的核酸分子进行扩增。所获得的扩增产物即是在5'和/或3'端引入了接头的待测核酸分子。在某些实施方案中，可使用非特异性的连接酶(例如T4DNA连接酶)，将核酸分子与接头相连接。在某些实施方案中，可使用限制性内切酶对核酸分子和接头进行处理，从而使它们具有相同的粘性末端，随后可使用连接酶将具有相同的粘性末端的核酸分子和接头连接在一起，从而获得与接头相连接的核酸分子。
在某些实施方案中，在使用连接酶将核酸分子和接头连接在一起后，所获得的产物在接合处可存在切口。在这种情况下，可使用聚合酶来修复这种切口。例如，丧失3'-5'核酸外切酶活性但显示5'-3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶可具有识别切口并修复切口的能力(Hamilton,S.C.,J.W.Farchaus and M.C.Davis.2001.DNA polymerases as enginesfor biotechnology.BioTechniques 31:370)。可用于这种用途的DNA聚合酶包括例如硫化氢热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosulfuricus)的polI、大肠肝菌(E.coli)的DNApolI、和噬菌体phi29。在一个优选的实施方案中，将嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的polI用于修复dsDNA的切口并且形成无缺口的dsDNA。
在某些优选的实施方案中，还可以对待测序的核酸分子进行扩增，以增加核酸分子的量或者拷贝数。用于扩增核酸分子的方法是本领域技术人员所熟知的，其典型实例为PCR。例如，可使用下述方法来扩增核酸分子：(i)需要温度循环的聚合酶链式反应(PCR)(参见例如，Saiki等人，1995.Science 230:1350-1354)，连接酶链式反应(参见例如，Barany,1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193；Barringer等人,1990.Gene 89:117-122)，和基于转录的扩增(参见例如，Kwoh等人，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)；(ii)等温扩增系统(参见例如，Guatelli等人，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)；QP复制酶系统(参见例如，Lizardi等人，1988.BioTechnology6:1197-1202)；和链置换扩增(Nucleic Acids Res.1992Apr 11；20(7):1691-6)。在某些优选的实施方案中，通过PCR来扩增待测序的核酸分子，并且，用于进行PCR扩增的引物包含接头序列和/或标签序列。由此所产生的PCR产物将带有接头序列和/或标签序列，从而可方便地用于后续应用(例如高通量测序)。
在某些优选的实施方案中，在进行各种预处理步骤之前或之后，还可以对待测序的核酸分子进行分离和纯化。此类分离和纯化步骤可能是有利的。例如，在某些优选的实施方案中，所述分离和纯化步骤可用于获得具有适宜长度(例如50-1000bp)的待测序的核酸分子，以利于后续应用(例如高通量测序)。在某些优选的实施方案中，可利用琼脂糖凝胶电泳来分离和纯化待测序的核酸分子。在某些优选的实施方案中，可以通过大小排阻层析法或蔗糖沉降来分离和纯化待测序的核酸分子。
应当理解的是，上述的预处理步骤(例如，片段化，末端补齐，添加接头，添加标签，切口修复，扩增，分离和纯化)仅仅是示例性的，而非限制性的。本领域技术人员可以根据实际需要，对待测序的核酸分子进行各种期望的预处理，并且各个预处理步骤不受特定的顺序限制。例如，在某些实施方案中，可以先对核酸分子进行片段化并添加接头，然后再进行扩增。在另一些实施方案中，可以先对核酸分子进行扩增，然后再进行片段化和添加接头。在某些实施方案中，对核酸分子进行片段化并添加接头，而不进行扩增步骤。
在某些示例性实施方案中，在步骤(1)之前，对目的核酸分子(例如，基因组DNA)进行下述预处理：
(i)对所述目的核酸分子(例如大的核酸片段，例如基因组DNA)进行片段化，从而产生经片段化的核酸分子；
(ii)将经片段化的核酸分子与接头序列(其例如包含，能够与通用扩增引物杂交的引物结合区，能够与通用测序引物杂交的引物结合区，和/或标签序列)连接，并任选地进行分离、纯化和变性，从而产生待测序的核酸分子；
(iii)将待测序的核酸分子与支持物相连接，从而获得连接于支持物上的待测序的核酸分子。
支持物
在通常情况下，用于连接待测序的核酸分子的支持物呈固相，以便于操作。因此，在本公开内容中，“支持物”有时也被称为“固体支持物”或“固相支持物”。然而，应当理解的是，本文所提及的“支持物”并不限于固体，其还可以是半固体(例如凝胶)。
在本发明的方法中，用于连接待测序的核酸分子的支持物可以由各种合适的材料制成。此类材料包括例如：无机物、天然聚合物、合成聚合物，以及其任何组合。具体的例子包括但不限于：纤维素、纤维素衍生物(例如硝化纤维素)、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯等交联的聚苯乙缔(参见例如，Merrifield Biochemistry 1964,3,1385-1390)、聚丙烯酰胺、乳胶、葡聚糖、橡胶、硅、塑料、天然海绵、金属塑料、交联的葡聚糖(例如，SephadexTM)、琼脂糖凝胶(SepharoseTM)，以及本领域技术人员已知的其他支持物。
在某些优选的实施方案中，用于连接待测序的核酸分子的支持物可以是包括惰性基底或基质(例如，载玻片、聚合物珠等)的固体支持物，所述惰性基底或基质已例如通过应用含有活性基团的中间材料而被功能化，所述活性基团允许共价连接诸如多核苷酸的生物分子。此类支持物的实例包括但不限于，负载于诸如玻璃的惰性基底上的聚丙酰胺水凝胶，特别是WO 2005/065814和US2008/0280773中描述的聚丙烯酰胺水凝胶，其中，所述专利申请的内容通过引用以其全文并入本文。在此类实施方案中，生物分子(例如多核苷酸)可被直接地共价地连接至中间材料(例如水凝胶)，而中间材料其自身可被非共价地连接至基底或基质(例如，玻璃基底)。在某些优选的实施方案中，所述支持物为表面修饰了一层亲和素、氨基、丙烯酰胺硅烷或醛基化学基团的玻片或硅片。
在本发明中，支持物或固体支持物不受限于其大小、形状和构造。在一些实施方案中，支持物或固体支持物是平面结构，例如载片、芯片、微芯片和/或阵列。此类支持物的表面可以是平面层的形式。
在一些实施方案中，支持物或其表面是非平面的，例如管或容器的内表面或外表面。在一些实施方案中，支持物或固体支持物包括微球或珠。本文中“微球”或“珠”或“颗粒”或语法上的等同物是指小的离散颗粒。合适的珠成分包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁材料、二氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶、交联葡聚糖例如Sepharose、纤维素、尼龙、交联胶束和teflon，以及本文概述的用于制备固体支持物的任何其他材料。此外，珠可以是球形的，也可以是非球形的。在一些实施方案中，可以使用球形的珠。在一些实施方案中，可以使用不规则的颗粒。此外，珠还可以是多孔的。
在某些优选的实施方案中，用于连接待测序的核酸分子的支持物为珠或孔的阵列(其也被称为芯片)。所述阵列可以使用本文概述的用于制备固体支持物的任何材料来制备，并且优选地，阵列上的珠或孔的表面进行了官能化，以利于核酸分子的连接。阵列上的珠或孔的数目不受限制。例如，每一个阵列可包含10-102、102-103、103-104、104-105、105-106、106-107、107-108、108-109或更多个珠或孔。在某些示例性实施方案中，每个珠或孔的表面可连接一个或多个核酸分子。相应地，每一个阵列可连接10-102、102-103、103-104、104-105、105-106、106-107、107-108、108-109或更多个核酸分子。因此，此类阵列可特别有利地用于核酸分子的高通量测序。
如本领域普遍所知的，可利用多种技术来制造支持物。此类技术包括但不限于照相平板印刷术、冲压技术、塑膜技术和显微蚀刻技术。如将被本领域人员所领会的，所使用的技术将取决于支持物的组成、结构和形状。
待测序的核酸分子与支持物的连接
在本发明的方法中，可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)。例如，可通过共价连接，或通过不可逆的被动吸附，或通过分子间的亲和力(例如，生物素与亲和素之间的亲和力)，将待测序的核酸分子与支持物相连接。然而优选的是，待测序的核酸分子与支持物之间的连接足够强，从而核酸分子不会因各种反应(例如聚合反应、生物正交切割反应和生物正交连接反应)所使用的条件以及水或缓冲溶液的洗涤而脱离支持物。
例如，在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的5'端携带有能够将该核酸分子共价连接于支持物的装置，例如化学修饰的官能团。此类官能团的实例包括但不限于磷酸基团、羧酸分子、醛分子、硫醇、羟基、二甲氧基三苯甲基(DMT)或氨基。
例如，在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的5'端可用化学官能团(例如磷酸、硫醇或氨基基团)进行修饰，并且支持物(例如多孔玻璃珠)用氨基-烷氧基硅烷(例如氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基丙基三乙氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷等)进行衍生，从而可通过活性基团之间的化学反应将核酸分子共价连接在支持物上。在某些优选的实施方案中，待测序的核酸分子的5'端可用羧酸或醛基进行修饰，并且支持物(例如乳胶珠)用肼进行衍生，从而可通过活性基团之间的化学反应将核酸分子共价连接在支持物上(Kremsky等人，1987)。
另外，还可以采用交联剂将目的核酸分子与支持物相连接。此类交联剂包括例如，琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐(Guo等人，1994)、马来酸酐(Yang等人，1998)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、间-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺(SMCC)、N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺(SMPB)，以及相应的硫代化合物(水溶性的)。
此外，还可用双功能交联剂(例如同源双功能交联剂和异源双功能交联剂)对支持物进行衍生，从而提供经修饰的功能化表面。随后，具有5'-磷酸、硫醇或氨基基团的核酸分子即能够与功能化表面相互作用，形成核酸和支持物之间的共价连接。大量的双功能交联剂及其使用方法是本领域公知的(参见例如，Pierce Catalog and Handbook,第155-200页)。
引物、聚合酶和碱基衍生物
在某些优选的实施方案中，在步骤(2)中，向所述待测序的核酸分子添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及四种碱基衍生物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系。
在本发明的方法中，引物可以是任何长度，并且可以包含任何序列或任何碱基，只要它能够特异性地退火到目标核酸分子的一个区域上。换言之，在本发明的方法中，引物不受限于其长度、结构和组成。例如，在一些示例性实施方案中，所述引物的长度可以为5-50bp，例如5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50bp。在一些示例性实施方案中，所述引物能够形成二级结构(例如发夹结构)。在一些示例性实施方案中，所述引物不形成任何二级结构(例如发夹结构)。在一些示例性实施方案中，所述引物可包含天然存在或非天然存在的核苷酸。在一些示例性实施方案中，所述引物包含天然存在的核苷酸或者由天然存在的核苷酸组成。在一些示例性实施方案中，所述引物包含经修饰的核苷酸，例如锁核酸(LNA)。在一些示例性实施方案中，所述引物能够在严紧条件(例如中度严紧条件或高度严紧条件)下与目的核酸分子杂交。在一些示例性实施方案中，所述引物具有与目的核酸分子中的靶序列完全互补的序列。在一些示例性实施方案中，所述引物与目的核酸分子中的靶序列是部分互补的(例如，存在错配)。在一些示例性实施方案中，所述引物包含通用引物序列。在一些示例性实施方案中，所述待测序的核酸分子包含接头，并且所述接头包含能够与通用引物杂交的序列，并且所使用的引物为通用引物。
在本发明的方法中，可使用各种已知的聚合酶来进行核苷酸聚合反应。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以DNA为模板合成新的DNA链(例如DNA聚合酶)。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以RNA为模板合成新的DNA链(例如反转录酶)。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以DNA或RNA为模板合成新的RNA链(例如RNA聚合酶)。因此，在某些优选的实施方案中，所述聚合酶选自DNA聚合酶，RNA聚合酶，和反转录酶。可根据实际需要，选择合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应。在某些优选的实施方案中，所述聚合反应为聚合酶链式反应(PCR)。在某些优选的实施方案中，所述聚合反应为反转录反应。
此外，如上文所描述的，在本发明的方法中，可重复进行步骤(4)-(7)。因此，在本发明的某些优选实施方案中，可进行一轮或多轮的核苷酸聚合反应。换言之，在本发明的某些优选实施方案中，可在一个或多个步骤中进行核苷酸聚合反应。在这种情况下，每一轮核苷酸聚合反应可以使用相同或不同的聚合酶。例如，可在第一轮核苷酸聚合反应中使用第一种DNA聚合酶，并且可在第二轮核苷酸聚合反应中使用第二种DNA聚合酶。然而，在某些示例性实施方案中，在所有的核苷酸聚合反应中，使用相同的聚合酶(例如相同的DNA聚合酶)。
在本发明的方法中，步骤(2)中所使用的四种化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物。在某些示例性实施方案中，所述的四种化合物分别为核糖或脱氧核糖核苷酸A、T、C和G的衍生物。在某些示例性实施方案中，所述的四种化合物分别为核糖或脱氧核糖核苷酸A、U、C和G的衍生物。特别有利地，所述的四种化合物在核苷酸聚合反应过程中，彼此之间不会发生化学反应。
此外，所述的四种化合物具有碱基互补配对能力。例如，当所述化合物为核苷酸A的衍生物时，其将能够与碱基T或U配对。当所述化合物为核苷酸T或U的衍生物时，其将能够与碱基A配对。当所述化合物为核苷酸C的衍生物时，其将能够与碱基G配对。当所述化合物为核苷酸G的衍生物时，其将能够与碱基C配对。由此，在步骤(4)中，聚合酶(例如DNA聚合酶)将根据碱基互补配对原则，将能够与模板核酸中相应位置处的碱基互补配对的化合物并入生长的核酸链的3'端。相应地，在通过荧光信号确定并入生长的核酸链3'端的化合物的类型后，可通过碱基互补配对原则，确定模板核酸中相应位置处的碱基的类型。例如，如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为核苷酸A的衍生物，那么即可确定模板核酸中相应位置处的碱基为T或U。如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为核苷酸T或U的衍生物，那么即可确定模板核酸中相应位置处的碱基为A。如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为核苷酸C的衍生物，那么即可确定模板核酸中相应位置处的碱基为G。如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为核苷酸G的衍生物，那么即可确定模板核酸中相应位置处的碱基为C。
在某些优选实施方案中，所述四种化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基(-OH)是受保护的。换言之，在某些优选实施方案中，在所述四种化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基(-OH)被保护基团保护，从而，它们能够终止聚合酶(例如DNA聚合酶)的聚合作用。例如，当所述四种化合物中的任一种被引入生长的核酸链的3'端时，由于该化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处不存在游离的羟基(-OH)，聚合酶将无法继续进行下一轮的聚合反应，从而聚合反应将被终止。在这种情况下，在每一轮的聚合反应中，将有且只有一个碱基被并入生长的核酸链。
特别有利地，所述四种化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团能够被去除。在某些优选的实施方案中，在步骤(7)之后(例如，在步骤(8)中)，将所述保护基团去除，并转变为游离的羟基(-OH)。随后，可使用聚合酶和所述四种化合物对生长的核酸链进行下一轮的聚合反应，并再次引入一个碱基。
因此，步骤(2)中所使用的四种化合物具有可逆终止特性：当它们被并入生长的核酸链的3'端(例如在步骤(4)中)时，它们将终止聚合酶继续进行聚合作用，终止生长的核酸链的进一步延伸；并且，在它们所包含的保护基团被去除后，聚合酶将能够继续对生长的核酸链进行聚合作用(例如在步骤(10)中)，继续延伸核酸链。
荧光信号和荧光基团
在本发明的方法中，可使用任何能发出荧光信号的材料(例如，荧光基团)。荧光基团的实例包括但不限于各种已知的荧光标记物，例如AF532,ALEX-350,FAM,VIC,TET,CALGold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CALFluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705等。此类荧光基团及其检测方法是本领域公知的，并且可根据实际需要进行选择。
不同的荧光基团可能会在同样的或接近的激发条件下有相同或实质相同的发射光谱，从而发出相同或实质相同的荧光信号。例如，CY3能够在波长约550nm的激发光条件下，发出波长约560nm的荧光，AF532能够在波长约530nm的激发光条件下，发出波长约555nm的荧光。选择合适的激发光条件，可以让二者产生相同或实质相同的发光光谱。本发明中，发光光谱实质相同是指，在同一激发条件下，发射光谱的最大发射波长接近(例如相差小于20nm)，因此在光学滤波片上给出相同的信号被认为是实质相同的光谱。
在某些实施方案中，荧光基团可以是结合配对的一个成员，和/或能够发生生物正交反应(例如生物正交连接反应或者生物正交切割反应)。例如，荧光基团Cy3作为结合配对的一个成员，可以与结合配对的另一成员Cy3抗体发生特异性结合。
并入生长的核酸链的化合物的确定
在本发明的方法中，仅通过一种荧光基团(或者能发出相同荧光信号的不同荧光基团)来鉴别/确定并入生长的核酸链的化合物的类型。为此目的，在本发明的方法中，在每一轮聚合反应之后，对双链体或生长的核酸链进行了两次的荧光信号检测。简言之，在本发明的方法中，首先通过使用聚合酶，以待测序的核酸分子为模板，按照碱基互补配对原则，将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端(步骤4)；随后，若第四化合物本身能够发出荧光信号，则对所述生长的核酸链进行第一次检测，以确定其是否发出荧光信号；若第四化合物不携带荧光基团，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物发出与第二化合物相同的荧光信号(步骤5)；检测后，对所述生长的核酸链进行处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物发出与第二化合物相同的荧光信号，并且能够去除第四化合物的荧光信号(步骤6)；然后，对所述生长的核酸链进行第二次检测，以确定其是否发出荧光信号(步骤7)。根据两次荧光信号检测的结果，可以准确地确定并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型。
特别地，如果在步骤(4)中，第一化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于第一化合物本身不携带荧光基团，并且不受步骤(6)中的所述处理的影响，因此，在步骤(5)和(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为第一化合物。
如果在步骤(4)中，第二化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于第二化合物本身携带荧光基团，并且不受步骤(6)中的所述处理的影响，因此，在步骤(5)和(7)中将都检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为第二化合物。
如果在步骤(4)中，第三化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于第三化合物本身不携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测不到荧光信号；并且(ii)由于第三化合物经历了步骤(6)的所述处理，而能够发出荧光信号，因此，在步骤(7)中将检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测不到荧光信号且在步骤(7)中检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为第三化合物。
如果在步骤(4)中，第四化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于第四化合物本身携带荧光基团，或者在步骤(5)中经过处理而携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测到荧光信号；并且(ii)由于第四化合物经历步骤(6)的所述处理，而丧失了荧光信号，因此，在步骤(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测到荧光信号且在步骤(7)中检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为第四化合物。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，根据步骤(5)和(7)的检测结果来确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，其中，
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为第一化合物；
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为第二化合物；
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为第三化合物；并且
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为第四化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，基于碱基互补配对原则，根据步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基类型。例如，如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为第一化合物(例如核苷酸A的衍生物)，那么即可确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基为能够与第一化合物配对的碱基(例如T或U)。
更具体而言，如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为核苷酸A的衍生物，那么即可确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基为T或U。如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为核苷酸T或U的衍生物，那么即可确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基为A。如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为核苷酸C的衍生物，那么即可确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基为G。如果并入生长的核酸链3'端的化合物被确定为核苷酸G的衍生物，那么即可确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基为C。
双链体或生长的核酸链的处理
在本发明方法的某些优选实施方案中，每一轮的聚合反应可涉及两次的荧光信号检测，以及对双链体或生长的核酸链进行的两次或三次处理，其中，步骤(6)中的处理可用于改变第三化合物和第四化合物的荧光信号(从而便于区分/鉴别并入生长的核酸链3'端的化合物的类型)；步骤(8)中的处理可用于去除并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团(从而可开始新一轮的聚合反应)，并去除所述双链体或生长的核酸链上可能携带的荧光信号(从而可避免对后续的荧光检测造成干扰)；任选地，若第四化合物本身不能发出荧光信号，则步骤(5)中包含使第四化合物带上荧光基团的处理。
可根据所使用的四种化合物的结构和类型，设计和选自合适的处理方式。例如，在某些示例性实施方案中，可在所述四种化合物的一种或多种中引入能够进行生物正交切割反应和/或生物正交连接反应的反应性基团，以便于在步骤(6)中控制(例如，维持或改变)所述四种化合物发出荧光信号的能力。在某些示例性实施方案中，可在所述四种化合物的一种或多种中引入结合配对的成员，以便于在步骤(6)中控制(例如，维持或改变)所述四种化合物发出荧光信号的能力。
例如，在某些示例性实施方案中，可在第三化合物中引入能够发生生物正交连接反应的反应性基团，并在步骤(6)中通过生物正交连接反应来在第三化合物中引入荧光基团，使其具有发出荧光信号的能力。在某些示例性实施方案中，可在第三化合物中引入结合配对的一个成员，并在步骤(6)中通过所述成员与该结合配对的另一个成员(其携带荧光基团)之间的特异性相互作用来在第三化合物中引入荧光基团，使其具有发出荧光信号的能力。在某些示例性实施方案中，可在第四化合物中引入能够发生生物正交切割反应的反应性基团，并在步骤(6)中通过生物正交切割反应来将第四化合物中的荧光基团切除，使其丧失发出荧光信号的能力。在某些示例性实施方案中，可在第四化合物中引入结合配对的一个成员，并在步骤(6)中通过所述成员与该结合配对的另一个成员(其携带淬灭基团)之间的特异性相互作用来在第四化合物中引入能够淬灭荧光的淬灭基团，使其丧失发出荧光信号的能力。在某些示例性实施方案中，可在所述四种化合物中引入能够进行生物正交切割反应的反应性基团，以便于在步骤(8)中去除核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团以及可能存在的荧光信号。
洗涤步骤
在本发明的方法中，可根据需要，增加洗涤步骤。可在任何期望的阶段，增加所述洗涤步骤，并且任选地，所述洗涤步骤可进行一次或多次。
例如，在步骤(5)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除游离的(即，未并入生长的核酸链的)携带荧光基团的化合物，尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(7)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(6)中应用的试剂(其可能携带荧光)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(9)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(8)中应用的试剂以及产生的产物(其可能携带荧光)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号，并且尽可能避免对后续的聚合反应造成不利的影响。
可使用各种合适的洗涤溶液来进行洗涤步骤。此类洗涤溶液的实例包括但不限于，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。可根据实际需要来选择合适的洗涤溶液(包括合适的成分，浓度，离子强度，pH值等)，这在本领域技术人员的能力范围之内。
下文详细描述了本发明方法的两种示例性实施方案。然而，应当理解的是，下文所详细描述的实施方案仅仅是示例性的，而并非是限制性的。本领域技术人员根据本文公开内容的详细教导，可对下文详细描述的实施方案进行修改和修饰，并且本申请意欲涵盖所有的此类修改和修饰。
示例性实施方案1
在某些示例性实施方案中，可通过使用能够进行生物正交切割反应和/或生物正交连接反应的反应性基团，在步骤(6)中控制(例如，维持或改变)所述四种化合物发出荧光信号的能力；并且优选地，可通过使用能够进行生物正交切割反应的反应性基团，在步骤(8)中实现所述保护基团和荧光信号的去除。例如，在某些示例性实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物可分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5b各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；
R7a为能够发出荧光信号的荧光基团(Dye1)，或者能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团，或者结合配对的一个成员；
并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R5b与R7a之间还存在能够进行第三生物正交连接反应的反应性基团R8。
在此类示例性实施方案中，第四化合物本身可以携带与第二化合物能够发出相同荧光信号的荧光基团，也可以不携带荧光基团，而是在步骤(5)中，通过与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同的荧光基团)的试剂(例如结合配对的另一个成员，或者能够与R7a进行第二生物正交连接反应的化合物)发生特异性相互作用/特异性结合或者发生第二生物正交连接反应，而将荧光基团引入第四化合物，并能够发出与第二化合物相同的荧光信号。进一步地，可通过使R5a与携带荧光基团(例如与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱的荧光基团)的试剂发生第一生物正交连接反应，从而使得第三化合物携带荧光基团；并且，(i)能够使第四化合物中的R5b发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第三正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光信号。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(6)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使R5a与携带荧光基团(例如与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱)的试剂发生第一生物正交连接反应(从而将所述试剂中携带的荧光基团引入第三化合物，使其携带荧光基团，并发出荧光信号)；并且能够使R5b发生生物正交切割反应(从而去除第四化合物中的荧光基团，使其不再发出荧光信号)，或者能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号。在此类示例性实施方案中，在步骤(6)的处理之前，第一化合物和第三化合物(如果存在的话)不发出荧光，且第二化合物和第四化合物(如果存在的话)发出荧光；并且，在步骤(6)的处理之后，第一化合物(如果存在的话)仍然不发出荧光，第二化合物(如果存在的话)仍然发出荧光，第三化合物(如果存在的话)改变为发出荧光，且第四化合物(如果存在的话)改变为不发出荧光。因此，可通过两次荧光信号检测的结果来确定并入生长的核酸链3'端的化合物的类型。
进一步，在此类示例性实施方案中，可通过使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团被去除，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(如果存在的话)被去除。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(8)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应。在此类示例性实施方案中，在步骤(8)的处理之后，生长的核酸链将不具有任何荧光基团，并且其3'端核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'位置处将具有游离的羟基，所述游离的羟基能够用于起始下一轮的聚合反应。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5b各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；
R7a为能够发出荧光信号的荧光基团(Dye1)，或者能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团，或者结合配对的一个成员；
并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R5b与R7a之间还存在能够进行第三生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，R7a为Dye1，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(ii)第四化合物不能发出荧光信号，R7a为能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团，或者结合配对的一个成员，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R7a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如结合配对的另一个成员，或者能够与R7a进行第二生物正交连接反应的化合物)发生特异性相互作用/特异性结合或者发生第二生物正交连接反应；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的结合配对的另一个成员具有下述结构：R7b-L-Dye1；其中，R7b为结合配对的另一个成员，L独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱；或者
所述携带荧光基团的能够与R7a进行第二生物正交连接反应的化合物具有下述结构：R7b-L-Dye1；其中，R7b为能够与R7a进行第二生物正交连接反应的基团，L独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂发生第一生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使第四化合物中的R5b发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第三正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1发出的荧光信号；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a或R4b连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些示例性实施方案中，如果在步骤(4)中，式(I)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(I)化合物本身不携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物。
如果在步骤(4)中，式(II)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(II)化合物本身携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将都检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物。
如果在步骤(4)中，式(III)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(III)化合物本身不携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测不到荧光信号；并且(ii)由于式(III)化合物在步骤(6)中与携带荧光基团的试剂发生了生物正交连接反应，导致荧光基团被引入生长的核酸链，因此，在步骤(7)中将检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测不到荧光信号且在步骤(7)中检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物。
如果在步骤(4)中，式(IV)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(IV)化合物本身携带荧光基团或在步骤(5)中经过处理而携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测到荧光信号；并且(ii)由于式(IV)化合物在步骤(6)中发生了生物正交切割反应或发生第三正交连接反应，而丧失了荧光基团或者荧光信号被淬灭，因此，在步骤(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测到荧光信号且在步骤(7)中检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，根据步骤(5)和(7)的检测结果来确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，其中，
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物；
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物；
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物；并且
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，基于碱基互补配对原则，根据步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基类型。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物在核苷酸聚合反应过程中，彼此之间不会发生化学反应。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘌呤碱基，并且Base3和Base4为嘧啶碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘧啶碱基，并且Base3和Base4为嘌呤碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基A，Base4为碱基G。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基A，Base4为碱基G。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R1。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为单磷酸基团(-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R2。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-OH。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5a、R5b各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应。如本文中所使用的，表述“各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应”意指，所提及的反应性基团、试剂、或分子等各自都能够进行生物正交切割或连接反应，而在彼此之间不互相干扰或影响。例如，表述“R3a和R3b各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应”意指，R3a和R3b均能够发生生物正交切割或连接反应，并且R3a不影响R3b的生物正交切割或连接反应的进行，R3b不影响R3a的生物正交切割或连接反应的进行。
在某些示例性实施方案中，R3a为能够在第一试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第一反应性基团；R3b为能够在第二试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第二反应性基团；R3c为能够在第三试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第三反应性基团；R3d为能够在第四试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第四反应性基团；R4a为能够在第五试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第五反应性基团；R4b为能够在第六试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第六反应性基团；R5a为能够在第七试剂存在的条件下发生生物正交连接反应的第七反应性基团；且，R5b为能够在第八试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第八反应性基团。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(6)中，可添加第七试剂和第八试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)发生第一生物正交连接反应，并且使得式(IV)化合物中的R5b(如果存在的话)发生生物正交切割反应。例如，第七试剂可以包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述化合物M能够与R5a发生第一生物正交连接反应，并由此将化合物M中的荧光基团引入式(III)化合物。此外，第八试剂能够使式(IV)化合物中的R5b发生生物正交切割反应，并由此将式(IV)化合物中的R5b以及与其相连接的荧光基团去除。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，第七试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第八试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加第七试剂和第八试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，第七试剂包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述化合物M能够与R5a发生生物正交连接反应，从而将化合物M中的荧光基团引入第三化合物；然后，在允许化合物M与R5a发生生物正交连接反应，且允许R5b发生生物正交切割反应的条件下，将所述双链体与第七试剂和第八试剂进行温育。
还优选地，在此类实施方案中，在步骤(8)中，可添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂，从而使得R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b(如果存在的话)各自发生生物正交切割反应。由此，R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将被从核糖或脱氧核糖的3'位置去除(换言之，-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)将被转变为游离的羟基)，并且R4a和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)以及R4b和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)也将被去除。由此，在步骤(8)之后，所述生长的核酸链将不携带所述荧光基团，并且在3'端具有游离的羟基，能够用于进行下一轮的聚合反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(8)中，添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，并在允许R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b各自发生生物正交切割反应的条件下，将所述双链体与所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述相同的R3a、R3b、R3c和R3d(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂和第六试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂和第六试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第五试剂)的存在下，所述相同的R4a和R4b(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a和R4b能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，仅需添加所述相同的试剂(即，第一试剂)，并且在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述R3a、R3b、R3c、R3d、R4a和R4b(如果存在的话)，将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些示例性实施方案中，R7a为能够发出荧光信号的荧光基团Dye1，Dye1具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱，因此第四化合物本身能够发出与第二化合物相同的荧光信号。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R7a为能够发生第二生物正交连接反应的反应性基团。在此类实施方案中，步骤(5)包括，添加第九试剂，从而使得式(IV)化合物中的R7a(如果存在的话)发生第二生物正交连接反应。例如，第九试剂可以包含化合物M’，其结构为R7b-L-Dye1，其中，R7b为能够与R7a进行第二生物正交连接反应的基团，L独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R7a为结合配对的一个成员。在此类实施方案中，步骤(5)包括，添加第九试剂，从而使得式(IV)化合物中的R7a(如果存在的话)与所述结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第九试剂可以包含化合物M”，其结构为R7b-L-Dye1，其中，R7b为所述结合配对的另一个成员，L独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱。
在某些示例性实施方案中，第四化合物的R5b与R7a之间还存在能够进行第三生物正交连接反应的反应性基团R8。在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5a、R8各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应。在某些示例性实施方案中，R8a能够在第十试剂存在的条件下发生第三生物正交连接反应。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(6)中，可添加第七试剂和第十试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)发生第一生物正交连接反应，并且使得式(IV)化合物中的R8(如果存在的话)发生第三生物正交连接反应。例如，第七试剂可以包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述化合物M能够与R5a发生第一生物正交连接反应，并由此将化合物M中的荧光基团引入式(III)化合物。此外，第十试剂能够使式(IV)化合物中的R8发生第三生物正交连接反应，并由此将式(IV)化合物中的荧光信号淬灭。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，第七试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第十试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加第七试剂和第十试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，第七试剂包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述化合物M能够与R5a发生第一生物正交连接反应，从而将化合物M中的荧光基团引入第三化合物；第十试剂包含化合物M”’，所述化合物M”’携带淬灭剂，并且所述化合物M”’能够与R8发生第三生物正交连接反应，从而将化合物M”’中的淬灭剂引入第四化合物；然后，在允许化合物M”’与R5a发生第一生物正交连接反应，且允许M4与R8发生第三生物正交连接反应的条件下，将所述双链体与第七试剂和第十试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d各自独立地选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且均为-CH2N3。
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b各自独立地选自下列基团：-O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b是相同的反应性基团，并且选自下列基团： -O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b均为
在某些优选的实施方案中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂各自独立地包含选自下列的物质：
钯的配合物(例如钯和4个三苯基膦三间磺酸的配合物)；
钌的配合物(例如钌和喹啉羧酸酯(或其衍生物)、烯丙基或环戊二烯的配合物)；
膦化物(例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3)；以及
化合物Q，其具有结构式其中，Z1和Z2各自独立地选自修饰或未经修饰的烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和修饰或未经修饰的芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基或吡啶基)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2。在这种情况下，优选地，R4a和R4b是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含钯的配合物或钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3。在这种情况下，优选地，R4a和R4b是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是在这种情况下，优选地，R4a和R4b是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含如上所定义的化合物Q。进一步优选地，在化合物Q中，Z1为甲基；Z2为修饰或未经修饰的吡啶基。更优选地，化合物Q为其中，W为氢或修饰基团。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物Q。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的连接基团L1和L2，和R7b-L-Dye1中的L是各自独立的，并且不受特别的限制。本领域技术人员可以根据化合物中所使用的碱基(Base1、Base2、Base3和Base4)以及反应性基团(R4a、R4b、R5a和R5b)，选择合适的连接基团L1、L2和L。
在某些示例性实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1和L2，和R7b-L-Dye1中的L各自独立地选自下列基团：
其中，m1、m2、m3、m4、n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些示例性实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：其中，m1、m2、m3和m4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团： 其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，R5a选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，R5b选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第七试剂包含的化合物M选自以下化合物：
化合物M1，其具有结构式其中，Y选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，L0不存在或者为连接基团，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)；
化合物M2，其具有结构式其中，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)；
化合物M3，其具有结构式其中，Z3各自独立地选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)。
在本发明的实施方案中，连接基团L0不受特别的限制。本领域技术人员可以根据实际需要，选择合适的连接基团L0。例如，在某些优选的实施方案中，L0可以为其中，q1、q2、q3、q4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第七试剂包含化合物M1，并且其中，Y为C1-C6烷基，例如甲基。在某些优选的实施方案中，化合物M1中的L0为在某些优选的实施方案中，化合物M1中的Dye为AF532。在某些优选的实施方案中，化合物M1具有以下结构：
在某些优选的实施方案中，除了化合物M，所述第七试剂还包含钌的配合物。在某些优选的实施方案中，所述第七试剂包含化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，所述第八试剂包含如上定义的化合物M，并且，化合物M选自如上定义的化合物M1、M2和M3。在某些优选的实施方案中，除了化合物M，所述第八试剂还包含钌的配合物。在某些优选的实施方案中，所述第八试剂包含化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，在相同的试剂存在下，R5a能够发生生物正交连接反应，并且R5b能够发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(7)中，第七试剂和第八试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R5a是在这种情况下，优选地，R5b是还进一步优选地，第七试剂和第八试剂包含化合物M1。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物M1。
在某些优选的实施方案中，R5a是在这种情况下，优选地，R5b是还进一步优选地，第七试剂和第八试剂包含化合物M2。更优选地，第七试剂和第八试剂均包含化合物M2和钌的配合物。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R5a是在这种情况下，优选地，R5b是还进一步优选地，第七试剂和第八试剂包含化合物M3。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物M3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是R5b是第七试剂和第八试剂包含化合物M1。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物M1。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是R5b是第七试剂和第八试剂包含化合物M1。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物M1。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是R5b是第七试剂和第八试剂包含化合物M2和钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是R5b是第七试剂和第八试剂包含化合物M3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含化合物M3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是R5b是第七试剂和第八试剂包含化合物M2和钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是R5b是第七试剂和第八试剂包含化合物M3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。优选地，第七试剂和第八试剂是相同的试剂，且包含化合物M3。
在某些优选的实施方案中，第三化合物中的Dye是Cy3或AF532。
在某些优选的实施方案中，第四化合物中的R7a为Dye1。在某些优选的实施方案中，Dye1为Cy3或AF532。
在某些优选的实施方案中，第三化合物中的Dye是AF532，第四化合物中的R7a为Cy3。
在某些优选的实施方案中，第三化合物中的Dye是Cy3，第四化合物中的R7a为AF532。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R7a为能够发生第二生物正交连接反应的反应性基团。在某些优选的实施方案中，R7a选自下列基团： 在某些示例性实施方案中，能够与R7a发生第二生物正交连接反应的化合物M选自如上定义的化合物M1、M2、M3。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R7a为结合配对的一个成员。在某些优选的实施方案中，所述结合配选自：抗原(例如小分子抗原)-抗体、半抗原-抗体、激素-受体、配体-受体、核酸链-互补核酸链、底物-酶、底物类似物-酶、抑制剂-酶、糖-植物凝集素、生物素-抗生物素蛋白(例如，亲和素和链酶亲和素)、地高辛和地高辛抗体，以及5位溴代去氧鸟苷和其抗体。在某些优选的实施方案中，所述结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)和(c)地高辛和地高辛抗体。
在某些优选的实施方案中，第一化合物具有式(Ia)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第二化合物具有式(IIa)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第三化合物具有式(IIIa)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第四化合物具有式(IVa)所示的结构：
另外，如上文所描述的，在本发明的方法中，可根据需要，增加洗涤步骤。可在任何期望的阶段，增加所述洗涤步骤，并且任选地，所述洗涤步骤可进行一次或多次。
例如，在步骤(5)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除游离的(即，未并入生长的核酸链的)携带荧光基团的化合物(例如式(II)化合物和式(IV)化合物)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(7)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(6)中应用的携带荧光的试剂，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(9)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(8)中应用的试剂以及产生的产物(其可能携带荧光)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号，并且尽可能避免对后续的聚合反应造成不利的影响。
可使用各种合适的洗涤溶液来进行洗涤步骤。此类洗涤溶液的实例包括但不限于，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。可根据实际需要来选择合适的洗涤溶液(包括合适的成分，浓度，离子强度，pH值等)，这在本领域技术人员的能力范围之内。
示例性实施方案2
在某些示例性实施方案中，可通过使用结合配对(其包含能够通过特异性非共价作用而相互作用的两个成员)，在步骤(6)中控制(例如，维持或改变)所述四种化合物发出荧光信号的能力；并且优选地，可通过使用能够进行生物正交切割反应的反应性基团，在步骤(8)中实现所述保护基团和荧光信号的去除。例如，在某些示例性实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物可分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a(i)是第二结合配对的一个成员，同时是第三结合配对的一个成员；或者
(ii)只是第三结合配对的一个成员；并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8。
在此类示例性实施方案中，第四化合物本身可以携带与第二化合物能够发出相同荧光信号的荧光基团，也可以不携带荧光基团，而是在步骤(5)中，通过与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员，或者能够与R6a进行第二生物正交连接反应的化合物)发生特异性相互作用/特异性结合或者发生第二生物正交连接反应，而将荧光基团引入第四化合物，并能够发出与第二化合物相同的荧光信号。进一步地，可通过使R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员(在本文中表示为“R5b-L-Dye3”，其中R5b为第一结合配对的另一个成员，L为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，其优选地为与第二化合物相同的荧光基团，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱的荧光基团)特异性相互作用/特异性结合，从而使得第三化合物携带荧光基团。此外，(i)可通过使R6a与携带淬灭基团的第三结合配对的另一个成员(在本文中表示为“R6c-L6-Que”，其中R6c为第三结合配对的另一个成员，L6为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye发出的荧光信号的淬灭基团)特异性相互作用/特异性结合，从而使得第四化合物所发出的荧光信号被淬灭。；或者，(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光信号。在此类示例性实施方案中，R6a可以是两个结合配对的成员(第二结合配对R6a和R6b，第三结合配对R6a和R6c)。特别优选地，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与第三结合配对的两个成员(R6a和R6b)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R6a和R6c之间的特异性相互作用，并且R6a和R6c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。
因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(6)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员(R5b-L5-Dye3)发生特异性相互作用/特异性结合(从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其携带荧光基团，并发出荧光信号)，并且能够使R6a与携带淬灭基团的第二结合配对的另一个成员(R6c-L6-Que)发生特异性相互作用/特异性结合(从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号)，或者使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应(从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号)。在此类示例性实施方案中，在步骤(6)的处理之前，第一化合物和第三化合物(如果存在的话)不发出荧光，且第二化合物和第四化合物(如果存在的话)发出荧光；并且，在步骤(6)的处理之后，第一化合物(如果存在的话)仍然不发出荧光，第二化合物(如果存在的话)仍然发出荧光，第三化合物(如果存在的话)改变为发出荧光，且第四化合物(如果存在的话)改变为不发出荧光。因此，可通过两次荧光信号检测的结果来确定并入生长的核酸链3'端的化合物的类型。
在本发明的方法中，可根据所使用的荧光基团，选择合适的淬灭基团。各种荧光基团的淬灭基团是本领域熟知的，其典型实例包括但不限于，DABCYL、BHQ类淬灭剂(如BHQ-1或BHQ-2)、ECLIPSE和/或TAMRA。
进一步，在此类示例性实施方案中，可通过使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团被去除，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(如果存在的话)被去除。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(8)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应。在此类示例性实施方案中，在步骤(8)的处理之后，生长的核酸链将不具有任何荧光基团，并且其3'端核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'位置处将具有游离的羟基，所述游离的羟基能够用于起始下一轮的聚合反应。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
在某些示例性实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a(i)是第二结合配对的一个成员，同时是第三结合配对的一个成员；或者
(ii)只是第三结合配对的一个成员；并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物不能发出荧光信号，R6a为第二结合配对的一个成员，同时是第三结合配对的一个成员，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
(ii)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，R6a只是第三结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1或还连接有-L3-Dye1，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员特异性结合，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使第四化合物中的R6a与携带淬灭基团的第三结合配对的另一个成员特异性结合，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号，其中，
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R5b-L5-Dye3；其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L5独立地为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且与第二化合物包含的荧光基团结构相同，或者结构不同但具有相同的发射光谱；并且
所述携带淬灭基团的第三结合配对的另一个成员具有下述结构：R6c-L6-Que；其中，R6c为第二结合配对的另一个成员，L6独立地为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a、R4b或R4c连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些示例性实施方案中，如果在步骤(4)中，式(I)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(I)化合物本身不携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物。
如果在步骤(4)中，式(II)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(II)化合物本身携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将都检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物。
如果在步骤(4)中，式(III)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(III)化合物本身不携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测不到荧光信号；并且(ii)由于式(III)化合物在步骤(6)中与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员(R5b-L-Dye3)特异性结合，导致荧光基团被引入生长的核酸链，因此，在步骤(7)中将检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测不到荧光信号且在步骤(7)中检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物。
如果在步骤(4)中，式(IV)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(IV)化合物本身携带荧光基团或在步骤(5)中经过处理而携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测到荧光信号；并且(ii)由于式(IV)化合物在步骤(6)中与携带淬灭基团的第三结合配对的另一个成员(R6C-L'-Que)特异性结合，或者发生生物正交连接反应，导致淬灭基团被引入生长的核酸链，淬灭了荧光基团发出的荧光信号，因此，在步骤(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测到荧光信号且在步骤(7)中检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，根据步骤(5)和(7)的检测结果来确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，其中，
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物；
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物；
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物；并且
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，基于碱基互补配对原则，根据步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基类型。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物在核苷酸聚合反应过程中，彼此之间不会发生化学反应。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘌呤碱基，并且Base3和Base4为嘧啶碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘧啶碱基，并且Base3和Base4为嘌呤碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基A，Base4为碱基G。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基A，Base4为碱基G。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R1。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为单磷酸基团(-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R2。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-OH。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地能够发生生物正交切割反应。如本文中所使用的，表述“各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，所提及的反应性基团、试剂、或分子等各自都能够进行生物正交切割反应，而在彼此之间不互相干扰或影响。例如，表述“R3a和R3b各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，R3a和R3b均能够发生生物正交切割反应，并且R3a不影响R3b的生物正交切割反应的进行，R3b不影响R3a的生物正交切割反应的进行。
在某些示例性实施方案中，R3a为能够在第一试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第一反应性基团；R3b为能够在第二试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第二反应性基团；R3c为能够在第三试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第三反应性基团；R3d为能够在第四试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第四反应性基团；R4a为能够在第五试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第五反应性基团；R4b为能够在第六试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第六反应性基团；且，R4c为能够在第七试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第七反应性基团。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(8)中，可添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂，从而使得R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c(如果存在的话)各自发生生物正交切割反应。由此，R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将被从核糖或脱氧核糖的3'位置去除(换言之，-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)将被转变为游离的羟基)，并且R4a和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)，R4b和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)，以及R4c和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)也将被去除。由此，在步骤(8)之后，所述生长的核酸链将不携带所述荧光基团，并且在3'端具有游离的羟基，能够用于进行下一轮的聚合反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(8)中，添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，并在允许R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自发生生物正交切割反应的条件下，将所述双链体与所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述相同的R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中R4a、R4b、R4c能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b、R4c是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第五试剂)的存在下，所述相同的R4a、R4b、R4c(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，仅需添加所述相同的试剂(即，第一试剂)，并且在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c(如果存在的话)，将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些示例性实施方案中，特别优选地，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与第三结合配对的两个成员(R6a和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R6a和R6c之间的特异性相互作用，并且R6a和R6c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。在此类实施方案中，优选地，在步骤(6)中，可添加R5b-L5-Dye3和R6c-L6-Que，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)与R5b-L5-Dye3中的R5b特异性结合，并且使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与R6c-L6-Que中的R6b特异性结合。由此，通过第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)之间的特异性相互作用，与R5b相连接的荧光基团Dye被引入式(III)化合物，使得式(III)化合物发出荧光信号。同时，通过第三结合配对的两个成员(R6a和R6c)之间的特异性相互作用，与R6c相连接的淬灭基团Que被引入式(IV)化合物，使得式(IV)化合物中Dye发出的荧光信号被淬灭，式(IV)化合物不再发出荧光。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，R5b-L5-Dye3不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，R6c-L6-Que不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加R5b-L5-Dye3和R6c-L6-Que，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L5为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且R6c为第三结合配对的另一个成员，L6为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团；然后，在允许R5a和R5b特异性结合且允许R6a和R6c特异性结合的条件下，将所述双链体与R5b-L5-Dye3和R6c-L6-Que进行温育。
在某些示例性实施方案中，R6a是第三结合配对的一个成员；并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1，Dye1具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱，因此第四化合物本身能够发出与第二化合物相同的荧光信号。在此类实施方案中，步骤(6)包括，添加第八试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与第三结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第八试剂可以包含携带荧光基团的第三结合配对的另一个成员，其结构为R6c-L6-Que，其中，R6c为第三结合配对的另一个成员，L6独立地为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R6a是第二结合配对的一个成员，同时是第三结合配对的一个成员。在此类实施方案中，步骤(5)包括，添加第九试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与第二结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第九试剂可以包含携带荧光基团的第二结合配对的另一个成员，其结构为R6b-L4-Dye2，其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱。在此类实施方案中，步骤(6)包括，添加第十试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与第三结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第十试剂可以包含携带荧光基团的第三结合配对的另一个成员，其结构为R6c-L6-Que，其中，R6c为第三结合配对的另一个成员，L6独立地为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团。
优选地，在上述两类实施方案中，在步骤(6)中，可添加第十一试剂和第十试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)与第一结合配对的另一成员发生特异性作用和/或特异性结合，并且使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与第三结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第十一试剂可以包含第一结合配对的另一个成员，所述第一结合配对的另一个成员携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述第一结合配对的另一个成员能够与R5a发生特异性结合，并由此将所携带的荧光基团引入式(III)化合物。此外，第十试剂包含携带淬灭剂的第三结合配对的另一个成员，并且能够与R6a(如果存在的话)发生特异性作用和/或特异性结合，并由此将式(IV)化合物中的荧光信号淬灭。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，第十一试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第十试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加第十一试剂和第十试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，第十一试剂包含第一结合配对的另一个成员，所述第一结合配对的另一个成员能够携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述第一结合配对的另一个成员能够能够与R5a发生特异性作用和/或特异性结合，从而将所携带的荧光基团引入第三化合物；第十试剂包含第三结合配对的另一成员，所述第三结合配对的另一成员携带淬灭剂，并且所述第三结合配对的另一成员能够与R6a发生特异性作用和/或特异性结合，从而将所携带的淬灭剂引入第四化合物；然后，在允许R5a与第一结合配对的另一成员发生特异性作用和/或特异性结合，且允许R6a与第三结合配对的另一成员发生特异性作用和/或特异性结合的条件下，将所述双链体与第十一试剂和第十试剂进行温育。
在某些示例性实施方案中，第四化合物的R5b与R7a之间还存在能够进行第三生物正交连接反应的反应性基团R8。在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5a、R8各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应。在某些示例性实施方案中，R8a能够在第十二试剂存在的条件下发生第三生物正交连接反应。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(6)中，可添加第十一试剂和第十二试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)发生第一生物正交连接反应，并且使得式(IV)化合物中的R8(如果存在的话)发生第三生物正交连接反应。例如，第十一试剂可以包含第一结合配对的另一个成员，所述第一结合配对的另一个成员携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述第一结合配对的另一个成员能够与R5a发生特异性结合，并由此将所携带的荧光基团引入式(III)化合物。此外，第十二试剂能够使式(IV)化合物中的R8发生第三生物正交连接反应，并由此将式(IV)化合物中的荧光信号淬灭。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，第十一试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第十二试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加第十一试剂和第十二试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，第十一试剂包含第一结合配对的另一个成员，所述第一结合配对的另一个成员能够携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述第一结合配对的另一个成员能够能够与R5a发生特异性作用和/或特异性结合，从而将所携带的荧光基团引入第三化合物；第十二试剂包含化合物M，所述化合物M携带淬灭剂，并且所述化合物M能够与R8发生第三生物正交连接反应，从而将化合物M中的淬灭剂引入第四化合物；然后，在允许R5a与第一结合配对的另一成员发生特异性作用和/或特异性结合，且允许M与R8发生第三生物正交连接反应的条件下，将所述双链体与第十一试剂和第十二试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d各自独立地选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且均为-CH2N3。
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c各自独立地选自下列基团：-O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c是相同的反应性基团，并且选自下列基团： -O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c均为
在某些优选的实施方案中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂各自独立地包含选自下列的物质：
钯的配合物(例如钯和4个三苯基膦三间磺酸的配合物)；
钌的配合物(例如钌和喹啉羧酸酯(或其衍生物)、烯丙基或环戊二烯的配合物)；
膦化物(例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3)；以及
化合物Q，其具有结构式其中，Z1和Z2各自独立地选自修饰或未经修饰的烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和修饰或未经修饰的芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基或吡啶基)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2。在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3。在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含如上所定义的化合物Q。进一步优选地，在化合物Q中，Z1为甲基；Z2为修饰或未经修饰的吡啶基。更优选地，化合物Q为其中，W为氢或修饰基团。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物Q。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的连接基团L1、L2和L3以及R6b-L4-Dye2、R5b-L5-Dye3和R6c-L6-Que中的连接基团L4、L5和L6是各自独立的，并且不受特别的限制。本领域技术人员可以根据化合物中所使用的碱基(Base1、Base2、Base3和Base4)、反应性基团(R4a、R4b和R4c)、以及第一和第二结合配对的成员(R5a、R5b、R6a和R6b)，选择合适的连接基团L1、L2、L3、L4、L5和L6。
在某些示例性实施方案中，连接基团L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自下列基团：
其中，m1、m2、m3、m4、n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些示例性实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：其中，m1、m2、m3和m4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团： 其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，R5a和R5b为第一结合配对的两个成员，R6a和R6b为第二结合配对的两个成员，R6a和R6c为第三结合配对的两个成员。在某些优选的实施方案中，第一结合配对和第二结合配对各自独立地选自：抗原(例如小分子抗原)-抗体、半抗原-抗体、激素-受体、配体-受体、核酸链-互补核酸链、底物-酶、底物类似物-酶、抑制剂-酶、糖-植物凝集素、生物素-抗生物素蛋白(例如，亲和素和链酶亲和素)、地高辛和地高辛抗体，以及5位溴代去氧鸟苷和其抗体。
在某些优选的实施方案中，第一结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)和(c)地高辛和地高辛抗体。在某些优选的实施方案中，R5a为生物素或脱硫生物素，并且R5b为亲和素(例如链霉亲和素)。某些优选的实施方案中，R5a为地高辛，并且R5b为地高辛抗体。
在某些优选的实施方案中，第二结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)和(c)地高辛和地高辛抗体。在某些优选的实施方案中，R6a为生物素或脱硫生物素，并且R6b为亲和素(例如链霉亲和素)。某些优选的实施方案中，R6a为地高辛，并且R6b为地高辛抗体。
在某些优选的实施方案中，第三结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(c)地高辛和地高辛抗体，(d)Cy3和Cy3抗体。在某些优选的实施方案中，R6a为Cy3，并且R6c为Cy3抗体。特别优选的是，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与第三结合配对的两个成员(R6a和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R6a和R6c之间的特异性相互作用，并且R6a和R6c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。因此，在某些优选的实施方案中，第一结合配对的两个成员分别为生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，且第三结合配对的两个成员分别为地高辛和地高辛抗体。在某些优选的实施方案中，第一结合配对的两个成员分别为地高辛和地高辛抗体，且第三结合配对的两个成员分别为生物素和亲和素(例如链霉亲和素)。在某些优选的实施方案中，第一结合配对的两个成员分别为生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，且第三结合配对的两个成员分别为Cy3和Cy3抗体。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，第一化合物具有式(Ib)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第二化合物具有式(IIb)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第三化合物具有式(IIIb)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第四化合物具有式(IVb)所示的结构：
另外，如上文所描述的，在本发明的方法中，可根据需要，增加洗涤步骤。可在任何期望的阶段，增加所述洗涤步骤，并且任选地，所述洗涤步骤可进行一次或多次。
例如，在步骤(5)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除游离的(即，未并入生长的核酸链的)携带荧光基团的化合物(例如R6b-L4-Dye2、式(II)化合物或式(IV)化合物)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(7)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(6)中应用的携带荧光的试剂(例如R5b-L5-Dye3)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(9)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(8)中应用的试剂以及产生的产物(其可能携带荧光)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号，并且尽可能避免对后续的聚合反应造成不利的影响。
可使用各种合适的洗涤溶液来进行洗涤步骤。此类洗涤溶液的实例包括但不限于，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。可根据实际需要来选择合适的洗涤溶液(包括合适的成分，浓度，离子强度，pH值等)，这在本领域技术人员的能力范围之内。
示例性实施方案3
在某些示例性实施方案中，可通过使用结合配对(其包含能够通过特异性非共价作用而相互作用的两个成员)以及能够进行生物正交连接反应的反应性基团，在步骤(6)中控制(例如，维持或改变)所述四种化合物发出荧光信号的能力；并且优选地，可通过使用能够进行生物正交切割反应的反应性基团，在步骤(8)中实现所述保护基团和荧光信号的去除。例如，在某些示例性实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物可分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
R6a(i)是第一结合配对的一个成员，同时是第二结合配对的一个成员；或者
(ii)只是第二结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8。
在此类示例性实施方案中，第四化合物本身可以携带与第二化合物能够发出相同荧光信号的荧光基团，也可以不携带荧光基团，而是在步骤(5)中，通过与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第一结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合，而将荧光基团引入化合物IV，并能够发出与第二化合物相同的荧光信号。进一步地，可通过使R5a与携带荧光基团(例如与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团结构不同，但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂发生第一生物正交连接反应，从而使得第三化合物携带荧光基团。此外，(i)可通过使R6a与携带淬灭基团的第二结合配对的另一个成员(在本文中表示为“R6c-L'-Que”，其中R6c为所述结合配对的另一个成员，L'为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye发出的荧光信号的淬灭基团)特异性相互作用/特异性结合，从而使得第四化合物所发出的荧光信号被淬灭；或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号。在此类示例性实施方案中，特别优选地，所述R5a和携带荧光基团的试剂与第二结合配对的两个成员(R6a和R6b)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，所述R5a和携带荧光基团的试剂不影响R6a和R6b之间的特异性相互作用，并且R6a和R6b不影响所述R5a和携带荧光基团的试剂之间的生物正交连接反应。
因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(6)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使R5a与携带荧光基团(例如与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱)的试剂发生第一生物正交连接反应(从而将所述试剂中携带的荧光基团引入第三化合物，使其携带荧光基团，并发出荧光信号)，并且能够使R6a与携带淬灭基团的所述结合配对的另一个成员(R6b-L'-Que)发生特异性相互作用/特异性结合(从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号)，或者能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应(从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号)。在此类示例性实施方案中，在步骤(6)的处理之前，第一化合物和第三化合物(如果存在的话)不发出荧光，且第二化合物和第四化合物(如果存在的话)发出荧光；并且，在步骤(6)的处理之后，第一化合物(如果存在的话)仍然不发出荧光，第二化合物(如果存在的话)仍然发出荧光，第三化合物(如果存在的话)改变为发出荧光，且第四化合物(如果存在的话)改变为不发出荧光。因此，可通过两次荧光信号检测的结果来确定并入生长的核酸链3'端的化合物的类型。
在本发明的方法中，可根据所使用的荧光基团，选择合适的淬灭基团。各种荧光基团的淬灭基团是本领域熟知的，其典型实例包括但不限于，DABCYL、BHQ类淬灭剂(如BHQ-1或BHQ-2)、ECLIPSE和/或TAMRA。
进一步，在此类示例性实施方案中，可通过使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团被去除，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(如果存在的话)被去除。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(8)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应。在此类示例性实施方案中，在步骤(8)的处理之后，生长的核酸链将不具有任何荧光基团，并且其3'端核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'位置处将具有游离的羟基，所述游离的羟基能够用于起始下一轮的聚合反应。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
R6a(i)是第一结合配对的一个成员，同时是第二结合配对的一个成员；或者
(ii)只是第二结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物不能发出荧光信号，R6a为第一结合配对的一个成员，同时是第二结合配对的一个成员，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第一结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第一结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
(ii)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，R6a只是第二结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂发生第一生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使第四化合物中的R6a与携带淬灭基团的第二结合配对的另一个成员特异性结合，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号；其中，
所述携带淬灭基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6c-L'-Que；其中，R6c为第二结合配对的另一个成员，L'独立地为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a、R4b或R4c连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些示例性实施方案中，如果在步骤(4)中，式(I)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(I)化合物本身不携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物。
如果在步骤(4)中，式(II)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(II)化合物本身携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将都检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物。
如果在步骤(4)中，式(III)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(III)化合物本身不携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测不到荧光信号；并且(ii)由于式(III)化合物在步骤(6)中与携带荧光基团的试剂发生了生物正交连接反应，导致荧光基团被引入生长的核酸链，因此，在步骤(7)中将检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测不到荧光信号且在步骤(7)中检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物。
如果在步骤(4)中，式(IV)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(IV)化合物本身携带荧光基团或在步骤(5)中经过处理而携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测到荧光信号；并且(ii)由于式(IV)化合物在步骤(6)中与携带淬灭基团的所述结合配对的另一个成员(R6b-L'-Que)特异性结合或发生第三正交连接反应，导致淬灭基团被引入生长的核酸链，淬灭了荧光基团发出的荧光信号，因此，在步骤(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测到荧光信号且在步骤(7)中检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，根据步骤(5)和(7)的检测结果来确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，其中，
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物；
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物；
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物；并且
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，基于碱基互补配对原则，根据步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基类型。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物在核苷酸聚合反应过程中，彼此之间不会发生化学反应。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘌呤碱基，并且Base3和Base4为嘧啶碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘧啶碱基，并且Base3和Base4为嘌呤碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基A，Base4为碱基G。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基A，Base4为碱基G。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R1。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为单磷酸基团(-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R2。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-OH。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地能够发生生物正交切割反应。如本文中所使用的，表述“各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，所提及的反应性基团、试剂、或分子等各自都能够进行生物正交切割反应，而在彼此之间不互相干扰或影响。例如，表述“R3a和R3b各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，R3a和R3b均能够发生生物正交切割反应，并且R3a不影响R3b的生物正交切割反应的进行，R3b不影响R3a的生物正交切割反应的进行。
在某些示例性实施方案中，R3a为能够在第一试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第一反应性基团；R3b为能够在第二试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第二反应性基团；R3c为能够在第三试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第三反应性基团；R3d为能够在第四试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第四反应性基团；R4a为能够在第五试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第五反应性基团；R4b为能够在第六试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第六反应性基团；R4c为能够在第七试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第七反应性基团；且，R5a为能够在第八试剂存在的条件下发生生物正交连接反应的第八反应性基团。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(8)中，可添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂，从而使得R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c(如果存在的话)各自发生生物正交切割反应。由此，R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将被从核糖或脱氧核糖的3'位置去除(换言之，-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)将被转变为游离的羟基)，并且R4a和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)，R4b和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)，以及R4c和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)也将被去除。由此，在步骤(8)之后，所述生长的核酸链将不携带所述荧光基团，并且在3'端具有游离的羟基，能够用于进行下一轮的聚合反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(8)中，添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，并在允许R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自发生生物正交切割反应的条件下，将所述双链体与所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述相同的R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中R4a、R4b、R4c能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b、R4c是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第五试剂)的存在下，所述相同的R4a、R4b、R4c(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，仅需添加所述相同的试剂(即，第一试剂)，并且在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c(如果存在的话)，将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些示例性实施方案中，特别优选地，所述R5a和携带荧光基团的试剂与第二结合配对的两个成员(R6a和R6b)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，所述R5a和携带荧光基团的试剂不影响R6a和R6b之间的特异性相互作用，并且R6a和R6b不影响所述R5a和携带荧光基团的试剂之间的生物正交连接反应。
在此类实施方案中，优选地，在步骤(6)中，可添加第八试剂和R6c-L'-Que，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)发生生物正交连接反应，并且使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与R6c-L'-Que中的R6c特异性结合。例如，第八试剂可以包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同(或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱)的荧光基团，并且所述化合物M能够与R5a发生生物正交连接反应，并由此将化合物M中的荧光基团引入式(III)化合物，使得式(III)化合物发出荧光信号。此外，通过所述结合配对的两个成员(R6a和R6c)之间的特异性相互作用，与R6c相连接的淬灭基团Que被引入式(IV)化合物，使得式(IV)化合物中发出的荧光信号被淬灭，式(IV)化合物不再发出荧光。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，第八试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，R6c-L'-Que不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加第八试剂和R6c-L'-Que，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，第八试剂包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同(或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱)的荧光基团，并且所述化合物M能够与R5a发生生物正交连接反应，从而将化合物M中的荧光基团引入第三化合物；并且R6c为第二结合配对的另一个成员，L'为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye发出的荧光信号的淬灭基团；然后，在允许化合物M与R5a发生生物正交连接反应，且允许R6a和R6c特异性结合的条件下，将所述双链体与第八试剂和R6c-L'-Que剂进行温育。
在某些示例性实施方案中，R6a为能够发出荧光信号的荧光基团Dye1，Dye1具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱，因此第四化合物本身能够发出与第二化合物相同的荧光信号。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R7a为第一结合配对的一个成员。在此类实施方案中，步骤(5)包括，添加第九试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与所述结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第九试剂可以包含化合物M’，其结构为R6b-L4-Dye2，其中，R6b为第一结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱。
在某些示例性实施方案中，第四化合物的R4c与R6a之间还存在能够进行第三生物正交连接反应的反应性基团R8。在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5a、R8各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应。在某些示例性实施方案中，R8a能够在第十试剂存在的条件下发生第二生物正交连接反应。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(6)中，可添加第七试剂和第十试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)发生第一生物正交连接反应，并且使得式(IV)化合物中的R8(如果存在的话)发生第二生物正交连接反应。例如，第七试剂可以包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述化合物M能够与R5a发生第一生物正交连接反应，并由此将化合物M中的荧光基团引入式(III)化合物。此外，第十试剂能够使式(IV)化合物中的R8发生第二生物正交连接反应，并由此将式(IV)化合物中的荧光信号淬灭。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，第七试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第十试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加第七试剂和第十试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，第七试剂包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)，并且所述化合物M能够与R5a发生第一生物正交连接反应，从而将化合物M中的荧光基团引入第三化合物；第十试剂包含化合物M”，所述化合物M”携带淬灭剂，并且所述化合物M”能够与R8发生第二生物正交连接反应，从而将化合物M”中的淬灭剂引入第四化合物；然后，在允许化合物M”与R5a发生第一生物正交连接反应，且允许M”与R8发生第二生物正交连接反应的条件下，将所述双链体与第七试剂和第十试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d各自独立地选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且均为-CH2N3。
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c各自独立地选自下列基团：-O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c是相同的反应性基团，并且选自下列基团： -O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c均为
在某些优选的实施方案中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂各自独立地包含选自下列的物质：
钯的配合物(例如钯和4个三苯基膦三间磺酸的配合物)；
钌的配合物(例如钌和喹啉羧酸酯(或其衍生物)、烯丙基或环戊二烯的配合物)；
膦化物(例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3)；以及
化合物Q，其具有结构式其中，Z1和Z2各自独立地选自修饰或未经修饰的烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和修饰或未经修饰的芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基或吡啶基)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2。在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3。在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含如上所定义的化合物Q。进一步优选地，在化合物Q中，Z1为甲基；Z2为修饰或未经修饰的吡啶基。更优选地，化合物Q为其中，W为氢或修饰基团。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物Q。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的连接基团L1、L2和L3，R6b-L4-Dye2中的L4以及R6b-L'-Que中的连接基团L'是各自独立的，并且不受特别的限制。本领域技术人员可以根据化合物中所使用的碱基(Base1、Base2、Base3和Base4)、反应性基团(R4a、R4b、R4c和R5a)、以及所述结合配对的成员(R6a和R6b)，选择合适的连接基团L1、L2、L3、L4和L'。
在某些示例性实施方案中，连接基团L1、L2、L3、L4和L'各自独立地选自下列基团：
其中，m1、m2、m3、m4、n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些示例性实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：其中，m1、m2、m3和m4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团： 其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，R5a选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第八试剂包含的化合物M选自以下化合物：
化合物M1，其具有结构式其中，Y选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，L0不存在或者为连接基团，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)；
化合物M2，其具有结构式其中，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)；
化合物M3，其具有结构式其中，Z3各自独立地选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)。
在本发明的实施方案中，连接基团L0不受特别的限制。本领域技术人员可以根据实际需要，选择合适的连接基团L0。例如，在某些优选的实施方案中，L0可以为其中，q1、q2、q3、q4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第八试剂包含化合物M1，并且其中，Y为C1-C6烷基，例如甲基。在某些优选的实施方案中，化合物M1中的L0为在某些优选的实施方案中，化合物M1中的Dye为AF532。在某些优选的实施方案中，化合物M1具有以下结构：
在某些优选的实施方案中，除了化合物M，所述第八试剂还包含钌的配合物。在某些优选的实施方案中，所述第八试剂包含化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R5a是在这种情况下，优选地，第八试剂包含化合物M1。
在某些优选的实施方案中，R5a是在这种情况下，优选地，第八试剂包含化合物M2。更优选地，第八试剂包含化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R5a是在这种情况下，优选地，第八试剂包含化合物M3。
在某些优选的实施方案中，R6a和R6b为第一结合配对的两个成员。在某些优选的实施方案中，R6a和R6c为第二结合配对的两个成员。在某些优选的实施方案中，所述第一结合配对和第二结合配对各自独立地选自：抗原(例如小分子抗原)-抗体、半抗原-抗体、激素-受体、配体-受体、核酸链-互补核酸链、底物-酶、底物类似物-酶、抑制剂-酶、糖-植物凝集素、生物素-抗生物素蛋白(例如，亲和素和链酶亲和素)、地高辛和地高辛抗体，以及5位溴代去氧鸟苷和其抗体。
在某些优选的实施方案中，所述第一结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)和(c)地高辛和地高辛抗体。在某些优选的实施方案中，所述第二结合配对的两个成员选自下述组合(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)和(c)地高辛和地高辛抗体。在某些优选的实施方案中，R6a为生物素或脱硫生物素，并且R6b为亲和素(例如链霉亲和素)。某些优选的实施方案中，R6a为地高辛，并且R6b为地高辛抗体。
特别优选的是，所述R5a和携带荧光基团的试剂与第二结合配对的两个成员(R6a和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，所述R5a和携带荧光基团的试剂不影响R6a和R6c之间的特异性相互作用，并且R6a和R6c不影响所述R5a和携带荧光基团的试剂之间的生物正交连接反应。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是第八试剂包含化合物M1；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是第八试剂包含化合物M1；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是第八试剂包含化合物M2和钌的配合物；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是第八试剂包含化合物M3；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是第八试剂包含化合物M2和钌的配合物；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是第八试剂包含化合物M3；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
另外，如上文所描述的，在本发明的方法中，可根据需要，增加洗涤步骤。可在任何期望的阶段，增加所述洗涤步骤，并且任选地，所述洗涤步骤可进行一次或多次。
例如，在步骤(5)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除游离的(即，未并入生长的核酸链的)携带荧光基团的化合物(例如式(II)化合物和式(IV)化合物)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(7)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(6)中应用的携带荧光的试剂，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(9)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(8)中应用的试剂以及产生的产物(其可能携带荧光)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号，并且尽可能避免对后续的聚合反应造成不利的影响。
可使用各种合适的洗涤溶液来进行洗涤步骤。此类洗涤溶液的实例包括但不限于，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。可根据实际需要来选择合适的洗涤溶液(包括合适的成分，浓度，离子强度，pH值等)，这在本领域技术人员的能力范围之内。
示例性实施方案4
在某些示例性实施方案中，可通过使用能够进行生物正交切割反应的反应性基团以及结合配对(其包含能够通过特异性非共价作用而相互作用的两个成员)，在步骤(6)中控制(例如，维持或改变)所述四种化合物发出荧光信号的能力；并且优选地，可通过使用能够进行生物正交切割反应的反应性基团，在步骤(8)中实现所述保护基团和荧光信号的去除。例如，在某些示例性实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物可分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R6各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为能够发出荧光信号的荧光基团(Dye1)，能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团，和/或第二结合配对的一个成员；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；任选地，R4c和R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8。
在此类示例性实施方案中，第四化合物本身可以携带与第二化合物能够发出相同荧光信号的荧光基团，也可以不携带荧光基团，而是在步骤(5)中，通过与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员，或者能够与R6a进行第一生物正交连接反应的化合物)发生特异性相互作用/特异性结合或者发生第一生物正交连接反应，而将荧光基团引入第四化合物，并能够发出与第二化合物相同的荧光信号。进一步地，可通过使R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员(在本文中表示为“R5b-L-Dye2”，其中R5b为所述结合配对的另一个成员，L为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，其优选地为与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)特异性相互作用/特异性结合，从而使得第三化合物携带荧光基团。此外，(i)使第四化合物中的R4c发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号；。在此类示例性实施方案中，特别优选地，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与R4c之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R4c的生物正交切割反应，并且R4c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。特别优选地，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与R8之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R8的生物正交连接反应，并且R8不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。
因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(6)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使R5a与携带荧光基团的所述结合配对的另一个成员(R5b-L-Dye2)发生特异性相互作用/特异性结合(从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其携带荧光基团，并发出荧光信号)，并且能够使R4c发生生物正交切割反应(从而去除第四化合物中的荧光基团，使其不再发出荧光信号)，或者能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应(从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号)。在此类示例性实施方案中，在步骤(6)的处理之前，第一化合物和第三化合物(如果存在的话)不发出荧光，且第二化合物和第四化合物(如果存在的话)发出荧光；并且，在步骤(6)的处理之后，第一化合物(如果存在的话)仍然不发出荧光，第二化合物(如果存在的话)仍然发出荧光，第三化合物(如果存在的话)改变为发出荧光，且第四化合物(如果存在的话)改变为不发出荧光。因此，可通过两次荧光信号检测的结果来确定并入生长的核酸链3'端的化合物的类型。
进一步，在此类示例性实施方案中，可通过使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团被去除，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(如果存在的话)被去除。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(8)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应。在此类示例性实施方案中，在步骤(8)的处理之后，生长的核酸链将不具有任何荧光基团，并且其3'端核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'位置处将具有游离的羟基，所述游离的羟基能够用于起始下一轮的聚合反应。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为能够发出荧光信号的荧光基团(Dye1)，能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团，和/或第二结合配对的一个成员；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c和R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，R6a为Dye1，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(ii)第四化合物不能发出荧光信号，R6a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团，或者第二结合配对的一个成员，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员，或者能够与R6a进行第一生物正交连接反应的化合物)发生特异性相互作用/特异性结合或者发生第一生物正交连接反应；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L’-Dye1；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L’独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；或者
所述携带荧光基团的能够与R6a进行第一生物正交连接反应的化合物具有下述结构：R6b-L’-Dye1；其中，R6b为能够与R6a进行第一生物正交连接反应的基团，L’独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员特异性结合，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使第四化合物中的R4c发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1发出的荧光信号；其中，
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R5b-L-Dye2；其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且与第二化合物包含的荧光基团相同，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a或R4b连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些示例性实施方案中，如果在步骤(4)中，式(I)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(I)化合物本身不携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物。
如果在步骤(4)中，式(II)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(II)化合物本身携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将都检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物。
如果在步骤(4)中，式(III)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(III)化合物本身不携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测不到荧光信号；并且(ii)由于式(III)化合物在步骤(6)中与携带荧光基团的所述结合配对的另一个成员(R5b-L-Dye2)特异性结合，导致荧光基团被引入生长的核酸链，因此，在步骤(7)中将检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测不到荧光信号且在步骤(7)中检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物。
如果在步骤(4)中，式(IV)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(IV)化合物本身携带荧光基团或在步骤(5)中经过处理而携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测到荧光信号；并且(ii)由于式(IV)化合物在步骤(6)中发生了生物正交切割反应或发生第二正交连接反应，而丧失了荧光基团或者荧光信号被淬灭，因此，在步骤(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测到荧光信号且在步骤(7)中检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，根据步骤(5)和(7)的检测结果来确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，其中，
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物；
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物；
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物；并且
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，基于碱基互补配对原则，根据步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基类型。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物在核苷酸聚合反应过程中，彼此之间不会发生化学反应。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘌呤碱基，并且Base3和Base4为嘧啶碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘧啶碱基，并且Base3和Base4为嘌呤碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基A，Base4为碱基G。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基A，Base4为碱基G。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R1。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为单磷酸基团(-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R2。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-OH。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b各自独立地能够发生生物正交切割反应。如本文中所使用的，表述“各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，所提及的反应性基团、试剂、或分子等各自都能够进行生物正交切割反应，而在彼此之间不互相干扰或影响。例如，表述“R3a和R3b各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，R3a和R3b均能够发生生物正交切割反应，并且R3a不影响R3b的生物正交切割反应的进行，R3b不影响R3a的生物正交切割反应的进行。
在某些示例性实施方案中，R3a为能够在第一试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第一反应性基团；R3b为能够在第二试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第二反应性基团；R3c为能够在第三试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第三反应性基团；R3d为能够在第四试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第四反应性基团；R4a为能够在第五试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第五反应性基团；R4b为能够在第六试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第六反应性基团；且，R4c为能够在第七试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第七反应性基团。
在某些示例性实施方案中，特别优选地，所述第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与R4c之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R4c的生物正交切割反应，并且R4c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。优选地，在此类实施方案中，在步骤(6)中，可添加R5b-L-Dye2和第七试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)与R5b-L-Dye2中的R5b特异性结合，并且使得式(IV)化合物中的R4c(如果存在的话)发生生物正交切割反应。由此，通过所述结合配对的两个成员(R5a和R5b)之间的特异性相互作用，与R5b相连接的荧光基团Dye2被引入式(III)化合物，使得式(III)化合物发出荧光信号。同时，第七试剂能够使式(IV)化合物中的R4c发生生物正交切割反应，并由此将式(IV)化合物中的R6以及与其相连接的荧光基团去除。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，R5b-L-Dye2不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第七试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加R5b-L-Dye2和第七试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L为连接基团或不存在；Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；然后，在允许允许R5a和R5b特异性结合且允许R4c生生物正交切割反应的条件下，将所述双链体与R5b-L-Dye2和第七试剂进行温育。
在某些示例性实施方案中，第四化合物的R5b与R7a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8。在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5a、R8各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应。在某些示例性实施方案中，R8a能够在第八试剂存在的条件下发生第三生物正交连接反应。
在此类实施方案中，特别优选地，所述第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与R8之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R8的生物正交连接反应，并且R8不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。优选地，在此类实施方案中，在步骤(6)中，可添加R5b-L-Dye2和第八试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)与R5b-L-Dye2中的R5b特异性结合，并且使得式(IV)化合物中的R8(如果存在的话)发生生物正交连接反应。由此，通过所述结合配对的两个成员(R5a和R5b)之间的特异性相互作用，与R5b相连接的荧光基团Dye2被引入式(III)化合物，使得式(III)化合物发出荧光信号。同时，第八试剂能够使式(IV)化合物中的R4c发生生物正交连接反应，并由此将式(IV)化合物中的荧光信号淬灭。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，R5b-L-Dye2不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第八试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加R5b-L-Dye2和第八试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团；然后，在允许允许R5a和R5b特异性结合且允许R8生生物正交连接反应的条件下，将所述双链体与R5b-L-Dye2和第八试剂进行温育。
还优选地，在此类实施方案中，在步骤(8)中，可添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂，从而使得R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b(如果存在的话)各自发生生物正交切割反应。由此，R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将被从核糖或脱氧核糖的3'位置去除(换言之，-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)将被转变为游离的羟基)，并且R4a和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)以及R4b和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)也将被去除。由此，在步骤(8)之后，所述生长的核酸链将不携带所述荧光基团，并且在3'端具有游离的羟基，能够用于进行下一轮的聚合反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(8)中，添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，并在允许R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b各自发生生物正交切割反应的条件下，将所述双链体与所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述相同的R3a、R3b、R3c和R3d(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂和第六试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂和第六试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第五试剂)的存在下，所述相同的R4a和R4b(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a和R4b能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，仅需添加所述相同的试剂(即，第一试剂)，并且在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述R3a、R3b、R3c、R3d、R4a和R4b(如果存在的话)，将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些示例性实施方案中，R6a为能够发出荧光信号的荧光基团Dye1，Dye1具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱，因此第四化合物本身能够发出与第二化合物相同的荧光信号。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R6a为能够发生第一生物正交连接反应的反应性基团。在此类实施方案中，步骤(5)包括，添加第九试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)发生第一生物正交连接反应。例如，第九试剂可以包含化合物M’，其结构为R6b-L’-Dye1，其中，R6b为能够与R6a进行第一生物正交连接反应的基团，L’独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R6a为第二结合配对的一个成员。在此类实施方案中，步骤(5)包括，添加第九试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与第二结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第九试剂可以包含化合物M”，其结构为R6b-L’-Dye1，其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d各自独立地选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且均为-CH2N3。
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b各自独立地选自下列基团：-O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b是相同的反应性基团，并且选自下列基团： -O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a和R4b均为
在某些优选的实施方案中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂各自独立地包含选自下列的物质：
钯的配合物(例如钯和4个三苯基膦三间磺酸的配合物)；
钌的配合物(例如钌和喹啉羧酸酯(或其衍生物)、烯丙基或环戊二烯的配合物)；
膦化物(例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3)；以及
化合物Q，其具有结构式其中，Z1和Z2各自独立地选自修饰或未经修饰的烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和修饰或未经修饰的芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基或吡啶基)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2。在这种情况下，优选地，R4a和R4b是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含钯的配合物或钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3。在这种情况下，优选地，R4a和R4b是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是在这种情况下，优选地，R4a和R4b是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含如上所定义的化合物Q。进一步优选地，在化合物Q中，Z1为甲基；Z2为修饰或未经修饰的吡啶基。更优选地，化合物Q为其中，W为氢或修饰基团。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物Q。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的连接基团L1和L2，R5b-L-Dye中的连接基团L以及R6b-L’-Dye1中的连接基团L’是各自独立的，并且不受特别的限制。本领域技术人员可以根据化合物中所使用的碱基(Base1、Base2、Base3和Base4)、反应性基团(R4a、R4b和R6)、以及所述结合配对的成员(R5a和R5b)，选择合适的连接基团L1、L2、L和L’。
在某些示例性实施方案中，连接基团L1、L2、L和L’各自独立地选自下列基团：
其中，m1、m2、m3、m4、n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些示例性实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：其中，m1、m2、m3和m4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团： 其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，R5a和R5b为第一结合配对的两个成员。在某些优选的实施方案中，R6a和R6b为第二结合配对的两个成员。在某些优选的实施方案中，所述结合配对选自：抗原(例如小分子抗原)-抗体、半抗原-抗体、激素-受体、配体-受体、核酸链-互补核酸链、底物-酶、底物类似物-酶、抑制剂-酶、糖-植物凝集素、生物素-抗生物素蛋白(例如，亲和素和链酶亲和素)、地高辛和地高辛抗体，以及5位溴代去氧鸟苷和其抗体。
在某些优选的实施方案中，第一结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)和(c)地高辛和地高辛抗体。在某些优选的实施方案中，第二结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)和(c)地高辛和地高辛抗体。在某些优选的实施方案中，R5a为生物素或脱硫生物素，并且R5b为亲和素(例如链霉亲和素)。某些优选的实施方案中，R5a为地高辛，并且R5b为地高辛抗体。在某些优选的实施方案中，R4c选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第七试剂包含选自以下化合物的化合物M：
化合物M1，其具有结构式其中，Y选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，L0不存在或者为连接基团，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)；
化合物M2，其具有结构式其中，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)；
化合物M3，其具有结构式其中，Z3各自独立地选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)。
在本发明的实施方案中，连接基团L0不受特别的限制。本领域技术人员可以根据实际需要，选择合适的连接基团L0。例如，在某些优选的实施方案中，L0可以为其中，q1、q2、q3、q4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第七试剂包含化合物M1，并且其中，Y为C1-C6烷基，例如甲基。在某些优选的实施方案中，化合物M1中的L0为在某些优选的实施方案中，化合物M1中的Dye为AF532。在某些优选的实施方案中，化合物M1具有以下结构：
在某些优选的实施方案中，除了化合物M，所述第七试剂还包含钌的配合物。在某些优选的实施方案中，所述第七试剂包含化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R4c是在这种情况下，优选地，第七试剂包含化合物M1。
在某些优选的实施方案中，R4c是在这种情况下，优选地，第七试剂包含化合物M2。更优选地，第七试剂均包含化合物M2和钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R4c是在这种情况下，优选地，第七试剂包含化合物M3。
特别优选地，所述结合配对的两个成员(R5a和R5b)与R4c之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R4c的生物正交切割反应，并且R4c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。在某些示例性实施方案中，第四化合物包含能够发生第二生物正交连接反应的反应性基团R8。在某些优选的实施方案中，R8选自下列基团：
在某些示例性实施方案中，能够与R8发生第二生物正交连接反应的化合物为N，N包含下列基团：
在某些优选的实施方案中，化合物N选自以下化合物：
化合物N1，其具有结构式其中，Y选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，L0不存在或者为连接基团，Que为淬灭剂，能够使第四化合物上的荧光信号淬灭；
化合物N2，其具有结构式其中，Que为淬灭剂，能够使第四化合物上的荧光信号淬灭；
化合物N3，其具有结构式其中，Z3各自独立地选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，Que为淬灭剂，能够使第四化合物上的荧光信号淬灭。
在本发明的实施方案中，连接基团L0不受特别的限制。本领域技术人员可以根据实际需要，选择合适的连接基团L0。例如，在某些优选的实施方案中，L0可以为其中，q1、q2、q3、q4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些实施方案中，化合物N为1,2,4,5-四嗪BHQ2，其结构如下：
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R4c是第七试剂包含化合物M1。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6是第七试剂包含化合物M1。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6是第七试剂包含化合物M2和钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6是第七试剂包含化合物M3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含化合物Q(例如，上文定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6是第七试剂包含化合物M2和钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a和R4b是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂包含化合物Q(例如，上文定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6是第七试剂包含化合物M3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂和第六试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，第三化合物中的Dye是Cy3或AF532。
在某些优选的实施方案中，第四化合物中的R6a为Dye1。在某些优选的实施方案中，Dye1为Cy3或AF532。
在某些优选的实施方案中，第三化合物中的Dye是AF532，第四化合物中的R6a为AF532。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R6a为能够发生第二生物正交连接反应的反应性基团。在某些优选的实施方案中，R6a选自下列基团： 在某些示例性实施方案中，能够与R7a发生第二生物正交连接反应的化合物N选自如上定义的化合物N1、N2、N3。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R7a为第二结合配对的一个成员。在某些优选的实施方案中，第二结合配选自：抗原(例如小分子抗原)-抗体、半抗原-抗体、激素-受体、配体-受体、核酸链-互补核酸链、底物-酶、底物类似物-酶、抑制剂-酶、糖-植物凝集素、生物素-抗生物素蛋白(例如，亲和素和链酶亲和素)、地高辛和地高辛抗体，以及5位溴代去氧鸟苷和其抗体。在某些优选的实施方案中，所述结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)，(b)脱硫生物素和亲和素(例如链霉亲和素)和(c)地高辛和地高辛抗体。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是AF532，R8是第八试剂包含化合物N，所述化合物N为1,2,4,5-四嗪BHQ2。
在某些优选的实施方案中，第一化合物具有式(Ic)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第二化合物具有式(IIc)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第三化合物具有式(IIIc)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第四化合物具有式(IVc)所示的结构：
另外，如上文所描述的，在本发明的方法中，可根据需要，增加洗涤步骤。可在任何期望的阶段，增加所述洗涤步骤，并且任选地，所述洗涤步骤可进行一次或多次。
例如，在步骤(5)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除游离的(即，未并入生长的核酸链的)携带荧光基团的化合物(例如式(II)化合物和式(IV)化合物)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(7)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(6)中应用的携带荧光的试剂，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(9)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(8)中应用的试剂以及产生的产物(其可能携带荧光)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号，并且尽可能避免对后续的聚合反应造成不利的影响。
可使用各种合适的洗涤溶液来进行洗涤步骤。此类洗涤溶液的实例包括但不限于，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。可根据实际需要来选择合适的洗涤溶液(包括合适的成分，浓度，离子强度，pH值等)，这在本领域技术人员的能力范围之内。
示例性实施方案5
在某些示例性实施方案中，可通过使用结合配对(其包含能够通过特异性非共价作用而相互作用的两个成员)，在步骤(6)中控制(例如，维持或改变)所述四种化合物发出荧光信号的能力；并且优选地，可通过使用能够进行生物正交切割反应的反应性基团，在步骤(8)中实现所述保护基团和荧光信号的去除。例如，在某些示例性实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物可分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为第二结合配对的一个成员，任选地，R6a为Dye1或者还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8。
在此类示例性实施方案中，第四化合物本身可以携带能够发出与第二化合物相同荧光信号的荧光基团，也可以不携带荧光基团，而是在步骤(5)中，通过与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员，在本文中表示为“R6b-L4-Dye2”)发生特异性相互作用/特异性结合，而将荧光基团引入第四化合物，并能够发出与第二化合物相同的荧光信号。
进一步地，可通过使R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员(在本文中表示为“R5b-L5-Dye3”，其中R5b为第一结合配对的另一个成员，L5为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，其优选地为与第二化合物相同的荧光基团(或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱的荧光基团)特异性相互作用/特异性结合，从而使得第三化合物携带荧光基团。此外，并且(i)能够使R6b与第三结合配对的另一成员R6c之间发生特异性相互作用/特异性结合，使R6b与R6a的结合物解离，从而使第四化合物失去荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号。在此类示例性实施方案中，R6b可以是两个结合配对的成员(第二结合配对R6a和R6b，第三结合配对R6b和R6c)。特别优选地，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与第三结合配对的两个成员(R6b和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R6b和R6c之间的特异性相互作用，并且R6b和R6c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。
因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(6)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员(R5b-L5-Dye3)发生特异性相互作用/特异性结合(从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其携带荧光基团，并发出荧光信号)，并且能够使R6b与第三结合配对的另一个成员(R6c)发生特异性相互作用/特异性结合(从而使第四化合物失去荧光基团)，或者使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应(从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号)。在此类示例性实施方案中，在步骤(6)的处理之前，第一化合物和第三化合物(如果存在的话)不发出荧光，且第二化合物和第四化合物(如果存在的话)发出荧光；并且，在步骤(6)的处理之后，第一化合物(如果存在的话)仍然不发出荧光，第二化合物(如果存在的话)仍然发出荧光，第三化合物(如果存在的话)改变为发出荧光，且第四化合物(如果存在的话)改变为不发出荧光。因此，可通过两次荧光信号检测的结果来确定并入生长的核酸链3'端的化合物的类型。
进一步，在此类示例性实施方案中，可通过使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团被去除，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(如果存在的话)被去除。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(8)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应。在此类示例性实施方案中，在步骤(8)的处理之后，生长的核酸链将不具有任何荧光基团，并且其3'端核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'位置处将具有游离的羟基，所述游离的羟基能够用于起始下一轮的聚合反应。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为第二结合配对的一个成员，任选地，R6a为Dye1或者还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物不能发出荧光信号，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第二结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；同时，R6b是第三结合配对的一个成员；
(ii)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员特异性结合，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使R6b与第三结合配对的另一成员R6c之间发生特异性相互作用/特异性结合，使R6b与R6a的结合物解离，从而使第四化合物失去荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号，其中，
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R5b-L5-Dye3；其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L5独立地为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且与第二化合物包含的荧光基团结构相同，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a、R4b或R4c连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些示例性实施方案中，如果在步骤(4)中，式(I)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(I)化合物本身不携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物。
如果在步骤(4)中，式(II)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(II)化合物本身携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将都检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物。
如果在步骤(4)中，式(III)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(III)化合物本身不携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测不到荧光信号；并且(ii)由于式(III)化合物在步骤(6)中与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员(R5b-L-Dye3)特异性结合，导致荧光基团被引入生长的核酸链，因此，在步骤(7)中将检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测不到荧光信号且在步骤(7)中检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物。
如果在步骤(4)中，式(IV)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(IV)化合物本身携带荧光基团或在步骤(5)中经过处理而携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测到荧光信号；并且(ii)由于式(IV)化合物在步骤(6)中由于R6a与R6b的结合物发生解离而失去荧光基团，或者发生生物正交连接反应，导致淬灭基团被引入生长的核酸链，淬灭了荧光基团发出的荧光信号，因此，在步骤(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测到荧光信号且在步骤(7)中检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，根据步骤(5)和(7)的检测结果来确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，其中，
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物；
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物；
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物；并且
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，基于碱基互补配对原则，根据步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基类型。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物在核苷酸聚合反应过程中，彼此之间不会发生化学反应。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘌呤碱基，并且Base3和Base4为嘧啶碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘧啶碱基，并且Base3和Base4为嘌呤碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基A，Base4为碱基G。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基A，Base4为碱基G。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R1。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为单磷酸基团(-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R2。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-OH。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地能够发生生物正交切割反应。如本文中所使用的，表述“各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，所提及的反应性基团、试剂、或分子等各自都能够进行生物正交切割反应，而在彼此之间不互相干扰或影响。例如，表述“R3a和R3b各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，R3a和R3b均能够发生生物正交切割反应，并且R3a不影响R3b的生物正交切割反应的进行，R3b不影响R3a的生物正交切割反应的进行。
在某些示例性实施方案中，R3a为能够在第一试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第一反应性基团；R3b为能够在第二试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第二反应性基团；R3c为能够在第三试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第三反应性基团；R3d为能够在第四试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第四反应性基团；R4a为能够在第五试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第五反应性基团；R4b为能够在第六试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第六反应性基团；且，R4c为能够在第七试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第七反应性基团。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(8)中，可添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂，从而使得R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c(如果存在的话)各自发生生物正交切割反应。由此，R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将被从核糖或脱氧核糖的3'位置去除(换言之，-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)将被转变为游离的羟基)，并且R4a和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)，R4b和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)，以及R4c和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)也将被去除。由此，在步骤(8)之后，所述生长的核酸链将不携带所述荧光基团，并且在3'端具有游离的羟基，能够用于进行下一轮的聚合反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(8)中，添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，并在允许R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自发生生物正交切割反应的条件下，将所述双链体与所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述相同的R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中R4a、R4b、R4c能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b、R4c是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第五试剂)的存在下，所述相同的R4a、R4b、R4c(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，仅需添加所述相同的试剂(即，第一试剂)，并且在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c(如果存在的话)，将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些示例性实施方案中，特别优选地，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与第三结合配对的两个成员(R6b和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R6b和R6c之间的特异性相互作用，并且R6b和R6c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。在此类实施方案中，优选地，在步骤(6)中，可添加R5b-L5-Dye3和R6c，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)与R5b-L5-Dye3中的R5b特异性结合，并且使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与R6b的结合物解离。由此，通过第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)之间的特异性相互作用，与R5b相连接的荧光基团Dye3被引入式(III)化合物，使得式(III)化合物发出荧光信号。同时，通过第三结合配对的两个成员(R6b和R6c)之间的特异性相互作用，使R6a与R6b的结合物解离，使得式(IV)化合物失去荧光基团，式(IV)化合物不再发出荧光。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，R5b-L5-Dye3不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，R6c不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加R5b-L5-Dye3和R6c，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，R5b为第一结合配对的另一个成员，L5为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且R6c为第三结合配对的另一个成员；然后，在允许R5a和R5b特异性结合且允许R6b和R6c特异性结合的条件下，将所述双链体与R5b-L5-Dye3和R6c-L6-Que进行温育。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R6a是第二结合配对的一个成员。在此类实施方案中，步骤(5)包括，添加第九试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与第二结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第九试剂可以包含携带荧光基团的第二结合配对的另一个成员，其结构为R6b-L4-Dye2，其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱。在此类实施方案中，步骤(6)包括，添加第十试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与R6b形成的结合物解离。例如，第十试剂可以包含第三结合配对的另一个成员R6c，其可以与R6b发生特异性结合而取代R6a，使R6a与R6b形成的结合物解离。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(6)中，可添加第八试剂和第九试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)与第一结合配对的另一成员发生特异性作用和/或特异性结合，并且使得式(IV)化合物中的R6a与R6b形成的结合物解离。例如，第八试剂可以包含第一结合配对的另一个成员，所述第一结合配对的另一个成员携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述第一结合配对的另一个成员能够与R5a发生特异性结合，并由此将所携带的荧光基团引入式(III)化合物。此外，第九试剂包含第三结合配对的另一个成员，并且能够与R6b发生特异性作用和/或特异性结合，使得式(IV)化合物中的R6a与R6b形成的结合物解离，并由此使式(IV)化合物中失去荧光基团。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，第八试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第九试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加第八试剂和第九试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，第八试剂包含第一结合配对的另一个成员，所述第一结合配对的另一个成员能够携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述第一结合配对的另一个成员能够能够与R5a发生特异性作用和/或特异性结合，从而将所携带的荧光基团引入第三化合物；第九试剂包含第三结合配对的另一成员，并且所述第三结合配对的另一成员能够与R6b发生特异性作用和/或特异性结合，并且使得式(IV)化合物中的R6a与R6b形成的结合物解离；然后，在允许R5a与第一结合配对的另一成员发生特异性作用和/或特异性结合，且允许R6b与第三结合配对的另一成员发生特异性作用和/或特异性结合的条件下，将所述双链体与第七试剂和第九试剂进行温育。
在某些示例性实施方案中，第四化合物的R5b与R7a之间还存在能够进行第三生物正交连接反应的反应性基团R8。在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5a、R8各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应。在某些示例性实施方案中，R8a能够在第十试剂存在的条件下发生生物正交连接反应。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d各自独立地选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且均为-CH2N3。
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c各自独立地选自下列基团：-O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c是相同的反应性基团，并且选自下列基团： -O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c均为
在某些优选的实施方案中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂各自独立地包含选自下列的物质：
钯的配合物(例如钯和4个三苯基膦三间磺酸的配合物)；
钌的配合物(例如钌和喹啉羧酸酯(或其衍生物)、烯丙基或环戊二烯的配合物)；
膦化物(例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3)；以及
化合物Q，其具有结构式其中，Z1和Z2各自独立地选自修饰或未经修饰的烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和修饰或未经修饰的芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基或吡啶基)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2。在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3。在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含如上所定义的化合物Q。进一步优选地，在化合物Q中，Z1为甲基；Z2为修饰或未经修饰的吡啶基。更优选地，化合物Q为其中，W为氢或修饰基团。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物Q。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的连接基团L1、L2和L3以及R6b-L4-Dye2、R5b-L5-Dye3和R6c-L6-Que中的连接基团L4、L5和L6是各自独立的，并且不受特别的限制。本领域技术人员可以根据化合物中所使用的碱基(Base1、Base2、Base3和Base4)、反应性基团(R4a、R4b和R4c)、以及第一和第二结合配对的成员(R5a、R5b、R6a和R6b)，选择合适的连接基团L1、L2、L3、L4、L5和L6。
在某些示例性实施方案中，连接基团L1、L2、L3、L4、L5和L6各自独立地选自下列基团：
其中，m1、m2、m3、m4、n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些示例性实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：其中，m1、m2、m3和m4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团： 其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，R5a和R5b为第一结合配对的两个成员，R6a和R6b为第二结合配对的两个成员，R6b和R6c为第三结合配对的两个成员。在某些优选的实施方案中，第一结合配对和第二结合配对各自独立地选自：抗原(例如小分子抗原)-抗体、半抗原-抗体、激素-受体、配体-受体、核酸链-互补核酸链、底物-酶、底物类似物-酶、抑制剂-酶、糖-植物凝集素、生物素-抗生物素蛋白(例如，亲和素和链酶亲和素)、地高辛和地高辛抗体，以及5位溴代去氧鸟苷和其抗体。
在某些优选的实施方案中，第一结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)；(b)地高辛和地高辛抗体；(c)脱硫生物素和链霉亲和素。
在某些优选的实施方案中，第二结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)；(b)地高辛和地高辛抗体；(c)脱硫生物素和链霉亲和素。
在某些优选的实施方案中，第三结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)；(b)地高辛和地高辛抗体；(c)脱硫生物素和链霉亲和素。
特别优选的是，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与第三结合配对的两个成员(R6b和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a和R5b不影响R6b和R6c之间的特异性相互作用，并且R6b和R6c不影响R5a和R5b之间的特异性相互作用。因此，在某些优选的实施方案中，第一结合配对的两个成员分别为地高辛和地高辛抗体，且第三结合配对的两个成员分别为链霉亲和素和生物素。在某些优选的实施方案中，第二节和配对的两个成员分别为脱硫生物素和链霉亲和素。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是脱硫生物素；R6b是链霉亲和素亲和素(例如链霉亲和素)；R6c是生物素。
在某些优选的实施方案中，第一化合物具有式(Id)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第二化合物具有式(IId)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第三化合物具有式(IIId)所示的结构：
在某些优选的实施方案中，第四化合物具有式(IVd)所示的结构：
另外，如上文所描述的，在本发明的方法中，可根据需要，增加洗涤步骤。可在任何期望的阶段，增加所述洗涤步骤，并且任选地，所述洗涤步骤可进行一次或多次。
例如，在步骤(5)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除游离的(即，未并入生长的核酸链的)携带荧光基团的化合物(例如式(II)化合物和式(IV)化合物)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(7)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(6)中应用的携带荧光的试剂，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(9)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(8)中应用的试剂以及产生的产物(其可能携带荧光)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号，并且尽可能避免对后续的聚合反应造成不利的影响。
可使用各种合适的洗涤溶液来进行洗涤步骤。此类洗涤溶液的实例包括但不限于，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。可根据实际需要来选择合适的洗涤溶液(包括合适的成分，浓度，离子强度，pH值等)，这在本领域技术人员的能力范围之内。
示例性实施方案6
在某些示例性实施方案中，可通过使用结合配对(其包含能够通过特异性非共价作用而相互作用的两个成员)，在步骤(6)中控制(例如，维持或改变)所述四种化合物发出荧光信号的能力；并且优选地，可通过使用能够进行生物正交切割反应的反应性基团，在步骤(8)中实现所述保护基团和荧光信号的去除。例如，在某些示例性实施方案中，所述第一、第二、第三和第四化合物可分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
R6a为第一结合配对的一个成员，任选地，R6a为Dye1或者还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8。
在此类示例性实施方案中，第四化合物本身可以携带能够发出与第二化合物相同荧光信号的荧光基团，也可以不携带荧光基团，而是在步骤(5)中，通过与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第一结合配对的另一个成员，在本文中表示为“R6b-L4-Dye2”)发生特异性相互作用/特异性结合，而将荧光基团引入第四化合物，并能够发出与第二化合物相同的荧光信号。
进一步地，可通过使R5a与携带荧光基团的化合物(在本文中表示为M)发生正交连接反应，从而使得第三化合物携带荧光基团。此外，并且(i)能够使R6b与第二结合配对的另一成员R6c之间发生特异性相互作用/特异性结合，使R6b与R6a的结合物解离，从而使第四化合物失去荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号。在此类示例性实施方案中，R6b可以是两个结合配对的成员(第一结合配对R6a和R6b，第二结合配对R6b和R6c)。特别优选地，第一结合配对的两个成员(R5a和R5b)与第三结合配对的两个成员(R6b和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，M不影响R6b和R6c之间的特异性相互作用，并且R6b和R6c不影响R5a与M之间的正交连接反应。
因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(6)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使R5a与携带荧光基团的化合物M发生正交连接反应(从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其携带荧光基团，并发出荧光信号)，并且能够使R6b与第二结合配对的另一个成员(R6c)发生特异性相互作用/特异性结合(从而使第四化合物失去荧光基团)，或者使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生正交连接反应(从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号)。在此类示例性实施方案中，在步骤(6)的处理之前，第一化合物和第三化合物(如果存在的话)不发出荧光，且第二化合物和第四化合物(如果存在的话)发出荧光；并且，在步骤(6)的处理之后，第一化合物(如果存在的话)仍然不发出荧光，第二化合物(如果存在的话)仍然发出荧光，第三化合物(如果存在的话)改变为发出荧光，且第四化合物(如果存在的话)改变为不发出荧光。因此，可通过两次荧光信号检测的结果来确定并入生长的核酸链3'端的化合物的类型。
进一步，在此类示例性实施方案中，可通过使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物中的核糖或脱氧核糖的3'位置处的保护基团被去除，以及所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(如果存在的话)被去除。因此，在某些优选的实施方案中，在步骤(8)中，使所述双链体或所述生长的核酸链经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应。在此类示例性实施方案中，在步骤(8)的处理之后，生长的核酸链将不具有任何荧光基团，并且其3'端核苷酸的核糖或脱氧核糖的3'位置处将具有游离的羟基，所述游离的羟基能够用于起始下一轮的聚合反应。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
R6a为第一结合配对的一个成员，任选地，R6a为Dye1或者还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)(i)第四化合物不能发出荧光信号，则使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物、第二化合物和第三化合物没有影响，但是能够使第四化合物中的R6a与携带荧光基团(例如，与第二化合物结构同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂(例如第一结合配对的另一个成员)发生特异性相互作用/特异性结合；之后，移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员具有下述结构：R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第一结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；同时，R6b是第二结合配对的一个成员；
(ii)第四化合物能够发出与第二化合物相同的荧光信号，则移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂发生第一生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且(i)能够使R6b与第二结合配对的另一成员R6c之间发生特异性相互作用/特异性结合，使R6b与R6a的结合物解离，从而使第四化合物失去荧光基团，或者(ii)能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1或Dye2发出的荧光信号；其中，
所述携带淬灭基团的第二结合配对的另一个成员具有下述结构：R6c-L'-Que；其中，R6c为第二结合配对的另一个成员，L'独立地为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye1或Dye2发出的荧光信号的淬灭基团；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与R4a、R4b或R4c连接的荧光基团)，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在某些示例性实施方案中，如果在步骤(4)中，式(I)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(I)化合物本身不携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物。
如果在步骤(4)中，式(II)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，由于式(II)化合物本身携带荧光基团，并且其在步骤(6)未发生任何反应，因此，在步骤(5)和(7)中将都检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)和(7)中都检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物。
如果在步骤(4)中，式(III)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(III)化合物本身不携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测不到荧光信号；并且(ii)由于式(III)化合物在步骤(6)中与携带荧光基团的化合物M发生正交连接反应，导致荧光基团被引入生长的核酸链，因此，在步骤(7)中将检测到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测不到荧光信号且在步骤(7)中检测到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物。
如果在步骤(4)中，式(IV)化合物被并入生长的核酸链的3'端，那么，(i)由于式(IV)化合物本身携带荧光基团或在步骤(5)中经过处理而携带荧光基团，因此，在步骤(5)中将检测到荧光信号；并且(ii)由于式(IV)化合物在步骤(6)中由于R6a与R6b的结合物发生解离而失去荧光基团，或者发生生物正交连接反应，导致淬灭基团被引入生长的核酸链，淬灭了荧光基团发出的荧光信号，因此，在步骤(7)中将检测不到荧光信号。也即，如果在步骤(5)中检测到荧光信号且在步骤(7)中检测不到荧光信号，那么可以确定并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，根据步骤(5)和(7)的检测结果来确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，其中，
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(I)化合物；
当步骤(5)和(7)的检测结果均为，所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(II)化合物；
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(III)化合物；并且
当步骤(5)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链发出所述荧光信号，且步骤(7)的检测结果为所述双链体或所述生长的核酸链不发出所述荧光信号时，确定在步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物为式(IV)化合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，在步骤(7)之后，基于碱基互补配对原则，根据步骤(4)中并入生长的核酸链的3'端的化合物的类型，确定待测序的核酸分子中相应位置处的碱基类型。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物在核苷酸聚合反应过程中，彼此之间不会发生化学反应。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘌呤碱基，并且Base3和Base4为嘧啶碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基G，Base2为碱基A，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基C，Base4为碱基T或U。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基A，Base2为碱基G，Base3为碱基T或U，Base4为碱基C。
在某些优选的实施方案中，Base1和Base2为嘧啶碱基，并且Base3和Base4为嘌呤碱基。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基C，Base2为碱基T或U，Base3为碱基A，Base4为碱基G。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基G，Base4为碱基A。在某些优选的实施方案中，Base1为碱基T或U，Base2为碱基C，Base3为碱基A，Base4为碱基G。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R1。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为单磷酸基团(-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)。在某些优选的实施方案中，R1各自独立地为四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)。
在某些优选的实施方案中，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物具有相同的R2。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-H。在某些优选的实施方案中，R2各自独立地为-OH。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地能够发生生物正交切割反应。如本文中所使用的，表述“各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，所提及的反应性基团、试剂、或分子等各自都能够进行生物正交切割反应，而在彼此之间不互相干扰或影响。例如，表述“R3a和R3b各自独立地能够发生生物正交切割反应”意指，R3a和R3b均能够发生生物正交切割反应，并且R3a不影响R3b的生物正交切割反应的进行，R3b不影响R3a的生物正交切割反应的进行。
在某些示例性实施方案中，R3a为能够在第一试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第一反应性基团；R3b为能够在第二试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第二反应性基团；R3c为能够在第三试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第三反应性基团；R3d为能够在第四试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第四反应性基团；R4a为能够在第五试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第五反应性基团；R4b为能够在第六试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第六反应性基团；且，R4c为能够在第七试剂存在的条件下发生生物正交切割反应的第七反应性基团。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(8)中，可添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂，从而使得R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c(如果存在的话)各自发生生物正交切割反应。由此，R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将被从核糖或脱氧核糖的3'位置去除(换言之，-OR3a、-OR3b、-OR3c或-OR3d(如果存在的话)将被转变为游离的羟基)，并且R4a和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)，R4b和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)，以及R4c和与其相连接的荧光基团(如果存在的话)也将被去除。由此，在步骤(8)之后，所述生长的核酸链将不携带所述荧光基团，并且在3'端具有游离的羟基，能够用于进行下一轮的聚合反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(8)中，添加第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，并在允许R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自发生生物正交切割反应的条件下，将所述双链体与所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂进行温育。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述相同的R3a、R3b、R3c、R3d(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中R4a、R4b、R4c能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b、R4c是相同的反应性基团。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，在所述相同的试剂(即，第五试剂)的存在下，所述相同的R4a、R4b、R4c(如果存在的话)将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c能够在相同的试剂存在下，各自发生生物正交切割反应。在这种情况下，优选地，在步骤(8)中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂。也即，在步骤(8)中，仅需添加所述相同的试剂(即，第一试剂)，并且在所述相同的试剂(即，第一试剂)的存在下，所述R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c(如果存在的话)，将各自进行生物正交切割反应，并从所述生长的核酸链上切除。
在某些示例性实施方案中，特别优选地，R5a与第二结合配对的两个成员(R6b和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a不影响R6b和R6c之间的特异性相互作用，并且R6b和R6c不影响R5a和M之间的正交连接反应。在此类实施方案中，优选地，在步骤(6)中，可添加M和R6c，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)与M发生正交连接反应，并且使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与R6b的结合物解离。由此，通过化合物中的R5a与M发生正交连接反应，使荧光基团Dye3被引入式(III)化合物，使得式(III)化合物发出荧光信号。同时，通过第二结合配对的两个成员(R6b和R6c)之间的特异性相互作用，使R6a与R6b的结合物解离，使得式(IV)化合物失去荧光基团，式(IV)化合物不再发出荧光。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，M不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，R6c不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加M和R6c，从而形成含有溶液相和固相的反应体系；然后，在允许R5a和R5b特异性结合且允许R6b和R6c特异性结合的条件下，将所述双链体与M和R6c-L6-Que进行温育。
在某些示例性实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，R6a是第一结合配对的一个成员。在此类实施方案中，步骤(5)包括，添加第九试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与第一结合配对的另一个成员发生特异性作用和/或特异性结合。例如，第九试剂可以包含携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员，其结构为R6b-L4-Dye2，其中，R6b为第一结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱。在此类实施方案中，步骤(6)包括，添加第十试剂，从而使得式(IV)化合物中的R6a(如果存在的话)与R6b形成的结合物解离。例如，第十试剂可以包含第二结合配对的另一个成员R6c，其可以与R6b发生特异性结合而取代R6a，使R6a与R6b形成的结合物解离。
优选地，在此类实施方案中，在步骤(6)中，可添加第八试剂和第九试剂，从而使得式(III)化合物中的R5a(如果存在的话)与M发生生物正交连接反应，并且使得式(IV)化合物中的R6a与R6b形成的结合物解离。例如，第八试剂可以包含化合物M，所述化合物M携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且所述M能够与R5a发生生物正交连接反应，并由此将所携带的荧光基团引入式(III)化合物。此外，第九试剂包含第二结合配对的另一个成员，并且能够与R6b发生特异性作用和/或特异性结合，使得式(IV)化合物中的R6a与R6b形成的结合物解离，并由此使式(IV)化合物中失去荧光基团。在此类实施方案中，还特别优选地，在步骤(6)中，第八试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应，并且进一步优选地，第九试剂不与第一化合物和第二化合物发生化学反应。因此，在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，可添加第八试剂和第九试剂，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，其中，第八试剂包含化合物M，所述M能够携带与第二化合物和第四化合物相同的荧光基团(或者结构不同但发光光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且M能够与R5a发生生物正交连接反应，从而将所携带的荧光基团引入第三化合物；第九试剂包含第二结合配对的另一成员，并且所述第二结合配对的另一成员能够与R6b发生特异性作用和/或特异性结合，并且使得式(IV)化合物中的R6a与R6b形成的结合物解离；然后，在允许R5a与M发生生物正交连接反应，且允许R6b与第二结合配对的另一成员发生特异性作用和/或特异性结合的条件下，将所述双链体与第八试剂和第九试剂进行温育。
在某些示例性实施方案中，第四化合物的R5b与R7a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8。在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5a、R8各自独立地能够发生生物正交切割或连接反应。在某些示例性实施方案中，R8a能够在第十试剂存在的条件下发生生物正交连接反应。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d各自独立地选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且选自下列基团：-CH2CH＝CH2、-CH2N3、C3-8环烯基(例如C3环烯基、C4环烯基、C5元环烯基、C6环烯基、C7环烯基或C8环烯基)。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基选自C3环烯基和C8环烯基。在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为在某些优选的实施方案中，所述C3-8环烯基为
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是相同的反应性基团，并且均为-CH2N3。
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c各自独立地选自下列基团：-O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c是相同的反应性基团，并且选自下列基团：-O-C3-8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”选自-O-C3环烯亚基，-O-C4环烯亚基，-O-C5环烯亚基，-O-C6环烯亚基，-O-C7环烯亚基，和-O-C8环烯亚基。在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为在某些优选的实施方案中，所述“-O-C3-8环烯亚基”为
在某些优选的实施方案中，R4a、R4b和R4c均为
在某些优选的实施方案中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂各自独立地包含选自下列的物质：
钯的配合物(例如钯和4个三苯基膦三间磺酸的配合物)；
钌的配合物(例如钌和喹啉羧酸酯(或其衍生物)、烯丙基或环戊二烯的配合物)；
膦化物(例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3)；以及
化合物Q，其具有结构式其中，Z1和Z2各自独立地选自修饰或未经修饰的烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和修饰或未经修饰的芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基或吡啶基)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2。在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3。在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是在这种情况下，优选地，R4a、R4b和R4c是还进一步优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含如上所定义的化合物Q。进一步优选地，在化合物Q中，Z1为甲基；Z2为修饰或未经修饰的吡啶基。更优选地，化合物Q为其中，W为氢或修饰基团。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，且包含如上所定义的化合物Q。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的连接基团L1、L2和L3以及R6b-L4-Dye2和R6c-L6-Que中的连接基团L4和L6是各自独立的，并且不受特别的限制。本领域技术人员可以根据化合物中所使用的碱基(Base1、Base2、Base3和Base4)、反应性基团(R4a、R4b和R4c)、以及第一和第二结合配对的成员(R5a、R5b、R6a和R6b)，选择合适的连接基团L1、L2、L3、L4和L6。
在某些示例性实施方案中，连接基团L1、L2、L3、L4和L6各自独立地选自下列基团：
其中，m1、m2、m3、m4、n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些示例性实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：其中，m1、m2、m3和m4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L1各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团： 其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3、a、b、c、d、e和f各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：其中，n1、n2、n3、n4、p1、p2、p3各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。。
在某些优选的实施方案中，第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物中的L2各自独立地选自下列基团：
在某些优选的实施方案中，R6a和R6b为第一结合配对的两个成员，R6b和R6c为第二结合配对的两个成员。在某些优选的实施方案中，第一结合配对和第二结合配对各自独立地选自：抗原(例如小分子抗原)-抗体、半抗原-抗体、激素-受体、配体-受体、核酸链-互补核酸链、底物-酶、底物类似物-酶、抑制剂-酶、糖-植物凝集素、生物素-抗生物素蛋白(例如，亲和素和链酶亲和素)、地高辛和地高辛抗体，以及5位溴代去氧鸟苷和其抗体。
在某些优选的实施方案中，第一结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)；(b)地高辛和地高辛抗体；(c)脱硫生物素和链霉亲和素。
在某些优选的实施方案中，第二结合配对的两个成员选自下述组合：(a)生物素和亲和素(例如链霉亲和素)；(b)地高辛和地高辛抗体；(c)脱硫生物素和链霉亲和素。
特别优选的是，R5a与第二结合配对的两个成员(R6b和R6c)之间不存在相互作用。此外，特别优选地，R5a不影响R6b和R6c之间的特异性相互作用，并且R6b和R6c不影响R5a和M之间的正交连接反应。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2-N3；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含膦化物，例如羧基膦化物或羟基膦化物，例如P(CH2CH2COOH)3或P(CH2CH2OH)3。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是地高辛；R6b是地高辛抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是地高辛；R5b是地高辛抗体；R6a是生物素；R6b是亲和素(例如链霉亲和素)。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是-CH2CH＝CH2；R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含钯的配合物或钌的配合物；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含钯的配合物或钌的配合物。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些优选的实施方案中，R3a、R3b、R3c和R3d是R4a、R4b和R4c是第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)；R5a是生物素；R5b是亲和素(例如链霉亲和素)；R6a是Cy3；R6b是Cy3抗体。优选地，第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、第五试剂、第六试剂和第七试剂是相同的试剂，并且包含化合物Q(例如，上文所定义的化合物Q)。
在某些实施方案中，化合物M选自以下化合物：
化合物M1，其具有结构式其中，Y选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，L0不存在或者为连接基团，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)；
化合物M2，其具有结构式其中，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)；
化合物M3，其具有结构式其中，Z3各自独立地选自烷基(例如C1-C6烷基，例如C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)和芳香基(例如6-10元芳香基，例如6元芳香基、7元芳香基、8元芳香基、9元芳香基或10元芳香基，例如苯基)，Dye为荧光基团，所述荧光基团与第二化合物和第四化合物包含的荧光基团相同(或结构不同但发射光谱相同或实质相同)。
在本发明的实施方案中，连接基团L0不受特别的限制。本领域技术人员可以根据实际需要，选择合适的连接基团L0。例如，在某些优选的实施方案中，L0可以为其中，q1、q2、q3、q4各自独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
另外，如上文所描述的，在本发明的方法中，可根据需要，增加洗涤步骤。可在任何期望的阶段，增加所述洗涤步骤，并且任选地，所述洗涤步骤可进行一次或多次。
例如，在步骤(5)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除游离的(即，未并入生长的核酸链的)携带荧光基团的化合物(例如式(II)化合物和式(IV)化合物)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(7)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(6)中应用的携带荧光的试剂，从而尽可能减少非特异性的荧光信号。
类似地，在步骤(9)中，在移除反应体系的溶液相之后，可进行一次或多次洗涤，以充分除去残留的溶液相。此类洗涤步骤可能是有利的，其可用于充分去除步骤(8)中应用的试剂以及产生的产物(其可能携带荧光)，从而尽可能减少非特异性的荧光信号，并且尽可能避免对后续的聚合反应造成不利的影响。
可使用各种合适的洗涤溶液来进行洗涤步骤。此类洗涤溶液的实例包括但不限于，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。可根据实际需要来选择合适的洗涤溶液(包括合适的成分，浓度，离子强度，pH值等)，这在本领域技术人员的能力范围之内。
(二)试剂盒
在一个方面，本发明提供了一种用于对核酸分子进行测序的试剂盒，其包括如上文所定义的四种化合物。在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含四种化合物(即，第一、第二、第三和第四化合物)，其中：
所述四种化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物，且具有碱基互补配对能力；并且，
所述四种化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的羟基(-OH)被保护基团保护；并且，所述保护基团能够被去除；
所述第一化合物和第三化合物不能发出荧光信号(例如不携带荧光基团)，所述第二化合物能够发出荧光信号(例如携带荧光基团)，所述第四化合物不能发出荧光信号，或者能够发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，携带荧光基团，所述荧光基团与第二化合物中的荧光基团相同，或所述荧光基团与第二化合物中的荧光基团结构不同，但二者具有相同或实质相同的发射光谱)；并且，
所述第三化合物经处理后能够发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，携带与第二化合物相同的荧光基团，或者携带与第二化合物结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)，且，(i)所述第四化合物本身能够发出与第二化合物相同的荧光信号，则经处理后能够去除自身的荧光信号(例如，去除自身的荧光基团，或者淬灭由自身的荧光基团发出的荧光信号)，或者(ii)所述第四化合物本身不能发出荧光信号，则经第一处理后能够发出与第二化合物相同的荧光信号(例如，携带与第二化合物相同的荧光基团，或者携带与第二化合物结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)，并且经第二处理后能够去除自身的荧光信号(例如，去除自身的荧光基团，或者淬灭由自身的荧光基团发出的荧光信号)。
在某些优选的实施方案中，所述四种化合物的核糖或脱氧核糖的3'位置处的所述保护基团可通过生物正交切割反应去除。例如，所述保护基团是能够发生生物正交切割反应的反应性基团。由此，可通过使所述四种化合物进行生物正交切割反应，去除所述保护基团。
在某些优选的实施方案中，第三化合物包含能够发生生物正交连接反应的反应性基团。由此，可通过使该反应性基团发生生物正交连接反应，在第三化合物中引入荧光基团，使其具有发出荧光信号的能力。因此，在此类实施方案中，可通过使所述第三化合物进行生物正交连接反应，从而使其发出与第二化合物相同的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，第三化合物包含结合配对的一个成员。由此，可通过所述成员与该结合配对的另一个成员(其携带荧光基团)之间的特异性相互作用来在第三化合物中引入荧光基团，使其具有发出荧光信号的能力。因此，在此类实施方案中，可通过使所述第三化合物与携带荧光基团的该结合配对的另一个成员相接触，从而在第三化合物中引入荧光基团，使其发出与第二化合物相同的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，第四化合物包含能够发生生物正交切割反应的反应性基团。由此，可通过使该反应性基团发生生物正交切割反应，将第四化合物中的荧光基团切除，使其丧失发出荧光信号的能力。因此，在此类实施方案中，可通过使所述第四化合物进行生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团，使第四化合物不再发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，第四化合物包含结合配对的一个成员。由此，可通过所述成员与该结合配对的另一个成员(其携带淬灭基团)之间的特异性相互作用，在第四化合物中引入能够淬灭荧光的淬灭基团，使其丧失发出荧光信号的能力。因此，在此类实施方案中，可通过使所述第四化合物与携带淬灭基团的该结合配对的另一个成员相接触，从而在第四化合物中引入淬灭基团，使其不再发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，第四化合物包含能够发生生物正交连接反应的反应性基团。由此，可通过使该反应性基团发生生物正交连接反应，在第四化合物中引入能够淬灭荧光的淬灭基团，使其丧失发出荧光信号的能力。因此，在此类实施方案中，可通过使所述第四化合物进行生物正交连接反应，从而在第四化合物中引入淬灭基团，使其不再发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，但其包含能够发生生物正交连接反应的反应性基团。由此，可通过使该反应性基团发生生物正交连接反应，在第四化合物中引入荧光基团，使其具有发出荧光信号的能力。因此，在此类实施方案中，可通过使所述第四化合物进行生物正交连接反应，从而使其发出与第二化合物相同的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，第四化合物本身不携带荧光基团，但其包含结合配对的一个成员。由此，可通过所述成员与该结合配对的另一个成员(其携带荧光基团)之间的特异性相互作用来在第四化合物中引入荧光基团，使其具有发出荧光信号的能力。因此，在此类实施方案中，可通过使所述第四化合物与携带荧光基团的该结合配对的另一个成员相接触，从而在第四化合物中引入荧光基团，使其发出与第二化合物相同的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，第四化合物包含第一结合配对的一个成员，所述第一结合配对的另一成员同时是第二结合配对的一个成员。由此，可通过第一结合配对的成员与该结合配对的另一个成员(其携带荧光基团)之间的特异性相互作用，在第四化合物中引入荧光基团，使其具有发出荧光信号的能力；并且，可通过第二结合配对的成员与第二结合配对的另一个成员之间的特异性相互作用，使第一结合配对的结合物解离，使所述第四化合物失去荧光基团，因而丧失发出荧光信号的能力。
在某些示例性实施方案中，第一、第二、第三和第四化合物分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R5b各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；
R7a为能够发出荧光信号的荧光基团(Dye1)，或者能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团，或者结合配对的一个成员；
并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R5b与R7a之间还存在能够进行第三生物正交连接反应的反应性基团R8。
在某些优选的实施方案中，所述四种化合物如上文的示例性实施方案1中所定义。在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂，其能够与第三化合物中的R5a发生第一生物正交连接反应，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，能够使第四化合物中的R5b发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团的试剂。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂，其能够与第四化合物中的R7a发生第二生物正交连接反应，或者能够与R7a特异性结合，从而将所述荧光基团引入第四化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带淬灭剂的试剂，其能够与第四化合物中的R8发生第三生物正交连接反应，从而淬灭第四化合物发出的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，除了所述的四种化合物之外，所述试剂盒还包含示例性实施方案1中所描述的任一种或多种试剂。
在某些示例性实施方案中，第一、第二、第三和第四化合物分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a(i)是第二结合配对的一个成员，同时是第三结合配对的一个成员；或者
(ii)只是第三结合配对的一个成员；并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8。
在某些优选的实施方案中，所述四种化合物如上文的示例性实施方案2中所定义。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱。所述R6b-L4-Dye2中的R6b能够与第四化合物中的R6a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述荧光基团(Dye2)引入第四化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R5b-L5-Dye3，其中R5b为第一结合配对的另一个成员，L5为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，其优选地为与第二化合物相同的荧光基团(或者与第二化合物的荧光基团结构不同但发射光谱相同或实质相同的荧光基团)。所述R5b-L5-Dye3中的R5b能够与第三化合物中的R5a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述荧光基团(Dye)引入第三化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R6b-L6-Que，其中R6b为第二结合配对的另一个成员，L6为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye发出的荧光信号的淬灭基团。所述R6b-L6-Que中的R6b能够与第四化合物中的R6a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述淬灭基团(Que)引入第四化合物，并淬灭第四化合物中的荧光基团(Dye)发出的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带淬灭剂的试剂，其能够与第四化合物中的R8发生第三生物正交连接反应，从而淬灭第四化合物发出的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，除了所述的四种化合物之外，所述试剂盒还包含示例性实施方案2中所描述的任一种或多种试剂。
在某些示例性实施方案中，第一、第二、第三和第四化合物分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
R6a(i)是第一结合配对的一个成员，同时是第二结合配对的一个成员；或者
(ii)只是第二结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1，或者R6a还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8。
在某些优选的实施方案中，所述四种化合物如上文的示例性实施方案3中所定义。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第一结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱。所述R6b-L4-Dye2中的R6b能够与第四化合物中的R6a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述荧光基团(Dye2)引入第四化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂，其能够与第三化合物中的R5a发生生物正交连接反应，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R6c-L'-Que，其中R6c为第二结合配对的另一个成员，L'为连接基团或不存在；Que表示能够淬灭Dye发出的荧光信号的淬灭基团。所述R6c-L'-Que中的R6b能够与第四化合物中的R6a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述淬灭基团(Que)引入第四化合物，并淬灭第四化合物中的荧光基团(Dye)发出的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带淬灭剂的试剂，其能够与第四化合物中的R8发生第三生物正交连接反应，从而淬灭第四化合物发出的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，除了所述的四种化合物之外，所述试剂盒还包含示例性实施方案3中所描述的任一种或多种试剂。
在某些示例性实施方案中，第一、第二、第三和第四化合物分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R6各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为能够发出荧光信号的荧光基团(Dye1)，能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团，和/或第二结合配对的一个成员；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱。
任选地，R4c和R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8；
在某些优选的实施方案中，所述四种化合物如上文的示例性实施方案4中所定义。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R6b-L-Dye1；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L独立地为连接基团或不存在；Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱。所述R6b-L-Dye1中的R6b能够与第四化合物中的R6a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述荧光基团(Dye1)引入第四化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂，其能够与第四化合物中的R6a发生第一生物正交连接反应，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R5b-L-Dye2，其中R5b为第一结合配对的另一个成员，L为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，其优选地为与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团。所述R5b-L-Dye2中的R5b能够与第三化合物中的R5a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述荧光基团(Dye2)引入第三化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带淬灭剂的试剂，其能够与第四化合物中的R8发生第二生物正交连接反应，从而淬灭第四化合物发出的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，能够使第四化合物中的R4c发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团的试剂。
在某些优选的实施方案中，除了所述的四种化合物之外，所述试剂盒还包含示例性实施方案4中所描述的任一种或多种试剂。
在某些示例性实施方案中，第一、第二、第三和第四化合物分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为第二结合配对的一个成员，任选地，R6a为Dye1或者还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行生物正交连接反应的反应性基团R8。
在某些优选的实施方案中，所述四种化合物如上文的示例性实施方案5中所定义。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第二结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱。所述R6b-L4-Dye2中的R6b能够与第四化合物中的R6a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述荧光基团(Dye1)引入第四化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，第二结合配对的另一个成员，其能够与R6b发生特异性相互作用/特异性结合，使R6a与R6b形成的结合物解离，从而使第四化合物失去荧光基团。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R5b-L5-Dye3，其中R5b为第一结合配对的另一个成员，L5为连接基团或不存在；Dye3表示能够发出荧光信号的荧光基团，其优选地为与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团。所述R5b-L5-Dye3中的R5b能够与第三化合物中的R5a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述荧光基团(Dye3)引入第三化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带淬灭剂的试剂，其能够与第四化合物中的R8发生第二生物正交连接反应，从而淬灭第四化合物发出的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，能够使第四化合物中的R4c发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团的试剂。
在某些优选的实施方案中，除了所述的四种化合物之外，所述试剂盒还包含示例性实施方案5中所描述的任一种或多种试剂。
在某些示例性实施方案中，第一、第二、第三和第四化合物分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示的结构：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、(T/U)、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团(-PO3H2)，二磷酸基团(-PO3H-PO3H2)，三磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H2)和四磷酸基团(-PO3H-PO3H-PO3H-PO3H2)；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c各自独立地为能够进行生物正交切割反应的反应性基团；
R5a为能够进行第一生物正交连接反应的反应性基团；
R6a为第一结合配对的一个成员，任选地，R6a为Dye1或者还连接有-L3-Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱；
任选地，R4c与R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8。
在某些优选的实施方案中，所述四种化合物如上文的示例性实施方案6中所定义。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括R6b-L4-Dye2；其中，R6b为第一结合配对的另一个成员，L4独立地为连接基团或不存在；Dye2表示能够发出荧光信号的荧光基团，并且具有与Dye相同的结构，或者结构不同但具有相同或实质相同的发射光谱。所述R6b-L4-Dye2中的R6b能够与第四化合物中的R6a发生特异性相互作用/特异性结合，从而将所述荧光基团(Dye1)引入第四化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，第二结合配对的另一个成员，其能够与R6b发生特异性相互作用/特异性结合，使R6a与R6b形成的结合物解离，从而使第四化合物失去荧光基团。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带荧光基团(例如，与第二化合物相同的荧光基团，或者与第二化合物的荧光基团的发射光谱相同或实质相同的荧光基团)的试剂，其能够与第三化合物中的R5a发生第一生物正交连接反应，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使之发出荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，携带淬灭剂的试剂，其能够与第四化合物中的R8发生第二生物正交连接反应，从而淬灭第四化合物发出的荧光信号。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括，能够使第四化合物中的R4c发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团的试剂。
在某些优选的实施方案中，除了所述的四种化合物之外，所述试剂盒还包含示例性实施方案6中所描述的任一种或多种试剂。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含：用于从样品中提取核酸分子的试剂和/或装置；用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含，用于从样品中提取核酸分子的试剂和/或装置。用于从样品中提取核酸分子的方法是本领域熟知的。因此，可根据需要，在本发明的试剂盒中配置各种用于提取核酸分子的试剂和/或装置，例如用于破碎细胞的试剂，用于沉淀DNA的试剂，用于洗涤DNA的试剂，用于溶解DNA的试剂，用于沉淀RNA的试剂，用于洗涤RNA的试剂，用于溶解RNA的试剂，用于去除蛋白的试剂，用于去除DNA的试剂(例如当目的核酸分子为RNA时)，用于去除RNA的试剂(例如当目的核酸分子为DNA时)，及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含，用于预处理核酸分子的试剂。在本发明的试剂盒中，用于预处理核酸分子的试剂不受额外限制，并且可根据实际需要选择。所述用于预处理核酸分子的试剂包括例如，用于核酸分子片段化的试剂(例如DNA酶I)，用于补齐核酸分子末端的试剂(例如DNA聚合酶，例如T4DNA聚合酶，Pfu DNA聚合酶，KlenowDNA聚合酶)，接头分子，标签分子，用于将接头分子与目的核酸分子相连接的试剂(例如连接酶，例如T4DNA连接酶)，用于修复核酸切口的试剂(例如，丧失3'-5'核酸外切酶活性但显示5'-3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶)，用于扩增核酸分子的试剂(例如，DNA聚合酶，引物，dNTP)，用于分离和纯化核酸分子的试剂(例如层析柱)，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于连接待测序的核酸分子的支持物。所述支持物可以具有上文中针对支持物所详细描述的任何技术特征以及其任何组合。
例如，在本发明中，所述支持物可以由各种合适的材料制成。此类材料包括例如：无机物、天然聚合物、合成聚合物，以及其任何组合。具体的例子包括但不限于：纤维素、纤维素衍生物(例如硝化纤维素)、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯等交联的聚苯乙缔(参见例如，MerrifieldBiochemistry 1964,3,1385-1390)、聚丙烯酰胺、乳胶、葡聚糖、橡胶、硅、塑料、天然海绵、金属塑料、交联的葡聚糖(例如，SephadexTM)、琼脂糖凝胶(SepharoseTM)，以及本领域技术人员已知的其他支持物。
在某些优选的实施方案中，用于连接待测序的核酸分子的支持物可以是包括惰性基底或基质(例如，载玻片、聚合物珠等)的固体支持物，所述惰性基底或基质已例如通过应用含有活性基团的中间材料而被功能化，所述活性基团允许共价连接诸如多核苷酸的生物分子。此类支持物的实例包括但不限于，负载于诸如玻璃的惰性基底上的聚丙酰胺水凝胶，特别是WO 2005/065814和US 2008/0280773中描述的聚丙烯酰胺水凝胶，其中，所述专利申请的内容通过引用以其全文并入本文。在此类实施方案中，生物分子(例如多核苷酸)可被直接地共价地连接至中间材料(例如水凝胶)，而中间材料其自身可被非共价地连接至基底或基质(例如，玻璃基底)。在某些优选的实施方案中，所述支持物为表面修饰了一层亲和素、氨基、丙烯酰胺硅烷或醛基化学基团的玻片或硅片。
在本发明中，支持物或固体支持物不受限于其大小、形状和构造。在一些实施方案中，支持物或固体支持物是平面结构，例如载片、芯片、微芯片和/或阵列。此类支持物的表面可以是平面层的形式。在一些实施方案中，支持物或其表面是非平面的，例如管或容器的内表面或外表面。在一些实施方案中，支持物或固体支持物包括微球或珠。在某些优选的实施方案中，用于连接待测序的核酸分子的支持物为珠或孔的阵列。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于将待测序的核酸分子与支持物连接(例如，共价或非共价连接)的试剂。此类试剂包括例如对核酸分子(例如其5'端)进行活化或修饰的试剂，例如磷酸、硫醇、胺、羧酸或醛；对支持物的表面进行活化或修饰的试剂，例如氨基-烷氧基硅烷(例如氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基丙基三乙氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷等)；交联剂，例如琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐(Guo等人，1994)、马来酸酐(Yang等人，1998)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、间-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺(SMCC)、N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺(SMPB)；以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于起始核苷酸聚合反应的引物。在本发明中，引物不受额外的限制，只要它能够特异性地退火到目标核酸分子的一个区域上。在一些示例性实施方案中，所述引物的长度可以为5-50bp，例如5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50bp。在一些示例性实施方案中，所述引物可包含天然存在或非天然存在的核苷酸。在一些示例性实施方案中，所述引物包含天然存在的核苷酸或者由天然存在的核苷酸组成。在一些示例性实施方案中，所述引物包含经修饰的核苷酸，例如锁核酸(LNA)。在某些优选的实施方案中，所述引物包含通用引物序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶。在本发明中，可使用各种合适的聚合酶。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以DNA为模板合成新的DNA链(例如DNA聚合酶)。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以RNA为模板合成新的DNA链(例如反转录酶)。在一些示例性实施方案中，所述聚合酶能够以DNA或RNA为模板合成新的RNA链(例如RNA聚合酶)。因此，在某些优选的实施方案中，所述聚合酶选自DNA聚合酶，RNA聚合酶，和反转录酶。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含一种或多种缓冲溶液。此类缓冲液包括但不限于，用于DNA酶I的缓冲溶液，用于DNA聚合酶的缓冲溶液，用于连接酶的缓冲溶液，用于洗脱核酸分子的缓冲溶液，用于溶解核酸分子的缓冲溶液，用于进行核苷酸聚合反应(例如PCR)的缓冲溶液，和用于进行连接反应的缓冲溶液。本发明的试剂盒可包含上述缓冲溶液的任一种或多种。
在某些优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含一种或多种洗涤溶液。此类洗涤溶液的实例包括但不限于，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液等等。本发明的试剂盒可包含上述洗涤溶液的任一种或多种。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的方法仅使用了一种荧光染料，或者使用能够发出相同荧光信号的两种荧光染料。因此，用于本发明测序方法的测序装置仅需配备一个激发光源和一个相机。这一方面大大降低了测序装置的制造成本，有助于测序装置和测序方法的推广和应用；另一方面显著减小了测序装置的体积，使测序装置更加轻便，便于携带。
(2)本发明的方法通过荧光的存在或不存在来区分碱基。与通过不同波长的荧光来区分碱基的方法相比，本发明的方法具有更高的灵敏度和更高的准确性。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
具体实施方式1
制备例1.dGTP的衍生物的制备
dGTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成获得，合成方法参考文献(US20130189743A1)。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C11H17N8O13P3[M],分子量：562.01(calc),561.00[M-H]-(found)。化合物结构如式1所示。
合成路线：
制备例2.dATP的衍生物的制备
dATP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成得到，合成方法参考文献(US20130189743A1),该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C60H68N15O25P3S2[M],分子量1555.31(calc),1554.25[M-H]-(found)。化合物结构如式2所示。
合成路线包括下述阶段1和2的路线：
阶段1：
阶段2：
制备例3.dTTP的衍生物的制备
dTTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成得到，合成方法参考文献US20130189743A1和Bioconjugate Chem.2014,25,1730-1738。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C37H50N11O20P3[M],分子量1061.25(calc),1060.11[M-H]-(found)。化合物结构如式(3)所示。
合成路线：
制备例4.dCTP的衍生物的制备
dCTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司，合成方法参考文献US20130189743A1和Bioconjug Chem.2016；27(7):1697-16706。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C54H64N11O24P3S2[M],分子量1406.27(calc),1405.26[M-H]-(found)。化合物结构如式4所示。
合成路线：
制备例5.1,2,4,5-四嗪衍生物的合成
用于生物正交性反应的化合物1,2,4,5-四嗪衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成，方法参考文献Bioconjugate Chem.2014,25,1730-1738，得到红色固体。ESI：计算得到分子式C42H42N8O9S2[M],分子量866.25(calc),865.24[M-H]-(found)。
合成路线：
在本实验例中，用四种核苷酸衍生物(即，制备例1获得的dGTP的衍生物，制备例2获得的dATP的衍生物，制备例3获得的dTTP的衍生物1和制备例4获得的dCTP的衍生物)来对模板核酸进行测序反应。简言之，本实验例所使用的测序方法涉及下述步骤：
(1)将模板核酸固定至芯片上，各待测核酸分子的序列见表1，通过BGISEQ-500建库试剂盒构建和DNB装载试剂盒固定于BGISEQ-500测序芯片上。
(2)添加测序引物，引物为BGISEQ-500常规测序引物，引物退火至模板核酸分子上，与模板核酸分子一起形成连接于芯片上的双链体。
(3)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；使用的DNA聚合酶和缓冲液均与BGISEQ-500测序试剂一样，其中使用的核苷酸替换成这里合成的四种核苷酸，在本实验中的试剂除切除试剂不同以外均保持与BGISEQ-500试剂相同。
(4)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，加入扫描缓冲液，之后检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片(即，实验照片1)；
(5)移除溶液相，洗涤，加入生物正交性试剂反应液，使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对G和A碱基没有影响，但是能够使C碱基的与携带AF532的试剂发生生物正交切割反应，从而去除C碱基化合物中的荧光基团，并且能够使T碱基中的发生生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入T碱基，使其发出荧光信号；
其中使用的生物正交性反应试剂为含有1mM的1,2,4,5,-四嗪衍生物的1X磷酸盐缓冲液，反应温度为35度，反应时间1-5分钟。
(6)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，加入BGISEQ-500扫描缓冲液，之后检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片(即，实验照片2)。
(7)移除溶液相，洗涤，并对芯片进行处理，以去除所述四种核苷酸衍生物中的保护基团，即，使叠氮亚甲基、叠氮次甲基发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OCH2N3(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团AF532，如果存在的话；
用于切除叠氮亚甲基、叠氮次甲基的反应试剂中包含：1M氯化钠，0.1M tris，pH＝9,10mM thpp。
(8)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(9)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(3)-(6)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(10)重复进行步骤(7)-(9)一次或多次。
在取得两次拍照的照片(即，实验照片1和2)之后，对同一个位置的信号进行比较。图1显示了实验照片1和2的比较结果，其中：
三角形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1和2中均无荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基G被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为C。
椭圆区域表示，该位置(核酸分子)在照片1中有荧光信号，但在照片2中无荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基C被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为G。
正方形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1和2中均有荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基A被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为T。
圆形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1中无荧光信号，但在照片2中有荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基T被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为A。
使用上述方法进行10个循环的测序验证，测试样本为36个不同序列混合样品，测序之后对比序列到36个序列中，达到完全匹配和允许一个错误的比例是94.65％。
结果表明：本实施方案中的方法能够在仅使用一种荧光基团的情况下，对模板核酸进行精确测序。
表1
*能够与特定编号的序列相匹配(包括完全匹配和允许一个错误)的样品数与所有样品总数之间的比例
具体实施方式2
制备例1.dGTP的衍生物的制备
dGTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成获得，合成方法参考文献US20130189743A1。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C11H17N8O13P3[M],分子量：562.01(calc),561.00[M-H]-(found)。化合物结构如式1所示。
合成路线：
制备例2.dATP的衍生物的制备
dATP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成得到，合成方法参考文献US20130189743A1,该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C60H68N15O25P3S2[M],分子量1555.31(calc),1554.25[M-H]-(found)。化合物结构如式2所示。
合成路线：
制备例3.dTTP的衍生物的制备
dTTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成得到，合成方法参考文献US20130189743A1和ucleic Acids Res.,15,4513–4534，该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C37H50N11O20P3[M],分子量1061.25(calc),1060.11[M-H]-(found)。化合物结构如式(3)所示。
dig:
制备例4.dCTP的衍生物的制备
dCTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成(合成方法参考文献US20130189743A1和Nucleic Acids Res.,15,4513–4534)。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C38H55N14O20P3[M],分子量1120.29(calc),1119.35[M-H]-(found)。化合物结构如式(4)所示。
合成路线：
ds-biotin：
第一结合配对：digoxingenin与digoxigenin抗体。可通过使dTTP衍生物上的digoxingenin与修饰有Cy3的digoxigenin抗体(digoxigenin抗体-cy3)结合，使dTTP衍生物带上Cy3。digoxingenin和digoxigenin抗体-cy3由antibody online购买(货号：ABIN739187)。
第二结合配对：desthiobiotin与链酶亲和素。可通过使dCTP衍生物上的desthiobiotin与修饰有Cy3(与AF532吸收激发波长相同)的链酶亲和素结合，使dCTP衍生物带上Cy3。修饰有Cy3的链酶亲和素由sigma购买(货号:S6402-1ML)。
第三结合配对：链霉亲和素与生物素。可通过链霉素与生物素之间的特异性结合，使desthiobiotin-链酶亲和素结合物解离，从而使dCTP失去荧光基团。
实验例2
在本实验例中，用四种核苷酸衍生物(即，制备例1获得的dGTP的衍生物，制备例2获得的dATP的衍生物，制备例3获得的dTTP的衍生物1和制备例4获得的dCTP的衍生物)来对模板核酸进行测序反应。简言之，本实验例所使用的测序方法涉及下述步骤：
(1)将模板核酸固定至芯片上，各待测核酸分子的序列见表2，通过BGISEQ-500建库试剂盒构建和DNB装载试剂盒固定于BGISEQ-500测序芯片上。
(2)添加测序引物，引物为BGISEQ-500常规测序引物，引物退火至模板核酸分子上，与模板核酸分子一起形成连接于芯片上的双链体。
(3)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；使用的DNA聚合酶和缓冲液均与BGISEQ-500测序试剂一样，其中使用的核苷酸替换成这里合成的四种核苷酸，在本实验中的试剂除切除试剂不同以外均保持与BGISEQ-500试剂相同。
(4)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，加入特异性结合试剂1，35℃下反应1分钟。
特异性结合试剂1包含：1X磷酸盐缓冲液，1μg/ml BSA,10ng/ml链酶亲和素-cy3。
(5)加入扫描缓冲液，之后检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片(即，实验照片1)；
(6)移除溶液相，洗涤，加入特异性结合试剂2，35℃反应1-5分钟，使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对G和A碱基没有影响，但是试剂中的生物素能够与C碱基携带的desthiobiotin-链酶亲和素结合物作用，取代掉desthiobiotin，形成biotin-链酶亲和素结合物，使链酶亲和素-cy3从C碱基上脱离开来，从而使C碱基失去荧光基团；而试剂中的digoxigenin抗体-cy3能够特异性地与T碱基中的digoxigenin结合，从而将荧光基团Cy3引入T碱基，使其发出荧光信号。
染色试剂2包含：1X磷酸盐缓冲液，1μg/ml BSA,10ng/ml digoxigenin抗体-cy3和10μM生物素。
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，加入BGISEQ-500扫描缓冲液，之后检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片(即，实验照片2)。
(8)移除溶液相，洗涤，并对芯片进行处理，以去除所述四种核苷酸衍生物中的保护基团，即，使叠氮亚甲基、叠氮次甲基发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OCH2N3(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团Cy3，如果存在的话；
用于去切除叠氮亚甲基、叠氮次甲基的反应试剂中包含；1M氯化钠，0.1M tris，pH＝9,10mM thpp。
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次。
在取得两次拍照的照片(即，实验照片1和2)之后，对同一个位置的信号进行比较。图2显示了实验照片1和2的比较结果，其中：
三角形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1和2中均无荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基G被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为C。
椭圆区域表示，该位置(核酸分子)在照片1中有荧光信号，但在照片2中无荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基C被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为G。
正方形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1和2中均有荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基A被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为T。
圆形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1中无荧光信号，但在照片2中有荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基T被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为A。
使用上述方法进行10个循环的测序验证，测试样本为36个不同序列混合样品，测序之后对比序列到36个序列中，达到完全匹配和允许一个错误的比例是92.85％。
结果表明：本实施方案中的方法能够在仅使用一种荧光基团的情况下，对模板核酸进行精确测序。
表2
*能够与特定编号的序列相匹配(包括完全匹配和允许一个错误)的样品数与所有样品总数之间的比例
具体实施方式3
制备例1.dGTP衍生物的合成
dGTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成获得，合成方法参考文献(US20130189743A1)。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C11H17N8O13P3[M],分子量：562.01(calc),561.00[M-H]-(found)。化合物结构如式(1)所示。
合成路线：
制备例2.dATP衍生物的合成
dATP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成得到，合成方法参考文献(US20130189743A1),该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C60H68N15O25P3S2[M],分子量1555.31(calc),1554.25[M-H]-(found)。化合物结构如式(2)所示。
合成路线：
制备例3dTTP衍生物的制备
dTTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成得到，合成方法参考文献US20130189743A1和ucleic Acids Res.,15,4513–4534，该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C38H52N13O21P3S[M],分子量：1151.23(calc),1150.21[M-H]-(found)。化合物结构如式(3)所示。
合成路线：
制备例4.dCTP衍生物的制备
dCTP衍生物由上海合亚医药科技(上海)有限公司合成(合成方法参考文献US20130189743A1和Nucleic Acids Res.,15,4513–4534)。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C59H76ClN14O19P3[M],分子量1412.43(calc.),1411.33[M-H]-(found)。化合物结构如式(4)所示。
合成路线：
第一结合配对：生物素与链酶亲和素-AF532(thermofisher货号:S11224)。可以通过使dTTP衍生物上的生物素与修饰有AF532的链酶亲和素结合，使dTTP衍生物带上AF532。链酶亲和素-AF532由thermofisher购买，货号:S11224。
第二结合配对：Cy3与cy3抗体。可以通过使dCTP衍生物上的Cy3与带有淬灭剂BHQ2的cy3抗体(Cy3抗体-BHQ2)特异性结合，使cy3被BHQ2 Quencher猝灭掉。Cy3抗体-BHQ2由santa cruz biotech购买，货号：sc-166894。
染色试剂：1XPBS缓冲液，1ug/ml BSA,10ng/ml链酶亲和素-AF532和10ng/ml cy3抗体-BHQ2(black hole quencher).染色时间温度：30秒，35℃。
实验例3
在本实验例中，用四种核苷酸衍生物(即，制备例1获得的dGTP的衍生物，制备例2获得的dATP的衍生物，制备例3获得的dTTP的衍生物1和制备例4获得的dCTP的衍生物)来对模板核酸进行测序反应。简言之，本实验例所使用的测序方法涉及下述步骤：
(1)将模板核酸固定至芯片上，各待测核酸分子的序列见表3，通过BGISEQ-500建库试剂盒构建和DNB装载试剂盒固定于BGISEQ-500测序芯片上。
(2)添加测序引物，引物为BGISEQ-500常规测序引物，引物退火至模板核酸分子上，与模板核酸分子一起形成连接于芯片上的双链体。
(3)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；使用的DNA聚合酶和缓冲液均与BGISEQ-500测序试剂一样，其中使用的核苷酸替换成这里合成的四种核苷酸，在本实验中的试剂除切除试剂不同以外均保持与BGISEQ-500试剂相同。
(4)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，加入扫描缓冲液，之后检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片(即，实验照片1)。
(5)移除溶液相，洗涤，加入特异性结合试剂，35℃反应1-5分钟。使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对G和A碱基没有影响，但是试剂中的cy3抗体-BHQ2能够使C碱基携带的cy3染料与cy3抗体结合，从而使cy3染料被BHQ2 Quencher特异性的猝灭掉，从而失去荧光的性质；而试剂中的链酶亲和素-AF532能够特异性地与T碱基中的生物素结合，从而将所述试剂中的荧光基团引入T碱基，使其发出荧光信号；由于cy3的激发和发射光谱和AF532几乎相同，而BHQ2能够完全猝灭Cy3的信号，因此cy3的抗体连接上BHQ2能够完全猝灭cy3的信号，因此在染色试剂中加入cy3抗体-BHQ2，能够实现1到0的信号转换，而AF532则不受影响。
特异性结合试剂包含：1X磷酸盐缓冲液，1μg/ml BSA,10ng/ml cy3抗体-BHQ2和10ng/ml链酶亲和素-AF532.
(6)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，加入BGISEQ-500扫描缓冲液，之后检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片(即，实验照片2)。
(7)移除溶液相，洗涤，并对芯片进行处理，以去除所述四种核苷酸衍生物中的保护基团，即，使叠氮亚甲基、叠氮次甲基发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OCH2N3(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与-OCHN3-R连接的荧光基团)，如果存在的话；
用于切除叠氮亚甲基、叠氮次甲基的反应试剂包含：1M氯化钠，0.1M tris，pH＝9,10mM thpp。
(8)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(9)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(3)-(6)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(10)重复进行步骤(7)-(9)一次或多次。
在取得两次拍照的照片(即，实验照片1和2)之后，对同一个位置的信号进行比较。图1显示了实验照片1和2的比较结果，其中：
三角形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1和2中均无荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基G被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为C。
椭圆区域表示，该位置(核酸分子)在照片1中有荧光信号，但在照片2中无荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基C被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为G。
正方形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1和2中均有荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基A被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为T。
圆形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1中无荧光信号，但在照片2中有荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基T被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为A。
使用上述方法进行10个循环的测序验证，测试样本为36个不同序列混合样品，测序之后对比序列到36个序列中，达到完全匹配和允许一个错误的比例是97.3％。
结果表明：本实施方案中的方法能够在仅使用一种荧光基团的情况下，对模板核酸进行精确测序。
表3
*能够与特定编号的序列相匹配(包括完全匹配和允许一个错误)的样品数与所有样品总数之间的比例
具体实施方式4
制备例1dGTP衍生物的制备
dGTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成获得，合成方法参考文献(US20130189743A1)该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C11H17N8O13P3[M],分子量：562.01(calc),561.00[M-H]-(found)。化合物结构如式(1)所示。
合成路线
制备例2.dATP的衍生物的制备
dATP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成得到，合成方法参考文献US20130189743A1,该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C60H68N15O25P3S2[M],分子量1555.31(calc),1554.25[M-H]-(found)。化合物结构如式(2)所示。
合成路线：
制备例3.dTTP衍生物的制备
d,dTTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司合成得到，合成方法参考文献US20130189743A1和Nucleic Acids Res.,15,4513–4534。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C38H52N13O21P3S[M],分子量1151.23(calc.),1150.21[M-H]-(found)。化合物结构如式(3)所示。
合成路线：
制备例4.dCTP的衍生物的制备
dCTP衍生物由合亚医药科技(上海)有限公司服务合成(合成方法参考文献US20130189743A1和Nucleic Acids Res.,15,4513–4534和Bioconjug Chem.2016；27(7):1697-16706))。该化合物通过分析型HPLC纯化，得到纯度大于95％产物。MALDI-TOF：计算得到分子式C74H93N16O28P3S2[M],分子量1810.50(calc),1809.43[M-H]-(found)。化合物结构如式(4)所示。
合成路线：
制备例5 1,2,4,5-四嗪BHQ2的制备
用于生物正交性反应的化合物1,2,4,5-四嗪BHQ2由合亚医药科技(上海)有限公司合成。方法参考文献Bioconjugate Chem.2014,25,1730-1738。ESI：计算得到分子式C37H38N12O6[M],分子量746.30(calc.),747.29[M+H]+(found)。
合成路线：
结合配对：生物素可以与链酶亲和素特异性结合。可通过使dTTP衍生物上的生物素与修饰有AF532的链酶亲和素结合，使dTTP衍生物带上AF532。修饰有AF532的链酶亲和素(链酶亲和素-AF532)由thermofisher购买，货号:S11224)。
实验例4
在本实验例中，用四种核苷酸衍生物(即，制备例1获得的dGTP的衍生物，制备例2获得的dATP的衍生物，制备例3获得的dTTP的衍生物和制备例4获得的dCTP的衍生物)来对模板核酸进行测序反应。简言之，本实验例所使用的测序方法涉及下述步骤：
(1)将模板核酸固定至芯片上，各待测核酸分子的序列见表4，通过BGISEQ-500建库试剂盒构建和DNB装载试剂盒固定于BGISEQ-500测序芯片上。
(2)添加测序引物，引物为BGISEQ-500常规测序引物，引物退火至模板核酸分子上，与模板核酸分子一起形成连接于芯片上的双链体。
(3)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；使用的DNA聚合酶和缓冲液均与BGISEQ-500测序试剂一样，其中使用的核苷酸替换成这里合成的四种核苷酸，在本实验中的试剂除切除试剂不同以外均保持与BGISEQ-500试剂相同。
(4)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，加入扫描缓冲液，之后检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片(即，实验照片1)；
(5)移除溶液相，洗涤，加入特异性结合试剂，35℃反应1-5分钟。使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对G和A碱基没有影响，但是试剂中的1,2,4,5四嗪BHQ2能够与C碱基携带的反式环辛烯烃发生生物正交连接反应，从而使AF532染料被BHQ2 Quencher特异性的猝灭掉，使C碱基失去荧光信号；而试剂中的链酶亲和素-AF532能够特异性的与T碱基中的生物素结合，从而将所述试剂中的荧光基团引入T碱基，使其发出荧光信号。
由于cy3的激发和发射光谱和AF532几乎相同，而BHQ2能够完全猝灭Cy3的信号，因此cy3抗体-BHQ2能够完全猝灭cy3的信号，因此在染色试剂中加入cy3抗体-BHQ2，能够实现1到0的信号转换，而AF532则不受影响。
特异性结合试剂包含：1X磷酸盐缓冲液，1μg/ml BSA,1Um 1,2,4,5四嗪-BHQ2和10ng/ml链酶亲和素-AF532。
(6)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，加入BGISEQ-500扫描缓冲液，之后检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号，拍照，存储照片(即，实验照片2)。
(7)移除溶液相，洗涤，并对芯片进行处理，以去除所述四种核苷酸衍生物中的保护基团，即处理能够使叠氮亚甲基、叠氮次甲基发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基(换言之，将-OCH2N3、(如果存在的话)转变为游离的羟基)，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团(换言之，去除与-OCHN3-R连接的荧光基团)，如果存在的话。
用于切除叠氮亚甲基、叠氮次甲基的反应试剂中包含：1M氯化钠，0.1M tris，pH＝9,10mM thpp。
(8)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(9)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(3)-(6)。
在某些优选的实施方案中，所述方法还包括下述步骤：
(10)重复进行步骤(7)-(9)一次或多次。
在取得两次拍照的照片(即，实验照片1和2)之后，对同一个位置的信号进行比较。图1显示了实验照片1和2的比较结果，其中：
三角形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1和2中均无荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基G被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为C。
椭圆区域表示，该位置(核酸分子)在照片1中有荧光信号，但在照片2中无荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基C被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为G。
正方形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1和2中均有荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基A被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为T。
圆形区域表示，该位置(核酸分子)在照片1中无荧光信号，但在照片2中有荧光信号；相应地，根据所使用的4种核苷酸衍生物的结构，可以确定碱基T被并入引物中，因此，可确定该核酸分子的对应位置上的碱基为A。
使用上述方法进行10个循环的测序验证，测试样本为36个不同序列混合样品，测序之后对比序列到36个序列中，达到完全匹配和允许一个错误的比例是94.93％。
结果表明：本实施方案中的方法能够在仅使用一种荧光基团的情况下，对模板核酸进行精确测序。
表4
*能够与特定编号的序列相匹配(包括完全匹配和允许一个错误)的样品数与所有样品总数之间的比例
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 一种基于单荧光染料的测序方法
<130> IDC190027
<150> PCT/CN2016/112402
<151> 2016-12-27
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 1
taggtccgat 10
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 2
ggacggaatc 10
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 3
cttactgccg 10
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 4
acctaattga 10
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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ttcgtatccg 10
<210> 6
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 6
ggtaacgagc 10
<210> 7
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 7
caacgtataa 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 9
ttctgctagc 10
<210> 10
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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aggaagatag 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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caagcacgca 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 13
cggcaatccg 10
<210> 14
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 14
atcaggattc 10
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 15
tcattccaga 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 16
gatgctggat 10
<210> 17
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<212> DNA
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<220>
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gtgagtgatg 10
<210> 18
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 18
gagtcagctg 10
<210> 19
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 19
tgtctgcgaa 10
<210> 20
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 20
attggtacaa 10
<210> 21
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 21
cgattgtggt 10
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<211> 10
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 22
acagacttcc 10
<210> 23
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 23
tccacactct 10
<210> 24
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 24
caccacaagc 10
<210> 25
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 25
tagaggacaa 10
<210> 26
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 26
cctagcgaat 10
<210> 27
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 27
gtagtcatcg 10
<210> 28
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 28
gctgagctgt 10
<210> 29
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 29
aacctagata 10
<210> 30
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 30
ttgccatctc 10
<210> 31
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 31
agatcttgcg 10
<210> 32
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 32
cgctatcggc 10
<210> 33
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 33
gcaacgatgg 10
<210> 34
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 34
taatcgttca 10
<210> 35
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 35
gttcgctcta 10
<210> 36
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 36
tctcacacat 10
Claims (7)
1.一种对核酸分子进行测序的方法，其包括以下步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、T/U、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团，二磷酸基团，三磷酸基团和四磷酸基团；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a,R3b,R3c,和R3d为-CH2-N3；
R4a和R4b为
R5a为R5b为
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；
R7a为Dye1，并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的试剂发生第一生物正交连接反应，从而将所述试剂中的荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号，所述荧光基团为与第二化合物结构相同的荧光基团，或者与第二化合物的结构不同但发射光谱相同的荧光基团；并且所述处理能够使第四化合物中的R5b发生生物正交切割反应，从而去除第四化合物中的荧光基团；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)；
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次；
Dye和R7a为AF532，和/或，所述携带荧光基团的试剂为1,2,4,5-四嗪衍生物，其结构为：
所述第一化合物的结构如式(Ia)所示：
所述第二化合物的结构如式(IIa)所示：
所述第三化合物的结构如式(IIIa)所示：
所述第四化合物的结构如式(IVa)所示：
2.一种对核酸分子进行测序的方法，其包括以下步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、T/U、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团，二磷酸基团，三磷酸基团和四磷酸基团；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d为-CH2-N3；
R4a、R4b、R4c为
R5a为第一结合配对的一个成员；
R6a为第三结合配对的一个成员，并且R6a为Dye1；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
L3为连接基团或不存在；
Dye和Dye1表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，二者具有相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱；
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员特异性结合，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号；并且所述处理能够使第四化合物中的R6a与携带淬灭基团的第三结合配对的另一个成员特异性结合，从而淬灭第四化合物中的荧光基团发出的荧光信号；
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员的结构为：R5b-L5-Dye3，其中，R5b为链酶亲和素，L5独立地为连接基团或不存在，Dye3表示AF532；
所述携带淬灭基团的第三结合配对的另一个成员的结构为：R6c-L6-Que，其中，R6c为Cy3抗体，L6独立地为连接基团或不存在，Que表示BHQ2；和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)；
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次；
R5a为生物素，R6a为Cy3，和/或，Dye表示AF532；
所述第一化合物的结构如式(Ib)所示：
所述第二化合物的结构如式(IIb)所示：N3
所述第三化合物的结构如式(IIIb)所示：
所述第四化合物的结构如式(IVb)所示：
3.一种对核酸分子进行测序的方法，其包括以下步骤：
(1)提供连接于支持物上的待测序的核酸分子，或者将待测序的核酸分子连接于支持物上；
(2)添加用于起始核苷酸聚合反应的引物，用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及分别具有式(I)、式(II)、式(III)和式(IV)所示结构的第一、第二、第三和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系：
其中，Base1、Base2、Base3和Base4代表4种不同的碱基，并且选自A、T/U、C和G；
R1各自独立地选自-H，单磷酸基团，二磷酸基团，三磷酸基团和四磷酸基团；
R2各自独立地选自-H和-OH；
R3a、R3b、R3c、R3d为-CH2-N3；R4a、R4b、R4c为
R5a为第一结合配对的一个成员，为生物素；
L1各自独立地为连接基团或不存在；
L2各自独立地为连接基团或不存在；
R6a即Dye1，为AF532；
Dye表示能够发出荧光信号的荧光基团；并且，Dye和Dye1具有相同的结构，或者结构不同但具有相同的发射光谱；
R4c和R6a之间还存在能够进行第二生物正交连接反应的反应性基团R8；R8为
(3)使引物退火至待测序的核酸分子上，所述引物作为起始的生长的核酸链，与所述待测序的核酸分子一起形成连接于支持物上的双链体；
(4)在允许聚合酶进行核苷酸聚合反应的条件下，使用聚合酶进行核苷酸聚合反应，从而将所述四种化合物中的一种并入生长的核酸链的3'端；
(5)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(6)使所述双链体或所述生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理对第一化合物和第二化合物没有影响，但是能够使第三化合物中的R5a与携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员特异性结合，从而将所述荧光基团引入第三化合物，使其发出荧光信号，并且，所述处理能够使第四化合物中的R8与携带淬灭基团的化合物发生第二正交连接反应，从而淬灭第四化合物中的荧光基团Dye1发出的荧光信号；其中，
所述携带荧光基团的第一结合配对的另一个成员的结构为：R5b-L-Dye2；其中，R5b为链霉亲和素，L独立地为连接基团或不存在，Dye2表示AF532；
携带淬灭基团的化合物为1,2,4,5-四嗪BHQ2，其结构式为：
和
(7)移除前一步骤的反应体系的溶液相，保留连接于支持物上的双链体，并检测所述双链体或所述生长的核酸链是否发出所述荧光信号；
(8)使前一步骤的双链体或生长的核酸链在含有溶液相和固相的反应体系中经历处理，所述处理能够使R3a、R3b、R3c、R3d、R4a、R4b、R4c发生生物正交切割反应，从而使得并入生长的核酸链3'端的化合物在核糖或脱氧核糖的3'位置具有游离的羟基，并且去除所述双链体或生长的核酸链上的荧光基团，如果存在的话；
(9)移除前一步骤的反应体系的溶液相；
(10)添加用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶，以及所述第一化合物、第二化合物、第三化合物和第四化合物，从而形成含有溶液相和固相的反应体系，然后进行步骤(4)-(7)；
(11)重复进行步骤(8)-(10)一次或多次；
Dye为AF532；
所述第一化合物的结构如式(Ic)所示：
所述第二化合物的结构如式(IIc)所示：
所述第三化合物的结构如式(IIIc)所示：
所述第四化合物的结构如式(IVc)所示：
4.一种试剂盒，其包含权利要求1定义的第一、第二、第三和第四化合物；任选地，所述试剂盒还包含1,2,4,5-四嗪衍生物，其结构为：
5.一种试剂盒，其包含权利要求2定义的第一、第二、第三和第四化合物；
任选地，所述试剂盒还包含：
R5b-L5-Dye3，其中，R5b为链酶亲和素，L5独立地为连接基团或不存在，Dye3表示AF532；和/或
R6c-L6-Que，其中，R6c为Cy3抗体，L6独立地为连接基团或不存在，Que表示BHQ2。
6.一种试剂盒，其包含权利要求3定义的第一、第二、第三和第四化合物；
任选地，所述试剂盒还包含：
R5b-L-Dye2，其中，R5b为链霉亲和素，L独立地为连接基团或不存在，Dye2表示AF532；和/或
1,2,4,5-四嗪BHQ2，其结构式为H：CN
7.权利要求4-6任一项的试剂盒，其还包括：用于从样品中提取核酸分子的试剂和/或装置；用于预处理核酸分子的试剂；用于连接待测序的核酸分子的支持物；用于将待测序的核酸分子与支持物共价或非共价连接的试剂；用于起始核苷酸聚合反应的引物；用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶；一种或多种缓冲溶液；一种或多种洗涤溶液；或其任何组合。
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