CN119156397A

CN119156397A - 具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽

Info

Publication number: CN119156397A
Application number: CN202380037390.7A
Authority: CN
Inventors: M·D·莫兰特; M·耶蒙森
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2022-07-15
Filing date: 2023-07-03
Publication date: 2024-12-17
Also published as: WO2024012912A1

Abstract

本发明涉及具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及产生和使用这些多肽的方法。

Description

具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽

序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。

技术领域

本发明涉及具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽，编码这些多肽的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。

背景技术

脱酰胺酶是由微生物细胞以无活性的原形式(proform)产生的，该原形式包含与脱酰胺酶结构域紧密结合的前肽结构域。该原形式几乎不具有脱酰胺酶活性以保护宿主细胞的活力。本质上，将该原形式进行后处理以去除前肽并将活性脱酰胺酶释放到宿主细胞外。然而，在重组表达系统中，该前肽不会自然地去除，并且失活的脱酰胺酶原形式在宿主细胞外分泌。

由于前肽对脱酰胺酶多肽的高结合亲和力，前肽结构域不能通过简单切割与脱酰胺酶结构域分离。该结合亲和力可以通过诱变来操纵，以使得前肽和活性脱酰胺酶更容易分离，但这会导致细胞内脱酰胺酶部分激活，降低宿主细胞的活力。

本发明的目的是提供新型脱酰胺酶抑制剂，该抑制剂可以与脱酰胺酶共表达，通过减轻活性细胞内脱酰胺酶对宿主细胞活力的负面影响来改善脱酰胺酶的重组表达。

发明内容

本发明提供了能够通过可逆地结合至脱酰胺酶以及与脱酰胺酶活性位点相互作用来抑制脱酰胺酶活性的多肽。

因此，在第一个方面，本发明涉及具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

(a)与SEQ ID NO：2具有至少60％氨基酸序列同一性的多肽；

(b)通过在一个或多个位置处具有1-30个改变(例如，取代、缺失和/或插入)，例如1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22或23或24或25或26或27或28或29或30个改变，特别是取代而衍生自SEQ ID NO：2的多肽；

(c)衍生自(a)或(b)的多肽的多肽，其中N-和/或C-末端已通过添加一个或多个氨基酸而延伸；以及

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段。

在另一个方面，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明的其他方面和实施例从说明书和实例是显而易见的。

序列

SEQ ID NO：1：编码来自金黄杆菌属物种-62563的脱酰胺酶抑制剂的多核苷酸。

SEQ ID NO：2：由SEQ ID NO：1编码的脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3：编码来自金黄杆菌属物种-62563的活性脱酰胺酶的多核苷酸。

SEQ ID NO：4：由SEQ ID NO：3编码的脱酰胺酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：6：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：7：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：8：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：9：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：10：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：11：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：12：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：13：脱酰胺酶抑制剂的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：14：脱酰胺酶活性位点的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：15：脱酰胺酶活性位点的氨基酸序列基序。

SEQ ID NO：16：脱酰胺酶活性位点的氨基酸序列基序。

定义

根据此详细描述，以下定义适用。注意，单数形式“一种/个(a/an)”以及“该/这些(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。

除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

脱酰胺酶活性：术语“脱酰胺酶活性”意指蛋白质-谷氨酰谷氨酰胺酶(也称为谷氨酰肽谷氨酰胺酶)活性，如EC 3.5.1.44中所述，其催化在羧基位置或α-氨基和羧基位置都取代的谷氨酰胺的γ-酰胺的水解，例如L-谷氨酰甘氨酸和L-苯丙氨酰基-L-谷氨酰甘氨酸。具有脱酰胺酶活性的多肽通常也称为脱酰胺酶。因此，脱酰胺酶可以将蛋白质中的谷氨酰胺残基脱酰胺为谷氨酸残基，并且脱酰胺酶也被称为蛋白质谷氨酰胺脱酰胺酶。脱酰胺酶包括Cys-His-Asp催化三联体(例如Cys-156、His-197和Asp-217，如Hashizume等人“Crystal structures of protein glutaminase and its pro forms converted intoenzyme-substrate complex”“蛋白质谷氨酰胺酶及其原形式转化为酶-底物复合体的晶体结构”,Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],第286卷,编号44,第38691-38702页所示)并且属于InterPro条目IPR041325。在一个优选的实施例中，本发明的脱酰胺酶属于PFAM结构域PF18626。脱酰胺酶氨基酸序列可以包含对应于SEQ ID NO：4的氨基酸残基40-47的氨基酸序列基序DGCYARAH(SEQ ID NO：14)，和/或对应于SEQ ID NO：4的氨基酸残基42-48的氨基酸序列基序CYARAH[R/K/Q](SEQ ID NO：15)，和/或对应于SEQ ID NO：4的氨基酸残基83-89的氨基酸序列基序HVA[L/V/I]LVS(SEQ ID NO：16)。这些基序与脱酰胺酶活性位点重叠。优选地，脱酰胺酶活性是由如SEQ ID NO：4所示的多肽展现出的活性。

如实例1中所述，通过使用包含谷氨酰胺残基和荧光淬灭基团的荧光底物测量脱酰胺酶活性。谷氨酰胺残基通过脱酰胺酶活性转化为谷氨酸残基，然后通过谷氨酰内肽酶切割底物以去除荧光淬灭基团。

脱酰胺酶活性还可以通过使谷氨酰胺底物(例如Cbz-Gln-Gly)脱酰胺来测量，并且在该过程中产生氨。将氨用作谷氨酸脱氢酶与α-酮戊二酸组合的底物以产生谷氨酸。后一种酶促反应需要NADH作为辅酶。NADH的消耗可以通过测量340nm处的动力学吸光度来跟踪，并且与脱酰胺酶活性直接成正比。该反应在pH 7下在37℃下进行。

脱酰胺酶抑制剂：术语“脱酰胺酶抑制剂”意指与脱酰胺酶活性位点的氨基酸残基相互作用的氨基酸序列。因此，脱酰胺酶抑制剂活性会降低或抑制脱酰胺酶活性，优选地由如SEQ ID NO：4所示的多肽展现出的脱酰胺酶活性。例如，在存在脱酰胺酶抑制剂的情况下，脱酰胺酶活性可以降低到少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、或少于40％(与不存在脱酰胺酶抑制剂的情况下的脱酰胺酶活性相比)。具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽通常也称为脱酰胺酶抑制剂。脱酰胺酶抑制剂可以包含选自由以下组成的组的氨基酸序列基序：F[F/Y][I/L/V][F/Q/S][E/K/R]；L[I,T]WY[D,H,K,N]；G[I,M]S[A,P,Q]Q；[D,H,K,N,S][I,L][G,V][I,V][D,E]；[N,H][I,L,M,V,Q][I,V][K,R,Q][E,I,Q]；[D/N][P/S][D/E][H/K/N/Q/R][A/P/S]；及其组合。脱酰胺酶抑制剂还可以包含选自由以下组成的组的氨基酸序列基序：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及其组合。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，通过一系列步骤(包括剪接)对前体进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框确定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指涉及在特定生物体内或体外调节多核苷酸表达的核酸序列。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸而言可以是天然的(即，来自相同基因)或异源的(即，来自不同基因)，并且对于彼此是天然的或异源的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前原肽、前肽、信号肽、启动子、终止子、增强子以及转录或翻译起始子和终止子序列。最少，这些控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”意指多肽产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：“表达载体”是指包含编码多肽的DNA序列的线性或环状DNA构建体，该编码序列可操作地连接到能够影响DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这样的控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。

延伸：术语“延伸”意指在多肽的氨基和/或羧基末端添加一个或多个氨基酸，其中该“延伸的”多肽具有脱酰胺酶抑制剂活性。

片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽，其中该片段具有脱酰胺酶抑制剂活性。

融合多肽：术语“融合多肽”是其中本发明的一种多肽在本发明的另一种多肽的N-末端和/或C-末端融合的多肽。通过将编码本发明的多肽的两个或更多个多核苷酸融合在一起来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用其中在翻译之后产生融合多肽的内含肽技术(Cooper等人，1993，EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]12：2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266：776-779)来构建融合多肽。融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。因此，这些融合多肽可以包含位点特异性内肽酶的切割位点，例如在第一多肽的C-末端的20个氨基酸内，优选地10个氨基酸内。熟知的位点特异性内肽酶的实例包括谷氨酰内肽酶(例如，EC3.4.21.19或EC 3.4.21.82)、胰蛋白酶样内肽酶和糜蛋白酶样内肽酶(包括肠肽酶)。切割位点和相应的内肽酶的许多其他实例包括但不限于在以下中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbio1.Biotechnol.[工业微生物学杂志]3：568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76：245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63：3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13：498-503；以及Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9：378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25：505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13：982-987；Carter等人，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics[蛋白质：结构，功能和遗传学]6：240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[药物发现世界]4：35-48。

异源的：对于宿主细胞，术语“异源的”意指多肽或核酸不是宿主细胞中天然存在的。对于多肽或核酸，术语“异源的”意指控制序列(例如多肽或核酸的启动子)不与该多肽或核酸天然相关联，即，控制序列是来自编码成熟多肽的基因以外的基因。

宿主菌株或宿主细胞：“宿主菌株”或“宿主细胞”是其中已引入表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体(包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸)的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖类的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括由细胞产生的原生质体。

引入：在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指“转染”、“转化”或“转导”，如本领域已知的。

分离的：术语“分离的”意指多肽、核酸、细胞或其他特定材料或组分，其与至少一种其他材料或组分(包括但不限于，其他蛋白质、核酸、细胞等)已经分离。因此，分离的多肽、核酸、细胞或其他材料呈自然界中不存在的形式。分离的多肽包括但不限于含有在宿主细胞中表达的分泌性多肽的培养液。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在N-末端和/或C-末端加工(例如，信号肽的去除)后呈其成熟形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO：2。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脱酰胺酶抑制剂活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1。

天然：术语“天然”意指天然存在于宿主细胞中的核酸或多肽。

核酸：术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可以是单链或双链，并且可以是化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码是简并的，所以可使用多于一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，否则核酸序列以5′至3′取向呈现。

核酸构建体：“核酸构建体”是指分离自天然存在的基因或以原本不存在于自然界中的方式被修饰以含有核酸的区段或是合成的并且包含可操作地连接到核酸序列的一个或多个控制序列的单链或双链核酸分子。

可操作地连接：“可操作地连接”意指指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，调节序列可操作地连接到编码序列，使得编码序列的表达处于调节序列的控制之下。

纯化的：术语“纯化的”意指基本上不含其他组分的核酸、多肽或细胞，如通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经受密度梯度离心的培养基中，纯化的多肽或核酸可形成离散的条带)所确定。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，按重量计或以摩尔计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后分子的浓度大幅度增加时，组合物富集了该分子。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。

在一个方面，如本文所用的术语“纯化的”是指多肽或细胞基本上不含来自生产生物体的组分(尤其是不溶性组分)。在其他方面，术语“纯化的”是指多肽基本上不含来自从中获得其的天然生物体的不溶性组分(尤其是不溶性组分)。在一个方面，将多肽与从中回收其的生物体和培养基的一些可溶性组分分离。可通过单元操作过滤、沉淀或色谱法中的一种或多种来纯化(即，分离)多肽。

相应地，可纯化多肽，使得仅存在少量的其他蛋白，特别是其他多肽。如本文所用的术语“纯化的”可指去除存在于多肽来源的细胞中的其他组分，特别是其他蛋白并且最特别是其他酶。多肽可以是“基本上纯的”，即不含来自产生其的生物体(例如，用于重组产生多肽的宿主生物体)的其他组分。在一个方面，按制剂中存在的总多肽材料的重量计，多肽是至少40％纯的。在一个方面，按制剂中存在的总多肽材料的重量计，多肽是至少50％、60％、70％、80％或90％纯的。如本文所用，“基本上纯的多肽”可表示含有按重量计至多10％、优选地至多8％、更优选地至多6％、更优选地至多5％、更优选地至多4％、更优选地至多3％、甚至更优选地至多2％、最优选地至多1％并且甚至最优选地至多0.5％的多肽与其天然或重组缔合的其他多肽材料的多肽制剂。

因此，优选的是按制剂中存在的总多肽材料的重量计，基本上纯的多肽是至少92％纯的、优选地至少94％纯的、更优选地至少95％纯的、更优选地至少96％纯的、更优选地至少97％纯的、更优选地至少98％纯的、甚至更优选地至少99％纯的、最优选地至少99.5％纯的。本发明的多肽优选地是基本上纯的形式(即，制剂基本上不含与其天然或重组缔合的其他多肽材料)。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来实现。

重组：术语“重组”以其常规含义使用，是指对核酸序列进行操纵(例如，切割和重接)以形成与在自然界中发现的序列群不同的序列群。术语重组指已从其天然状态修饰的细胞、核酸、多肽或载体。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与在自然界中发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。术语“重组”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。

回收：术语“回收(recover或recovery)”是指从选自细胞、核酸或其他指定材料的列表的至少一种发酵液组分中去除多肽，例如通过以下方法从全发酵液或从无细胞发酵液中回收多肽：通过多肽晶体收获、通过过滤(例如，深度过滤(通过使用助滤剂或填充过滤介质、箱式过滤器中的布过滤、转鼓过滤、鼓过滤、旋转真空鼓过滤、烛式过滤器、水平叶过滤器或类似物、在框架式或模块化装置中使用片状或垫式过滤)或膜过滤(使用板过滤、模块过滤、烛式过滤、微过滤、横流、动态横流或死端操作中的超滤))或者通过离心(使用卧式离心机、圆盘堆式离心机、水式漩涡分离器(hyrdo cyclone)或类似物)或者通过沉淀多肽并使用相关的固-液分离方法以通过使用粒度分级分离从肉汤培养基中收获多肽。回收涵盖多肽的分离和/或纯化。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunschalgorithm)(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16：276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定-nobrief选项。Needle标记的“最长同一性”的输出计算如下：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人，2000，同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。Needle标记的“最长同一性”的输出计算如下：

(相同的核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

信号肽：“信号肽”是附接至蛋白质的N-末端部分的氨基酸序列，其促进蛋白质分泌到细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式缺乏信号肽，该信号肽在分泌过程中被切除。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个核苷酸从成熟多肽编码序列的5′端和/或3′端缺失的多核苷酸；其中子序列编码具有脱酰胺酶抑制剂活性的片段。

热解折叠温度：术语“热解折叠温度”，也称为“解链温度”、“T_m”、或“中点解折叠温度”，意指其中大约50％的蛋白质被解折叠的温度。典型地，折叠蛋白质的级分在室温下是优势的(>99.999％)，并且随着温度接近解链温度(T_m)而降低。在T_m处，约50％的分子处于折叠状态，并且约50％处于解折叠状态。在温度高于T_m时，解折叠状态变成优势种(>50％)。确定包含本发明的抑制剂的脱酰胺酶/抑制剂复合物的热解折叠温度的优选方法是nanoDSF。使用nanoDSF，可以在330nm、350nm、和/或以330nm/350nm的比率进行T_m的确定，其中T_m等于一阶导数的拐点(IP)的温度。在拐点处，一阶导数达到局部最大值或最小值，并且二阶导数具有孤立的零点。对于本发明，T_m或热解折叠温度是通过nanoDSF在330nm处确定的一阶导数的拐点(IP)的温度，如实例2中所述。

用于确定热解折叠温度的其他方法是如Current Protocols in ProteinScience：“Analysis of protein stability and ligand interactions by thermalshift assay”[蛋白质科学的当前方案：“通过热位移测定的蛋白质稳定性和配体相互作用的分析”](K.Huynh和C.L Partch，2015)所描述的热位移测定，或描述于Encyclopedia ofIndustrial Biotechnology[工业生物技术百科全书]：“Proteins：Thermal Unfolding”[蛋白质：热解折叠](R.Lonescu和L Shi，2009)中的方法。

热解折叠代表了评估蛋白质稳定性的重要工具。为了评估蛋白质偏好以维持其折叠(活性)构象，将蛋白质暴露于增加水平的变性应激(温度)中，并且基于产生解折叠蛋白质的显著级分所需的应激水平来确定蛋白质稳定性。影响热稳定性的因素包括但不限于，蛋白质结构、配体或赋形剂的存在、抑制剂与酶之间的结合强度、以及溶剂条件。

变体：术语“变体”意指具有脱酰胺酶抑制剂活性的、在一个或多个位置处包含人为突变(即取代、插入(包括延伸)和/或缺失(例如截短))的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指与占据一个位置的氨基酸相邻并紧接其后添加1-5个氨基酸(例如，1-3个氨基酸，特别是1个氨基酸)。

野生型：提及氨基酸序列或核酸序列时术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。

具体实施方式

具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽

本发明涉及具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

(a)与SEQ ID NO：2具有至少60％氨基酸序列同一性的多肽；

(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段。

在一个方面，具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽与SEQ ID NO：2具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％氨基酸序列同一性。

该多肽优选地包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

多肽可以具有一个或多个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸，例如，1-20个氨基酸、1-10个氨基酸、或1-5个氨基酸。

在另一个方面，该多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列基序：F[F/Y][I/L/V][F/Q/S][E/K/R]；L[I,T]WY[D,H,K,N]；G[I,M]S[A,P,Q]Q；[D,H,K,N,S][I,L][G,V][I,V][D,E]；[N,H][I,L,M,V,Q][I,V][K,R,Q][E,I,Q]；[D/N][P/S][D/E][H/K/N/Q/R][A/P/S]；及其组合。

在另一个方面，该多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列基序：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及其组合。

在另一个方面，该多肽通过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加衍生自SEQ IDNO：2。在一些实施例中，该多肽是SEQ ID NO：2的在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入的变体。在一个方面，引入到SEQ ID NO：2的多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个。氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小段氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端的甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(诸如聚组氨酸段、抗原表位或结合模块)来促进纯化。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244：1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得分子的脱酰胺酶抑制剂活性以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271：4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如由如以下技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255：306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224：899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309：59-64。必需氨基酸的同一性也可以从与相关多肽的比对推断，和/或从与相关多肽或者多肽或蛋白质家族内与来自共同祖先的多肽/蛋白质(通常具有相似的三维结构、功能和显著的序列相似性)的序列同源性和保守催化机制推断。另外地或可替代地，蛋白质结构预测工具可以用于蛋白质结构建模以鉴定多肽的必需氨基酸和/或活性位点。参见例如Jumper等人,2021,“Highlyaccurate protein structure prediction with AlphaFold[利用α折叠进行高度准确的蛋白质结构预测]”,Nature[自然]596：583-589。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241：53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、CRISPR基因编辑、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30：10832-10837；US 5,223,409；WO 92/06204)，以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46：145；Ner等人,1988,DNA 7：127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17：893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是融合多肽。

在一个方面，该多肽是分离的。

在另一方面，该多肽是纯化的。

在另一个方面，本发明提供了一种方法，该方法用于

在又另一个方面，本发明提供了包含脱酰胺酶和根据本发明的脱酰胺酶抑制剂的组合物。

野生型脱酰胺酶抑制剂多肽的来源

野生型脱酰胺酶抑制剂多肽可以从任何属的微生物(供体菌株)中获得。优选地，野生型脱酰胺酶抑制剂多肽是从金黄杆菌属物种获得的。

出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已插入本发明的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

在一个实施例中，该野生型脱酰胺酶抑制剂多肽是从金黄杆菌属物种获得的。

可以从来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接获得自天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)的DNA样品中鉴定和获得野生型脱酰胺酶抑制剂多肽。用于从天然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过利用本领域的普通技术人员已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Davis等人,2012,Basic Methodsin Molecular Biology[分子生物学的基本方法],Elsevier[爱思唯尔公司])。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，如本文所述。

该多核苷酸可以通过引入不导致该多肽的氨基酸序列变化，但对应于意图用于产生该酶的宿主生物体的密码子使用的核苷酸取代来突变，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来突变。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如，Ford等人,1991,Protein Expression and Purification[蛋白质表达与纯化]2：95-107。

在一个方面，该多核苷酸是分离的。

在另一方面，该多核苷酸是纯化的。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可用多种方式操纵多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

启动子

控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。

用于指导本发明的多核苷酸在细菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例描述于Sambrook等人，1989,Molecular Cloning：ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor Lab.[冷泉港实验室]、NY、Davis等人,2012,同上、和Song等人,2016,PLOS One[公共科学图书馆综合]11(7)：e0158447中。

用于指导本发明的多核苷酸在丝状真菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例是获得自曲霉属、镰孢属、根毛霉属(Rhizomucor)和木霉属细胞的启动子，诸如描述于以下中的启动子：Mukherjee等人,2013,“Trichoderma：Biology and Applications[木霉属：生物学和应用]”中以及Schmoll和2016,“Gene Expression Systems inFungi：Advancements and Applications[真菌中的基因表达系统：进展和应用]”,FungalBiology[真菌生物学]。

对于在酵母宿主中的表达，有用的启动子的实例由以下描述：Smolke等人,2018,“Synthetic Biology：Parts,Devices and Applications”[合成生物：零件，装置和应用文件](第6章：Constitutive and Regulated Promoters in Yeast：How to Design andMake Use of Promoters in S.cerevisiae[酵母中的组成型和调节型启动子：如何设计和利用酿酒酵母中的启动子])以及Schmoll和2016,“Gene ExpressionSystems in Fungi：Advancements and Applications[真菌中的基因表达系统：进展和应用]”,Fungal Biology[真菌生物学]。

终止子

控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3'末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子均可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子可获得自以下基因：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子可获得自曲霉属或木霉属物种，诸如获得自黑曲霉葡糖淀粉酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I和里氏木霉内切葡聚糖酶I的基因，诸如描述于以下中的终止子：Mukherjee等人,2013,“Trichoderma：Biology andApplications[木霉属：生物学和应用]”中以及Schmoll和2016,“GeneExpression Systems in Fungi：Advancements and Applications[真菌中的基因表达系统：进展和应用]”,Fungal Biology[真菌生物学]。

酵母宿主细胞的优选终止子可获得自以下基因：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。其它酵母宿主细胞有用的终止子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8：423-488描述。

mRNA稳定剂

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其提高该基因的表达。

合适的mRNA稳定子区域的实例获得自苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,J.Bacteriol.[细菌学杂志]177：3465-3471)。

真菌细胞的mRNA稳定子区域的实例描述于Geisberg等人,2014,Cell[细胞]156(4)：812-824以及Morozov等人,2006,Eukaryotic Cell[真核细胞]5(11)：1838-1846中。

前导序列

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译而言重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的5'末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

细菌宿主细胞的合适前导序列由Hambraeus等人,2000,Microbiology[微生物学]146(12)：3051-3059以及Kaberdin和2006,FEMS Microbiol.Rev.[FEMS微生物学综述]30(6)：967-979描述。

丝状真菌宿主细胞的优选前导序列可获得自以下基因：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。

酵母宿主细胞的合适的前导序列可获得自以下基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

多腺苷酸化序列

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即可操作地连接到多核苷酸的3'-末端的序列，该序列在转录时被宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化获得自以下基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15：5983-5990描述。

信号肽

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端本身可以含有在翻译可读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可含有对于编码序列是异源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要异源信号肽编码序列。可替代地，异源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA的基因的信号肽编码序列。另外的信号肽由Freudl,2018,Microbial Cell Factories[微生物细胞工厂]17：52描述。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶，诸如由Xu等人,2018,Biotechnology Letters[生物技术快报]40：949-955描述的信号肽。

酵母宿主细胞的有用信号肽获得自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上描述。

调节序列

还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真菌系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。

转录因子

控制序列也可以是转录因子，即编码多核苷酸特异性DNA结合多肽的多核苷酸，其通过与特定多核苷酸序列结合来控制遗传信息从DNA到mRNA的转录速率。转录因子可单独发挥作用和/或与复合物中的一种或多种其他多肽或转录因子一起通过促进或阻断RNA聚合酶的募集而发挥作用。转录因子的特征在于包含至少一个DNA结合结构域，该结合结构域通常附接到与由转录因子调节的遗传元件相邻的特定DNA序列。转录因子可直接(即通过与其启动子结合来激活编码目的蛋白的基因的转录)或间接(即诸如通过与另外的转录因子(其调节编码目的蛋白的基因的转录)的启动子结合来激活另外的转录因子的转录)调节目的蛋白的表达。真菌宿主细胞的合适转录因子描述于WO 2017/144177中。原核宿主细胞的合适的转录因子描述于Seshasayee等人,2011,Subcellular Biochemistry[亚细胞生物化学]52：7-23以及Balleza等人,2009,FEMS Microbiol.Rev.[FEMS微生物学综述]33(1)：133-151中。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码多肽的多核苷酸在这样的位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起该多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。而且，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的至少一个元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，载体可依赖于编码多肽的多核苷酸序列或用于通过同源重组(诸如同源定向修复(HDR))或非同源重组(诸如非同源末端连接(NHEJ))整合到基因组中的载体的任何其他元件。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体能够在讨论中的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以提高多肽的生产。例如，将2个或3个或4个或5个或更多个拷贝插入宿主细胞。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的生产。

将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，使得构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。该多肽对于重组宿主细胞可以是天然的或异源的。此外，该一个或多个控制序列中的至少一个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸可以是异源的。重组宿主细胞可包含本发明的多核苷酸的单拷贝或至少两个拷贝，例如三个、四个、五个或更多个拷贝。

宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的多肽的任何微生物细胞，例如原核细胞或真菌细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、以及链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、以及脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。在一个实施例中，该芽孢杆菌属细胞是解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌细胞。

出于本发明的目的，芽孢杆菌类/属/种应如Patel和Gupta,2020,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.[国际系统与进化微生物学杂志]70：406-438中所述的进行定义。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)以及马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

用于将DNA引入原核宿主细胞中的方法是本领域熟知的，并且可以使用任何合适的方法，包括但不限于原生质体转化、感受态细胞转化、电穿孔、接合、转导，其中DNA作为线性化或环状多核苷酸引入。本领域技术人员将能够容易地根据例如属来确定用于将DNA引入给定原核细胞中的合适方法。用于将DNA引入原核宿主细胞中的方法例如描述于Heinze等人,2018,BMC Microbiology[BMC微生物学]18：56、Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98：6289-6294、Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物方法杂志]64：391-397以及Donald等人,2013,J.Bacteriol.[细菌学杂志]195(11)：2612-2620中。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌词典]，第8版，1995，CABInternational[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥]中定义的)。

真菌细胞可通过涉及原生质体介导的转化、土壤杆菌介导的转化、电穿孔、基因枪方法和冲击波介导的转化的过程(如Li等人,2017,Microbial Cell Factories[微生物细胞工厂]16：168中所综述)以及描述于EP 238023、Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81：1470-1474；Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物技术]6：1419-1422以及Lubertozzi和Keasling,2009,Biotechn.Advances[生物技术进展]27：53-75中的程序来进行转化。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入真菌宿主细胞中的任何方法，并且DNA可以作为线性化或环状多核苷酸引入。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于不完全菌(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。出于本发明的目的，酵母应如Biology and Activities ofYeast[酵母的生物学和活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所述的进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。在一个优选的实施例中，该酵母宿主细胞是毕赤酵母属(Pichia)或形式酵母属(Komagataella)细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞(法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii))。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等人,1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌的特征一般在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(诸如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。在一个优选的实施例中，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属、木霉属或镰孢属细胞。在一个进一步优选的实施例中，该丝状真菌宿主细胞是黑曲霉、米曲霉、镶片镰孢菌或里氏木霉细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

在一个方面，该宿主细胞是分离的。

在另一方面，该宿主细胞是纯化的。

在又另一个方面，该宿主细胞进一步包含展现出脱酰胺酶活性的共表达多肽。在一个相关的方面，本发明还涉及一种产生具有脱酰胺酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生具有脱酰胺酶活性的多肽的条件下，培养重组宿主细胞(包含展现出脱酰胺酶活性的共表达多肽)；优选地，该方法进一步包括回收具有脱酰胺酶活性的多肽。对具有脱酰胺酶活性的多肽的这种回收可以包括渗滤步骤。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及任选地(b)回收该多肽。

宿主细胞是在适用于使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下通过摇瓶培养或者在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或基于固态和/或微载体的发酵)来培养细胞。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不被分泌，则可以从细胞裂解物中将其回收。

可使用本领域已知的对多肽特异的方法来检测多肽，包括但不限于使用特异性抗体、酶产物形成、酶底物消失或者测定多肽的相对活性或比活性的测定。

可以使用本领域已知的方法从培养基中回收多肽，这些方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收包含多肽的全发酵液。在另一方面，回收包含多肽的无细胞发酵液。

多肽可以通过本领域已知的多种程序来进行纯化，以获得基本上纯的多肽和/或多肽片段(参见例如，Wingfield,2015,Current Protocols in Protein Science[蛋白科学的最新方案]；80(1)：6.1.1-6.1.35；Labrou,2014,Protein Downstream Processing[蛋白下游加工],1129：3-10)。

在可替代的方面，不回收多肽。

固体配制品

本发明还涉及包含本发明的多肽的酶颗粒/粒子。在一个实施例中，该颗粒包含核心以及任选地包围该核心的一个或多个包衣(外层)。

核心的直径(测量为当量球径(基于体积的平均粒度))可以是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。可以使用激光衍射诸如使用马尔文帕纳科公司(Malvern)Mastersizer和/或在ISO13320(2020)下描述的方法来测定作为当量球径测量的核心直径。

在一个实施例中，该核心包含具有本发明的脱酰胺酶抑制剂活性的多肽。

该核心可以包括另外的材料如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、粘度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。

该核心可以包括粘合剂，例如合成聚合物、蜡、脂肪或碳水化合物。

该核心典型地作为均匀的共混物可以包括多价阳离子的盐、还原剂、抗氧化剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲剂组分。

该核心可以包含惰性粒子，其中多肽被吸附到该惰性粒子之内，或者被施加(例如通过流化床包衣)到该惰性粒子的表面上。

该核心的直径可以是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

该核心可以被至少一种包衣包围，例如以改善储存稳定性、以减少在处理过程中的粉尘形成或用于着色该颗粒。任选的一种或多种包衣可包括盐包衣或其他适合的包衣材料，诸如聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)和聚乙烯醇(PVA)。

可按核心的重量计以至少0.1％(例如，至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％或至少15％)的量施加包衣。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。

该包衣优选地是至少0.1μm厚，特别是至少0.5μm、至少1μm或至少5μm厚。在一些实施例中，该包衣的厚度低于100μm，诸如低于60μm或低于40μm。

该包衣应通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应被理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得核心单元具有极少或没有未包衣的区域。层或包衣特别应在厚度上是均匀的。

该包衣可以进一步含有其他本领域已知的材料，例如填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或粘合剂，例如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。

盐包衣可以包含按重量计至少60％的盐，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

为了提供可接受的保护，该盐包衣优选地是至少0.1μm厚，例如至少0.5μm、至少1μm、至少2μm、至少4μm、至少5μm或至少8μm。在一个具体的实施例中，该盐包衣的厚度低于100μm，诸如低于60μm或低于40μm。

盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中这些细粒子是少于50μm，例如少于10μm或少于5μm)中添加。

盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。该盐可以是水溶性的，特别地具有在20℃下在100g水中至少0.1g的溶解度，优选地至少0.5g/100g水，例如至少1g/100g水、例如至少5g/100g水。

该盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(少于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐例如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，例如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别地，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。

在包衣中的盐可以在20℃下具有超过60％的恒定湿度，特别是超过70％、超过80％或超过85％，或者它可以是此盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。盐包衣可以如WO00/01793或WO 2006/034710中所述。

合适的盐的特定实例是NaCl(CH₂₀℃＝76％)、Na₂CO₃(CH₂₀℃＝92％)、NaNO₃(CH₂₀℃＝73％)、Na₂HPO₄(CH₂₀℃＝95％)、Na₃PO₄(CH₂₅℃＝92％)、NH₄Cl(CH₂₀℃＝79.5％)、(NH₄)₂HPO₄(CH₂₀℃＝93,0％)、NH₄H₂PO₄(CH₂₀℃＝93.1％)、(NH₄)₂SO₄(CH₂₀℃＝81.1％)、KCl(CH₂₀℃＝85％)、K₂HPO₄(CH₂₀℃＝92％)、KH₂PO₄(CH₂₀℃＝96.5％)、KNO₃(CH₂₀℃＝93.5％)、Na₂SO₄(CH₂₀℃＝93％)、K₂SO₄(CH₂₀℃＝98％)、KHSO₄(CH₂₀℃＝86％)、MgSO₄(CH₂₀℃＝90％)、ZnSO₄(CH₂₀℃＝90％)和柠檬酸钠(CH₂₅℃＝86％)。其他实例包括NaH₂PO₄、(NH₄)H₂PO₄、CuSO₄、Mg(NO₃)₂和乙酸镁。

该盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，例如描述于WO 99/32595中。具体实例包括无水硫酸钠(Na₂SO₄)、无水硫酸镁(MgSO₄)、七水硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)、七水硫酸锌(ZnSO₄.7H₂O)、七水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.7H₂O)、六水硝酸镁(Mg(NO₃)₂(6H₂O))、二水柠檬酸钠以及四水乙酸镁。

优选地，作为盐溶液施加该盐，例如使用流化床。

包衣材料可以是蜡状包衣材料和成膜包衣材料。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。

颗粒可任选地具有一个或多个另外的包衣。适合的包衣材料的实例是聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)和聚乙烯醇(PVA)。具有多个包衣的酶颗粒的实例描述于WO 93/07263和WO 97/23606中。

该核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，例如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤出、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)和/或高剪切造粒。

用于制备核心的方法可见于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；C.E.Capes的Particle size enlargement[粒度增大]；1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔出版公司]中。制备方法包括已知的饲料和颗粒配制技术，例如，

(a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含多肽溶液以形成小液滴，在它们沿干燥塔下降的过程中干燥形成含多肽微粒状材料。用这种方法可以产生非常小的粒子(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant ScienceSeries[表面活性剂科学系列]；1998；71卷；140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。

(b)层状产品，其中多肽在预形成的惰性核心粒子周围包衣成层，其中通常在流化床装置中雾化含多肽溶液，在该流化床装置中预形成的核心粒子被流体化并且含多肽溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干多肽层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有希望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有希望尺寸的粒子。该类型的产品描述于例如，WO 97/23606中。

(c)吸收的核心粒子，其中不是将多肽在核心周围包衣成层，而是将多肽吸收到核心的表面上和/或表面中。这样的方法描述于WO 97/39116中。

(d)挤出或丸粒化的产品，其中将含多肽糊剂压成丸粒或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些丸粒。这样的粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压降。此外，当使用小开口时，非常高的挤出压力增加了多肽糊剂中的热发生，这对多肽是有害的(MichaelS.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；71卷；140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。

(e)喷射造粒产品，其中将含多肽粉末悬浮于熔化的蜡中，并将悬浮液喷射(例如通过转盘喷雾器)到冷却室中，在此冷却室中液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；71卷；140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。所获得的产品是多肽均匀分布在整个惰性材料中而不是集中在其表面上的产品。US 4,016,040和US 4,713,245描述了这种技术。

(f)混合器造粒产品，其中将含多肽液体添加到常规造粒组分的干燥粉末组合物中。将液体和粉末以适合的比例混合，并且随着液体的水分被吸收在干燥粉末中，干燥粉末的组分将开始粘附并凝聚，并且粒子将积聚，形成包含多肽的颗粒。这样的方法描述于US4,106,991、EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO 90/09440和WO 90/09428中。在该过程的特定方面，各种高剪切混合器可以用作造粒机。将由多肽、填料和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，从而产生所谓的T-颗粒。经强化的粒子更加坚固，并释放更少的酶粉尘。

(g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含有多肽的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产物过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小描述于Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版社]中。

(h)流化床造粒。流化床造粒涉及将微粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷射液体到流体化粒子上。被喷射的液滴击中的粒子湿润并发粘。发粘的粒子与其他粒子碰撞并附着到其上以形成颗粒。

(i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用在饲料或酶工业中用于干燥颗粒的其他已知的方法。干燥优选地在从25℃至90℃的产品温度下进行。对于一些多肽来说，重要的是包含多肽的核心在用盐包衣之前含有少量的水。如果在去除过量的水之前用盐包衣水敏性多肽，则过量的水将被截留在核心中并且可能对多肽的活性产生负面影响。干燥之后，这些核心优选地含有0.1％w/w-10％w/w的水。

无尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和US 4,661,452中所披露而生产，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。

颗粒可进一步包含一种或多种另外的酶，例如水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶。一种或多种另外的酶优选地选自由以下组成的组：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。然后，每种酶将存在于更多颗粒中，确保酶的更均匀分布，并且还由于不同的粒度而减少不同酶的物理分离。用于产生多酶共颗粒的方法披露于ip.com披露内容IPCOM000200739D中。

通过使用共颗粒配制多肽的另一个实例披露于WO 2013/188331中。

本发明还涉及根据EP 238216中披露的方法制备的受保护的多肽。

液体配制品

本发明还涉及包含本发明的多肽的液体组合物。该组合物可包含酶稳定剂(酶稳定剂的实例包括多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯基硼酸)))。

在一些实施例中，包括一种或多种填料或一种或多种运载体材料以增加这样的组合物的体积。合适的填料或运载体材料包括但不限于硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的合适的填料或运载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。这样的醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，这些组合物含有约5％至约90％的这样的材料。

在一方面，该液体配制品包含20％w/w-80％w/w的多元醇。在一个实施例中，该液体配制品包含0.001％w/w-2％w/w防腐剂。

在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：

(a)0.001％w/w-25％w/w的具有本发明的脱酰胺酶抑制剂活性的多肽；

(b)20％w/w-80％w/w的多元醇；

(c)任选地0.001％w/w-2％w/w防腐剂；以及

(d)水。

在另一个实施例中，本发明涉及液体配制品，其包含：

(b)0.001％w/w-2％w/w防腐剂；

(c)任选地20％w/w-80％w/w的多元醇；以及

(d)水。

优选地，上述两个实施例的该液体组合物进一步包含具有脱酰胺酶活性的多肽，例如，以0.001％w/w-25％w/w的量存在。

在另一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种配制剂，例如选自由以下组成的组的配制剂：多元醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、PVA、乙酸盐和磷酸盐，优选地选自由以下组成的组：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。在一个实施例中，这些多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)，更优选地选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)或其任何组合。

在另一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％多元醇(即多元醇的总量)，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇、或40％-60％多元醇。在一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％多元醇，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇、或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％多元醇(即多元醇的总量)，例如，25％-75％多元醇、30％-70％多元醇、35％-65％多元醇、或40％-60％多元醇，其中该多元醇选自由以下组成的组：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。

在另一个实施例中，该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，该液体配制品包含0.02％w/w-1.5％w/w防腐剂，例如0.05％w/w-1％w/w防腐剂或0.1％w/w-0.5％w/w防腐剂。在一个实施例中，该液体配制品包含0.001％w/w-2％w/w防腐剂(即，防腐剂的总量)，例如0.02％w/w-1.5％w/w防腐剂、0.05％w/w-1％w/w防腐剂、或0.1％w/w-0.5％w/w防腐剂，其中该防腐剂选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

在另一个实施例中，该液体配制品进一步包含一种或多种另外的酶，例如水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶和转移酶。一种或多种另外的酶优选地选自由以下组成的组：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液配制品或细胞组合物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵生产的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下温育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心除去微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一些实施例中，该发酵液配制品或细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一些实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一个方面，该组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一些实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物剂(例如，抑菌剂)，包括但不限于，山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他防腐剂和/或抗微生物剂。

细胞杀灭的全培养液或细胞组合物可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或细胞组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下温育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或细胞组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过描述于WO 90/15861或WO 2010/096673中的方法产生。

通过以下编号的实施例进一步定义本发明：

实施例1.一种具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

(a)与SEQ ID NO：2具有至少60％氨基酸序列同一性的多肽；

(b)通过在一个或多个位置处具有1-30个改变(例如，取代、缺失和/或插入)而衍生自SEQ ID NO：2的多肽；

(c)衍生自(a)或(b)的该多肽的多肽，其中N-和/或C-末端已通过添加一个或多个氨基酸而延伸；以及

(d)(a)、(b)或(c)的该多肽的片段。

实施例2.如实施例1所述的多肽，该多肽通过具有1-25个改变而衍生自SEQ IDNO：2。

实施例3.如实施例1所述的多肽，该多肽通过具有1-20个改变而衍生自SEQ IDNO：2。

实施例4.如实施例1所述的多肽，该多肽通过具有1-15个改变而衍生自SEQ IDNO：2。

实施例5.如实施例1所述的多肽，该多肽通过具有1-10个改变而衍生自SEQ IDNO；2。

实施例6.如实施例1所述的多肽，该多肽通过具有1-5个改变而衍生自SEQ ID NO：2。

实施例7.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中这些改变是取代、缺失和/或插入；优选地为取代。

实施例8.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中这些改变是取代。

实施例9.如实施例1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO：2具有至少70％氨基酸序列同一性。

实施例10.如实施例1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO：2具有至少80％氨基酸序列同一性。

实施例11.如实施例1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO：2具有至少90％氨基酸序列同一性。

实施例12.如实施例1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO：2具有至少95％氨基酸序列同一性。

实施例13.如实施例1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO：2具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性。

实施例14.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中N-和/或C-末端已通过添加1-20个氨基酸而延伸。

实施例15.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中N-和/或C-末端已通过添加1-10个氨基酸而延伸。

实施例16.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中N-和/或C-末端已通过添加1-5个氨基酸而延伸。

实施例17.如前述实施例中任一项所述的多肽，该多肽包含氨基酸序列基序F[F/Y][I/L/V][F/Q/S][E/K/R]。

实施例18.如前述实施例中任一项所述的多肽，该多肽包含氨基酸序列基序L[I,T]WY[D,H,K,N]。

实施例19.如前述实施例中任一项所述的多肽，该多肽包含氨基酸序列基序G[I,M]S[A,P,Q]Q。

实施例20.如前述实施例中任一项所述的多肽，该多肽包含氨基酸序列基序[D,H,K,N,S][I,L][G,V][I,V][D,E]。

实施例21.如前述实施例中任一项所述的多肽，该多肽包含氨基酸序列基序[N,H][I,L,M,V,Q][I,V][K,R,Q][E,I,Q]。

实施例22.如前述实施例中任一项所述的多肽，该多肽包含氨基酸序列基序[D/N][P/S][D/E][H/K/N/Q/R][A/P/S]。

实施例23.如前述实施例中任一项所述的多肽，该多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列基序：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及其组合。

实施例24.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶抑制剂活性将脱酰胺酶活性降低至少于90％活性。

实施例25.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶抑制剂活性将脱酰胺酶活性降低至少于80％活性。

实施例26.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶抑制剂活性将脱酰胺酶活性降低至少于70％活性。

实施例27.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶抑制剂活性将脱酰胺酶活性降低至少于60％活性。

实施例28.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶抑制剂活性将脱酰胺酶活性降低至少于50％活性。

实施例29.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶抑制剂活性将脱酰胺酶活性降低至少于40％活性。

实施例30.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶活性衍生自脱酰胺酶，该脱酰胺酶包含选自由以下组成的组的氨基酸序列基序：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及其组合。

实施例31.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶活性衍生自具有衍生自金黄杆菌属物种的脱酰胺酶活性的多肽。

实施例32.如前述实施例中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶活性衍生自如SEQID NO：4所示的多肽。

实施例33.一种编码如前述实施例中任一项所述的多肽的多核苷酸。

实施例34.如实施例33所述的多核苷酸，该多核苷酸是分离的和/或纯化的。

实施例35.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如实施例33所述的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

实施例36.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如实施例35所述的核酸构建体或表达载体。

实施例37.如实施例36所述的重组宿主细胞，其中该多肽与该重组宿主细胞是异源的。

实施例38.如实施例36或37所述的重组宿主细胞，其中该一个或多个控制序列中的至少一个与编码该多肽的多核苷酸是异源的。

实施例39.如实施例36-38中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如实施例33-35中任一项所述的多核苷酸的至少两个拷贝，例如三个、四个、或五个、或更多个拷贝。

实施例40.如实施例36-39中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是酵母重组宿主细胞，例如，假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞。

实施例41.如实施例36-39中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是丝状真菌重组宿主细胞，例如，枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞，特别是，泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、埃默森篮状菌、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

实施例42.如实施例36-39中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是原核重组宿主细胞，例如，选自由以下组成的组的革兰氏阳性细胞：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属细胞，或者选自由以下组成的组的革兰氏阴性细菌：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属细胞，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽疫亚种、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

实施例43.如实施例36-39中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

实施例44.如实施例36-43中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是分离的。

实施例45.如实施例36-44中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞是纯化的。

实施例46.如实施例36-45中任一项所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞进一步包含展现出脱酰胺酶活性的共表达多肽；优选地，该展现出脱酰胺酶活性的共表达多肽是如SEQ ID NO：4所示的多肽，或与SEQ ID NO：4具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性的多肽。

实施例47.一种产生如实施例1-32中任一项所述的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如实施例36-45中任一项所述的重组宿主细胞。

实施例48.如实施例47所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

实施例49.一种液体组合物，该液体组合物包含

(a)0.001％w/w-25％w/w的如实施例1-32中任一项所述的多肽，

(b)多元醇，优选地为20％w/w-80％w/w的多元醇，以及

(c)水。

实施例50.如实施例49所述的液体组合物，该液体组合物进一步包含展现出脱酰胺酶活性的多肽。

实施例51.如实施例49所述的液体组合物，该液体组合物进一步包含0.001％w/w-25％w/w的展现出脱酰胺酶活性的多肽。

实施例52.如实施例50或51所述的液体组合物，其中该展现出脱酰胺酶活性的多肽与如SEQ ID NO：4所示的多肽具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性。

实施例53.如实施例50-52中任一项所述的液体组合物，其中该展现出脱酰胺酶活性的多肽是如SEQ ID NO：4所示的多肽。

实施例54.一种产生具有脱酰胺酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该具有脱酰胺酶活性的多肽的条件下，培养如实施例46所述的重组宿主细胞。

实施例55.如实施例54所述的方法，该方法进一步包括回收该具有脱酰胺酶活性的多肽。

实施例56.如实施例55所述的方法，其中对该具有脱酰胺酶活性的多肽的回收包括渗滤。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

菌株

从2013年9月在瑞典Sibhult收集的土壤样品中分离金黄杆菌属物种-62563菌株。

实例1

脱酰胺酶活性

材料

来自地衣芽孢杆菌的谷氨酰内肽酶

FITC-PP-Dnp(FITC-Ahx-His-His-Gln-Ser-Ser-ED-Dnp)是来自TAG哥本哈根公司(TAG Copenhagen)，Kong Georgs Vej 12，DK-2000Frederiksberg(www.tagc.com)的定制合成底物分子，其中：

FITC是在大约490nm和520nm处的、具有激发和发射最大值的荧光素，

Ahx是氨基己酸，

ED是乙二胺。并且

Dnp是2,4-二硝基苯基(荧光素荧光淬灭剂)。

脱酰胺酶活性测定

该测定测量活性脱酰胺酶的(相对)活性。

将50μL脱酰胺酶样品转移至标准黑色96孔板中并添加：

20μL的0.25μg/mL FITC-PP-Dnp

50μL的50μg/mL谷氨酰内肽酶

130μL的100mM HEPES缓冲液(pH 7.0)，和

0.01％v/v Triton X洗涤剂。

使用Biotek Synergy H1荧光板读取器，使用发射/激发波长485nm/525nm测量荧光信号(RFU)30min。

使用取决于曲线形状(信号对时间)的可变时间间隔分析数据的初始速率。将每个样品的初始速率相对于具有完全活性的脱酰胺酶参照酶(由野生型供体菌株产生)的初始速率进行归一化。将活性测量为“起始速率％”，即样品分子相对于活性脱酰胺酶参照酶的初始速率的初始速率％。

当本发明的脱酰胺酶抑制剂(SEQ ID NO：2)以约1：1的比率(脱酰胺酶：抑制剂)添加至包含活性脱酰胺酶(SEQ ID NO：4)的样品中时，脱酰胺酶活性(起始速率％)显著降低。

实例2

纳米差示扫描荧光测定法(nanoDSF)-热解折叠温度

使用纳米差示扫描荧光测定法(nanoDSF)来评估脱酰胺酶/抑制剂复合物(使用本发明的脱酰胺酶抑制剂)的构象稳定性。将这些分子暴露于温度梯度中，如下所示。所得结构变化反映在荧光强度变化中，并且给出了温度稳定性的量度。脱酰胺酶抑制剂与脱酰胺酶的结合有助于分子的稳定性，因此nanoDSF热解折叠温度也给出了关于脱酰胺酶/抑制剂结合亲和力的信息。

在来自IMAC(固定化金属亲和色谱)柱；20mM磷酸钠；500mM氯化钠；500mM咪唑；pH7.4的洗脱缓冲液中接收His-Tag纯化的样品。

将60μL样品重复转移到黑底384孔板中，并且将板短暂离心以去除潜在的气泡。

使用来自纳米温度技术股份有限公司(NanoTemper Technologies GmbH)的、具有以下设置的Prometheus NT.Plex系统分析样品的热解折叠温度：

(i)温度扫描速率：3.3℃/分钟；以及

(ii)温度扫描间隔：20℃-95℃。

在运行期间，在经受温度梯度之前，将样品加载到毛细管(Prometheus NT.Plex-毛细作用片，标准品，目录号PR-AC002)中。通过PR.稳定性分析v.1.0.1软件分析生成的数据。基于330nm迹线(trace)的一阶导数对中点解折叠温度(T_m，℃)进行注释。在一些情况下，可以观察到多于一个T_m。在这些情况下，选择330nm处的一阶导数迹中的主峰作为样品的T_m。

实例3

脱酰胺酶/抑制剂复合物的热解折叠温度

使用如实例2中所述的nanoDSF程序，测量活性脱酰胺酶和相应的脱酰胺酶/抑制剂复合物的热解折叠温度。

表1.多肽的NanoDSF热解折叠温度。

Claims

1.一种具有脱酰胺酶抑制剂活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

(a)与SEQ ID NO:2具有至少60％氨基酸序列同一性的多肽；

(b)通过在一个或多个位置处具有1-30个改变(例如，取代、缺失和/或插入)，例如1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22或23或24或25或26或27或28或29或30个改变，特别是取代而衍生自SEQ ID NO:2的多肽；

(d)(a)、(b)或(c)的该多肽的片段。

2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列基序：F[F/Y][I/L/V][F/Q/S][E/K/R]；L[I,T]WY[D,H,K,N]；G[I,M]S[A,P,Q]Q；[D,H,K,N,S][I,L][G,V][I,V][D,E]；[N,H][I,L,M,V,Q][I,V][K,R,Q][E,I,Q]；[D/N][P/S][D/E][H/K/N/Q/R][A/P/S]；及其组合。

3.如权利要求1所述的多肽，该多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列基序：SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13及其组合。

4.如权利要求1所述的多肽，该多肽包含SEQ ID NO:2、基本上由SEQ ID NO:2组成、或由SEQ ID NO:2组成。

5.如前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该脱酰胺酶抑制剂活性将脱酰胺酶活性降低至少于90％活性；优选地，该脱酰胺酶抑制剂活性将如SEQ ID NO:4所示的多肽的脱酰胺酶活性降低至少于90％。

6.一种编码如前述权利要求中任一项所述的多肽的多核苷酸。

7.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求6所述的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

8.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求7所述的核酸构建体或表达载体。

9.一种产生如权利要求1-5中任一项所述的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求8所述的重组宿主细胞。

10.一种液体组合物，该液体组合物包含

(a)0.001％w/w-25％w/w的如权利要求1-5中任一项所述的多肽，

(b)多元醇，以及

(c)水。

11.如权利要求10所述的液体组合物，该液体组合物进一步包含展现出脱酰胺酶活性的多肽；优选地，以0.001％w/w-25％w/w的量存在。

12.如权利要求11所述的液体组合物，其中该展现出脱酰胺酶活性的多肽是如SEQ IDNO:4所示的多肽，或与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性的多肽。

13.如权利要求8所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞进一步包含展现出脱酰胺酶活性的共表达多肽；优选地，该展现出脱酰胺酶活性的共表达多肽是如SEQ ID NO:4所示的多肽，或与SEQ ID NO:4具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性的多肽。

14.一种产生具有脱酰胺酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该具有脱酰胺酶活性的多肽的条件下，培养如权利要求13所述的重组宿主细胞。

15.如权利要求14所述的方法，该方法进一步包括回收该具有脱酰胺酶活性的多肽。

16.如权利要求15所述的方法，其中对该具有脱酰胺酶活性的多肽的回收包括渗滤。