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CN110042153A - 一种smn1基因突变的检测方法及其引物组 - Google Patents

一种smn1基因突变的检测方法及其引物组 Download PDF

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CN110042153A
CN110042153A CN201810040639.0A CN201810040639A CN110042153A CN 110042153 A CN110042153 A CN 110042153A CN 201810040639 A CN201810040639 A CN 201810040639A CN 110042153 A CN110042153 A CN 110042153A
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CN
China
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seq
primer
smn1 gene
sma
primer sets
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CN201810040639.0A
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裘敏燕
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Shanghai Union Medical Laboratory Co Ltd
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Shanghai Union Medical Laboratory Co Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

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Abstract

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了一种用于检测SMN1基因突变的方法及其引物组。本发明对脊髓性肌萎缩症（SMA）相关SMN1基因外显子7和外显子8缺失突变区域的核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增，最后以Ion Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快等优点。为SMA的遗传学方面的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为该类疾病的临床诊断提供理论基础。

Description

一种SMN1基因突变的检测方法及其引物组
技术领域
本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对SMN1基因突变位点检测的引物组，特别涉及用Ion Torrent半导体芯片测序技术对SMN1基因突变位点进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是最常见的致死性常染色体隐性遗传病之一。患病率为1/6000～1/10000，居致死性常染色体隐性遗传病的第二位。脊髓性肌萎缩症有时候也被称为“进行性脊肌萎缩症”或者“脊肌萎缩症”。
在神经肌肉遗传病中，SMA属于典型的神经源性损害性疾病，也是婴幼儿和儿童期发病的最常见神经源性损害导致运动发育落后的疾病。SMA患者由于遗传物质缺陷，导致运动神经元发育障碍，以对称性四肢肌肉无力和运动能力下降为主要表现。大多数SMA患者在2岁内发病，患者不会行走、站立，严重患者甚至无法抬头，完全丧失运动能力。大多数SMA患者在2-10岁之间因为极度衰弱和呼吸衰竭而死亡，重症患者只能存活几个月。因此是一种严重危害生命的遗传病。SMA根据发病年龄不同，可分为SMA I、SMA II、SMA III、SMA IV和SMA V型。
SMA主要是因为5q11.2-13.3的SMN基因纯合性缺失所致。SMA患者可以诊断出SMN1基因有大片段缺失的情形发生（至少包括整段exon7甚至exon8 ）。其中大部分SMA type I患者的SMN1基因发生了纯合子缺失突变（homozygous deletion）；许多SMA type II患者其一套SMN基因发生缺失突变，另一套SMN基因发生转换（conversion，SMN1基因转变成SMN2基因）；SMA type III的患者，其两套SMN1基因可能都转变成SMN2基因。至于少数未发现SMN基因大片段缺失或转换的SMA患者，则可能在SMN基因上发生一些小突变而致病。由此可知，藉由DNA分子诊断技术来检测SMN1基因的拷贝数，可以作为诊断是否为SMA患者或携带者的一项重要依据。
美国医学遗传学会有一些临床指南对于常见遗传病的预防策略进行说明，SMA是推荐对所有夫妇进行筛查的疾病中的一种。根据大量的数据研究，人群中SMA致病基因的携带率大约在1/40，也就是每40个正常人中就有一个SMA携带者。有对上海地区孕妇的一批研究数据也与此类似。
SAM患者中SMN1基因外显子7和外显子8的缺失情况，发生外显子7和外显子8缺失（占人群87%）或单独外显子7缺失的比例（占人群比例的7%），发生外显子缺失的比例约94%[1]，所以检测SMN1基因外显子7和外显子8的缺失情况是诊断脊肌萎缩症关键证据。
目前检测SAM相关SMN1基因外显子7和外显子8缺失突变的方法主要有MLPA、PCR-RFLP、DHPLC等，存在操作复杂、通量低、成本贵等问题。
Ion Torrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H+，H+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。
Ion Torrent半导体芯片测序技术与传统Sanger法及二代测序技术比较，IonTorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对 H+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1G通量的测序检测仅需2~3小时，是传统Sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。
目前尚没有报道Ion Torrent半导体芯片测序技术专门用于SMN1基因突变的检测。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对SMN1基因突变的定性、定量检测的方法及其引物。
为解决上述问题，本发明采取以下技术方案：
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的SAM相关SMN1基因外显子7和外显子8缺失突变位点，用Primer Express Software 5.0软件设计PCR引物。
用于检测SMN1基因序列片段1的引物，是由序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2组成的引物对。
上游引物：5’- agtagaattaagactatcaacttaatttctgatca -3’ SEQ ID No: 1；
下游引物：5’- ccttccttctttttgattttgttt -3’ SEQ ID No: 2。
用于检测SMN1基因序列片段2的引物，是由序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4组成的引物对。
上游引物：5’- agtagaattagtaataaccaaatgcaatgtgaa -3’ SEQ ID No: 3；
下游引物：5’- ctacaacacccttctcacag -3’ SEQ ID No: 4。
用于检测SMN1基因序列片段3的引物，是由序列表中SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6组成的引物对。
上游引物：5’- agtagaattacctttattttccttacagggttt -3’ SEQ ID No: 5；
下游引物：5’- agtaatgtgagcaccttccttct -3’ SEQ ID No: 6。
用于检测SMN1基因序列片段4的引物，是由序列表中SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8组成的引物对。
上游引物：5’- agtagaattaggaatgggtaactcttcttgatta -3’ SEQ ID No: 7；
下游引物：5’- ttctcaactgcctcaccacc -3’ SEQ ID No: 8。
采用多重PCR的方法用上述引物组对待检测样本进行PCR扩增。
将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建、ISP（Ion Sphere™ Particles, Ion微球）模板的制备，在Ion Torrent PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
本发明利用多重PCR方法结合Ion Torrent半导体芯片测序技术同时对SAM相关SMN1基因外显子7和外显子8缺失突变位点进行并行检测，该检测的范围涵盖了约90%以上的SAM患者SMN1基因缺失情况。检测结果可用于SAM的辅助诊断或筛查。其优势在于通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。
具体实施方式
本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1、用于SMN1基因突变检测的引物组的设计。
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的SAM相关SMN1基因外显子7和外显子8缺失突变位点，用Primer Express Software 5.0软件设计PCR引物，引物序列如下。
用于检测SMN1基因序列片段1的引物，是由序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2组成的引物对。
上游引物：5’- agtagaattaagactatcaacttaatttctgatca -3’ SEQ ID No: 1；
下游引物：5’- ccttccttctttttgattttgttt -3’ SEQ ID No: 2。
用于检测SMN1基因序列片段2的引物，是由序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4组成的引物对。
上游引物：5’- agtagaattagtaataaccaaatgcaatgtgaa -3’ SEQ ID No: 3；
下游引物：5’- ctacaacacccttctcacag -3’ SEQ ID No: 4。
用于检测SMN1基因序列片段3的引物，是由序列表中SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6组成的引物对。
上游引物：5’- agtagaattacctttattttccttacagggttt -3’ SEQ ID No: 5；
下游引物：5’- agtaatgtgagcaccttccttct -3’ SEQ ID No: 6。
用于检测SMN1基因序列片段4的引物，是由序列表中SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8组成的引物对。
上游引物：5’- agtagaattaggaatgggtaactcttcttgatta -3’ SEQ ID No: 7；
下游引物：5’- ttctcaactgcctcaccacc -3’ SEQ ID No: 8。
每个检测序列片段的上游引物5’端均包含一段用于识别样本信息的barcode序列5’- agtagaatta -3’。
实施例2、 SMN1基因突变的检测。
1）样本基因组DNA的获取
用Qiagen DNA抽提试剂盒提取全血样本的基因组DNA。
2）PCR的扩增和测序
以步骤1）提取的样本基因组DNA为模板，在实施例1所述引物的引导下，进行多重PCR扩增(95℃ 5 min; 95℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环)，获得的扩增产物依次进行扩增子文库的构建，ISP（Ion Sphere™Particles, Ion微球）模板的制备，以及芯片上样和在IonTorrent PGM系统上进行测序。
3）分析并获得结论
用IGV2.0软件对测序结果进行分析，统计SMN1基因片段的读序结果，根据检测结果确定样本是否有SMN1基因突变，如有突变，则在结果分析中提示突变具体情况，如“该受检者SMN1基因外显子7发生纯合缺失”；如无突变，则在结构分析中提示“该受检者SMN1外显子7和外显子8未发生纯合缺失，提示正常”。
本次检测共检测1个样本，检测结果及结论见下表。
序列表
<110> 上海联吉医学检验所有限公司
<120> 一种SMN1基因突变的检测方法及其引物组
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtagaatta agactatcaa cttaatttct gatca 35
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttccttct ttttgatttt gttt 24
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtagaatta gtaataacca aatgcaatgt gaa 33
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctacaacacc cttctcacag 20
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtagaatta cctttatttt ccttacaggg ttt 33
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtaatgtga gcaccttcct tct 23
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtagaatta ggaatgggta actcttcttg atta 34
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttctcaactg cctcaccacc 20

Claims (3)

1.一种检测SMN1基因突变的方法及其引物组，具体步骤为：
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的SMA相关SMN1基因外显子7和外显子8缺失突变位点，用Primer Express Software 5.0软件设计PCR引物；
采用多重PCR的方法对待检测样本进行PCR扩增；
将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建，ISP（Ion Sphere™ Particles, Ion微球）模板的制备，在Ion Torrent PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
2.如权利要求1所述的一种检测SMN1基因突变的方法及其引物组，其特征在于，所述的PCR引物组包括针对4个SMN1基因序列片段的引物，其序列分别为：SEQ ID No: 1-SEQ IDNo: 8：
5’- agtagaattaagactatcaacttaatttctgatca -3’ SEQ ID No: 1；
5’- ccttccttctttttgattttgttt -3’ SEQ ID No: 2；
5’- agtagaattagtaataaccaaatgcaatgtgaa -3’ SEQ ID No: 3；
5’- ctacaacacccttctcacag -3’ SEQ ID No: 4；
5’- agtagaattacctttattttccttacagggttt -3’ SEQ ID No: 5；
5’- agtaatgtgagcaccttccttct -3’ SEQ ID No: 6；
5’- agtagaattaggaatgggtaactcttcttgatta -3’ SEQ ID No: 7；
5’- ttctcaactgcctcaccacc -3’ SEQ ID No: 8。
3.用于如权利要求1所述一种检测SMN1基因突变的方法及其引物组，其特征在于，所述的引物组组成一种检测SMN1基因突变的试剂盒。
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