ES2628485T3 - Secuenciación mediante síntesis ortogonal - Google Patents

Abstract

Un método para secuenciar moldes de ácido nucleico, que comprende: (a) proporcionar un conjunto de sitios, en el que cada sitio comprende un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico, en el que el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico; (b) extender un primer cebador unido al primer molde utilizando una primera especie de polimerasa y un primer conjunto de análogos de nucleótidos, produciendo de este modo un primer producto de extensión del cebador que comprende un primer análogo de nucleótido en cada uno de los sitios; (c) extender un segundo cebador unido al segundo molde usando una segunda especie de polimerasa y un segundo conjunto de análogos de nucleótidos, produciendo de este modo un segundo producto de extensión de cebador que comprende un segundo análogo de nucleótido en cada uno de los sitios, en el que la primera especie de polimerasa es diferente de la segunda especie de polimerasa y en el que el primer conjunto de análogos de nucleótidos es diferente del segundo conjunto de análogos de nucleótidos; (d) detectar el primer producto de extensión del cebador y el segundo producto de extensión del cebador en cada uno de los sitios; y (e) repetir las etapas (b) a (d), determinando así las diferentes secuencias del primer molde y el segundo molde en cada uno de los sitios.

Description

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nucleótidos. Alternativamente o adicionalmente, se puede producir una población de ácidos nucleicos diana, o sus amplicones, bajo condiciones o ser configuradas de otro modo para que tengan una longitud mínima para sus miembros. Por ejemplo, la longitud mínima para los miembros que se usan en una o más etapas de un método establecido en la presente memoria o que están presentes en una composición particular puede ser más de aproximadamente 10 nucleótidos, 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 500 nucleótidos, 1.000 nucleótidos , 5.000 nucleótidos, 10.000 nucleótidos, 50.000 nucleótidos o 100.000 nucleótidos. La longitud de cadena máxima y mínima para los ácidos nucleicos diana en una población puede estar en un intervalo entre un valor máximo y mínimo establecido anteriormente. Se entenderá que los amplicones generados en un sitio de amplificación (o de otro modo fabricados o utilizados en este documento) pueden tener longitudes de cadena máximas y/o mínimas en un intervalo entre los límites superior e inferior ejemplificados anteriormente.

Puede usarse cualquiera de una variedad de técnicas de amplificación conocidas para aumentar la cantidad de secuencias de molde presentes para su uso en un método expuesto en este documento. Las técnicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) o amplificación de cebador aleatoria (RPA) de moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de molde. Se entenderá que la amplificación de los ácidos nucleicos diana antes del uso en un método o composición expuestos en este documento es opcional. Como tal, los ácidos nucleicos diana no se amplificarán antes de su uso en algunas realizaciones de los métodos y composiciones en este documento expuestos. Los ácidos nucleicos diana pueden derivarse opcionalmente de bibliotecas sintéticas. Los ácidos nucleicos sintéticos pueden tener composiciones nativas de ADN o ARN o pueden ser análogos de los mismos. Pueden utilizarse también métodos de amplificación en fase sólida, que incluyen, por ejemplo, amplificación en clúster, amplificación de puente u otros métodos expuestos a continuación en el contexto de los métodos basados en matrices.

Un ácido nucleico usado en un método expuesto en este documento puede ser una fase en solución o una fase sólida. El ácido nucleico, en fase de disolución, es generalmente soluble, pero también puede estar en una forma suspendida que sea capaz de precipitarse, como es el caso de algunas especies de ácidos nucleicos grandes tales como los cromosomas o los Nanoballs de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, publicación de patente de EE.UU. Nº. 2007/0099208 A1). Un ácido nucleico que está en fase sólida puede estar en un soporte en fase sólida o sobre éste. Ejemplos de soportes en fase sólida incluyen los fabricados a partir de vidrio, nitrocelulosa, sílice, metal, plástico y otros materiales expuestos en otra parte en este documento, por ejemplo, con respecto a los formatos de matrices y células de flujo. Similarmente, un ácido nucleico puede estar en un soporte semisólido o sobre éste, tal como en un gel. Geles ejemplares que son útiles incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; estructura de malla polimérica, tal como gelatina; o estructura de polímero reticulado, tal como poliacrilamida. Los hidrogeles son particularmente útiles tales como los expuestos en la publicación de patente de EE.UU. Nº. 2011/0059865 A1 y solicitud de patente de EE.UU. Nº. Ser. 13/784.368.

La fijación de un ácido nucleico a un soporte, ya sea rígido o semirrígido, puede ocurrir por medio de un enlace(s) covalente o no covalente. Los enlaces ejemplares se exponen en las patentes de EE.UU. Nos. 6.737.236; 7.259.258; 7.375.234 y 7.427.678; y la publicación de patente de EE.UU. Nº. 2011/0059865 A1. En algunas realizaciones, un ácido nucleico u otro componente de reacción puede unirse a un gel u otro soporte semisólido que a su vez esté unido o adherido a un soporte de fase sólida. En tales realizaciones, se entenderá que el ácido nucleico u otro componente de reacción está en fase sólida.

Los sistemas de detección ortogonales pueden basarse en el uso de dos o más sistemas de reactivos para la extensión del cebador, en el que los componentes de los dos sistemas de reactivos no reaccionan sustancialmente inespecíficamente. Por ejemplo, un primer sistema reactivo puede incluir una ADN polimerasa, desoxirribonucleótidos y un cebador de ADN; y un segundo sistema reactivo puede incluir una ARN polimerasa, ribonucleótidos y un cebador de ARN. Ambos sistemas son capaces de actuar sobre un molde de ADN, por ejemplo, uno que tiene un primer sitio de cebado que es complementario al cebador de ADN y un segundo sitio de cebado que es complementario al cebador de ARN. Sin embargo, la ADN polimerasa es específica para el cebador de ADN y desoxirribonucleótidos de tal manera que extiende selectivamente el cebador de ADN con los desoxirribonucleótidos en lugar de los ribonucleótidos. Por el contrario, la ARN polimerasa es específica para el cebador de ARN y los ribonucleótidos de tal manera que extiende selectivamente el cebador de ARN con los ribonucleótidos en lugar de los desoxirribonucleótidos. De forma similar, la ortogonalidad se puede conseguir usando otros sistemas de reactivos específicos tales como una polimerasa modificada que incorpora selectivamente HNA (ácidos nucleicos de 1,5-anhidrohexitol) en un cebador hecho de monómeros de HNA. La extensión del cebador basado en HNA es ortogonal a la ADN polimerasa y los sistemas de extensión de ARN polimerasa. Las condiciones ejemplares y los reactivos que pueden usarse para la extensión de cebadores a base de HNA se describen en Pinheiro et al, Science, 336 (6079): 341-344 (2012) y Cozens et al., Pro Nat. Acad. Sci. USA, 109 (21): 8067 -8072 (2012).

De acuerdo con las realizaciones ejemplares expuestas anteriormente, los desoxirribonucleótidos pueden considerarse una clase ortogonal de nucleótidos con respecto a los ribonucleótidos y HNA. De manera similar, en el contexto de realizaciones particulares, las clases de ADN polimerasas y ARN polimerasas son ortogonales entre sí y las clases de cebadores de ADN y cebadores de ARN son ortogonales entre sí. Generalmente, la ortogonalidad puede explotarse en un método expuesto en este documento cuando una primera polimerasa sea selectiva para una

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lectura del segundo extremo del molde 1 (indicado por la flecha cerrada en el diagrama inferior). La proximidad del promotor bidireccional al sitio de cebado Lectura 2' permite que se produzca la extensión de la ARN polimerasa (indicada por la flecha abierta en el diagrama inferior). La construcción ejemplificada en la Fig. 5 puede hacerse, por ejemplo, usando los métodos descritos en la Fig. 4.

Un promotor bidireccional no es necesario para las lecturas de extremos emparejados usando una ARN polimerasa en una realización de síntesis de secuenciación ortogonal. Más bien, los sitios de cebado de ARN y sus promotores pueden situarse en los extremos de una construcción de 2 moldes y el adaptador que enlaza los dos moldes puede contener sitios de cebado de ADN. Tomando el constructo de la Fig. 5 a modo de ejemplo, las posiciones de los sitios de cebado Lectura 1 y Lectura 1’ pueden intercambiarse, las posiciones de los sitios de cebado Lectura 2 y Lectura 2' se pueden intercambiar, el promotor bidireccional puede ser retirado y los promotores de ARN separados pueden estar situados aguas arriba de los sitios de cebado Lectura 1' y Lectura 2', respectivamente.

Una reacción de extensión de ácido nucleico, u otra reacción cíclica, que se lleve a cabo utilizando los procedimientos expuestos en la presente memoria, puede proceder durante uno o más ciclos. En realizaciones particulares, una reacción multiciclo puede incluir al menos 2 ciclos, 5 ciclos, 10 ciclos, 50 ciclos, 100 ciclos, 500 ciclos, 1.000 ciclos, 5.000 ciclos, 10.000 ciclos o más. Alternativamente o adicionalmente, una reacción puede tener un límite superior por el cual no más de 1 ciclo, 2 ciclos, 5 ciclos, 10 ciclos, 50 ciclos, 100 ciclos, 500 ciclos, 1.000 ciclos, 5.000 ciclos, o 10.000 ciclos aparecen. En algunas realizaciones, cada ciclo resultará en la incorporación de un único análogo de nucleótidos en un cebador extendido. En este caso, el número mínimo o máximo de ciclos ejemplificados anteriormente se puede entender para ejemplificar el número mínimo o máximo de nucleótidos incorporados en un producto de extensión en una reacción catalizada por polimerasa.

Algunas realizaciones pueden utilizar reacciones de extensión no cíclicas tales como la extensión de base única (SBE) o las reacciones de extensión de cebador específicas de alelo (ASPE). Los restos terminadores reversibles se pueden usar para la extensión no cíclica. Dado que una etapa de desbloqueo no es necesaria para estas reacciones no cíclicas, los nucleótidos pueden estar en su lugar terminados de forma no reversible. Por ejemplo, se pueden usar didesoxinucleótidos. Los ejemplos de reactivos y técnicas relacionadas para SBE, ASPE y otras técnicas de extensión no cíclicas útiles se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 7.670.810 y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nos. 2003/0108867; 2003/0108900; 2003/ 0170684; 2003/0207295; o 2005/0181394.

Un ejemplo de un producto comercialmente disponible que utiliza una técnica de extensión no cíclica y que puede modificarse para aumentar el contenido de información a través de los métodos de detección ortogonales expuestos en la presente memoria es el producto de genotipificación Infinium® disponible en Illumina, Inc. (San Diego, CA).

Las reacciones cíclicas y no cíclicas por igual pueden incluir etapas en las que los componentes de reacción están separados entre sí o eliminados del entorno de reacción. Uno o más componentes de reacción pueden separarse, por ejemplo, por separación de componentes de fase sólida de componentes en fase líquida. Opcionalmente, se pueden incluir etapas de lavado con el fin de eliminar de forma más completa el componente(s) de fase líquida no deseado del componente(s) en fase sólida. Un recipiente de reacción particularmente útil para tales separaciones es una célula de flujo, tal como las comúnmente usadas en procedimientos de secuenciación cíclica. Ejemplos de células de flujo, métodos para su fabricación y métodos para su uso se describen en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nos. 2010/0111768 A1 y 2012/0270305 A1; y el documento WO 05/065814.

Independientemente de que se utilicen métodos de separación en fase sólida, los componentes de reacción pueden eliminarse mediante cualquiera de una variedad de otras técnicas conocidas en la técnica, incluyendo extracción líquido-líquido, extracción en fase sólida, cromatografía, filtración, centrifugación o similares.

La detección puede llevarse a cabo en un método de la presente descripción usando un aparato adecuado para el marcador particular en uso. Por ejemplo, se puede usar un detector óptico tal como un detector de fluorescencia, detector de absorbancia, detector de luminiscencia o similar para detectar marcadores ópticos apropiados. Los sistemas diseñados para la detección basada en matrices son particularmente útiles. Por ejemplo, los sistemas ópticos para uso con los métodos en este documento expuestos pueden construirse para incluir diversos componentes y conjuntos como se describe en la patente de EE.UU. Nos. 8. 241.573; 7.329.860 y 8.039.817; y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nos. 2009/ 0272914 A1 y 2012/0270305 A1.

Como se ha expuesto anteriormente, un método de la presente descripción puede incluir dos etapas de extensión de cebador ortogonales. Por ejemplo, se expone un método que incluye inter alia las etapas de (b) extender un primer cebador unido a un primer ácido nucleico usando una primera especie de polimerasa y un primer conjunto de análogos de nucleótidos, produciendo de este modo un primer producto de extensión de cebador que tiene un primer análogo de nucleótidos en cada uno de los sitios; y (c) extender un segundo cebador unido a un segundo ácido nucleico usando una segunda especie de polimerasa y un segundo conjunto de análogos de nucleótidos, produciendo de este modo un segundo producto de extensión de cebador que tiene un segundo análogo de nucleótido en cada uno de los sitios, en donde la primera especie de polimerasa es diferente de la segunda especie de polimerasa y en el que el primer conjunto de análogos de nucleótidos es diferente del segundo conjunto de análogos de nucleótidos. En algunas realizaciones, las etapas (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente. Alternativamente, las etapas (b) y (c) pueden llevarse a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En cualquier

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caso, la ortogonalidad de las reacciones de extensión del cebador permite distinguir los dos productos de extensión. Por tanto, ambos productos de extensión pueden estar simultáneamente presentes durante una etapa de detección y no necesitan ser resueltos espacialmente por el detector utilizado.

Una reacción multiplex puede utilizar un soporte en fase sólida. Un soporte en fase sólida puede ser útil para separar reacciones individuales de modo que cada una puede ser examinada por separado o individualmente. Por ejemplo, se pueden unir varios ácidos nucleicos diferentes en una mezcla al soporte en fase sólida. Los ácidos nucleicos se pueden unir al soporte en fase sólida en un formato de matriz.

En algunas realizaciones, se proporciona una matriz de sitios, en la que cada sitio incluye un primer molde de ácido nucleico y un segundo molde de ácido nucleico y en donde el primer molde de ácido nucleico tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del segundo molde de ácido nucleico. Ejemplos de matrices que pueden ser útiles incluyen, sin limitación, una matriz BeadChip disponible de Illumina®, Inc. (San Diego, CA) o matrices tales como las descritas en las patentes de Estados Unidos Nº 6.266.459; 6.355.431; 6.770.441; 6.859.570; o 7.622.294; o la publicación PCT Nº WO 00/63437. Otros ejemplos de matrices comercialmente disponibles que pueden usarse incluyen, por ejemplo, una matriz Affymetrix® GeneChip® u otra matriz sintetizada de acuerdo con técnicas a veces denominadas tecnologías VLSIPS™ (Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis). Una matriz de detección también se puede usar de acuerdo con algunas realizaciones. Una matriz de detección ejemplar es una matriz CodeLink™ disponible en Amersham Biosciences. Otra matriz que es útil es una que se fabrica utilizando métodos de impresión de inyección de tinta tal como la Tecnología SurePrint™ disponible de Agilent Technologies.

Otras matrices útiles incluyen aquellas que se usan en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las matrices que tienen amplicones de fragmentos genómicos (a menudo denominados grupos) son particularmente útiles; tales como las descritas en Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), documentos WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, o US 2008/0108082.

Los grupos de ácidos nucleicos pueden crearse mediante métodos de amplificación en fase sólida. Por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una o más secuencias de molde a detectar puede unirse a una superficie y amplificarse utilizando la amplificación de puente. Los métodos de amplificación de puentes útiles se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 5.641.658; publicación de patente de Estados Unidos No. 2002/0055100; patente de Estados Unidos No. 7.115.400; publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0096853; publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0002090; publicación de patente de Estados Unidos No. 2007/0128624; y publicación de patente de Estados Unidos No. 2008/0009420. Otro método útil para amplificar ácidos nucleicos sobre una superficie es la amplificación en círculo rodante (RCA), por ejemplo, como se describe en Lizardi et al, Nat. Genet. 19: 225-232 (1998) y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 2007/ 0099208 A1. Otro tipo de matriz que es útil es una matriz de partículas producidas a partir de una técnica de amplificación por PCR en emulsión. Ejemplos se describen en Dressman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8817-8822 (2003), documentos WO 05/010145, US 2005/0130173 o US 2005/0064460. Aunque las matrices anteriores han sido descritas en el contexto de aplicaciones de secuenciación, se entenderá que las matrices pueden usarse en otras realizaciones incluyendo, por ejemplo, aquellas que usan una técnica de extensión de cebador no cíclica.

La detección puede llevarse a cabo a niveles de conjunto o de molécula única en una matriz. La detección a nivel de conjunto es la detección que se produce de manera que varias copias de una única secuencia de molde se detectan en cada sitio individual y las copias individuales en el sitio no se distinguen entre sí. Por lo tanto, la detección en conjunto proporciona una señal media de una secuencia de molde particular en el sitio. Por ejemplo, el sitio puede contener al menos 10, 100, 1000 o más copias de una secuencia de molde particular. Por supuesto, un sitio puede contener múltiples secuencias de molde diferentes cada una de las cuales está presente como un conjunto. Alternativamente, la detección a nivel de molécula única incluye la detección que tiene lugar de manera que las secuencias individuales de molde se resuelven individualmente en la matriz, cada una en un sitio diferente. De este modo, la detección de una sola molécula proporciona una señal de una molécula individual que se distingue de una

o más señales que pueden surgir de una población de moléculas dentro de la cual está presente la molécula individual. Por supuesto, incluso en una matriz de molécula única, un sitio puede contener varias secuencias de molde diferentes (por ejemplo, dos o más regiones de secuencia de molde situadas a lo largo de una única molécula de ácido nucleico).

Una matriz de sitios puede aparecer como una cuadrícula de puntos o parches. Los sitios pueden estar situados en un patrón repetitivo o en un patrón no repetitivo irregular. Los patrones particularmente útiles son los patrones hexagonales, patrones rectilíneos, patrones de rejilla, patrones que tienen simetría reflexiva, patrones que tienen simetría rotacional, o similares. Los patrones asimétricos también pueden ser útiles. El tamaño de los sitios y/o la separación entre los sitios en una matriz puede variar para conseguir una densidad alta, densidad media o densidad más baja. Las matrices de alta densidad se caracterizan por tener sitios separados por menos de aproximadamente 15 μm. Las matrices de densidad media tienen sitios separados por aproximadamente 15 a 30 μm, mientras que las matrices de baja densidad tienen sitios separados por más de 30 μm. Una matriz útil en algunas realizaciones puede tener sitios que estén separados por menos de 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 1 μm o 0,5 μm. Una realización de los métodos expuestos en la presente memoria puede usarse para fotografiar una matriz a una resolución suficiente para distinguir los sitios en las densidades o intervalos de densidad anteriores. Sin embargo, la etapa de detección

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usará típicamente un detector con una resolución espacial que será demasiado baja para resolver puntos a una distancia equivalente a la separación entre el primer producto de extensión de cebador y el segundo producto de extensión de cebador en cada uno de los sitios. En realizaciones particulares, los sitios de una matriz pueden tener cada uno un área que es mayor que aproximadamente 100 nm2, 250 nm2, 500 nm2, 1 μm2, 2,5 μm2, 5 μm2, 10 μm2, 100 μm2, o 500 μm2. Alternativamente o adicionalmente, los sitios de una matriz pueden tener cada uno un área que sea más pequeña que aproximadamente 1 mm2, 500 μm2, 100 μm2, 25 μm2, 10 μm2, 5 μm2, 1 μm2, 500 nm2, o 100 nm2. De hecho, el sitio puede tener un tamaño que esté en un intervalo entre un límite superior e inferior seleccionado de los ejemplificados anteriormente.

Los métodos expuestos en la presente memoria pueden usar matrices con sitios en cualquiera de una variedad de densidades incluyendo, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 sitios/cm2, 100 sitios/cm2, 500 sitios/cm2, 1.000 sitios/cm2, 5.000 sitios/cm2, 10.000 sitios/cm2, 50.000 sitios/cm2, 100.000 sitios/cm2, 1.000.000 sitios/cm2, 5.000.000 sitios/cm2, o superior.

Un sistema de detección ortogonal, tal como un sistema utilizado para la síntesis secuencial ortogonal, puede utilizar diferentes marcadores para distinguir los diferentes nucleótidos que se añaden a cada cebador. En una realización, cada especie de nucleótido tendrá un marcador óptico único que producirá una señal única para distinguir esa especie de nucleótido. Un ejemplo es el enfoque de SBOS de 4 tintes descrito en el Ejemplo 1, a continuación, y mostrado en la Fig. 1A y Fig. 1B. En este ejemplo, se utiliza un primer conjunto de 4 tintes fluorescentes diferentes para distinguir entre sí a los 4 análogos de dNTP diferentes y se utiliza un segundo conjunto de 4 tintes fluorescentes diferentes para distinguir entre sí los 4 análogos de rNTP diferentes. Los dos conjuntos de colorantes son únicos de tal manera que los 8 colorantes producen 8 señales distinguibles, respectivamente.

En realizaciones en las que todos los nucleótidos están marcados de forma distinguible, tal como el enfoque de SBOS de 4 tintes, se puede poner en contacto un par de secuencias de molde con todos los nucleótidos y luego se puede realizar la detección después. En este caso la capacidad de distinguir todos los nucleótidos debido a marcadores ópticos únicos proporciona el beneficio de manipulaciones fluídicas relativamente sencillas, con lo que todos los nucleótidos pueden ser suministrados a las secuencias molde de modo que estén simultáneamente presentes. En una realización SBOS relativamente sencilla y preferida, todos los 8 nucleótidos se administran simultáneamente; sin embargo, uno o más subconjuntos se pueden entregar secuencialmente si se desea. La detección puede producirse durante o después del suministro de los nucleótidos. Este proceso fluido relativamente simple se acomoda mediante un dispositivo de detección relativamente complejo que tiene la capacidad de distinguir todas las señales. Por ejemplo, puede utilizarse un sistema de detección de fluorescencia capaz de distinguir 8 señales fluorescentes diferentes para un enfoque SBOS que utiliza 8 nucleótidos marcados fluorescentemente diferentes. Los expertos en la técnica sabrán o serán capaces de determinar un aparato de detección de fluorescencia apropiado para conseguir este tipo de diferenciación de señal. Por ejemplo, las propiedades de excitación y emisión de los marcadores fluorescentes pueden adaptarse adecuadamente con una combinación de longitudes de onda de excitación producidas y longitudes de onda de emisión detectadas por un fluorómetro. En Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3ª Ed. Springer (2006); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products 9th Ed., Molecular Probes, Inc, (2002); y Shapiro, Practical Flow Cytometry, 4ª Ed., John Wiley & Sons (2003) se proporcionan guías ejemplares para la óptica y marcadores útiles para la detección de fluorescencia de longitud de onda múltiple.

Los principios ejemplificados anteriormente para un sistema en el que todos los nucleótidos están marcados de forma distinguible, se pueden extender fácilmente a un formato de matriz. Se espera que una matriz que tenga un número y una variedad suficientes de diferentes secuencias de molde incorporará todos los nucleótidos marcados cuando se trate con sistemas de reacción de extensión de cebador. Más específicamente, en un enfoque SBOS basado en matrices, que tiene una amplia variedad de ácidos nucleicos a través de los sitios de la matriz y que tiene dos moldes diferentes por sitio, todas las combinaciones posibles del tinte de 2-tintes se espera que se produzcan en la matriz después de un ciclo de extensión de cebador en el que todos los 8 nucleótidos se suministraron a la matriz. Los sitios se pueden distinguir espacialmente utilizando dispositivos ópticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en las patentes de EE.UU. Nos. 8.241.573; 7.329.860 y 8.039.817; y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nos. 2009/ 0272914 A1 y 2012/0270305 A1. Dichos sistemas de detección pueden modificarse fácilmente para acomodar la detección fluorescente de 8 colores tal como se ha expuesto anteriormente. Un sistema de detección que se modifica de esta manera será capaz de multiplexar la detección ortogonal de manera que se distingan dos moldes diferentes (por ejemplo, mediante secuenciación) en múltiples sitios, teniendo cada uno una composición de secuencia diferente.

En algunas realizaciones, el número de señales diferentes que se distinguen en un método particular es menor que el número de especies de nucleótidos diferentes utilizadas en ese método. Por ejemplo, múltiples especies de nucleótidos diferentes pueden tener el mismo marcador y/o un subconjunto de las especies de nucleótidos puede no estar marcado. Un ejemplo de una configuración que usa el mismo marcador para múltiples especies de nucleótidos diferentes es el caso de un método de extensión de cebador ortogonal (o SBOS) en el que 4 desoxirribonucleótidos diferentes tienen un primer marcador en común y 4 ribonucleótidos diferentes tienen un segundo marcador en común. En esta configuración, los 4 desoxirribonucleótidos diferentes pueden distinguirse entre sí mediante ciclos secuenciales de liberación de uno de los desoxirribonucleótidos y detectando los desoxirribonucleótidos antes de administrar el desoxirribonucleótido subsiguiente. Siempre y cuando se puedan distinguir el primer marcador y el

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Tabla 2: Nucleótidos para la configuración SBS de 1 tinte

Conjunto rtdNTP

Conjunto rtrNTP

rtdTTP-Fazul

rtrUTP-Frojo

rtdCTP-Biotina

50% rtrCTP-Frojo/ 50% rtrCTP-Fazul

rtdGTP (no marcado)

rtrGTP (no marcado)

rtdATP-S-S-Fazul

rtrATP-S-S-Frojo

Para un enfoque SBOS usando la configuración de la Tabla 2, los componentes ópticos sólo necesitan incluir 2 canales de emisión diferentes y sólo 1 ó 2 líneas de excitación diferentes. En este enfoque, como se muestra en la Fig. 2A, se obtienen un total de 4 imágenes por ciclo (2 por color). Dos imágenes se registran antes y dos después del tratamiento con estreptavidina-Fazul. En la Fig. 2A y Fig. 2B, "oscuro" indica la ausencia del marcador del fluoróforo, "NR550C4" es el fluoróforo que emite en azul, "THP" es Tris(3-hidroxipropil)fosfina que escinde el enlace disulfuro ("SS"), "Strep" es estreptavidina, "d-FFN" es rtdNTP, "r-FFN" es rtrNTP y "rojo" es el fluoróforo emisor rojo.

Aunque la mezcla de especies marcadas con rtrCTP se ejemplifica anteriormente como una relación molar 1:1 (es decir, 50% Frojo y 50% de Fazul), se entenderá que se pueden usar otras relaciones en su lugar. Por ejemplo, puede ser deseable ajustar la relación para acomodar diferentes propiedades ópticas para los dos fluoróforos (por ejemplo, uno de los fluoróforos puede estar presente a un ligero exceso molar para acomodar una intensidad de emisión relativamente más baja que el otro fluoróforo a la longitud de onda de detección usada). La proporción también puede desviarse de 1:1 para acomodar diferentes propiedades bioquímicas de los nucleótidos marcados (por ejemplo una afinidad diferente por la polimerasa).

(3) Química basada en SBOS de 2-tintes. Este enfoque proporciona otra combinación de nucleótidos con menos fluoróforos que las especies de nucleótidos. Se puede usar un conjunto de rtrNTP que tienen fluoróforos con dos emisiones diferentes (por ejemplo, emisión de rojo lejano y azul). De forma similar, se puede usar un conjunto de rtdNTP con fluoróforos con dos emisiones diferentes. Las cuatro emisiones diferentes son ópticamente distinguibles entre los dos conjuntos de rtNTP. Un conjunto ejemplar de nucleótidos se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3: Nucleótidos para la configuración SBS de 2 tintes

Conjunto rtdNTP

Conjunto rtrNTP

50% rtdTTP-Fverde/ 50% rtdTTP-Frojo

rtrUTP-Flejos de rojo

rtdGTP-Frojo

50% rtrCTP-Flejos de rojo/ 50% rtrCTP-Fazul

rtdGTP (no marcado)

rtrGTP (no marcado)

rtdATP-Fverde

rtrATP-Fazul

El enfoque de 2 tintes, ejemplificado anteriormente, proporciona una ventaja sobre el enfoque de 1 tinte previamente ejemplificado en que las etapas de procesamiento químico, tales como la unión a estreptavidina, y la escisión de THP, no se usan durante la fase de detección del enfoque de 2 tintes. Esto se demuestra por el protocolo del ciclo de extensión mostrado para el enfoque de 2 tintes en la Fig. 3. Sin embargo, en el caso de este enfoque particular de 2 tintes, se utiliza un dispositivo óptico capaz de distinguir cuatro colores diferentes. Como se ilustra en esta comparación, pueden utilizarse diferentes aproximaciones para ajustar la complejidad óptica o la complejidad fluídica para adaptarse a una plataforma de secuenciación particular. Por ejemplo, añadiendo etapas fluídicas para modificar nucleótidos durante un ciclo de detección de SBS se pueden usar menos componentes ópticos y/o más simples. Por el contrario, en los casos en que se dispone de componentes ópticos más complejos, se pueden utilizar menos manipulaciones fluidas y/o más sencillas.

Preparación de la muestra

Se puede preparar una muestra de ADN genómico u otra muestra de ácido nucleico para SBS de 2 – cebadores como se ejemplifica en la Fig. 4. El método permite la creación de un molde de ADN que tiene dos sitios de cebado diferentes. El método puede llevarse a cabo bajo condiciones que proporcionan fragmentos en un intervalo de tamaños deseado. Como se muestra en la Fig. 4, se puede usar una transposasa para marcar una muestra de ADN genómico con dos secuencias de marcador diferentes. Las condiciones pueden seleccionarse para producir fragmentos que tienen un promedio de aproximadamente 300 nucleótidos de longitud y que tienen un primera marcador en un extremo y un segundo marcador en el otro extremo. Los marcadores formarán salientes de una sola

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