CN108603232A - 监测骨髓瘤的治疗或进展 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于诊断骨髓瘤、监测患有骨髓瘤的个体的疾病进展或治疗功效的方法和试剂盒。在一个方面，本发明涉及用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：提供源于已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血样品的无细胞核酸；针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；其中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中不存在突变或突变的数量减少表明该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应。

Description

监测骨髓瘤的治疗或进展

本申请要求澳大利亚临时申请AU 2015905013和AU 2016903019的优先权，将其全部披露以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于确定个体是否患有骨髓瘤、监测骨髓瘤的进展或骨髓瘤的治疗功效的方法和试剂盒。

背景技术

多发性骨髓瘤(MM)是一种由遍及骨髓(BM)的多灶性肿瘤沉积表征的不可治愈的血液系统恶性肿瘤。几乎所有MM中都存在核型不稳定和染色体数目异常。涉及免疫球蛋白(IgH)基因和FGFR3/MMSET、CCND1、CCND3或MAF的原发性易位发生在疾病发病期间，并且涉及MYC基因的继发性易位发生在疾病进展期间。MM的治疗通过蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂的实施已经取得了显著的进展，然而，因为细胞通过积累在疾病初期期间通常不存在的突变而获得对全身性疗法的抗性，该疾病仍然不能治愈。对疗法的抗性通常通过MM细胞的遗传进化来介导，更具抗性的克隆具有生长和存活优势。诊断和预后预测的当前实践是进行连续的BM活检，但是从活检获得的遗传信息(GI)被一种或多种肿瘤的已知的克隆间和克隆内异质性干扰。

需要用于确定多发性骨髓瘤的诊断、预后预测和/或监测治疗功效的改进方法或替代方法。

在本说明书中对任何现有技术的提及并不是承认或暗示此现有技术形成任何管辖权的公知常识的一部分，或者此现有技术可合理地预期被理解为被认为与本领域技术人员已知的其他现有技术是相关的和/或与之组合。

发明内容

本发明提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-提供源于已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

其中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中不存在突变或突变的数量减少表明该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应；或者其中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中存在突变或突变的数量增加表明该个体对多发性骨髓瘤治疗无响应。

本发明提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-提供源于已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-提供来自该个体的骨髓单核细胞的核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估来自骨髓单核细胞的核酸；

其中在无细胞核酸或来自骨髓单核细胞的核酸的一者或两者中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中不存在突变或突变的数量减少表明该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应；或者其中在无细胞核酸或来自骨髓单核细胞的核酸的一者或两者中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中存在突变或突变的数量增加表明该个体对多发性骨髓瘤治疗无响应。

本发明提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-评估来自已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血测试样品，从而形成测试样品谱(profile)；

-将测试样品谱与对照谱进行比较以鉴定测试样品谱与对照谱之间是否存在无细胞核酸水平的差异，对照谱包含关于无多发性骨髓瘤个体的外周血中无细胞核酸水平的数据；

-在测试样品谱中的无细胞核酸水平与对照谱相同的情况下，确定该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应。

本发明提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-评估来自已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血测试样品，从而形成测试样品谱；

-将测试样品谱与对照谱进行比较以鉴定测试样品谱与对照谱之间是否存在无细胞核酸水平的差异，对照谱包含关于开始治疗前该个体的外周血中无细胞核酸水平的数据；

-在测试样品谱中的无细胞核酸水平低于对照谱的情况下，确定该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应。

本发明提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-评估来自已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血测试样品，从而形成测试样品谱；

-将测试样品谱与对照谱进行比较以鉴定测试样品谱与对照谱之间是否存在无细胞核酸水平的差异，对照谱包含关于开始治疗前该个体的外周血中无细胞核酸水平的数据；

-在测试样品谱中的无细胞核酸水平低于对照谱的情况下，确定该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应；或者

-在测试样品谱中的无细胞核酸水平与对照谱相同或更高的情况下，确定该个体对多发性骨髓瘤治疗无响应。

本发明提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-提供来自已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血测试样品；

-评估测试样品的无细胞核酸水平，从而形成测试样品谱；

-提供包含关于无多发性骨髓瘤个体的外周血中无细胞核酸水平的数据的对照谱；

-将测试样品谱与对照谱进行比较以鉴定测试样品谱与对照谱之间是否存在无细胞核酸水平的差异；

-在测试样品谱中的无细胞核酸水平与对照谱相同的情况下，确定该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应。

本发明提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-提供来自已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血测试样品；

-评估测试样品的无细胞核酸水平，从而形成测试样品谱；

-提供包含关于患有多发性骨髓瘤个体的外周血中无细胞核酸水平的数据的对照谱；

-将测试样品谱与对照谱进行比较以鉴定测试样品谱与对照谱之间是否存在无细胞核酸水平的差异；

-在测试样品谱中的无细胞核酸水平低于对照谱的情况下，确定该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应；或者

-在测试样品谱中的无细胞核酸水平与对照谱相同或更高的情况下，确定该个体对多发性骨髓瘤治疗无响应。

在本文所述的本发明的任何方面，无细胞核酸是无细胞DNA。在本文所述的本发明的任何方面，无细胞核酸是无细胞的肿瘤来源的DNA。

本发明还提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-提供源于已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

其中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中不存在突变表明该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应。

本发明还提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-提供源于已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-提供来自该个体的骨髓单核细胞的核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估来自骨髓单核细胞的核酸；

其中在无细胞核酸或来自骨髓单核细胞的核酸的一者或两者中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中不存在突变表明该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应。

本发明提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估来自已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血的无细胞核酸，从而形成测试样品谱；

-将测试样品谱与对照谱进行比较以鉴定测试样品谱与对照谱之间是否存在突变数量或包含至少一个突变的无细胞核酸的水平的差异，对照谱包含关于开始治疗前该个体的外周血中无细胞DNA水平的数据；

-确定该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应，其中在测试样品谱中的突变数量或包含至少一个突变的无细胞核酸的水平低于对照谱。可替代地，确定该个体对多发性骨髓瘤治疗无响应的步骤是其中在测试样品谱中的突变数量或包含至少一个突变的无细胞核酸的水平与对照谱相同或更高。

本发明还提供了用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-根据如本文所述的本发明的方法，提供已经历多发性骨髓瘤治疗、已被诊断为患有多发性骨髓瘤，或已被鉴定为患有晚期疾病的个体；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

其中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中不存在突变或突变的数量减少表明该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应。

在本发明的任何方面，提供外周血测试样品的步骤可以涉及直接从待诊断或监测的个体获得外周血样品。

在本发明的任何方面，评估无细胞核酸的突变可以包括确定具有该突变的转录物的数量或丰度分数。

优选地，评估测试样品的无细胞核酸水平或无细胞核酸(通常为DNA)中的突变数量的步骤包括从外周血提取无细胞核酸并丢弃外周血的除无细胞核酸外的所有组分。

在以上的本发明的任何方面，进一步包括给予一种或多种药物以治疗该个体的步骤。优选地，治疗包括给予与先前向患者给予的药物不同的一种或多种药物，使得改变该个体对多发性骨髓瘤的总体治疗。在一些实施例中，先前向患者给予的一种或多种药物补充有一种或多种另外的药物。在替代性实施例中，先前给予的一种或多种药物用一种或多种替代药物替换。

优选地，所给予的药物是技术人员已知的疗法，包括地塞米松、环磷酰胺、沙利度胺、来那度胺(Lenalinomide)、依托泊苷(Etopside)、顺铂、伊沙佐米(Ixazomib)、硼替佐米、威罗非尼(Vemurafinib)、瑞格色替(Rigosertib)、曲美替尼、帕比司他、氮杂胞苷、帕姆单抗(Pembrolizumab)、尼鲁单抗(Nivolumumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)或自体干细胞移植(ASCT)。治疗可以包括一种或多种药物、或两种或更多种药物的任何组合，包括按以下组合：地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷和顺铂(DCEP)；地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂和沙利度胺(T-DCEP)；来那度胺和地塞米松(Rd)、伊沙佐米-环磷酰胺-地塞米松(ICd)；或硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(VCD)。治疗可以包括与另外的药物组合的DCEP、T-DCEP、Rd、Icd或VCD的组合。

在以上的本发明的任何方面，在以下情况下给予药物以治疗该个体的步骤：确定步骤鉴定患者对治疗无响应或鉴定患者在源于外周血样品的无细胞核酸或循环肿瘤游离核酸中具有比在相应的骨髓来源的核酸中更高的突变负荷。

本发明提供了用于为患有多发性骨髓瘤的个体确定治疗方案的方法，该方法包括：

-根据如本文所述的本发明的方法，提供正在接受或已经历多发性骨髓瘤治疗、或已被鉴定为患有晚期疾病的个体；

-提供源于该个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

其中检测到选自由KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53突变中的任何一种组成的组的突变确定治疗方案包括给予特异性靶向KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53途径的药物。

应当理解的是，在确定个体具有多于一个突变的情况下，治疗可以包括多于一种药物，使得每个突变都被特异性靶向。

本发明还包括在确定该个体的突变不响应于当前治疗方案的情况下决定停止给予特定药物并开始替代治疗的步骤。此外，本发明包括决定维持给予靶向特定突变的药物并通过添加靶向该个体中的不同突变的一种或多种药物来补充治疗方案的步骤。

本发明提供了用于监测患有多发性骨髓瘤的个体的疾病进展的方法，该方法包括：

-提供来自待确定多发性骨髓瘤进展的个体的外周血测试样品；

-评估测试样品的KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因中循环肿瘤游离核酸的水平或肿瘤游离核酸中突变的数量，从而形成测试样品谱；

-提供包含关于在前一时间同一个体的KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因中循环肿瘤游离核酸的水平或肿瘤游离核酸中突变的数量的数据的比较谱；

-将测试样品谱与比较谱进行比较以鉴定测试样品谱与比较谱之间是否存在循环肿瘤游离核酸水平或肿瘤游离核酸中突变数量的差异；

-在测试样品谱中的循环肿瘤游离核酸水平或肿瘤游离核酸中突变数量高于比较谱的情况下，确定该个体中的疾病已进展。可替代地，在测试样品谱中的循环肿瘤游离核酸水平或肿瘤游离核酸中突变数量与比较谱相同或更低的情况下，确定该个体中的疾病尚未进展。

优选地，在前一时间来自同一个体的比较谱距进行本发明的方法前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或24个月。

优选地，提供外周血测试样品的步骤涉及直接从待诊断的个体获得外周血样品。

优选地，评估测试样品的循环肿瘤游离核酸的存在、循环肿瘤游离核酸的水平或循环肿瘤游离核酸中的突变数量的步骤包括从外周血提取无细胞DNA并丢弃外周血的除无细胞DNA外的所有组分。

本发明提供了用于监测患有多发性骨髓瘤的个体中的疾病进展的方法，该方法包括：

-提供源于待确定疾病进展的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对TP53基因的核苷酸序列中的一个或多个突变评估无细胞核酸；

其中在TP53中检测到一个或多个突变诊断该个体已经进展为晚期疾病。优选地，TP53中的突变编码图10中列出的任何一个或多个突变。

本发明提供了用于监测患有多发性骨髓瘤的个体中的疾病进展的方法，该方法包括：

-提供源于待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血样品的无细胞核酸和骨髓单核细胞；

-针对KRAS、NRAS、BRAF或TP53中的任何一个或多个中的突变评估无细胞核酸和骨髓来源的核酸；

其中检测到大于3个TP53突变诊断该个体已经进展为晚期疾病。优选地，TP53中的突变编码图10中列出的任何一个或多个突变。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-评估来自待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血测试样品的循环肿瘤游离核酸，

其中确定存在循环肿瘤游离核酸诊断该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。优选地，循环肿瘤游离核酸是在KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中存在至少一个突变的无细胞核酸。优选地，突变是编码图10中列出的突变的任何一个或多个。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供来自待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血测试样品；

-评估测试样品的循环肿瘤游离核酸，

其中检测到循环肿瘤游离核酸诊断该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。优选地，循环肿瘤游离核酸是在KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中存在至少一个突变的无细胞核酸。优选地，突变编码图10中列出的任何一个或多个突变。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供源于待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

其中在KRAS、NRAS、BRAF或TP53中的任何一个或多个中检测到突变诊断该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。优选地，该方法包括从自其中提取无细胞核酸的个体获得外周血样品的步骤。

在本发明的任何方面，在核酸中检测到的突变编码选自由图10中所示的那些组成的组中的任何一个或多个的突变。更优选地，突变选自KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12S、KRAS G12R、KRAS G12A、KRAS G13C、NRAS Q61K、NRAS Q61H_1、NRAS G13D、NRASQ61H、NRAS Q61L、NRAS G13R、BRAF V600E和TP53 R273H中的任何一个或多个。更优选地，突变选自KRAS G12S、KRAS G12R和NRAS Q61L。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供设计用于检测已知与多发性骨髓瘤相关的突变的多个探针；

-使源于外周血样品的无细胞核酸与该多个探针在适于允许探针与无细胞核酸结合的条件下接触；并且

-检测探针与无细胞核酸的结合。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供设计用于在编码选自由图10中所示的那些组成的组的突变的核酸中检测一个或多个突变的多个探针；

-使源于外周血样品的无细胞核酸与该多个探针在适于允许探针与无细胞核酸结合的条件下接触；并且

-检测探针与无细胞核酸的结合。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供源于待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个序列中的突变评估无细胞核酸；

-提供来自该个体的骨髓单核细胞的核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估来自骨髓单核细胞的核酸；

其中在无细胞核酸和来自骨髓的核酸中都检测到突变诊断该个体患有多发性骨髓瘤。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-评估来自待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血测试样品的无细胞DNA水平，从而形成测试样品谱；

-将测试样品谱与对照谱进行比较以鉴定测试样品谱与对照谱之间是否存在无细胞DNA水平的差异，对照谱包含关于无多发性骨髓瘤个体的外周血中无细胞DNA水平的数据；

-在测试样品谱中的无细胞DNA水平高于对照谱的情况下，确定该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供来自待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血测试样品；

-评估测试样品的无细胞DNA水平，从而形成测试样品谱；

-提供包含关于无多发性骨髓瘤个体的外周血中无细胞DNA水平的数据的对照谱；

-将测试样品谱与对照谱进行比较以鉴定测试样品谱与对照谱之间是否存在无细胞DNA水平的差异；

-在测试样品谱中的无细胞DNA水平高于对照谱的情况下，确定该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。

本发明提供了用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供来自待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血测试样品；

-评估测试样品的无细胞DNA水平，从而形成测试样品谱；

-提供包含关于在前一时间同一个体的外周血中无细胞DNA水平的数据的比较谱；

-将测试样品谱与比较谱进行比较以鉴定测试样品谱与比较谱之间是否存在无细胞DNA水平的差异；

-在测试样品谱中的无细胞DNA水平高于比较谱的情况下，确定该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。

上述本发明的任何方面都可以用于鉴定用靶向Ras-MAPK途径的模式进行治疗的个体，优选地该模式是Ras-MAPK途径的抑制剂。例如，在编码参与Ras-MAPK途径的产物的基因中鉴定到突变鉴定出该个体可能从用Ras-MAPK途径的抑制剂进行的治疗中受益。

在本发明的任何方面，在KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中的突变编码选自由图10中列出的那些组成的组的氨基酸序列中的突变。

在本文所述的本发明的任何方面，进一步包括给予药物以治疗诊断为患有多发性骨髓瘤、活动性疾病或晚期疾病的个体的步骤。治疗多发性骨髓瘤的药物可以是通常用于治疗的任何药物，包括本文所述的那些。

在本文所述的本发明的任何方面，评估突变包括将包含来自该个体的全部或部分的KRAS、NRAS、BRAF或TP53基因的核苷酸序列与包含来自一个或多个对照个体(例如源于无多发性骨髓瘤或具有新诊断的非晚期疾病的一个或多个个体，视情况而定)的全部或部分的KRAS、NRAS、BRAF或TP53基因的核苷酸序列进行比较。

本发明还提供了用于在诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险中使用的、或用于在监测疾病的进展或阶段或监测治疗功效中使用的试剂盒，该试剂盒包含：

-用于在KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中检测任何一个或多个突变的装置，所述突变编码选自由图10中列出的那些组成的组的突变；

-用于从个体的外周血样品中分离或提取无细胞核酸的试剂。

优选地，该试剂盒还包含来自不患有多发性骨髓瘤的个体的KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列。

优选地，该试剂盒在已经检测到在患有多发性骨髓瘤的患者中鉴定到的突变的位置处还包含KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的野生型序列。通常，在患有多发性骨髓瘤的患者中鉴定到的突变的位置列于图10中。

优选地，该试剂盒还包含在如本文所述的本发明方法中使用该试剂盒的书面说明书。

优选地，用于检测一个或多个突变的装置是与包含该突变的序列杂交或扩增包含该突变的序列的一个或多个核酸探针或引物。优选的是，探针是通过互补碱基配对与KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的序列内的其靶位点结合的寡核苷酸探针。为免生疑，在本发明的上下文中，寡核苷酸探针的定义不包括全长KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因(或其互补序列)。

本发明还提供了多发性骨髓瘤检测系统，该检测系统包含固定于固体支持物以供在如本文所述的方法中使用或当在如本文所述的方法中使用时固定于固体支持物的多个探针。优选地，探针被设计用于检测选自图10中列出的组的一个或多个突变。

在本文的任何方面，骨髓单核细胞可以来自骨髓活检。

本发明还提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，该方法包括给予药物以治疗该个体，其中通过本文所述的本发明的任何方法将该个体诊断为患有多发性骨髓瘤。优选地，所给予的药物是技术人员已知的疗法，包括地塞米松、环磷酰胺、沙利度胺、来那度胺、依托泊苷、顺铂、伊沙佐米、硼替佐米、威罗非尼、瑞格色替、曲美替尼、帕比司他、氮杂胞苷、帕姆单抗、尼鲁单抗、度伐鲁单抗或自体干细胞移植(ASCT)。治疗可以包括一种或多种药物、或两种或更多种药物的任何组合，包括按以下组合：地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷和顺铂(DCEP)；地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂和沙利度胺(T-DCEP)；来那度胺和地塞米松(Rd)、伊沙佐米-环磷酰胺-地塞米松(ICd)；或硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(VCD)。治疗可以包括与另外的药物组合的DCEP、T-DCEP、Rd、Icd或VCD的组合。

如本文所用的，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”及该术语的变体如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”并不旨在排除其他添加剂、组分、整体或步骤。

前述段落中所述的本发明其他方面和这些方面的其他实施例将从以举例方式给出的以下描述中并且参考附图而变得清楚。

附图说明

图1：来自患有多发性骨髓瘤(MM)的患者的血浆中的无细胞DNA(cfDNA)量显著更高。柱形图指示了从来自MM患者(n＝37)和正常志愿者(NV)(n＝21)的1ml血浆(PL)中回收的以ng计的cfDNA的量。如通过使用GraphPad Prism V6进行统计分析的曼-惠特尼(Mann-Whitney)t检验评估的，MM中的量显著更高，并且指示出p＝0.0085的显著性。

图2：cfDNA量与疾病阶段相关。柱形图指示了从NV以及患有活动性和稳定性疾病的MM患者的1ml的PL中回收的以ng计的cfDNA的量。使用曼-惠特尼t检验进行比较，患有活动性疾病的患者中的cfDNA水平显著高于NV(p＝0.0067)。

图3：cfDNA量与副蛋白、血清游离轻链(SFLC)或骨髓(BM)MM细胞比例不相关。关联图指示cfDNA的量与副蛋白、SFLC和BM MM细胞比例的量不相关。进行皮尔逊(Pearson)相关系数分析以便使用GraphPad Prism V6f确定相关性的r值。

图4：MM患者的配对BM和PL样品中突变的分布。柱形图表示出了存在于BM和PL样品中的KRAS、NRAS、TP53和BRAF的突变数量和比例。

图5：复发性/难治性(RR)和新诊断(ND)患者中突变的分布。柱形图指示了每名患者内BM和PL中发现的突变数量。18名48RR患者中有10名表现出仅在PL中可检测到的突变，与距BM活检部位较远的突变不相干疾病一致(RR1RR2、4、10、12、13、14、15、28、35和8及11以及ND 13中的柱顶部分)。

图6：样品的BM和PL中的突变丰度(MA)。点图是BM、PL或BM和PL两者中存在的突变的MA的表示。示出了MA的中值水平。对于在两室(compartment)中检测到的突变而言，BM中MA的中值水平显著高于PL(p＝0.014)。在BM和PL两者中发现的突变中，BM中的中值MA显著高于仅在BM中发现的突变中的中值MA(p＜0.0001)。仅PL突变的MA显著低于在BM和PL两者中检测到的PL突变的MA(p＝0.003)。使用曼-惠特尼t检验进行所有分析。

图7：突变类型的分布(A)在48名患者的BM和/或PL中检测到的所有突变。NRASQ61K是最普遍的。(B)检测到的KRAS突变(C)检测到的NRAS突变(D)检测到的TP53突变，和(E)检测到的BRAF突变。

图8：MM主要具有KRAS突变。在(A)仅BM(B)仅PL(C)BM和PL两者中检测到的KRAS、NRAS、BRAF和TP53突变的比例。

图9：ND和RR患者中突变的分布。柱形图表示出了每名RR和ND患者内存在的突变的数量和类型。超过69％的患者中存在一个或多个RAS突变。

图10：OMD面板(panel)中的KRAS、NRAS、BRAF和TP53突变的列表。

图11：在患者的骨髓(BM)、外周血(PB)样品或两者中检测到的突变的汇总。

图12：患者#1-3的PL中的突变型克隆的连续追踪。

(A)：线形图表示出了患者#1中通过ddPCR测得的突变型克隆的FA。在诊断后第1、2、3、5、8和10个月收集PL。在右侧的Y轴上示出了血清κ游离轻链(κLC)水平，在第10个月时明显有明显的疾病进展。绘制在左侧的Y轴上的突变型克隆KRAS G12D FA而非TP53 R273HFA的显著增加与在接受口服氮杂胞苷、雷利米得(revlimid)和地塞米松(Rd)疗法时的血清学进展一致。

(B)：线形图表示出了在接受雷利米得和地塞米松时在第1、2、6、12、15和17个月收集的连续PL中突变型克隆KRAS G12V和KRAS G12S的FA(在左侧的Y轴上)。λ轻链(LC)和副蛋白(右侧的Y轴)在第12个月时下降，随后在第15和17个月时增加。KRAS G12V的水平与治疗期间的λLC增加一致。

(C)：线形图表示出了在同种异体移植(Allo)后第1、4和13个月收集的连续PL中突变型KRAS G12C的FA(左侧的Y轴)。FA水平与κ轻链(LC)一致，并且在右侧的Y轴示出的在allo后第4和13个月时以可检测水平存在，与稳定疾病一致。

患者PL中的突变型克隆的连续追踪。线形图表示出了患者#3中通过ddPCR测得的突变型克隆的FA。在诊断后第1、2、3、5、8和10个月收集PL(显示为红色星号)。示出了血清κ游离轻链(κLC)水平，在第10个月时明显有明显的疾病进展。突变型克隆KRAS G12D FA而非TP53 R273H FA的显著增加与在接受口服氮杂胞苷、雷利米得和地塞米松(Rd)疗法时的血清学进展一致。

图13：患者#4、#5、#6和#7的PL中的突变型克隆的连续追踪。

(A)线形图表示出了在接受帕比司他疗法的新诊断患者的第1、4和7个月收集的PL中患者#4中的仅PL突变KRAS G13C的FA。在第4个月和第7个月之间，λ轻链(LC)和副蛋白水平均未检测到显著变化；然而，在第4个月和第7个月之间KRAS G13C水平急剧增加，与疾病复发一致(左侧的Y轴)。

(B)治疗期间患者#5的PL突变的检测。线形图表示出了在接受口服氮杂胞苷、雷利米得和地塞米松(Rd)时在第1、10、20和90天收集的患者#5PL中的突变型克隆NRAS Q61K、KRAS Q61H_1和BRAF V600E的FA。FA水平在治疗的第10天时下降，而仅从第20天检测到κ轻链(LC)下降。

(C)线形图表示出了在治疗期间在第1、13和24个月收集的复发患者的连续PL中的4个突变型克隆(左侧的Y轴)和λLC(右侧的Y轴)的FA。患者#6在接受雷利米得和地塞米松时复发，在第13个月时两个突变型克隆KRAS G12V和KRAS G12A的水平增加(与λLC一致)，然而发现TP53 R273H和NRAS G13R FA下降。在第13个月时转为伊沙佐米、环磷酰胺和地塞米松(Cd)使KRAS G12A和KRAS G12V的水平下降而使NRAS G13R的水平增加，表明突变型克隆对治疗的响应不同。

(D)线形图表示出了非分泌型患者(患者#7)中通过ddPCR测得的突变型克隆的FA。在诊断后第1、3、13、17和19个月收集PL。示出了BM MM细胞的比例，在第13个月(自体干细胞移植(ASCT)后仅9个月)时4个克隆的FA增加，与BM复发一致。在19个月时，BM对VCD的响应很明显，但NRAS G13D克隆的FA增加。此后不久，该患者死于难治性进行性疾病。

图14：使用ddPCR验证OnTargetTM突变检测平台(OMD)结果。表格汇总了使用ddPCR针对特定突变针对突变的存在(√)或不存在(X)检查的BM和PL样品。

具体实施方式

现在将详细地参照本发明的某些实施例。虽然本发明将结合实施例来进行描述，但是应当理解的是，不意图将本发明限于那些实施例。相反，本发明意图涵盖可以包括在如权利要求书所限定的本发明的范围内的所有替代方案、修改方案以及等效方案。

本领域技术人员应认识到类似于或等同于本文所述的那些的可以在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明绝不限于所述的方法和材料。

应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分或附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替代组合。所有这些不同组合构成本发明的多个可替代方面。

诸位发明人已经确定了通过检测外周血中的无细胞DNA来诊断多发性骨髓瘤和多发性骨髓瘤疾病进展的各个阶段的方法。本发明因此提供了显著的优势，包括可以经由非侵入性方法(采血对比骨髓活检)监测疾病进展和对治疗的响应，并且经由无细胞DNA检测突变状态提供了比单个部位的组织活检更全面的肿瘤遗传特征写照。这些优势允许更加有力的诊断，并且允许特定的治疗与疾病中存在的遗传改变相匹配。更具体地说，诸位发明人已经证明，在用于监测疾病进展的常规方法可以指示治疗已经成功的情况下，本发明的方法使得能够更准确地评估疾病的进展，包括更精确地监测疾病动力学。这种类型的洞察使得临床医师能够提供更加个性化的治疗，其中通过调整治疗方案以响应于针为个体确定的突变状态(包括在个体的突变状态在疾病过程中改变时)来靶向特定分子途径。此外，本发明的方法使得能够在一种治疗方法不再有效的情况下更早进行干预，从而有助于适应治疗方案以反映随着疾病进展个体的突变状态的变化。

核酸通过细胞凋亡、坏死和DNA/RNA-脂蛋白复合物的自发释放以及其他来源而释放到血浆和血清中。循环的无细胞的肿瘤来源的DNA(ctDNA)含有具有源自多个独立肿瘤的DNA的整个肿瘤基因组的代表。此ctDNA的全基因组或外显子组测序可以用于鉴定与获得的对癌症疗法的抗性相关的突变，而不需要进行肿瘤的连续活检。同样显而易见的是，继发性突变在血浆中比经由过原发性肿瘤的再活检更容易地检测到，这是由于与后者相关的高假阴性率，从而验证了基于血浆的分析用于表征靶致癌基因和鉴定疾病进展期间获得的突变的效用。因此，可用数据表明，对循环核酸的分析提供了比单个部位的组织活检可能更全面的一个或多个肿瘤的遗传情况阐释。诸位发明人已经获得了本文所述的结果，其显示个体MM患者的遗传情况的更全面的阐释可分析源于外周血(PB)的循环无细胞核酸即无细胞DNA和RNA(分别是cfDNA和cfRNA)，因为这包含可能由多个独立肿瘤产生的整个肿瘤基因组和转录组的表示。

如本文所用的“无细胞核酸”或“cfDNA”是已从细胞释放或以其他方式从细胞逃逸到细胞所驻留的血液或其他体液中的核酸、优选DNA(基因组的或线粒体的)。从体液(如外周血)中提取或分离无细胞核酸(例如DNA)不涉及存在于体液中的任何细胞的破裂。无细胞DNA可以是从体液中分离的DNA，其中体液中的全部或基本上全部颗粒材料(如细胞或细胞碎片)已经被除去。

在无细胞核酸源于肿瘤(即，源自肿瘤并释放到血液或其他体液中的核酸)的情况下，可以使用术语无细胞肿瘤来源的DNA或ctDNA。

可以使用如下技术从外周血样品中提取无细胞核酸(如DNA)，包括例如Lo等人，美国专利6,258,540；Huang等人，Methods Mol.Biol[分子生物学方法]，444：203-208(2008)等，将其通过引用并入本文。通过举非限制性实例的方式，外周血可以收集在EDTA管中，之后可以通过离心分级成血浆、白细胞和红细胞组分。根据制造商的方案，可以使用QIAampDNA血液迷你试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(凯杰公司(Qiagen)，瓦伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州)或类似试剂盒提取存在于无细胞血浆级分中的DNA(例如从0.5至2.0mL)。

除非上下文另有说明，循环的无细胞的肿瘤来源的核酸和循环肿瘤游离核酸可互换使用，无细胞的肿瘤来源的DNA和循环肿瘤游离DNA也是如此。

本发明可以用于诊断、监测个体的疾病进展或治疗功效。本发明可以用于表征患有骨髓瘤的个体的突变状态或情况，包括表征个体疾病过程中和/或响应于各种治疗方法的突变状态的变化。

监测疾病进展或治疗功效可以是患有任何类型的多发性骨髓瘤的个体，包括阴燃或无痛多发性骨髓瘤、活动性多发性骨髓瘤、多发性孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、分泌性、非分泌性、IgGλ或κ轻链(LC)类型。由多发性骨髓瘤中的骨髓瘤细胞制备的最常见的免疫球蛋白(Ig)是IgG、IgA和IgM，较少见地涉及IgD或IgE。

本发明的方面(如监测疾病进展或治疗功效)可能在没有常规外周血生物标志物(例如，没有副蛋白、或本文(包括实例)所述的或本领域已知的其他标志物)是可检测的个体中是特别有用的。

本发明的方法通常包括将来自个体的核酸(有时称为“测试样品”)与对照谱中的核酸进行比较。

在一些情况下，“对照谱”可以包括来自不患有任何临床或生物化学可检测的多发性骨髓瘤的一个或多个个体的外周血样品的无细胞核酸(优选无细胞DNA)的水平。在此类情况下，不患有任何临床或生物化学可检测的多发性骨髓瘤的一个或多个个体的外周血样品在本文中被称为“对照样品”。“对照谱”可以源于除不存在多发性骨髓瘤外通常与选择用于确定他们是否患有多发性骨髓瘤的个体相同或非常相似的个体。通常使用用于测量测试样品中的无细胞DNA的相同测定形式来测量来自获得对照谱的一个或多个个体的外周血的对照样品中的无细胞DNA水平。

应该理解的是，对照谱也可以源于取测试样品的同一个体，但是在不同的时间点，例如一年或几年前。这样，对照谱还可以包括在个体接受多发性骨髓瘤治疗之前或在多发性骨髓瘤治疗期间的较早阶段来自个体的无细胞核酸水平。这样的对照谱因此形成个体中无细胞DNA水平的基线或基础水平谱，测试样品可以与之进行比较。

除了提供无细胞核酸水平的测量之外，对照谱还可以提供关于存在或不存在特定突变的信息，如本文所述的，在来自个体的无细胞核酸中检测到那些突变。

用于测量疾病进展或监测治疗功效的对照谱可以从取测试样品的同一个体产生，但是在不同的时间点，例如一年或几年前。这样的对照谱因此形成个体中(a)循环肿瘤游离核酸水平、(b)循环肿瘤游离核酸中的突变数量或(c)包含至少一个或多个突变的循环肿瘤游离核酸的比例的基线或基础水平谱。

在本说明书中，治疗失败包括在接受治疗(例如化疗)方案的同时疾病进展而没有经历任何短暂改善、在接受一个或多个周期的治疗方案后没有响应或在接受治疗方案的同时有有限响应但随后进展。不响应于疗法的骨髓瘤也可被称为“难治性多发性骨髓瘤”。难治性骨髓瘤可能出现在从未见过来自治疗疗法的响应的患者中，或者可能出现在最初对治疗有响应但在复发后对治疗无响应的患者中。

在本说明书中，除非另有说明，“复发”意指经过一段时间的改善后癌症的体征和症状恢复。

如本文所用的“晚期疾病”包括个体患有复发性和/或患有难治性多发性骨髓瘤。

单词“治疗(treat或treatment)”或“对治疗的响应”是指治疗性治疗，其中目的是减缓(减轻)所不希望的生理改变或障碍。为了本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定化(即，未恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及减轻(无论是部分减轻还是全部减轻)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗还可以意指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。治疗可以不必致使疾病或障碍完全清除，但是可以减少或最小化感染的并发症和副作用以及疾病或障碍的进展。

虽然本发明可用于人类中，但是本发明对于治疗性兽用目的也是有用的。本发明对于家养或农场动物(如牛、绵羊、马和家禽)；对于宠物(如猫和狗)；以及对于动物园动物是有用的。

本发明还提供了个体中RAS/MAPK途径的突变状态，然后可以将其用于鉴定可通过靶向RAS/MAPK途径的治疗模式(如曲美替尼、瑞格色替、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼、索拉非尼或威罗非尼)治疗的个体。

本发明包括监测多发性骨髓瘤治疗的功效，其中治疗包括但不限于给予以下中的任何一种或多种：地塞米松、环磷酰胺、沙利度胺、来那度胺、依托泊苷、顺铂、伊沙佐米、硼替佐米、威罗非尼、瑞格色替、曲美替尼、帕比司他、氮杂胞苷、帕姆单抗、尼鲁单抗、度伐鲁单抗或自体干细胞移植(ASCT)。

治疗可以包括一种或多种药物、或两种或更多种药物的任何组合，包括按以下组合：地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷和顺铂(DCEP)；地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂和沙利度胺(T-DCEP)；氮杂胞苷和来那度胺(Rd)、伊沙佐米-环磷酰胺-地塞米松(ICd)；或硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(VCD)。治疗可以包括与另外的药物组合的DCEP、T-DCEP、Rd、Icd或VCD的组合。

本发明还包括基于确定或监测接受多发性骨髓瘤治疗的个体的突变状态的结果来调整或修改多发性骨髓瘤治疗。调整或修改可以包括从治疗方案中移除特定的一种或多种药物并用一种或多种替代药物替换该药物。可替代地，调整或修改可以包括为现有治疗补充另外的药物。

在任何实施例中，替换或补充治疗包括给予地塞米松、环磷酰胺、沙利度胺、来那度胺、依托泊苷、顺铂、硼替佐米、考比替尼、伊沙佐米、瑞格色替、司美替尼、索拉非尼、曲美替尼、威罗非尼、帕比司他、氮杂胞苷、帕姆单抗、尼鲁单抗、度伐鲁单抗或自体干细胞移植(ASCT)中的任何一种或多种。替换或补充治疗还可以包括给予以下的组合中的任何一种或多种：地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷和顺铂(DCEP)；地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂和沙利度胺(T-DCEP)；来那度胺和地塞米松(Rd)、伊沙佐米-环磷酰胺-地塞米松(ICd)；或硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(VCD)。治疗可以包括与另外的药物组合的DCEP、T-DCEP、Rd、Icd或VCD的组合。

通过使用本发明的方法监测个体的突变状态的进展和变化，临床医生或从业者能够做出与任何一个个体采用的治疗方法有关的知情决定。例如，在某些实施例中，可以确定在MM患者中鉴定的特定突变型克隆对第一次治疗无响应，但是对第二次治疗有响应；而在个体中鉴定的其他克隆对第一次治疗有响应，但是对第二次治疗无响应。因此，通过使用本发明的方法监测突变型克隆对各种治疗方法的响应，还可以定制组合两种或更多种治疗的方法，每种治疗靶向个体中克隆的不同子集。

以下是说明本发明在疾病过程中调整MM的治疗中的效用的一些情境：

-个体接受用来那度胺(雷利米得)和地塞米松的组合进行的治疗数月。在治疗过程中，副蛋白和λLC的水平逐渐降低，血浆中具有KRAS G12S突变的的克隆的丰度也是如此。治疗15个月后，血浆中KRAS G12V克隆的丰度分数急剧增加，其速率仅超过副蛋白和λLC量的适量增加。结果指示需要改变治疗方案以特异性靶向KRAS G12V克隆。考虑到来那度胺-地塞米松在靶向KRAS G21S克隆中的功效，建议为现有治疗方案补充靶向RAS途径的另外的药物；

-个体接受用氮杂胞苷和Rd(来那度胺和地塞米松)的组合进行的治疗。在治疗数月后，血浆中KRAS G12D克隆的丰度分数急剧增加，指示需要修改治疗方案以靶向RAS/MAPK途径；

-个体在诊断患有MM后两个月接受用ASCT进行的治疗。在治疗后的几个月中，KRASG31C克隆的丰度降低。将治疗转为帕比司他(Panabinostat)后，KRAS G13C克隆的丰度分数增加，指示此药物未成功靶向这些克隆并且需要替代或补充治疗；

-个体接受用组合Rd(来那度胺和地塞米松)进行的治疗。在治疗过程中，TP53R273H和RNAS G13R克隆的丰度分数降低，指示这些克隆对用Rd进行的治疗有响应。然而，KRAS G12V和G12A克隆的丰度增加，指示这些克隆不响应于初始治疗。用伊沙佐米、环磷酰胺和地塞米松(Icd)替换Rd治疗显示KRAS G12V和G12A克隆对治疗有响应，但是RNASG13R克隆的丰度分数增加。然后为ICd治疗补充Rd治疗，从而靶向KRAS G12V和G12A及RNASG13R克隆；

-个体接受用硼替佐米、环磷酰胺和地塞米松(VCD)进行的治疗，随后接受用ASCT进行的治疗。在初始治疗后血浆中各个克隆的丰度分数降低，并且在接下来的几个月中仅略有增加。响应于骨髓MM的增加，开始地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺铂和沙利度胺(T-DCEP)治疗。T-DCEP治疗没有效果，并且随后G13D克隆和NRAS Q61K克隆的丰度分数增加。随后转为VCD治疗成功靶向骨髓MM和NRAS Q61K克隆，但是不靶向NRAS G13D克隆，指示需要用靶向此克隆的药物进行的补充治疗。

上述情境中的每一个指示，根据本发明的方法监测疾病进展使得能够替换或补充现有治疗，以便特异性靶向随着疾病进展在血浆中的丰度分数增加的克隆。

在图10和11中描述且在本文中称为在本发明中有用的突变显示为特定蛋白质中的氨基酸突变。例如，KRAS G12D是指编码KRAS的基因中的突变，其导致在位置12处在野生型正常蛋白质中出现的甘氨酸(G)变为天冬氨酸(D)。本文考虑了导致图10中的氨基酸突变的核酸中的任何突变。所有氨基酸突变的编号对应于来自给定蛋白质的野生型人类氨基酸序列中的位置。然而，氨基酸残基编号在另一种动物中可能不同，因此本发明考虑了在来自本文所述的人类或其他动物的直向同源物或旁系同源物中与图10中所示的那些等同的突变。KRAS、NRAS、BRAF或TP53基因的核苷酸序列是已知的，并且可以通过任何已知的数据库(如GenBank数据库)进行访问，例如人类KRAS通过登录号NM_004985.3、人类NRAS通过登录号NM_002524.4、人类BRAF通过登录号NM_004333.4、人类TP53通过登录号NM_000546.5。

GTPase KRAS也称为V-Ki-ras2基尔斯滕(Kirsten)大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物和KRAS，是一种在人类中由KRAS基因编码的蛋白质。KRAS可以被称为KRAS；C-K-RAS；CFC2；K-RAS2A；K-RAS2B；K-RAS4A；K-RAS4B；KI-RAS；KRAS1；KRAS2；NS；NS3；RASK2。

NRAS是一种在人类中由NRAS基因编码的酶。NRAS可以被称为NRAS；ALPS4；CMNS；N-ras；NCMS；NRAS1；NS6。

BRAF是一种产生叫做B-Raf的蛋白质的人类基因.该基因也被称为原癌基因B-Raf和v-Raf鼠肉瘤病毒致癌基因同系物B，而该蛋白更正式地称为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-Raf。BRAF可以被称为BRAF；B-RAF1；BRAF1；NS7；RAFB1。

肿瘤蛋白p53，也称为p53、细胞肿瘤抗原p53(UniProt名称)、磷蛋白p53、肿瘤阻遏物p53、抗原NY-CO-13或转化相关蛋白53(TRP53)，是由各种生物体中的同源基因(如TP53(人类)和Trp53(小鼠))编码的蛋白质的任何亚型。TP53可以被称为TP53；BCC7；LFS1；P53；TRP53。

如本文所用的，术语“核酸”是指掺入核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的任何分子、优选聚合物分子。核酸可以是单链的或双链的。单链核酸可以是变性双链DNA的一条链核酸。可替代地，它可以是不源于任何双链DNA的单链核酸。合适的核酸分子是DNA，包括基因组DNA或cDNA。其他合适的核酸分子是RNA，包括mRNA。

如本文所用的术语“分离的”或“部分纯化的”在核酸的情况下是指从至少一种其他组分(例如，核酸或多肽)中分离的核酸，其他组分与如在其天然来源中发现的核酸一起存在和/或当由细胞表达时与核酸一起存在。化学合成的核酸或使用体外转录/翻译合成的核酸被认为是“分离的”。

如本文所用的，核酸分子的一“部分”是指由该分子包含的连续的一组核苷酸。一部分可以包含由该分子包含的核苷酸的全部或仅子集。一部分可以是双链的或单链的。

如本文所用的，“扩增的产物”、“扩增产物”或“扩增子”是指由扩增反应产生的寡核苷酸，这些寡核苷酸是特定靶核酸模板链和/或其互补序列的部分拷贝，这些寡核苷酸在核苷酸序列中对应于模板核酸序列和/或其互补序列。扩增产物可以进一步包含对引物具有特异性的并且侧接作为靶核酸和/或其互补序列的一部分的序列的序列。如本文所述的扩增的产物通常是双链DNA，尽管可以提及其单链。

在本文所述的本发明的任何方法中，评估或确定样品中(a)循环的无细胞的肿瘤来源的核酸或循环肿瘤游离核酸、或(b)无细胞核酸的量、水平、存在或其中的突变可以通过如本文所述的任何方法，例如PCR、微阵列、测序等的形式。

可以使用本文所述的任何方法或例如聚合酶链式反应(PCR)或特别是定量聚合酶链式反应(QPCR)或液滴数字聚合酶链式反应(DDPCR)来定量核酸的量。QPCR是一项基于聚合酶链式反应的技术，并且用于扩增和同时定量靶向的核酸分子。QPCR允许既检测又定量(当归一化为DNA输入或另外的归一化基因时，作为绝对拷贝数或相对量)DNA样品中的特定序列。该程序遵循聚合酶链式反应的一般原则，另外的特征是定量扩增的DNA，因为它在每个扩增循环后实时积累在反应中。QPCR描述于例如Kurnit等人(美国专利号6,033,854)、Wang等人(美国专利号5,567,583和5,348,853)、Ma等人(The Journal of AmericanScience[美国科学杂志]，2(3)，2006)、Heid等人(Genome Research[基因组研究]986-994，1996)、Sambrook和Russell(Quantitative PCR，Cold Spring Harbor Protocols[定量PCR，冷泉港方案]，2006)和Higuchi(美国专利号6,171,785和5,994,056)中。将这些的内容通过引用以其整体并入本文。

一个实例是实例中描述的OnTarget^TM突变检测(OMD)平台(北方基因组学公司(Boreal Genomics))。

用于对核酸测序的任何高通量技术均可以用于本发明的方法中以确定无细胞核酸或无细胞肿瘤核酸的量、水平或其中的突变。具有这种能力的多种测序技术是可用的，其是可商购的，亿明达公司(Illumina，Inc.)(圣地亚哥，加利福尼亚州)；生命技术公司(LifeTechnologies，Inc.)(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。在一些实施例中，采用高通量测序方法，其包括在平行测序的固体表面上空间分离单个分子的步骤。此类固体表面可以包括无孔表面(如在Solexa测序中，例如Bentley等人，Nature[自然]，456：53-59(2008)；或Complete Genomics测序，例如Drmanac等人，Science[科学]，327：78-81(2010))、可以包括珠或颗粒结合模板的孔阵列(如与454一起，例如Margulies等人，Nature[自然]，437：376-380(2005)；或Ion Torrent测序，美国专利公开2010/0137143或2010/0304982)、微加工膜(如与SMRT测序一起，例如Eid等人，Science[科学]，323：133-138(2009))或珠阵列(如与SOLiD测序或聚合酶克隆(polony)测序一起，例如Kim等人，Science[科学]，316：1481-1414(2007))。在另一方面，此类方法包括在固体表面上空间分离之前或之后扩增分离的分子。先前的扩增可以包括基于乳液的扩增(如乳液PCR)或滚环扩增。特别感兴趣的是基于Solexa的测序，其中单个模板分子在固体表面上空间分离，之后通过桥式PCR将它们平行扩增以形成分离的克隆群体或簇，并且然后对其测序，如在Bentley等人(上面引用的)和在制造商的说明书(例如TruSeq^TM样品制备试剂盒和数据表(TruSeq^TM Sample PreparationKit and Data Sheet)，亿明达公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，2010)以及进一步在以下参考文献中所述的：美国专利6,090,592；6,300,070；7,115,400；和EP0972081B1，将其通过引用而并入。全外显子组测序描述于实例中。

如本文所述的突变可以使用探针、优选寡核苷酸检测。探针被设计用于使用常规软件基于所希望的参数的选择与靶基因序列结合。优选的是，结合条件使得提供高水平的特异性-即结合发生在“严格条件”下。通常，严格条件选择为在确定的离子强度和pH下比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。

Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针结合时的温度(在确定的离子强度和pH下)。就此而言，在pH 7下在约0.02M或更低的盐浓度下，本发明的探针的Tm优选高于40℃且优选低于70℃、更优选约53℃。预混合的结合溶液是可用的(例如，来自CLONTECH实验室公司(CLONTECH Laboratories，Inc.)的EXPRESSHYB杂交溶液(EXPRESSHYB HybridisationSolution))，并且可以根据制造商的说明书进行结合。可替代地，本领域技术人员可以设想出这些结合条件的变体。

结合后，在严格(优选高严格)条件下洗涤除去未结合的核酸分子。典型的严格洗涤条件包括在55℃-65℃下在含有0.1％SDS的0.5-2x SSC的溶液中洗涤。典型的高严格洗涤条件包括在55℃-65℃下在含有0.1％SDS的0.1-0.2x SSC的溶液中洗涤。技术人员可以容易地设想出等效条件，例如通过用SSPE代替洗涤溶液中的SSC。

除了杂交条件的严格性外，杂交特异性可能受多种探针设计因素的影响，包括总体序列相似性、错配碱基的分布和位置以及由探针和靶序列形成的DNA双链体的自由能。

核酸序列的“互补序列”经由互补碱基配对与所述核酸序列结合。非编码(反义)核酸链也被称为“互补链”，因为它经由互补碱基配对与编码(有义)链结合。

因此，在一个方面，探针与包含图10中列出的任何一个或多个突变的KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列的编码(有义)链内的靶序列结合。可替代地，在另一方面，探针与包含图10中列出的任何一个或多个突变的KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列的互补非编码(反义)链内的靶序列结合。

在一个方面，探针可以被固定到支持物或平台上。固定探针为探针提供物理位置，并且可以用于将探针固定在所希望的位置和/或促进探针的回收或分离。

支持物可以是由例如玻璃或塑料制成的刚性固体支持物，或者支持物可以是膜，如尼龙或硝酸纤维素膜。3D基质是用于与本发明一起使用的合适的支持物-例如，聚丙烯酰胺或PEG凝胶。

在一个实施例中，支持物可以处于一个或多个珠或微球的形式，例如处于液珠微阵列的形式。合适的珠或微球是可商购的(例如，路明克斯集团(Luminex Corp.)，奥斯丁，德克萨斯州)。珠的表面可以被羧化以附着DNA。珠或微球可以被独特地识别，从而使得能够根据其独特的特征(例如，通过珠尺寸或颜色、或独特的标记)进行分选。在一个方面，珠/微球内部用荧光团(例如，红色和/或红外荧光团)染色并且可以通过它们不同的荧光强度而彼此区分。

在一个方面，在使包含图10中列出的任何一个或多个突变的KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列与所述寡核苷酸探针接触之前，该方法进一步包括扩增KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因或其互补序列的一部分的步骤，从而产生扩增子。

如果样品较小和/或包含DNA序列的异质集合，则可能需要扩增靶核酸。

扩增可以通过本领域已知的方法进行，并且优选通过PCR进行。技术人员应能够确定促进核酸序列扩增的合适条件。

因此，在一个方面，使用一对序列特异性引物进行扩增，其中所述引物通过互补碱基配对与KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因或其互补序列中的靶位点结合。在合适的DNA聚合酶和DNA前体(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的存在下，延伸引物，从而开始合成与靶核酸的单链互补的新核酸链。引物因此驱动KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因或其互补序列的一部分的扩增，从而产生扩增子。此扩增子包含探针所结合的靶序列，或者可以直接测序以鉴定如本文所述的一个或多个突变的存在。

为免生疑，在本发明的上下文中，寡核苷酸引物的定义不包括全长KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因(或其互补序列)。

引物对包含正向和反向寡核苷酸引物。正向引物是与靶核酸的互补非编码(反义)链结合的引物，并且反向引物是与靶核酸的相应编码(有义)链结合的引物。如本文所用的，靶核酸是包含待确定突变、优选图10中列出的突变的存在的KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列的核酸。

本发明的引物使用常规软件(如Primer Express(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)))基于所希望的参数的选择被设计用于与靶基因序列结合。就此而言，优选的是，结合条件使得提供高水平的特异性。引物的解链温度(Tm)优选超过50℃且最优选是约60℃。本发明的引物优选与靶核酸结合，但是优选被筛选以使自身互补性和二聚体形成(引物与引物的结合)最小化。

正向和反向寡核苷酸引物通常1至40个核苷酸长。使用更短的引物是有利的，因为这使得能够更快地退火至靶核酸。

正向引物优选地至少10个核苷酸长、更优选地至少15个核苷酸长、更优选地至少18个核苷酸长、最优选地至少20个核苷酸长，并且正向引物优选地长达35个核苷酸长、更优选地长达30个核苷酸长、更优选地长达28个核苷酸长、最优选地长达25个核苷酸长。在一个实施例中，正向引物约20-21个核苷酸长。

反向引物优选至少10个核苷酸长、更优选地至少15个核苷酸长、更优选地至少20个核苷酸长、最优选地至少25个核苷酸长，并且反向引物优选地长达35个核苷酸长、更优选地长达30个核苷酸长、最优选地长达28个核苷酸长。在一个实施例中，反向引物约26个核苷酸长。

“聚合酶链式反应”或“PCR”意指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。换句话说，PCR是用于制备侧接引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制体的反应，这样的反应包括以下步骤的一次或多次重复：(i)使靶核酸变性，(ii)使引物退火至引物结合位点，和(iii)在核苷三磷酸的存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，该反应在热循环仪中通过针对每个步骤优化的不同温度进行循环。具体的温度、每个步骤的持续时间以及步骤之间的变化率取决于本领域普通技术人员众所周知的许多因素，例如由以下参考文献所例示的：McPherson等人编辑，PCR：A Practical Approach[PCR：实用方法]和PCR2：A Practical Approach[PCR2：实用方法](IRL出版社(IRL Press)，牛津，分别是1991年和1995年)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，双链靶核酸可以在＞90℃的温度下变性，引物在范围50℃-75℃的温度下退火，并且引物在范围72℃-78℃的温度下延伸。术语“PCR”包括该反应的派生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。反应体积的范围从几百纳升(例如，200nl)至几百μl(例如，200μl)。“逆转录PCR”或“RT-PCR”意指之前进行逆转录反应的PCR，该反应将靶RNA转化为互补的单链DNA，然后将其扩增，例如Tecott等人，美国专利5,168,038，将该专利通过引用并入本文。“实时PCR”意指当反应进行时监测反应产物(即扩增子)的量的PCR。有许多形式的实时PCR，其主要区别在于用于监测反应产物的检测化学反应，例如Gelfand等人，美国专利5,210,015(“taqman”)；Wittwer等人，美国专利6,174,670和6,569,627(嵌入染料)；Tyagi等人，美国专利5,925,517(分子信标)；将这些专利通过引用并入本文。用于实时PCR的检测化学反应综述于Mackay等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，30：1292-1305(2002)中，也将其通过引用并入本文。“巢式PCR”意指两阶段PCR，其中第一次PCR的扩增子变成使用一组新的引物的第二次PCR的样品，这些引物中的至少一个与第一扩增子的内部位置结合。如本文所用的，关于巢式扩增反应的“初始引物”意指用于产生第一扩增子的引物，并且“次级引物”意指用于产生第二或巢式扩增子的一个或多个引物。“多重PCR”意指其中多个靶序列(或单个靶序列和一个或多个参考序列)在同一反应混合物中同时进行的PCR，例如Bernard等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]，273：221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，针对被扩增的每个序列采用不同的引物组。通常，多重PCR中靶序列的数目在从2至50、或从2至40、或从2至30的范围内。“定量PCR”意指设计用于测量样品或标本中一个或多个特定靶序列的丰度的PCR。定量PCR包括此类靶序列的绝对定量和相对定量。

使用一个或多个参考序列或内部标准进行定量测量，所述参考序列或内部标准可以单独测定或与靶序列一起测定。参考序列对于样品或样本可以是内源的或外源的，并且在后一种情况下，可以包含一个或多个竞争模板。典型的内源参考序列包括以下基因的转录物区段：β-肌动蛋白、GAPDH、p2-微球蛋白、核糖体RNA等。用于定量PCR的技术是本领域普通技术人员众所周知的，如在通过引用并入本文的以下参考文献中所例示的：Freeman等人，Biotechniques[生物技术]，26：112-126(1999)；Becker-Andre等人，Nucleic AcidsResearch[核酸研究]，17：9437-9447(1989)；Zimmerman等人，Biotechniques[生物技术]，21：268-279(1996)；Diviacco等人，Gene[基因]，122：3013-3020(1992)；Becker-Andre等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，17：9437-9446(1989)；等。

实例

实例1

外周血(PB)收集和处理：

根据阿尔弗雷德人类伦理委员会(Alfred Human Ethics Committee)，在获得知情同意书后，使用10ml Streck Cell-Free DNA BCT管或10ml EDTA管从正常志愿者(NV)或MM患者获得PB样品(30ml)。在样品收集后，立即将管倒置以将血液与收集管中的防腐剂混合，从而防止样品处理和储存期间DNA从血细胞中释放出来(Das K等人(2014)Moleculardiagnosis&therapy[分子诊断与治疗]18(6)：647-653；Qin J，Williams TL和Fernando MR(2013)BMC research notes[BMC研究笔记]6：380)。通过在820x g下离心10分钟(min)从PB中分离血浆(PL)。在不干扰细胞层的情况下收集上清液并且在16,000x g下再次离心10min以除去任何残留的细胞碎片。收集上清液并以1ml等分试样在-80℃下储存以用于长期储存直至从血浆中分离cfDNA。

无细胞DNA提取：

根据制造商的说明书，使用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，德国)将冷冻血浆样品用于cfDNA提取。将平均6ml血浆用于cfDNA提取。随后，用QUBIT荧光计和高灵敏度DNA检测试剂盒(生命技术公司(Life Technologies)，澳大利亚)定量血浆ctDNA。使用Qubit 2.0荧光计(生命技术公司)测量DNA产量。用于QUBIT测定的最大输入量是5μl。将提取的DNA在-80℃下储存直至进一步处理。

骨髓单核细胞的聚蔗糖(Ficoll)分离，MM细胞比例的确定和CD138+MM细胞的分离

与PB取样同时，根据阿尔弗雷德医院人类伦理委员会(Alfred Hospital HumanEthics Committee)批准的协议，在获得书面知情同意书后，从MM患者或NV获得BM。按照制造商的指南，利用Ficoll Paque Plus(通用医疗集团(GE Healthcare)，来多米尔(Rydalmere)，新南威尔士州，澳大利亚)分离包含骨髓单核细胞(BMMNC)的血沉棕黄层。使用红细胞裂解缓冲液(10mmol/L KHCO₃、150mmol/L NH₄Cl和0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)在37℃下持续5分钟除去红细胞，随后通过用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤来除去任何裂解缓冲液。然后将细胞在补充有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中培养过夜。通过CD138、CD38和CD45染色的流式细胞计数确定从每名患者分离的BMMNC中MM或正常浆细胞(PC)的比例。简言之，将细胞用CD45-FITC(碧迪(BD)生物科学公司(Becton Dickinson(BD)Biosciences)，北莱德，新南威尔士州，澳大利亚)、CD38-PerCP(BD生物科学公司)和CD138-PE(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，麦考瑞公园(Macquarie Park)，新南威尔士州，澳大利亚)在室温下染色20分钟，洗涤并重悬于300μL缓冲液(0.5％FCS/PBS)中。在BDFACSCalibur流式细胞仪上采集样品，并确定来自MM BM的CD38+/CD45-/CD138+细胞的比例。为了分离MM细胞，使用制造商的指南(美天旎生物技术公司)采用CD138微珠。将细胞在珠缓冲液(PBS/2mM EDTA/0.5％BSA)中洗涤并用微珠染色20min。通过使用MS柱(美天旎生物技术公司)的磁性分离来选择CD138+细胞。使用QIAGEN Blood DNeasy Kit(凯杰公司)进行DNA提取并用QUBIT荧光计2.0定量。

OnTarget^TM突变检测(OMD)平台

来自患者的CD138 MM细胞和配对血浆(2ml)的基因组DNA用于用OnTarget^TM突变检测(OMD)平台进行突变表征，该平台包括在KRAS、NRAS、CTNNB1、EGFR、PIK3CA、TP53、FOXL2、GNAS和BRAF基因中的96个突变，43个突变(BRAF n＝6；KRAS n＝18；NRAS n＝10和TP53n＝9)潜在地与MM相关(图10和11)。下文提供了用于OMD样品提取、定量、处理、突变富集、MiSeq文库制备和测序、数据分析的方法并如先前所述(Kidess E，Heirich K，Wiggin M，Vysotskaia V，Visser BC，Marziali A等人Mutation profiling of tumor DNA fromplasma and tumor tissue of colorectal cancer patients with a novel，high-sensitivity multiplexed mutation detection platform[用新颖高灵敏度多重突变检测平台进行的来自结直肠癌患者的血浆和肿瘤组织的肿瘤DNA的突变分析].Oncotarget[肿瘤标靶].2015；6：2549-61)。

OnTarget^TM突变检测(OMD)平台样品提取、定量和处理

使用改良版本的QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰公司，产品型号55114)从血浆样品中提取DNA。将样品洗脱到最终体积为60μl的0.1X TE中。将源于骨髓的DNA样品在0.1X TE中稀释至60μl。取出5μl等分试样用于质量控制。保留剩余部分用于在OnTarget测定中使用。使用qPCR测定每个DNA样品中存在的基因组拷贝数。将5μl样品等分试样连续稀释15倍和60倍，并且使用包含在COG5和ALB基因内的扩增子通过qPCR一式两份地进行测定。将包含少于300ng(测定的输入质量限)的样品用于运行该测定，而将包含多于300ng的样品用dH₂O稀释，使得如通过qPCR测量的50μl等分试样产生300ng。将包含30至300ng野生型DNA(罗氏(Roche)人类基因组DNA，产品型号11691112001)的六(6)个阴性对照样品与收到的样品平行运行。然后将内部阳性对照添加到每个样品中，这些对照用于分别计算每个突变的过程产量并验证每个突变的测定成功。内部阳性对照在PCR引物和OnTarget同源位点处具有与突变型等位基因相同的序列，但是还另外包含随机标识符(RID)，即有助于单个输入分子的产量计算并允许对照易于在测序后与真正的突变体区分开的随机DNA条形码。在96突变面板中为每个突变添加大约100个内部阳性对照分子。然后在多重12V循环条形码PCR反应(PCR1)中为每个样品分配独特的样品DNA条形码。99％的每个样品在条形码反应中用作模板以扩增包含面板中的96个突变的基因座。剩余的1％在分开的反应中条形码化，在该反应中扩增了突变面板基因座和两个另外的对照基因座(COG5和ALB，用于定量中)。在两个条形码PCR反应中，所有引物都包含用作通用引物的5′标签，从而允许在后续步骤中用单个引物组扩增所有基因座。然后合并条形码化的扩增的产物和定量反应产物，从而为包含该样品的全部PCR产物的每个样品产生单个等分试样。合并每个样品的15％的PCR产物，并且随后根据制造商的说明书使用Zymo DNA清洁和浓缩(Zymo DNA Clean and Concentrator)柱进行纯化。保留每个样品的剩余部分。

OnTarget突变富集

将样品组加载到OnTarget中，并富集96个突变以及野生型COG5和ALB序列。然后根据制造商的说明书使用BioRad Micro BioVSpin 6柱纯化富集的OnTarget产物。

MiSeq文库制备和测序

然后将富集且纯化的OnTarget输出用于Illumina MiSeq文库制备。使用通用引物通过35个循环的PCR扩增产物并用MiSeq衔接子标记(PCR2)，这些通用引物包含组特异性条形码和5′MiSeq衔接子标签。然后使用Agencourt AMPure XP试剂盒纯化PCR产物。然后使用KAPA Library Quant试剂盒通过qPCR对测序文库进行定量，将其归一化为5nM的浓度，并且然后在Illumina MiSeq上对文库测序。

数据分析序列比对

使用用BWA(用于与由来自OnTarget 96-plex突变面板内的序列组成的自定义参考文库进行比对)和SAM Tool(用于在比对后进行进一步的数据处理)编写的自定义分析脚本以完全自动化的方式分析测序数据。使用Perl，Python和MySql中编写的脚本并用如Graphviz等工具进行突变定量、质量控制和可视化。该算法的简要描述如下。首先通过样品和组条形码(分别在第一和第二PCR反应中添加)将来自MiSeq的原始FastQ文件解复用，修整以仅保留位于条形码PCR引物之间的每个分子的内源区域，并且然后根据以下标准进行过滤：

a)正向和反向读数必须与相同的参考序列对齐b)两个读数都携带相同的突变c)鉴定的突变必须包含在OnTarget 96-plex面板内。

根据样品条形码和突变将满足以上条件的读数分类(binned)。然后重新分析剩余的读数以确定它们是否与如下的内部阳性对照分子的单独参考文库对齐：

1.每个读数的内源部分的前15个碱基与OnTarget 96-plex面板内的基因座的一组减少的参考序对齐

2.通过搜索其基因座所特有的侧翼序列而找到RID条形码

3.然后从内源序列中除去RID序列；然后使剩余的内源序列通过上面的测试(a)-(c)。

通过过滤器的内部阳性对照读数针对RID内的测序误差进行校正，并根据样品条形码、突变和独特的RID序列进行分类。然后计算每个样品条形码/突变组合的整个工作流的平均单分子产量作为该条形码和突变的所有RID的读数的平均数。

质量控制检查

进行质量控制检查以确保测序仪检测了每个IPC分子，并且引申开来，检测了进入工作流的每个基因组突变体分子。对于每个样品中的每个突变，进行两次检测：

(a)检测到的内部阳性对照分子的数量必须是输入内部阳性对照分子的预期数量的至少50％。

(b)针对每个输入分子观察到的读数的平均数必须大于10。不符合以上两个条件的突变被标记为具有降低的灵敏度。

检测限计算和突变调用

然后通过将给定条形码的突变体读数的数量除以该突变和条形码的平均单分子产量来计算每个样品内每个突变的输入突变体分子的数量。对WT COG5和ALB序列进行类似的过程，并用于测量进入工作流的基因组的总数；考虑到这些基因座中只有1％在条形码PCR反应中被扩增。将突变丰度计算为输入突变体拷贝与总输入基因组拷贝的比率。对于两个样品，没有内部阳性对照添加到样品中，这意味着不可能直接测量单分子产量。这两个样品的单分子产量通过对平行处理的另外9个样品的单分子产量取平均来粗略估计。然后使用此近似单分子产量从突变体读数的数量确定突变体拷贝数。为了检查此分析的有效性，对的确包含内部阳性对照的组内的所有其他样品进行此计算方法，并且对照标准计算进行检查；在所有样品中所有突变的结果相差不到20％。只有在检测到突变体拷贝数大于检测限时，突变才称为阳性，其定义为：

其中总和中的项是：

·两个输入突变体拷贝

·WT样品中的最大预期突变背景(99.9％置信区间，单尾)，计算为在历史BorealGenomics野生型(wildVtype)样品中检测到的平均突变丰度加3个标准偏差(WT_背景)，通过除以输入基因组的数量(N基因组)转化为拷贝。

·由对扩增子内的其他序列的测序误差产生的最大预期串扰。这被计算为不与扩增子内的突变匹配的所有检测到的输入拷贝(cp_in)的总和的1％，并且包括96-plex面板中的WT和突变。在一个突变以高丰度存在的情况下，这可能会对密切相关突变的检测限产生重大影响。

全外显子组测序

用于WES，来自配对患者的基因组DNA和ctDNA，分别用NEBNext超文库制备试剂盒(NEBNext Ultra Library prep kit)(Genesearch公司)和SureSelect XT2人类外显子组V5.0试剂盒(SureSelect XT2 human exome V5.0kit)(安捷伦公司(Agilent))进行文库制备和外显子组捕获。然后在Illumina HiSeq 2500上进行测序并经由APF人类外显子组管线进行处理。

液滴数字PCR(ddPCR)：OMD验证和患者ctDNA追踪

OMD研究结果用突变特异性ddPCR验证，并且用ddPCR(Biorad QX200液滴数字PCR系统)定量追踪来自患者的连续PL样品。使用QX200 ddPCR(伯乐公司(Biorad))进行PCR。使用液滴产生器产生液滴，在该液滴产生器中20ul反应物被分配成高达20,000个稳定的纳升液滴的乳液。然后使液滴经受使用Prime PCR测定条件(伯乐公司)进行的PCR扩增。所有ddPCR设置都没有模板对照。PCR后，用双荧光检测器读取液滴以确定对感兴趣突变为阳性的液滴。Quantasoft^TM软件版本1.7使得能够确定样品的突变体拷贝数和丰度分数(FA)。

实例2

MM患者中的无细胞DNA含量显著高于正常志愿者

确定MM患者(n＝37)和NV(n＝21)中的cfDNA量。从MM患者比从NV获得更高量的cfDNA(分别为中位数23ng/ml[范围5-195ng/ml]对比15ng/ml[范围6-32ng/ml]，p＝0.0085，图1)。当cfDNA的量与疾病阶段相关时，很明显与NV相比，患有活动性疾病(ND和复发性疾病)的患者具有显著更高量的cfDNA(p＝0.0067；图2)。虽然患有活动性疾病的患者中的cfDNA的量显著更高，但是其水平与副蛋白、血清游离轻链和BM MM细胞比例的量没有相关性(图3，斯皮尔曼(Spearman)秩相关系数)。

实例3

对BM MM细胞和ctDNA两者的分析提供了MM患者的突变情况的全面阐释

收集了48名MM患者(15名新诊断[ND]患者和33名复发性/难治性[RR]患者)的同时期的富含CD138的MM肿瘤细胞群，并且所有配对的BM MM DNA和ctDNA标本以及6个野生型(WT)DNA对照都经历了OMD。在MM患者(BM和/或ctDNA)中检测到总共128个突变(KRAS n＝65[50.7％]，NRAS n＝37[28.9％]，BRAF n＝10[7.8％]，TP53n＝16[12.5％])，在WT对照中未检测到(图4)。在128个突变中，在BM和PL两者中发现了n＝38个突变，在BM中发现了n＝59个突变，在PL中发现了n＝31个突变。此外，在PL中发现了总共53.9％的突变，表明MM中存在ctDNA。48名患者中有10名在PL中具有不存在于BM中的31个突变，因此排他地或主要地检测到总共24.2％与BM活检部位相距较远(图10)。

在48名患者中，12名患者(25％)在BM或PL中都没有任何可检测到的突变，16名患者(33.3％)在PL中没有突变，并且3名患者(6％)仅在PL中有突变。

在RR组群内，与ND组群(1个突变)相比，仅在PL中发现了更多的突变(30个突变)，与在RR患者中存在遗传异质优势亚克隆的可能性更大一致，这些亚克隆排他地与BM活检部位相距较远地存在(图5)。此外，与ND相比，在RR患者中检测到更高频率的仅PL突变(27.2％对比6.6％，p＝0.25，卡方检验)。突变的存在/数量与高风险细胞遗传学的存在没有任何相关性。

在BM或PL中都没有检测到突变的患者(12名患者)被排除在验证分析之外。使用ddPCR针对所选突变对来自具有匹配的BM和PL的初始组群的剩余的36名患者进行验证。通过ddPCR测试BM和P1样品的123个突变，OMD与ddPCR之间的一致性为92.6％。

液滴数字PCR(ddPCR)用于随后验证在OMD中检测到的突变。使用ddPCR针对所选突变(KRAS G13D、G12D、G12V、G12A和G12R)对来自具有匹配的BM和PL的初始组群的总共12名患者进行验证。通过ddPCR检测到通过OMD测得存在的10/11(90.9％一致性)的突变，并且通过ddPCR检测到在OMD中呈阴性的4/13(30.7％)的突变，指示ddPCR具有更高的灵敏度(图14)。

突变丰度反映了MM患者的遗传异质情况

BM中突变的突变丰度(MA)的范围从0.0059％-32％(中位数0.14％)，并且对于PL是从0.0090％-14％(中位数0.11％)(图6)。与仅在BM中发现的突变相比，在BM和PL两者中发现的突变在BM中的中值MA显著高于在PL中的中值MA(图6；p＜0.0001)，指示在BM中更具优势的克隆在PL中也可检测到(图6，p＝0.014)。这与在OMD中表示出的突变谱不包括低于该测定的检测水平的较小BM克隆的观点一致。同样地，仅PL突变的MA显著低于在BM和PL两者中检测到的PL突变的MA(图6；p＝0.003)。

突变主要与RAS-MAPK途径相关

在BM和PL两者中发现的前4个突变是NRAS Q61K(8.6％)、KRAS Q61H_1(7.0％)、KRAS G13D(6.3％)和KRAS G12D(6.3％)(图7A)。在KRAS突变内，KRAS Q61H_1(13.9％)最突出，其次是KRAS G13D(12.3％)和KRAS G12D(12.3％)(图7B)；而在NRAS突变中，NRAS Q61K(29.7％)具有最高的发生率，其次是NRAS G12D(13.5％)和NRAS G13D(10.8％)(图7C)。在TP53中，TP53G245D、R273H和R248W具有相同的发生率(18.8％；图7D)；而在测试的所有4个BRAF突变中，BRAF V600E(50％；图7E)具有最高的发生率。

在测试的48名患者中，33名(69％)具有至少一个RAS激活性突变。KRAS突变在仅PL、仅BM和两者(图8A-C)中具有最高的发生率(图8C)。RAS突变分布于ND和RR患者中，73％的ND和67％的RR患者具有至少一个RAS激活性突变(图9)。然而，与ND(4/15(27％))相比，患有晚期疾病的个体患者具有更高数量的RAS突变，35名中有15名(43％)具有≥2个激活性突变(图9，p＝0.35，卡方检验)。在RR组群内，3名患者(RR24、RR12和RR13，图9)具有多于10个激活性RAS突变。在RAS-MAPK途径突变中，KRAS在RR患者中具有最高的出现率(56个突变)，其次是NRAS突变(27个突变)。然而，在ND患者中，NRAS(10个突变)高于KRAS(9个突变)。这些结果指示KRAS和NRAS突变在MM中是主要的。虽然RAS-MAPK途径突变的发生率高，但是在RR患者中排他地发现TP53突变(图9)。

表1：样品信息。表格包含关于样品和样品的突变谱的信息。

实例4

患有晚期疾病的MM患者在ctDNA中具有更多突变

与ND患者相比，RR患者中存在更多的MTS-分别是中位数2.5个突变/患者(范围0-11)对比1个突变/患者(范围0-3)，p＝0.03。在28名患者的22名(79％)的(BM和/或ctDNA)中检测到RAS-MAPK途径的激活性MTS(KRAS/NRAS/BRAF)，包括90％的ND患者(中值MTS 1，范围0-3)和72％的RR患者(中值MTS 1，范围0-11)，此外，18名RR患者中有8名(44％)具有≥2个激活MTS(各自是2个、2个、3个、4个、4个、8个、8个、11个)。此外，所有13个TP53 MTS均排他地在RR患者中发现。

实例5

全外显子组测序可以用于ctDNA突变检测

对4个ctDNA样品进行了探索性WES，并且主要显示了108、152、101和98个不同基因的外显子变体，中值读数深度分别是115、79、78和65。变体富含C＞T转换(分别是所有变体的51％、45％、51％和44％)，反映了甲基化胞嘧啶自发脱氨基为胸腺嘧啶，如已经通过MMBM的WES描述的。

本文的数据证实了ctDNA评估作为MM的突变表征的辅助的效用。此外，使用高灵敏度的靶向方法，已经证明MM中的突变情况比先前用BM WES所示的更复杂。在本文的组群中，RAS-MAPK途径的激活性MTS与表明在此途径上明显的亚克隆会聚(subclonalconvergence)的研究结果高度相关(prevalent)。结合了旨在鉴定随时备用的MTS的血浆ctDNA评估的高灵敏度方法可能代表了在使未来MM治疗策略个性化尝试方面的重大进展，并且结合了针对MM的RAS-MAPK途径靶向方法的未来研究是必要的。

实例6

在以下实例中用于监测7名患者的突变转录物的方法学

为患者提供收集血液用于由澳大利亚墨尔本的阿尔弗雷德医院人类研究伦理委员会(Alfred Hospital Human Research Ethics Committee)批准的调查研究的书面知情同意书。

基于临床要求从患者获得血液样品。将所有血液样品收集在Streck DNA管中并在收集后48小时内处理。在800g下离心10分钟，随后在1600g下再离心10分钟后分离血浆，然后将血浆等分至1.8ml管中并在-80℃下储存直至需要。按照制造商的说明书使用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰公司)提取血浆DNA。使用100μl缓冲液AVE洗脱DNA并使用NanoDrop1000分光光度计(赛默飞世尔公司(ThermoScientific))进行定量。

由北方基因组学公司鉴定每名患者内的突变，并且我们使用液滴数字聚合酶链式反应(DDPCR)(伯乐公司)追踪和定量突变。我们使用了BioRad QX200 DDPCR系统和DDPCR探针预混物[用于探针的DDPCR Supermix(无dUTP)]以及针对特定突变型克隆的引物。这些突变型和野生型引物购自伯乐公司，并且这些引物序列属该公司所有。

将DNA样品通过限制酶消化而片段化，这通过以每20μl DDPCR反应5个单位的浓度直接向DDPCR反应中添加MSE1并在具有96深孔反应模块的C1000触摸式热循环仪(C1000Touch Thermal Cycler)上运行来实现。用于扩增突变的热循环方案是95℃持续10分钟以激活酶，随后在94℃下变性30秒。退火在55℃下持续60秒，并且将变性和退火步骤重复39次，随后在98℃下使酶失活10分钟，并且将反应在12℃下保持直至从机器上取下样品。所有步骤的变温速率均设定为每秒2℃。在完成PCR步骤后，然后将样品加载到QX200液滴读取器(QX200 Droplet Reader)上并使用QuantaSoft Ver 1.7进行分析。

实例7

在口服氮杂胞苷与雷利米得和地塞米松(Rd)组合的1b期试验中进行治疗时，从患有晚期复发性疾病的患者#1收集连续的PL样品。通过ddPCR测试ctDNA的先前鉴定的TP53R273H和KRAS G12D突变。KRAS G12D(其似乎是优势克隆)的FA随疾病复发而迅速增加，而TP53 273H的FA随时间变化不明显(图12A)。

患有多发性骨髓瘤(特别是IgGλ形式)的人类患者中的此临床实例显示了在疾病的不同阶段可检测到的突变的异质性。

实例8

患者#2患有复发性MM，并在服用雷利米得和地塞米松(Rd)时收集连续的PL样品。两个突变KRAS G12S和KRAS G12V的ctDNA的分析指示，KRAS G12S突变随时间表现出最小的变化，而KRAS G12V克隆的FA与λ轻链(LC)水平的变化平行地改变，两者都随对疗法显现的难治性而增加(图12B)。

患有多发性骨髓瘤(特别是IgGλ形式)的人类患者中的此临床实例显示了在疾病的不同阶段可检测到的突变的异质性。

实例9

患者#3患有复发性MM，在复发时和同种异体移植后收集连续的PL。κLC水平在同种异体移植后12个月内逐渐降低；相比之下，突变型克隆KRAS G12C的FA在同种异体移植后急剧下降，在PL中仅剩余低可检测水平，与稳定疾病一致(图12C)。

患有多发性骨髓瘤(特别是IgGκ形式)的人类患者中的此临床实例显示了循环肿瘤DNA下降后血清标志物的下降。

实例10

患者#4是在针对在高剂量化疗条件下自体干细胞移植(ASCT)后未能实现完全响应的MM患者的帕比司他II期研究中征募的新诊断的MM。分析在ASCT之前和之后以及帕比司他治疗3个月后收集的连续PL样品的KRAS G13C(未在BM中鉴定到的仅PL突变)的存在。在接受治疗时KRAS G13C的FA增加，PP或λLC的最小变化预示随后的复发和停止试验疗法(图13A)。

这是ctDNA作为疾病状态的更好的生物标志物的临床实例，在肿瘤负荷的标准量度的可观察的变化之前的或显示与其不一致的FA的变化使得能够比通过血清标志物预测更早地转换疗法。

实例11

患者#5患有晚期复发性MM，在口服氮杂胞苷与Rd组合的1b期试验中进行治疗时，在90天内收集连续的PL。追踪三个突变型克隆NRAS Q61K、KRAS Q61H_1和BRAF V600E，在治疗后10天内观察到所有三个突变型克隆的FA急剧下降。相比之下，κLC持续上升直到第20天。KRAS Q61H_1(其具有最高的FA)的水平持续下降直到地90天，与κLC水平一致(图13B)。

ctDNA作为疾病状态的更好的生物标志物的临床实例，在肿瘤负荷的标准量度的可观察的变化之前的或显示与其不一致的FA的变化使得能够比血清标志物更早地预测疾病响应。

实例12

患者#6患有复发性疾病，服用Rd时TP53 R273H和NRAS G13R克隆都减少。与轻链逃逸一致的λLC的快速增加与两个新的先前未检测到的KRAS克隆(G12A和G12V)在PL中的出现一致。两个KRAS克隆的FA都随着转为伊沙佐米-环磷酰胺-地塞米松(ICd)疗法而降低，与血清学响应一致。然而，与持续响应的TP53 R273H克隆相比，响应于Rd的NRAS G13R克隆的FA在服用ICd时升高，强调了4个突变型克隆对两种不同治疗方式的响应有差异(图13C)。

ctDNA作为疾病状态的更好的生物标志物的临床实例，在肿瘤负荷的标准量度的可观察的变化之前的或显示与其不一致的FA的变化使得能够比血清标志物更早地预测疾病响应并且可能使得能够进行疗法转换。它还显示了与难治性疾病相关的新突变的上升，而预先存在的突变保持在相同水平。

实例13

患者#7患有新诊断的非分泌型MM，没有常规外周血标志物。连续PL ctDNA分析显示，复发性疾病与突变型KRAS G12V和KRAS G12D克隆(其在诊断时已经存在于BM中)的再次出现和两个新克隆NRAS G13D和NRAS Q61K的出现有关，其中前者对沙利度胺-地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷和顺铂(T-DCEP)以及用硼替佐米(万珂(velcade))-环磷酰胺-地塞米松(VCD)进行的再治疗都显示出难治性并持续到患者不久后死于进行性疾病(图13D)。有趣的是，在第19个月时的BM活检显示出与重新引入VCD一致的疾病负荷的明显减轻，但是PLctDNA的ddPCR显示出与VCD难治性疾病一致的NRAS G13D克隆的FA增加。

患有多发性骨髓瘤的人类患者中的此临床实例强调了针对突变检测循环无细胞DNA作为疾病状态和治疗功效的标志物的临床效用。此实例清楚地显示，没有常规外周血生物标志物(即无副蛋白)的患者将特别从检测循环无细胞DNA水平或突变中受益。

本文所述的实例中的临床结果清楚地显示了患有各种形式的多发性骨髓瘤的患者中循环无细胞核酸的非侵入性测试的益处，其可用于鉴定疾病阶段和治疗功效。这使得医生和执业医师能够更彻底地了解疾病的总体突变状态，从而产生针对驱动癌症进展的信号传导途径的更量身定制的治疗。

MM患者中的多灶性肿瘤沉积和克隆内异质性为使用WGS或WES在单个BM部位处进行全面的突变表征提供了困难的环境，这是由于其空间和时间限制。已知在疾病复发时许多继发性激活性突变在RAS、FGFR3、TRAF3和TP53中是普遍的，指示包容表征可以为治疗决策提供信息。可以提供个体MM患者的遗传情况的更全面阐释的替代方法是分析源于PL的ctDNA，因为这理论上包含由多个独立肿瘤产生的整个肿瘤基因组的表示。本文所述的MM研究试图评估PL来源的ctDNA作为BM活检的辅助用于突变表征和在患者治疗期间实时监测突变型克隆的效用。

在此项研究中，使用OMD平台评估来自ND和RR MM患者的PL和配对的BM样品中的ctDNA，以表征MM患者的关注与MM有关的4个基因(即KRAS、NRAS、BRAF和TP53)的突变谱。在BM和PL两种样品中均检测到突变，指示ctDNA作为BM活检的辅助用于MM的全面突变表征的效用。ctDNA来自多个独立肿瘤的概念通过仅在PL中发现31％的突变而得到强化。在一部分患者(23％)中，因为在BM和ctDNA两者中均发现了突变，突变负荷在ctDNA内成比例地更大，进一步加强了此观点。此外，RR患者的仅PL突变的发生率更高，支持遗传结构在疾病进展期间在多个肿瘤部位演变的概念。同样地，当进行PL的连续ddPCR时，患者#1具有与BM部位相距较远显现的NRAS G13D克隆，与难治性疾病复发对应(图12)。总之，这些结果证实，单部位BM活检在其全面捕获演变的肿瘤基因组的能力方面受限，特别是如果需要实时监测肿瘤动力学和预测对治疗的抗性的话。

在本文所述的组群中，RAS-MAPK途径的激活性突变是高度普遍的，在BM和/或PL中79％的患者中存在至少1个激活性突变，因此证明了此途径上明显的亚克隆会聚。这些数据还证实，一些患者中的亚克隆结构比先前的NGS研究提出的要复杂得多，RAS突变的盛行率比先前描述的要高，并且强化了适当设计靶向RAS-MAPK途径的前瞻性临床试验的必要性。此外，使用ctDNA的ddPCR来定量追踪特定的突变型亚克隆应该更好地为治疗决策提供信息。此外，用此方法检测到的突变数量增加(与WES BM分析相比)，从而使得能够识别具有超突变写照的患者(例如，RR患者1-4(图9))，具有治疗相关性。最近的观察表明检查点抑制在具有最高突变负荷的实体肿瘤患者中更有效。此类治疗策略可以在更全面的患者突变表征的背景下以更定向的方式进行。

类似地，使用先前鉴定的突变的ddPCR进行的连续ctDNA分析揭示了与复发一致的或在复发之前的特定突变型克隆的FA增加(图12和13)。基于此，有人提出针对潜在随时备用的突变的存在的靶向ctDNA评估可能不仅提供肿瘤负荷的非侵入性实时测量，而且还为治疗选择提供关键信息。此外，源于ctDNA评估的定量数据可能代表了全身肿瘤负荷和随后的对靶向疗法的响应的评估(而不是源于单个部位BM活检检查)的更全面测量。这是MM的首次概念验证研究，该研究已评估了ctDNA作为辅助用于MM的突变表征的效用。使用高灵敏度的靶向方法，诸位发明人已经证明MM中的突变情况比先前用BM WES显示的更复杂，并且重要的是与BM活检部位相距较远主要地或排他地存在的突变型克隆可以在患者治疗期间进行追踪。诸位发明人得出结论，结合了旨在鉴定随时备用的突变的PL ctDNA评估的高灵敏度方法代表了在使未来MM治疗策略个性化尝试方面的重大进展，并且结合了针对MM的RAS-MAPK途径靶向方法的未来研究是必要的。

Claims (27)

1.一种用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-提供源于已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

其中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中不存在突变或突变的数量减少表明该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应；或者其中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中存在突变或突变的数量增加表明该个体对多发性骨髓瘤治疗无响应。

2.一种用于监测个体对多发性骨髓瘤治疗的响应的方法，该方法包括：

-提供源于已经历多发性骨髓瘤治疗的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-提供来自该个体的骨髓单核细胞的核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估来自骨髓单核细胞的这些核酸；

其中在这些无细胞核酸或来自骨髓单核细胞的这些核酸的一者或两者中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中不存在突变或突变的数量减少表明该个体对多发性骨髓瘤治疗有响应；或者其中在这些无细胞核酸或来自骨髓单核细胞的这些核酸的一者或两者中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中存在突变或突变的数量增加表明该个体对多发性骨髓瘤治疗无响应。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中检测到的突变编码选自由图10中所示的那些组成的组的突变。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该方法包括将来自该个体的无细胞核酸与在多发性骨髓瘤治疗之前从该个体获得的无细胞核酸进行比较。

5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中该方法包括将来自该个体的骨髓单核细胞的核酸与来自在多发性骨髓瘤治疗之前从该个体获得的骨髓单核细胞的核酸进行比较。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中检测到的突变编码选自由以下组成的组的突变：KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12S、KRAS G12R、KRAS G12A、KRAS G13C、NRAS Q61K、NRAS Q61H_1、NRAS G13D、NRAS Q61H、NRAS Q61L、NRAS G13R、BRAF V600E和TP53 R273H。

7.一种用于确定个体是否患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供来自待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血测试样品；

-评估该测试样品的无细胞DNA水平，从而形成测试样品谱；

-提供包含关于无多发性骨髓瘤个体的外周血中无细胞DNA水平的数据的对照谱；

-将该测试样品谱与该对照谱进行比较以鉴定该测试样品谱与该对照谱之间是否存在无细胞DNA水平的差异；

-在该测试样品谱中的无细胞DNA水平高于该对照谱的情况下，确定该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。

8.根据权利要求7所述的方法，其中提供外周血测试样品的步骤包括直接从待诊断的个体获得外周血样品。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中评估该测试样品的无细胞DNA水平的步骤包括从外周血提取无细胞DNA并丢弃外周血的除无细胞DNA外的所有组分。

10.一种用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供来自待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血测试样品；

-评估该测试样品的循环肿瘤游离核酸，

其中检测到循环肿瘤游离核酸诊断该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。

11.根据权利要求10所述的方法，其中这些循环肿瘤游离核酸是在KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中存在至少一个突变的无细胞核酸。

12.根据权利要求11所述的方法，其中该突变是图10中列出的任何一个或多个突变。

13.一种用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供源于待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估这些无细胞核酸；

其中在KRAS、NRAS、BRAF或TP53中的任何一个或多个中检测到突变诊断该个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险。

14.根据权利要求13所述的方法，该方法进一步包括从自其中提取无细胞核酸的个体获得外周血样品的步骤。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中检测到的突变编码选自由图10中所示的那些组成的组的突变。

16.根据权利要求15所述的方法，其中该突变选自KRAS G12D、KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12S、KRAS G12R、KRAS G12A、KRAS G13C、NRAS Q61K、NRAS Q61H_1、NRAS G13D、NRASQ61H、NRAS Q61L、NRAS G13R、BRAF V600E和TP53 R273H。

17.一种用于诊断个体患有多发性骨髓瘤或处于患上多发性骨髓瘤的风险的方法，该方法包括：

-提供源于待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个序列中的突变评估这些无细胞核酸；

-提供来自该个体的骨髓单核细胞的核酸；

-针对KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的任何一个或多个核苷酸序列中的突变评估来自骨髓单核细胞的这些核酸；

其中在这些无细胞核酸和来自骨髓的这些核酸中都检测到突变诊断该个体患有多发性骨髓瘤。

18.根据权利要求17所述的方法，其中KRAS、NRAS、BRAF和/或TP53基因的核苷酸序列中的这些突变选自由图10中列出的那些组成的组。

19.一种用于诊断患有多发性骨髓瘤的个体的晚期疾病的方法，该方法包括：

-提供源于待确诊晚期疾病的个体的外周血样品的无细胞核酸；

-针对TP53基因的核苷酸序列中的一个或多个突变评估这些无细胞核酸；

其中在TP53中检测到一个或多个突变诊断该个体患有晚期疾病。

20.根据权利要求19所述的方法，其中TP53中的这些突变是图10中列出的那些中的任何一个或多个。

21.一种用于诊断患有多发性骨髓瘤的个体的晚期疾病的方法，该方法包括：

-提供源于待确诊多发性骨髓瘤的个体的外周血样品的无细胞核酸和骨髓单核细胞；

-针对KRAS、NRAS、BRAF或TP53中的任何一个或多个中的突变评估这些无细胞核酸和来源于骨髓的这些核酸；

其中检测到大于3个TP53突变诊断该个体患有晚期疾病。

22.根据权利要求21所述的方法，其中TP53中的这些突变是图10中列出的那些中的任何一个或多个。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，该方法进一步包括给予药物以治疗诊断为对治疗无响应、患有多发性骨髓瘤、活动性疾病或晚期疾病的个体的步骤。

24.根据权利要求23所述的方法，其中该药物靶向RAS/MAPK途径。

25.根据权利要求24所述的方法，其中该药物选自由以下组成的组：曲美替尼、瑞格色替、考比替尼、司美替尼、索拉非尼和威罗非尼。

26.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中当作出该个体对治疗无响应的评估时，该方法进一步包括用另外的药物替换或补充现有治疗的步骤。

27.根据权利要求26所述的方法，其中这些另外的药物选自地塞米松、环磷酰胺、沙利度胺、来那度胺、依托泊苷、顺铂、硼替佐米、考比替尼、伊沙佐米、瑞格色替、司美替尼、索拉非尼、曲美替尼、威罗非尼、帕比司他、氮杂胞苷、帕姆单抗、尼鲁单抗、度伐鲁单抗或自体干细胞移植(ASCT)。