CN108368528A - 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及葡糖淀粉酶变体，所述变体具有增加的比活性和/或通过TSA测量的至少0.5摄氏度增加的解链温度，并且进一步地其中所述变体与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用所述变体的方法。
Description
对序列表的引用
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发明背景
技术领域
本发明涉及葡糖淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。还描述了本发明的葡糖淀粉酶用于淀粉转化以产生发酵产物(例如乙醇)和糖浆(例如葡萄糖)的用途。本发明还涉及包含本发明的葡糖淀粉酶变体的组合物。
相关领域说明
葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。葡糖淀粉酶由若干丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉属(Aspergillus)的那些在商业上最为重要。
在商业上，葡糖淀粉酶用于将已经由α-淀粉酶部分水解的含淀粉的材料转化成葡萄糖。然后可以使用一种发酵有机体将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，和更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素和其他难以合成生产的化合物。发酵过程通常还用于可食用酒精(例如，啤酒和酒)工业、乳制品(例如，在酸乳和奶酪的生产中)工业中。
最终产物还可以是糖浆。例如，最终产物可以是葡萄糖，但是还可以被葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎均等的葡萄糖与果糖组成的一种混合物。这种混合物或进一步富含果糖的一种混合物是全世界商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。
本发明的目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且这些多肽和多核苷酸在发酵产物的生产过程(例如乙醇生产过程)中提供高产量。
WO 2011/068803披露了从真菌粘褶菌，特别是从篱边粘褶菌和密粘褶菌分离的葡糖淀粉酶。
本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。
WO 2014/177546和WO 2016/062875披露了具有增加的热稳定性和增加的比活性的密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)的葡糖淀粉酶变体。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S2、V3、D4、S5、S8、S9、I13、K15、V18、L19、N25、S27、K28、S30、V36、V37、T43、D45、S57、V59、F60、I71、S73、T74、L77、D82、D83、V85、T86、E88、L91、S95、P97、T103、D114、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、S155、N156、L157、W158、P159、I160、Q162、V169、S170、S175、T176、Y177、D184、S186、R199、A202、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、Y231、P234、S235、Y238、T240、T243、G244、G245、G246、R247、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A270、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、A302、S303、N304、T309、E314、S316、Q318、G319、T326、V330、N339、E342、S343、E348、S351、T352、Q359、S362、G363、V364、T365、A366、S371、S372、T378、S381、I383、N385、F386、A392、N394、K396、Y408、K410、D412、S414、S417、V419、A426、S427、E433、A434、N436、N437、T438、Q439、G442、A446、L448、V450、N470、E472、V474、W475、N478、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、S501、A502、T506、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、N528、A530、E534、D536、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、S548、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在第二方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S2、V3、D4、S5、S8、S9、G11、I13、K15、A16、V18、L19、N25、S27、S30、A32、A34、V36、V37、S44、S57、V59、F60、Y67、T68、I71、D72、S73、T74、S75、S76、L77、R78、D82、D83、F84、V85、T86、N90、L91、Q93、S95、L101、T102、T103、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、Y152、V153、T154、S155、L157、W158、P159、I160、Q162、N163、S170、S175、T176、Y177、S186、R199、A202、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、S215、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、P234、S235、Y238、T240、T243、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、A270、A271、K279、S282、L284、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、A302、S303、N304、S316、G319、T326、V330、N339、E342、S343、Q344、E348、S351、Q359、S362、G363、T365、A366、S371、S372、T378、S381、I383、F386、A392、N394、K396、N401、K410、D412、S414、S417、V419、D420、E433、N437、T438、Q439、F440、G442、A446、N470、E472、V474、W475、N478、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、S501、A502、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、A530、E534、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.1的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。
本发明还进一步涉及包括本发明的变体葡糖淀粉酶的组合物。
在另一个方面，本发明涉及该变体葡糖淀粉酶用于生产糖浆或发酵产物的用途。
仍在另一个方面，本发明涉及一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：
(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉的材料液化；
(b)使该液化的材料糖化；以及
(c)使用一种发酵有机体进行发酵；
其中使用本发明的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(b)。
在另一个方面，本发明涉及由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：
(a)在低于含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉的材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵，
其中使用本发明的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(a)。
在进一步的实施例中，本发明涉及由含淀粉的材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉的材料液化；(b)在本发明的变体葡糖淀粉酶的存在下，使液化的材料糖化。
在另一个实施例中，本发明涉及由含淀粉的材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：在本发明的变体葡糖淀粉酶的存在下，在低于含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉的材料糖化。
定义
葡糖淀粉酶：术语“葡糖淀粉酶”(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)被定义为催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的一种酶。出于本发明的目的，根据本文实例中所述的程序确定葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：5分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异通过突变天然产生，并且可能导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该DNA分子包含一种的多核苷酸，该的多核苷酸编码变体并且有效地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指与亲本相比改进的变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于增加的比活性、和增加的热稳定性。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其天然相关的一种或多种或所有天然存在的组分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸18至573。SEQ ID NO：2的氨基酸1至17是信号肽。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本文中成熟多肽还作为SEQ ID NO:3涵盖在内。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸52至1719。SEQID NO:1的核苷酸1至51编码信号肽。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接的：术语“可操作地连接的”意指将控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的构型。
亲本或亲本葡糖淀粉酶：术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”意指具有葡糖淀粉酶活性的任何多肽，对其进行变化以产生本发明的酶变体。
序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-非简化(–nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且计算如下：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle输出(使用-非简化(–nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有葡糖淀粉酶活性的一个多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:3的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的葡糖淀粉酶活性。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
野生型葡糖淀粉酶：术语“野生型”葡糖淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种葡糖淀粉酶。在一个实施例中，野生型葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)。在本披露中，其也被命名为Gs-AMG。
变体命名规则
出于本发明的目的，在SEQ ID NO:3中披露的多肽用于确定另一种葡糖淀粉酶中对应的氨基酸残基。将另一种葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:3中所披露的多肽中的任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar，2004，Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma，2002，NucleicAcids Research[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人，2005，Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh，2007，Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人，2009，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:_39-64；Katoh和Toh，2010，Bioinformatics[生物信息学]26:_1899-1900)以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)。
当其他酶与SEQ ID NO:3的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可以使用搜索程序来获得，所述搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱图(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人，1997，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，甚至可以实现更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用了已接受的IUPAC单字母和三字母的氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”表示在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。将多个氨基酸的插入表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入氨基酸#1、插入氨基酸#2等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
| 亲本： | 变体： |
| 195 | 195 195a 195b |
| G | G-K-A |
多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”表示在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变。在可以在一个位置处引入不同的改变的情况下，这些不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明涉及具有相比于亲本葡糖淀粉酶改进的性质的葡糖淀粉酶变体。在具体的实施例中，亲本葡糖淀粉酶是源自篱边粘褶菌的葡糖淀粉酶，例如在本文中如SEQ ID NO:3披露的葡糖淀粉酶。在具体的实施例中，改进的性质选自增加的热稳定性，如在实例1中通过TSA测定所测量的解链温度的增加所测量的。在另一个具体的实施例中，所述改进的性质选自作为增加的改进因子(IF)确定的增加的比活性，如作为在实例1中所描述的通过阿卡波糖测定所确定的相对比活性测量的。IF的增加是相对于SEQ ID NO:3(其具有IF＝1.0)的野生型酶来计算。
变体
本发明提供葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S2、V3、D4、S5、S8、S9、I13、K15、V18、L19、N25、S27、K28、S30、V36、V37、T43、D45、S57、V59、F60、I71、S73、T74、L77、D82、D83、V85、T86、E88、L91、S95、P97、T103、D114、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、S155、N156、L157、W158、P159、I160、Q162、V169、S170、S175、T176、Y177、D184、S186、R199、A202、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、Y231、P234、S235、Y238、T240、T243、G244、G245、G246、R247、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A270、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、A302、S303、N304、T309、E314、S316、Q318、G319、T326、V330、N339、E342、S343、E348、S351、T352、Q359、S362、G363、V364、T365、A366、S371、S372、T378、S381、I383、N385、F386、A392、N394、K396、Y408、K410、D412、S414、S417、V419、A426、S427、E433、A434、N436、N437、T438、Q439、G442、A446、L448、V450、N470、E472、V474、W475、N478、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、S501、A502、T506、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、N528、A530、E534、D536、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、S548、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在具体的实施例中，所述葡糖淀粉酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1K、Q1R、S2E、S2K、S2L、S2P、S2R、V3L、V3G、V3R、D4R、D4S、D4G、D4A、D4W、S5L、S5V、S5G、S5C、S5R、S8Q、S8H、S8A、S8Y、S9C、S9Q、S9M、S9W、S9D、S9G、I13V、I13R、I13S、I13L、I13E、K15G、K15R、V18M、V18Q、L19G、L19F、N25S、N25A、S27A、S27L、S27G、S27V、S27C、K28C、K28R、S30Q、S30A、S30K、S30T、S30L、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、D45L、D45P、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59G、V59T、V59S、V59E、F60S、I71M、I71S、I71T、I71V、S73H、S73A、S73R、S73N、S73V、S73G、T74V、L77S、L77P、L77R、D82N、D82R、D82V、D82G、D83L、D83C、D83W、V85Q、V85G、V85P、T86R、T86V、E88Q、E88R、E88G、L91S、L91P、L91G、S95A、S95P、S95T、S95V、P97T、P97I、P97R、T103Y、T103A、T103G、D114G、D114N、D114M、D114R、D114C、S134P、S134A、S134V、S134W、S134D、S134H、S134L、S134G、L137W、L137S、L137A、L137V、L137G、L137D、L137R、L137P、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145A、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、S155C、S155P、S155R、S155G、S155A、N156I、N156A、N156V、N156R、N156T、N156K、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、I160A、I160G、I160N、I160T、I160R、I160V、Q162L、Q162V、Q162H、Q162P、Q162R、V169A、V169L、V169W、V169S、V169D、V169R、V169E、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、Y177H、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A202R、A202W、A202E、A202S、A202V、A203M、A203W、A203P、A203L、T206C、T206P、T206G、T206A、T206R、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、S212D、S212E、S212L、S212P、S212T、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、F227G、F227W、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、S235C、S235R、S235N、S235G、S235W、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、T243V、T243S、T243L、T243R、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、R247E、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A270L、A270M、A271V、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、S299P、S299C、S299M、S299L、S299T、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、A302G、A302L、A302C、A302R、A302V、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、S316T、S316L、S316G、S316F、S316R、S316P、S316V、S316Q、Q318L、Q318R、G319R、G319Q、G319P、G319A、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、V330S、V330L、V330P、V330R、V330A、V330G、N339P、N339A、N339T、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、E348W、E348F、E348P、E348V、E348G、E348M、S351P、S351C、S351G、S351R、S351L、S351W、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、S362P、S262R、S262G、S262M、G363R、G363T、G363P、V364A、V364C、V364E、V364S、V364G、V364L、T365S、T365G、T365W、T365L、T365H、A366D、A366T、A366P、A366R、A366H、S371A、S371G、S372A、S372E、S372C、S372L、S372R、T378G、T378L、T378D、T378H、T378A、T378P、S381K、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、N385R、N385W、N385S、N385G、N385D、F386S、F386W、F386Q、F386V、F386I、F386G、F386C、F386A、F386T、F386L、A392V、A392L、A392E、A392G、N394D、N394R、N394Y、N394W、N394E、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、Y408V、Y408E、Y408P、Y408S、Y408K、Y408L、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S414C、S414R、S414G、S414V、S414W、S414H、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、E433C、A434Q、A434G、N436S、N436P、N436D、N437K、N437R、N437T、N437P、T438E、T438G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、G442V、G442D、G442C、G442A、G442L、G442W、G442E、G442M、G442R、A446G、A446D、A446R、A446E、A446I、L448G、L448P、L448E、V450P、V450S、V450C、V450E、V450L、V450N、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、E472I、V474W、V474C、V474A、V474L、V474G、W475P、W475A、W475R、N478L、N478I、N478P、N478R、N478W、N478S、N478G、N478K、N478A、S484G、S484Y、S484P、S484A、S484N、V485A、V485W、V485K、V485G、V485R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、A487S、A487V、A487L、A487G、A487C、A487K、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、S501R、S501L、S501M、S501K、S501W、A502C、A502Q、A502W、A502G、A502V、T506A、T506P、T506V、I509E、I509D、I509S、I509F、I509W、I509R、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、N512Q、N512K、N512H、N512R、N512V、S516R、S516W、S516P、S516K、S516Y、S516C、A518D、A518G、A518Y、A518V、A518R、A518L、A518T、I519W、I519L、I519R、I519F、I519K、N527T、N527K、N527P、N527L、N528D、N528G、N528K、N528V、N528E、N528L、A530R、A530C、A530G、A530V、A530S、A530T、E534W、E534Q、E534C、E534V、E534G、E534R、E534F、E534K、D536G、D536R、D536W、D536H、D536K、D536N、D536M、D536C、D536V、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、N539M、N539R、N539P、N539A、I541A、I541T、I541V、I541G、I541N、A545R、A545T、A545V、A545L、S546P、S546G、S546C、S546E、S546N、G547D、G547S、G547V、S548P、S548W、S548L、S548G、S548T、N552V、N552E、N552F、N552A、N552R、N552G和T554Q、T554G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处取代，该组由以下组成：S2、V3、D4、S8、S9、I13、V18、L19、S27、K28、S30、V36、V37、T43、S57、V59、S73、T74、L77、D82、V85、T86、L91、S95、P97、D114、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、S155、N156、L157、W158、P159、I160、Q162、S170、S175、T176、Y177、D184、S186、R199、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、Y231、P234、S235、Y238、T240、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、S303、N304、T309、E314、S316、Q318、G319、T326、V330、N339、E342、S343、E348、T352、Q359、G363、V364、A366、S371、S372、T378、S381、I383、N385、F386、A392、N394、K396、Y408、K410、D412、S414、S417、V419、A426、S427、A434、N436、T438、Q439、G442、L448、V450、N470、E472、V474、W475、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、A502、T506、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、N528、A530、E534、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、S548、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.7摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在具体的实施例中，所述葡糖淀粉酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S2E、S2K、S2L、S2P、S2R、V3L、V3G、V3R、D4R、D4S、D4G、D4A、D4W、S8Q、S8H、S8A、S8Y、S9C、S9Q、S9M、S9W、S9D、S9G、I13V、I13R、I13S、I13L、I13E、V18M、V18Q、L19G、L19F、S27A、S27L、S27G、S27V、S27C、K28C、K28R、S30Q、S30A、S30K、S30T、S30L、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59G、V59T、V59S、V59E、S73H、S73A、S73R、S73N、S73V、S73G、T74V、L77S、L77P、L77R、D82N、D82R、D82V、D82G、V85Q、V85G、V85P、T86R、T86V、L91S、L91P、L91G、S95A、S95P、S95T、S95V、P97T、P97I、P97R、D114G、D114N、D114M、D114R、D114C、S134P、S134A、S134V、S134W、S134D、S134H、S134L、S134G、L137W、L137S、L137A、L137V、L137G、L137D、L137R、L137P、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145A、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、S155C、S155P、S155R、S155G、S155A、N156I、N156A、N156V、N156R、N156T、N156K、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、I160A、I160G、I160N、I160T、I160R、I160V、Q162L、Q162V、Q162H、Q162P、Q162R、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、Y177H、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、T206C、T206P、T206G、T206A、T206R、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、S212D、S212E、S212L、S212P、S212T、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、F227G、F227W、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、S235C、S235R、S235N、S235G、S235W、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A271V、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、S299P、S299C、S299M、S299L、S299T、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、S316T、S316L、S316G、S316F、S316R、S316P、S316V、S316Q、Q318L、Q318R、G319R、G319Q、G319P、G319A、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、V330S、V330L、V330P、V330R、V330A、V330G、N339P、N339A、N339T、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、E348W、E348F、E348P、E348V、E348G、E348M、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、G363R、G363T、G363P、V364A、V364C、V364E、V364S、V364G、V364L、A366D、A366T、A366P、A366R、A366H、S371A、S371G、S372A、S372E、S372C、S372L、S372R、T378G、T378L、T378D、T378H、T378A、T378P、S381K、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、N385R、N385W、N385S、N385G、N385D、F386S、F386W、F386Q、F386V、F386I、F386G、F386C、F386A、F386T、F386L、A392V、A392L、A392E、A392G、N394D、N394R、N394Y、N394W、N394E、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、Y408V、Y408E、Y408P、Y408S、Y408K、Y408L、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S414C、S414R、S414G、S414V、S414W、S414H、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、A434Q、A434G、N436S、N436P、N436D、T438E、T438G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、G442V、G442D、G442C、G442A、G442L、G442W、G442E、G442M、G442R、L448G、L448P、L448E、V450P、V450S、V450C、V450E、V450L、V450N、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、E472I、V474W、V474C、V474A、V474L、V474G、W475P、W475A、W475R、S484G、S484Y、S484P、S484A、S484N、V485A、V485W、V485K、V485G、V485R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、A487S、A487V、A487L、A487G、A487C、A487K、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、A502C、A502Q、A502W、A502G、A502V、T506A、T506P、T506V、I509E、I509D、I509S、I509F、I509W、I509R、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、N512Q、N512K、N512H、N512R、N512V、S516R、S516W、S516P、S516K、S516Y、S516C、A518D、A518G、A518Y、A518V、A518R、A518L、A518T、I519W、I519L、I519R、I519F、I519K、N527T、N527K、N527P、N527L、N528D、N528G、N528K、N528V、N528E、N528L、A530R、A530C、A530G、A530V、A530S、A530T、E534W、E534Q、E534C、E534V、E534G、E534R、E534F、E534K、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、N539M、N539R、N539P、N539A、I541A、I541T、I541V、I541G、I541N、A545R、A545T、A545V、A545L、S546P、S546G、S546C、S546E、S546N、G547D、G547S、G547V、S548P、S548W、S548L、S548G、S548T、N552V、N552E、N552F、N552A、N552R、N552G、T554Q和T554G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.7摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S2、S8、V18、K28、V36、V37、T43、S57、V59、S73、T74、T86、S95、P97、D114、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、S155、L157、W158、P159、I160、Q162、S170、S175、T176、Y177、D184、S186、R199、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、Y231、P234、Y238、T240、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、G300、S303、N304、T309、E314、Q318、T326、V330、E342、S343、E348、T352、Q359、S371、T378、I383、F386、N394、K396、Y408、K410、D412、S417、V419、A426、S427、A434、Q439、G442、L448、N470、E472、W475、V485、D486、S492、A493、D494、N495、I509、T510、I519、N527、P537、N538、S546、G547和T554，其中所述位置对应于在SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.9摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S2E、S2K、S2L、S2P、S2R、S8Q、S8H、S8A、S8Y、V18M、V18Q、K28C、K28R、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59G、V59T、V59S、V59E、S73H、S73A、S73R、S73N、S73V、S73G、T74V、T86R、T86V、S95A、S95P、S95T、S95V、P97T、P97I、P97R、D114G、D114N、D114M、D114R、D114C、S134P、S134A、S134V、S134W、S134D、S134H、S134L、S134G、L137W、L137S、L137A、L137V、L137G、L137D、L137R、L137P、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145A、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、S155C、S155P、S155R、S155G、S155A、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、I160A、I160G、I160N、I160T、I160R、I160V、Q162L、Q162V、Q162H、Q162P、Q162R、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、Y177H、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、T206C、T206P、T206G、T206A、T206R、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、S212D、S212E、S212L、S212P、S212T、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、F227G、F227W、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A271V、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、Q318L、Q318R、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、V330S、V330L、V330P、V330R、V330A、V330G、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、E348W、E348F、E348P、E348V、E348G、E348M、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、S371A、S371G、T378G、T378L、T378D、T378H、T378A、T378P、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、F386S、F386W、F386Q、F386V、F386I、F386G、F386C、F386A、F386T、F386L、N394D、N394R、N394Y、N394W、N394E、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、Y408V、Y408E、Y408P、Y408S、Y408K、Y408L、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、A434Q、A434G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、G442V、G442D、G442C、G442A、G442L、G442W、G442E、G442M、G442R、L448G、L448P、L448E、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、E472I、W475P、W475A、W475R、V485A、V485W、V485K、V485G、V485R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、I509E、I509D、I509S、I509F、I509W、I509R、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、I519W、I519L、I519R、I519F、I519K、N527T、N527K、N527P、N527L、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、S546P、S546G、S546C、S546E、S546N、G547D、G547S、G547V、T554Q和T554G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.9摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下各项组成：V18、K28、V36、V37、T43、S57、V59、S73、T86、S95、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、L157、W158、P159、S170、S175、T176、D184、S186、R199、A203、Q210、T211、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、Y231、P234、Y238、T240、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、G300、S303、N304、T309、E314、T326、E342、S343、T352、Q359、I383、K396、K410、D412、S417、V419、A426、S427、A434、Q439、N470、W475、D486、S492、A493、D494、N495、T510、P537、N538、G547和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少1.1摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：V18M、V18Q、K28C、K28R、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59G、V59T、V59S、V59E、S73H、S73A、S73R、S73N、S73V、S73G、T86R、T86V、S95A、S95P、S95T、S95V、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145A、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A271V、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、A434Q、A434G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、W475P、W475A、W475R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、G547D、G547S、G547V、T554Q和T554G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少1.1摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：K28、T43、S57、S73、S95、T139、L145、N149、Y152、V153、L157、W158、P159、S175、D184、S186、R199、A203、Q210、T211、Q213、V214、Y217、T218、T219、A221、D222、L224、Y231、P234、Y238、T240、G244、G246、S248、A252、T254、L255、Y262、A271、K279、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、N304、S343、T352、K410、D412、V419、S427、N470、W475、S492、A493和P537，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少1.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：K28C、K28R、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、S73H、S73A、S73R、S73N、S73V、S73G、S95A、S95P、S95T、S95V、T139D、T139P、T139V、L145C、L145D、L145G、L145V、L145A、L145S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、S175L、S175C、S175W、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、A271V、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、S343R、S343C、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、W475P、W475A、W475R、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W和P537D、P537M、P537W、P537G、P537E，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少1.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：K28、T43、S57、S95、T139、L145、N149、V153、L157、P159、S186、R199、A203、T211、V214、Y217、Y231、P234、Y238、T240、G244、G246、S248、T254、L255、A271、L284、V294、Y295、S296、K410、S492和A493，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少2.0摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：K28C、K28R、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A,、S95A、S95P、S95T、S95V、T139D、T139P、T139V、L145C、L145D、L145G、L145V、L145A、L145S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、A271V、A271W、A271Y、A271L、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、K410S、K410R、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D和A493W，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少2.0摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在具体的实施例中，所述葡糖淀粉酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1K、Q1R、S2E、S2K、S2L、S2P、S2R、V3L、V3G、V3R、D4R、D4S、D4G、D4A、D4W、S5L、S5V、S5G、S5C、S5R、S8Q、S8H、S8A、S8Y、S9C、S9Q、S9M、S9W、S9D、S9G、I13V、I13R、I13S、I13L、I13E、K15G、K15R、V18M、V18Q、L19G、L19F、N25S、N25A、S27A、S27L、S27G、S27V、S27C、K28C、K28R、S30Q、S30A、S30K、S30T、S30L、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、D45L、D45P、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59T、V59S、V59E、F60S、I71M、I71S、I71T、I71V、S73H、S73R、S73N、S73V、S73G、T74V、L77S、L77P、L77R、D82N、D82R、D82V、D82G、D83L、D83C、D83W、V85Q、V85G、V85P、T86R、T86V、E88Q、E88R、E88G、L91S、L91P、L91G、S95A、S95T、S95V、P97T、P97I、P97R、T103Y、T103A、T103G、D114G、D114N、D114M、D114R、D114C、S134P、S134A、S134V、S134W、S134D、S134H、S134L、S134G、L137W、L137S、L137A、L137V、L137G、L137D、L137R、L137P、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、S155C、S155P、S155R、S155G、S155A、N156I、N156A、N156V、N156R、N156T、N156K、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、I160A、I160G、I160N、I160T、I160R、I160V、Q162L、Q162V、Q162H、Q162P、Q162R、V169A、V169L、V169W、V169S、V169D、V169R、V169E、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、Y177H、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A202R、A202W、A202E、A202S、A202V、A203M、A203W、A203P、A203L、T206C、T206P、T206G、T206A、T206R、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、S212D、S212E、S212L、S212P、S212T、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、F227G、F227W、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、S235C、S235R、S235N、S235G、S235W、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、T243V、T243S、T243L、T243R、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、R247E、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A270L、A270M、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、S299P、S299C、S299M、S299L、S299T、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、A302G、A302L、A302C、A302R、A302V、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、S316T、S316L、S316G、S316F、S316R、S316P、S316V、S316Q、Q318L、Q318R、G319R、G319Q、G319P、G319A、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、V330S、V330L、V330P、V330R、V330A、V330G、N339P、N339A、N339T、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、E348W、E348F、E348P、E348V、E348G、E348M、S351P、S351C、S351G、S351R、S351L、S351W、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、S362P、S262R、S262G、S262M、G363R、G363T、G363P、V364A、V364C、V364E、V364S、V364G、V364L、T365S、T365G、T365W、T365L、T365H、A366D、A366T、A366P、A366R、A366H、S371A、S371G、S372A、S372E、S372C、S372L、S372R、T378G、T378L、T378D、T378H、T378A、T378P、S381K、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、N385R、N385W、N385S、N385G、N385D、F386S、F386W、F386Q、F386V、F386I、F386G、F386C、F386A、F386T、F386L、A392V、A392L、A392E、A392G、N394D、N394R、N394Y、N394W、N394E、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、Y408V、Y408E、Y408P、Y408S、Y408K、Y408L、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S414C、S414R、S414G、S414V、S414W、S414H、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、E433C、A434Q、A434G、N436S、N436P、N436D、N437K、N437R、N437T、N437P、T438E、T438G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、G442V、G442D、G442C、G442A、G442L、G442W、G442E、G442M、G442R、A446G、A446D、A446R、A446E、A446I、L448G、L448P、L448E、V450P、V450S、V450C、V450E、V450L、V450N、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、E472I、V474W、V474C、V474A、V474L、V474G、W475P、W475A、W475R、N478L、N478I、N478P、N478R、N478W、N478S、N478G、N478K、N478A、S484G、S484Y、S484P、S484A、S484N、V485A、V485W、V485K、V485G、V485R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、A487S、A487V、A487L、A487G、A487C、A487K、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、S501R、S501L、S501M、S501K、S501W、A502C、A502Q、A502W、A502G、A502V、T506A、T506P、T506V、I509E、I509D、I509S、I509F、I509W、I509R、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、N512Q、N512K、N512H、N512R、N512V、S516R、S516W、S516P、S516K、S516Y、S516C、A518D、A518G、A518Y、A518V、A518R、A518L、A518T、I519W、I519L、I519R、I519F、I519K、N527T、N527K、N527P、N527L、N528D、N528G、N528K、N528V、N528E、N528L、A530R、A530C、A530G、A530V、A530S、A530T、E534W、E534Q、E534C、E534V、E534G、E534R、E534F、E534K、D536G、D536R、D536W、D536H、D536K、D536N、D536M、D536C、D536V、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、N539M、N539R、N539P、N539A、I541A、I541T、I541V、I541G、I541N、A545R、A545T、A545V、A545L、S546P、S546G、S546C、S546E、S546N、G547D、G547S、G547V、S548P、S548W、S548L、S548G、S548T、N552V、N552E、N552F、N552A、N552R、N552G和T554Q、T554G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在具体实施例中，所述葡糖淀粉酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S2E、S2K、S2L、S2P、S2R、V3L、V3G、V3R、D4R、D4S、D4G、D4A、D4W、S8Q、S8H、S8A、S8Y、S9C、S9Q、S9M、S9W、S9D、S9G、I13V、I13R、I13S、I13L、I13E、V18M、V18Q、L19G、L19F、S27A、S27L、S27G、S27V、S27C、K28C、K28R、S30Q、S30A、S30K、S30T、S30L、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59T、V59S、V59E、S73H、S73R、S73N、S73V、S73G、T74V、L77S、L77P、L77R、D82N、D82R、D82V、D82G、V85Q、V85G、V85P、T86R、T86V、L91S、L91P、L91G、S95A、S95T、S95V、P97T、P97I、P97R、D114G、D114N、D114M、D114R、D114C、S134P、S134A、S134V、S134W、S134D、S134H、S134L、S134G、L137W、L137S、L137A、L137V、L137G、L137D、L137R、L137P、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、S155C、S155P、S155R、S155G、S155A、N156I、N156A、N156V、N156R、N156T、N156K、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、I160A、I160G、I160N、I160T、I160R、I160V、Q162L、Q162V、Q162H、Q162P、Q162R、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、Y177H、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、T206C、T206P、T206G、T206A、T206R、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、S212D、S212E、S212L、S212P、S212T、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、F227G、F227W、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、S235C、S235R、S235N、S235G、S235W、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、S299P、S299C、S299M、S299L、S299T、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、S316T、S316L、S316G、S316F、S316R、S316P、S316V、S316Q、Q318L、Q318R、G319R、G319Q、G319P、G319A、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、V330S、V330L、V330P、V330R、V330A、V330G、N339P、N339A、N339T、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、E348W、E348F、E348P、E348V、E348G、E348M、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、G363R、G363T、G363P、V364A、V364C、V364E、V364S、V364G、V364L、A366D、A366T、A366P、A366R、A366H、S371A、S371G、S372A、S372E、S372C、S372L、S372R、T378G、T378L、T378D、T378H、T378A、T378P、S381K、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、N385R、N385W、N385S、N385G、N385D、F386S、F386W、F386Q、F386V、F386I、F386G、F386C、F386A、F386T、F386L、A392V、A392L、A392E、A392G、N394D、N394R、N394Y、N394W、N394E、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、Y408V、Y408E、Y408P、Y408S、Y408K、Y408L、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S414C、S414R、S414G、S414V、S414W、S414H、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、A434Q、A434G、N436S、N436P、N436D、T438E、T438G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、G442V、G442D、G442C、G442A、G442L、G442W、G442E、G442M、G442R、L448G、L448P、L448E、V450P、V450S、V450C、V450E、V450L、V450N、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、E472I、V474W、V474C、V474A、V474L、V474G、W475P、W475A、W475R、S484G、S484Y、S484P、S484A、S484N、V485A、V485W、V485K、V485G、V485R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、A487S、A487V、A487L、A487G、A487C、A487K、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、A502C、A502Q、A502W、A502G、A502V、T506A、T506P、T506V、I509E、I509D、I509S、I509F、I509W、I509R、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、N512Q、N512K、N512H、N512R、N512V、S516R、S516W、S516P、S516K、S516Y、S516C、A518D、A518G、A518Y、A518V、A518R、A518L、A518T、I519W、I519L、I519R、I519F、I519K、N527T、N527K、N527P、N527L、N528D、N528G、N528K、N528V、N528E、N528L、A530R、A530C、A530G、A530V、A530S、A530T、E534W、E534Q、E534C、E534V、E534G、E534R、E534F、E534K、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、N539M、N539R、N539P、N539A、I541A、I541T、I541V、I541G、I541N、A545R、A545T、A545V、A545L、S546P、S546G、S546C、S546E、S546N、G547D、G547S、G547V、S548P、S548W、S548L、S548G、S548T、N552V、N552E、N552F、N552A、N552R、N552G、T554Q和T554G，其中所述位置对应于在SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.7摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的变体，该组由以下组成：S2E、S2K、S2L、S2P、S2R、S8Q、S8H、S8A、S8Y、V18M、V18Q、K28C、K28R、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59T、V59S、V59E、S73H、S73A、S73R、S73N、S73V、S73G、T74V、T86R、T86V、S95A、S95T、S95V、P97T、P97I、P97R、D114G、D114N、D114M、D114R、D114C、S134P、S134A、S134V、S134W、S134D、S134H、S134L、S134G、L137W、L137S、L137A、L137V、L137G、L137D、L137R、L137P、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、S155C、S155P、S155R、S155G、S155A、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、I160A、I160G、I160N、I160T、I160R、I160V、Q162L、Q162V、Q162H、Q162P、Q162R、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、Y177H、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、T206C、T206P、T206G、T206A、T206R、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、S212D、S212E、S212L、S212P、S212T、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、F227G、F227W、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、Q318L、Q318R、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、V330S、V330L、V330P、V330R、V330A、V330G、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、E348W、E348F、E348P、E348V、E348G、E348M、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、S371A、S371G、T378G、T378L、T378D、T378H、T378A、T378P、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、F386S、F386W、F386Q、F386V、F386I、F386G、F386C、F386A、F386T、F386L、N394D、N394R、N394Y、N394W、N394E、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、Y408V、Y408E、Y408P、Y408S、Y408K、Y408L、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、A434Q、A434G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、G442V、G442D、G442C、G442A、G442L、G442W、G442E、G442M、G442R、L448G、L448P、L448E、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、E472I、W475P、W475A、W475R、V485A、V485W、V485K、V485G、V485R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、I509E、I509D、I509S、I509F、I509W、I509R、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、I519W、I519L、I519R、I519F、I519K、N527T、N527K、N527P、N527L、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、S546P、S546G、S546C、S546E、S546N、G547D、G547S、G547V、T554Q和T554G，其中所述位置对应于在SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.9摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：V18M、V18Q、K28C、K28R、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59T、V59S、V59E、S73H、S73R、S73N、S73V、S73G、T86R、T86V、S95A、S95T、S95V、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、A434Q、A434G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、W475P、W475A、W475R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、G547D、G547S、G547V、T554Q和T554G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少1.1摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：K28C、K28R、T43K、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、S73H、S73R、S73N、S73V、S73G、S95A、S95T、S95V、T139D、T139P、T139V、L145C、L145D、L145G、L145V、L145S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、S175L、S175C、S175W、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A203M、A203W、A203P、A203L、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、S343R、S343C、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、W475P、W475A、W475R、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W和P537D、P537M、P537W、P537G、P537E，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少1.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含取代T43K，其中该位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置，并且其中该取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少2.0摄氏度、具体地至少3.0摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S2、V3、D4、S5、S8、S9、G11、I13、K15、A16、V18、L19、N25、S27、S30、A32、A34、V36、V37、S44、S57、V59、F60、Y67、T68、I71、D72、S73、T74、S75、S76、L77、R78、D82、D83、F84、V85、T86、N90、L91、Q93、S95、L101、T102、T103、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、Y152、V153、T154、S155、L157、W158、P159、I160、Q162、N163、S170、S175、T176、Y177、S186、R199、A202、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、S215、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、P234、S235、Y238、T240、T243、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、A270、A271、K279、S282、L284、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、A302、S303、N304、S316、G319、T326、V330、N339、E342、S343、Q344、E348、S351、Q359、S362、G363、T365、A366、S371、S372、T378、S381、I383、F386、A392、N394、K396、N401、K410、D412、S414、S417、V419、D420、E433、N437、T438、Q439、F440、G442、A446、N470、E472、V474、W475、N478、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、S501、A502、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、A530、E534、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.1的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1R、Q1L、Q1T、Q1G、Q1P、Q1K、Q1M、Q1F、Q1S、Q1A、Q1W、S2V、S2Q、S2E、S2D、S2P、S2A、S2T、S2L、S2R、S2K、S2W、S2G、V3G、V3L、V3I、V3A、V3E、D4R、D4C、D4S、D4G、D4N、D4V、D4W、D4F、D4A、S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S8A、S8W、S8R、S8L、S8Y、S8G、S8M、S8H、S8P、S8Q、S8V、S8C、S8E、S8K、S8T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、G11D、I13L、I13A、I13Q、I13S、I13D、I13R、I13M、I13V、I13G、I13Y、I13E、K15V、K15R、K15I、K15M、K15A、K15F、K15L、K15S、K15E、K15W、K15G、K15D、A16L、A16V、A16G、A16E、A16S、A16T、A16K、A16G、V18A、V18R、V18M、V18T、V18L、V18Q、V18I、L19S、L19A、L19K、L19V、L19C、L19H、L19W、L19F、L19R、N25W、N25Y、N25D、N25F、N25G、N25R、N25V、N25L、N25A、N25S、N25E、N25C、N25Q、S27A、S27W、S27H、S27V、S27T、S27C、S27G、S27E、S27L、S27F、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、A32D、A32E、A32S、A32V、A32R、A32G、A32M、A32T、A32C、A32K、A32W、A34W、A34R、A34L、A34Q、A34G、A34C、A34F、A34V、A34E、A34T、A34I、A34P、V36I、V36R、V36A、V36G、V36L、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、S44R、S44W、S44L、S44T、S44C、S44A、S44V、S44P、S44E、S57G、S57T、S57H、S57P、S57A、V59T、V59G、V59E、V59Q、V59L、V59R、V59A、F60L、F60S、F60V、F60A、F60I、Y67C、Y67N、Y67A、Y67G、Y67T、Y67V、Y67D、Y67H、Y67R、Y67F、Y67L、Y67P、Y67S、Y67M、T68K、T68C、T68A、T68P、T68R、T68Q、I71T、I71M、I71V、I71S、I71N、I71F、I71D、I71P、I71R、I71L、I71K、D72V、D72L、D72G、D72N、D72R、D72K、D72E、D72W、D72A、D72C、D72Y、D72S、D72Q、D72T、S73A、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、T74S、T74E、T74P、T74N、T74F、T74P、T74M、T74R、T74C、S75G、S75N、S75P、S75E、S75C、S75R、S75L、S75K、S75I、S75T、S76H、S76P、S76Q、S76E、L77S、L77Y、L77E、L77A、L77P、R78W、R78G、R78K、R78Q、R78T、R78A、R78C、R78M、R78E、D82V、D82G、D82R、D82N、D82E、D82C、D83L、D83C、D83W、D83A、D83R、D83G、D83V、D83S、D83E、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、T86C、T86R、T86G、T86W、T86D、T86V、T86S、T86A、N90G、N90E、N90T、N90P、N90C、L91H、L91P、L91F、L91V、L91R、Q93L、Q93M、Q93C、Q93H、Q93G、Q93R、Q93W、Q93D、Q93A、Q93N、Q93K、S95V、S95R、S95D、S95Y、S95P、S95G、S95Q、S95A、S95K、L101M、L101V、L101R、L101P、L101F、L101H、L101A、L101G、L101N、L101K、L101C、T102N、T102S、T102C、T102R、T102A、T102I、T102M、T102W、T102E、T102P、T102F、T103A、T103S、T103G、T103D、T103I、T103E、T103V、T103N、S134V、S134I、S134M、S134P、S134L、S134A、S134C、L137S、L137D、L137W、L137G、L137R、L137A、L137I、L137T、T139A、T139N、T139S、T139G、T139D、T139H、T139R、N142K、N142E、N142Q、N142R、N142G、N142H、N142W、N142A、L145S、L145W、L145N、L145C、L145V、L145R、L145D、S146V、S146G、S146L、S146T、S146A、S146C、S146P、S146F、S146R、S146W、N147K、N147E、N147S、N147F、N147T、N147I、N147D、N147P、N147Y、N147H、N147L、Y152V、Y152E、Y152L、Y152I、Y152A、Y152M、Y152R、Y152F、Y152G、V153R、V153Y、V153C、T154R、T154G、T154L、T154S、T154A、T154M、T154P、S155R、S155G、S155L、S155A、S155H、S155W、S155C、S155I、S155P、S155M、S155N、S155T、L157P、L157Q、L157V、L157M、L157R、W158R、W158E、W158C、W158K、W158L、W158G、P159S、P159R、P159V、P159Q、P159T、P159D、P159A、P159L、P159G、I160T、I160A、I160V、I160D、I160G、I160S、I160L、I160Y、I160N、I160F、Q162L、Q162K、Q162R、Q162S、Q162H、Q162P、Q162I、Q162V、N163D、N163G、N163R、N163T、N163I、N163Q、N163Y、N163K、N163H、N163W、N163A、N163S、S170A、S175W、S175R、S175T、S175C、T176S、T176R、T176L、T176A、T176W、T176I、Y177S、Y177T、Y177D、Y177V、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、R199K、R199V、R199A、R199M、R199N、R199W、R199T、R199E、A202S、A202T、A202Q、A202L、A202E、A202P、A202V、A202F、A202W、A202G、A203Q、A203K、A203W、A203R、A203V、A203L、A203M、A203T、A203E、A203G、A203S、A203P、T206I、T206S、T206W、T206V、T206A、T206P、T206G、T206R、Q210D、Q210R、Q210G、Q210A、Q210L、Q210H、Q210P、Q210V、Q210I、Q210C、T211P、T211R、T211S、T211D、T211Q、T211H、T211A、T211L、T211G、T211W、S212V、S212K、S212D、S212T、S212H、S212L、S212P、S212E、S212C、S212A、S212M、Q213Y、Q213D、Q213R、Q213N、Q213S、Q213W、Q213K、Q213L、Q213C、Q213P、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、Q220L、Q220P、Q220K、Q220R、Q220H、Q220E、A221V、A221T、A221E、A221G、A221P、D222E、D222M、D222A、D222G、D222N、D222V、D222H、N223K、N223R、L224V、F227A、F227V、F227L、F227S、F227Y、F227E、F227G、P234A、P234L、P234Q、P234S、S235C、S235R、S235W、S235G、S235K、Y238C、Y238L、Y238E、Y238W、Y238A、Y238S、Y238G、T240L、T240C、T240G、T240W、T240V、T240R、T240S、T240A、T240E、T243S、T243Q、T243M、T243G、T243L、T243V、T243E、T243P、T243R、T243W、G244W、G244D、G244Y、G244A、G244S、G244R、G245M、G245N、G245S、G245T、G245V、G245D、G245I、G246V、G246W、G246M、G246E、G246N、G246Q、G246S、G246D、G246R、S248E、S248L、S248C、S248G、S248P、S248F、S248T、A252S、A252T、A252V、A252P、A252G、T254A、T254S、T254G、T254P、L255V、L255A、L255P、L255I、L255C、A270W、A270T、A270E、A270C、A270M、A270S、A270L、A270G、A270R、A270Y、A270V、A271V、A271R、A271P、A271L、A271W、A271G、A271T、K279V、K279W、K279A、K279L、K279R、K279E、K279Y、K279P、K279G、K279S、S282G、S282T、S282L、S282V、S282F、S282R、S282A、S282I、S282W、L284V、L284G、L284S、L284M、L284T、Y295K、Y295H、Y295Q、Y295W、Y295M、Y295F、Y295C、Y295E、Y295V、S296A、S296T、S296K、S296N、S296Y、S296F、S296Q、S296P、S296L、S296D、I297L、I297V、I297H、I297R、I297W、I297K、I297T、I297F、I297G、I297Q、N298M、N298D、N298S、N298R、N298K、N298A、N298V、N298E、N298G、N298L、S299L、S299G、S299V、S299A、S299R、S299Q、S299M、S299I、S299P、S299T、G300A、G300N、G300D、G300R、G300L、G300F、G300C、G300P、G300W、G300T、G300S、A302L、A302R、A302P、A302V、A302K、A302M、A302Y、A302S、A302T、A302G、S303P、S303K、S303R、S303C、S303A、S303F、S303W、S303L、S303Q、N304V、N304G、N304P、N304W、N304F、N304E、N304T、N304D、N304R、N304S、N304A、N304I、N304M、N304K、S316T、S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ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.1的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、V3、D4、S5、S8、S9、I13、A16、V18、S27、S30、A32、V37、S44、S57、V59、F60、Y67、I71、S73、T74、S75、L77、R78、F84、V85、T86、Q93、S95、L101、T102、T103、L137、N142、N147、Y152、V153、L157、W158、N163、S186、R199、Q210、T211、S212、S215、N223、L224、P234、S235、T240、T243、T254、K279、S282、I297、N298、S299、G300、S303、E342、S343、Q344、E348、G363、A366、S381、A392、Q439、V474、W475、D486、A493、A502、T510、A518、I519、A530、E534、N538和S546、G547，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.2的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1R、Q1L、Q1T、Q1G、Q1P、Q1K、Q1M、Q1F、Q1S、Q1A、Q1W、V3G、V3L、V3I、V3A、V3E、D4R、D4C、D4S、D4G、D4N、D4V、D4W、D4F、D4A、S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S8A、S8W、S8R、S8L、S8Y、S8G、S8M、S8H、S8P、S8Q、S8V、S8C、S8E、S8K、S8T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、I13L、I13A、I13Q、I13S、I13D、I13R、I13M、I13V、I13G、I13Y、I13E、A16L、A16V、A16G、A16E、A16S、A16T、A16K、A16G、V18A、V18R、V18M、V18T、V18L、V18Q、V18I、S27A、S27W、S27H、S27V、S27T、S27C、S27G、S27E、S27L、S27F、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、A32D、A32E、A32S、A32V、A32R、A32G、A32M、A32T、A32C、A32K、A32W、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、S44R、S44W、S44L、S44T、S44C、S44A、S44V、S44P、S44E、S57G、S57T、S57H、S57P、S57A、V59T、V59G、V59E、V59Q、V59L、V59R、V59A、F60L、F60S、F60V、F60A、F60I、Y67C、Y67N、Y67A、Y67G、Y67T、Y67V、Y67D、Y67H、Y67R、Y67F、Y67L、Y67P、Y67S、Y67M、I71T、I71M、I71V、I71S、I71N、I71F、I71D、I71P、I71R、I71L、I71K、S73A、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、T74S、T74E、T74P、T74N、T74F、T74P、T74M、T74R、T74C、S75G、S75N、S75P、S75E、S75C、S75R、S75L、S75K、S75I、S75T、L77S、L77Y、L77E、L77A、L77P、R78W、R78G、R78K、R78Q、R78T、R78A、R78C、R78M、R78E、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、T86C、T86R、T86G、T86W、T86D、T86V、T86S、T86A、Q93L、Q93M、Q93C、Q93H、Q93G、Q93R、Q93W、Q93D、Q93A、Q93N、Q93K、S95V、S95R、S95D、S95Y、S95P、S95G、S95Q、S95A、S95K、L101M、L101V、L101R、L101P、L101F、L101H、L101A、L101G、L101N、L101K、L101C、T102N、T102S、T102C、T102R、T102A、T102I、T102M、T102W、T102E、T102P、T102F、T103A、T103S、T103G、T103D、T103I、T103E、T103V、T103N、L137S、L137D、L137W、L137G、L137R、L137A、L137I、L137T、N142K、N142E、N142Q、N142R、N142G、N142H、N142W、N142A、N147K、N147E、N147S、N147F、N147T、N147I、N147D、N147P、N147Y、N147H、N147L、Y152V、Y152E、Y152L、Y152I、Y152A、Y152M、Y152R、Y152F、Y152G、V153R、V153Y、V153C、L157P、L157Q、L157V、L157M、L157R、W158R、W158E、W158C、W158K、W158L、W158G、N163D、N163G、N163R、N163T、N163I、N163Q、N163Y、N163K、N163H、N163W、N163A、N163S、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、R199K、R199V、R199A、R199M、R199N、R199W、R199T、R199E、Q210D、Q210R、Q210G、Q210A、Q210L、Q210H、Q210P、Q210V、Q210I、Q210C、T211P、T211R、T211S、T211D、T211Q、T211H、T211A、T211L、T211G、T211W、S212V、S212K、S212D、S212T、S212H、S212L、S212P、S212E、S212C、S212A、S212M、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、N223K、N223R、L224V、P234A、P234L、P234Q、P234S、S235C、S235R、S235W、S235G、S235K、T240L、T240C、T240G、T240W、T240V、T240R、T240S、T240A、T240E、T243S、T243Q、T243M、T243G、T243L、T243V、T243E、T243P、T243R、T243W、T254A、T254S、T254G、T254P、K279V、K279W、K279A、K279L、K279R、K279E、K279Y、K279P、K279G、K279S、S282G、S282T、S282L、S282V、S282F、S282R、S282A、S282I、S282W、I297L、I297V、I297H、I297R、I297W、I297K、I297T、I297F、I297G、I297Q、N298M、N298D、N298S、N298R、N298K、N298A、N298V、N298E、N298G、N298L、S299L、S299G、S299V、S299A、S299R、S299Q、S299M、S299I、S299P、S299T、G300A、G300N、G300D、G300R、G300L、G300F、G300C、G300P、G300W、G300T、G300S、S303P、S303K、S303R、S303C、S303A、S303F、S303W、S303L、S303Q、E342L、E342K、E342T、E342M、E342R、E342V、E342H、E342G、E342Q、E342S、E342F、E342A、E342W、S343A、S343W、S343G、S343P、S343Q、S343T、S343E、S343R、S343L、Q344L、Q344V、Q344T、Q344D、Q344A、Q344H、Q344K、Q344R、Q344P、Q344E、E348C、E348G、E348V、E348M、E348N、E348A、E348I、E348D、E348L、E348K、E348R、G363C、G363H、G363D、G363W、G363R、G363Q、G363S、G363A、G363T、G363P、A366R、A366L、A366I、A366Q、A366P、A366T、A366S、A366E、A366G、A366D、A366W、A366H、S381E、S381Y、S381D、S381N、S381R、S381G、S381V、S381A、S381T、S381P、S381W、S381Q、S381C、S381I、A392V、A392R、A392T、A392S、A392E、A392L、A392G、A392P、A392F、A392M、A392I、A392Q、Q439A、Q439R、Q439G、Q439W、Q439P、Q439C、Q439M、Q439Y、Q439D、V474R、V474F、V474Y、V474I、V474M、V474W、V474E、V474Q、V474L、V474G、V474A、V474K、V474T、V474H、W475P、W475S、W475L、W475C、W475Q、W475G、W475R、W475T、D486I、D486G、D486R、D486E、D486S、D486A、D486T、D486K、D486F、D486M、D486Q、D486C、D486L、D486Y、D486P、A487M、A493G、A493S、A493Y、A493V、A493T、A493E、A493Q、A493R、A502W、A502V、A502S、A502G、A502D、A502E、A502T、A502M、A502Y、A502H、T510R、T510I、T510A、T510H、T510S、T510Y、T510V、T510L、T510K、T510E、T510P、T510F、T510M、A518G、A518P、A518W、A518V、A518R、A518L、A518M、A518F、A518Y、A518S、I519L、I519C、I519G、I519W、I519S、I519Y、I519N、I519A、I519V、I519Q、I519T、I519H、I519M、A530R、A530C、A530S、A530G、A530F、A530Y、A530W、A530T、A530V、E534M、E534A、E534V、E534W、E534C、E534R、E534T、E534L、E534G、E534F、E534S、E534Q、E534K、N538G、N538V、N538R、N538A、N538W、N538D、N538M、N538S、N538I、N538Y、S546E、S546C、S546G、S546N和S546V、G547S、G547V、G547L、G547D、G547R、G547C、G547M，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.2的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S5、S9、I13、V18、S30、V37、V59、I71、S73、T74、F84、V85、Q93、L137、N142、W158、N163、S186、S215、N223、P234、S235、S299、E348、Q439、D486、A493、E534和S546，其中多数位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.3的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1R、Q1L、Q1T、Q1G、Q1P、Q1K、Q1M、Q1F、Q1S、Q1A、Q1W、S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、I13L、I13A、I13Q、I13S、I13D、I13R、I13M、I13V、I13G、I13Y、I13E、V18A、V18R、V18M、V18T、V18L、V18Q、V18I、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、V59T、V59G、V59E、V59Q、V59L、V59R、V59A、I71T、I71M、I71V、I71S、I71N、I71F、I71D、I71P、I71R、I71L、I71K、S73A、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、T74S、T74E、T74P、T74N、T74F、T74P、T74M、T74R、T74C、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、Q93L、Q93M、Q93C、Q93H、Q93G、Q93R、Q93W、Q93D、Q93A、Q93N、Q93K、L137S、L137D、L137W、L137G、L137R、L137A、L137I、L137T、N142K、N142E、N142Q、N142R、N142G、N142H、N142W、N142A、W158R、W158E、W158C、W158K、W158L、W158G、N163D、N163G、N163R、N163T、N163I、N163Q、N163Y、N163K、N163H、N163W、N163A、N163S、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、N223K、N223R、P234A、P234L、P234Q、P234S、S235C、S235R、S235W、S235G、S235K、S299L、S299G、S299V、S299A、S299R、S299Q、S299M、S299I、S299P、S299T、E348C、E348G、E348V、E348M、E348N、E348A、E348I、E348D、E348L、E348K、E348R、Q439A、Q439R、Q439G、Q439W、Q439P、Q439C、Q439M、Q439Y、Q439D、D486I、D486G、D486R、D486E、D486S、D486A、D486T、D486K、D486F、D486M、D486Q、D486C、D486L、D486Y、D486P、A493G、A493S、A493Y、A493V、A493T、A493E、A493Q、A493R、E534M、E534A、E534V、E534W、E534C、E534R、E534T、E534L、E534G、E534F、E534S、E534Q、E534K、S546E、S546C、S546G、S546N和S546V，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.3的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S5、S9、S30、V37、S73、F84、V85、S186、S215、Q439、D486、E534和S546，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.5的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、S73A、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、Q439A、Q439R、Q439G、Q439W、Q439P、Q439C、Q439M、Q439Y、Q439D、D486I、D486G、D486R、D486E、D486S、D486A、D486T、D486K、D486F、D486M、D486Q、D486C、D486L、D486Y、D486P、E534M、E534A、E534V、E534W、E534C、E534R、E534T、E534L、E534G、E534F、E534S、E534Q、E534K、S546E、S546C、S546G、S546N和S546V，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.5的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1R、Q1L、Q1T、Q1G、Q1P、Q1K、Q1M、Q1F、Q1S、Q1A、Q1W、S2V、S2Q、S2E、S2D、S2P、S2A、S2T、S2L、S2R、S2K、S2W、S2G、V3G、V3L、V3I、V3A、V3E、D4R、D4C、D4S、D4G、D4N、D4V、D4W、D4F、D4A、S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S8A、S8W、S8R、S8L、S8Y、S8G、S8M、S8H、S8P、S8Q、S8V、S8C、S8E、S8K、S8T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、G11D、I13L、I13A、I13Q、I13S、I13D、I13R、I13M、I13V、I13G、I13Y、I13E、K15V、K15R、K15I、K15M、K15A、K15F、K15L、K15S、K15E、K15W、K15G、K15D、A16L、A16V、A16G、A16E、A16S、A16T、A16K、A16G、V18A、V18R、V18M、V18T、V18L、V18Q、V18I、L19S、L19A、L19K、L19V、L19C、L19H、L19W、L19F、L19R、N25W、N25Y、N25D、N25F、N25G、N25R、N25V、N25L、N25A、N25S、N25E、N25C、N25Q、S27A、S27W、S27H、S27V、S27T、S27C、S27G、S27E、S27L、S27F、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、A32D、A32E、A32S、A32V、A32R、A32G、A32M、A32T、A32C、A32K、A32W、A34W、A34R、A34L、A34Q、A34G、A34C、A34F、A34V、A34E、A34T、A34I、A34P、V36I、V36R、V36A、V36G、V36L、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、S44R、S44W、S44L、S44T、S44C、S44A、S44V、S44P、S44E、S57G、S57T、S57H、S57P、S57A、V59T、V59E、V59Q、V59L、V59R、、F60S、F60V、F60A、F60I、Y67C、Y67N、Y67A、Y67G、Y67T、Y67V、Y67D、Y67H、Y67R、Y67F、Y67L、Y67P、Y67S、Y67M、T68K、T68C、T68A、T68P、T68R、T68Q、I71T、I71M、I71V、I71S、I71N、I71F、I71D、I71P、I71R、I71L、I71K、D72L、D72G、D72N、D72R、D72K、D72E、D72W、D72A、D72C、D72Y、D72S、D72Q、D72T、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、T74S、T74E、T74P、T74N、T74F、T74P、T74M、T74R、T74C、S75G、S75N、S75P、S75E、S75C、S75R、S75L、S75K、S75I、S75T、S76H、S76P、S76Q、S76E、L77S、L77Y、L77E、L77P、R78W、R78G、R78K、R78Q、R78T、R78A、R78C、R78M、R78E、D82V、D82G、D82R、D82N、D82E、D82C、D83L、D83C、D83W、D83A、D83R、D83G、D83V、D83S、D83E、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、T86C、T86R、T86G、T86W、T86D、T86V、T86S、T86A、N90G、N90E、N90T、N90P、N90C、L91H、L91P、L91F、L91V、L91R、Q93L、Q93M、Q93C、Q93H、Q93G、Q93R、Q93W、Q93D、Q93A、Q93N、Q93K、S95V、S95R、S95D、S95Y、S95G、S95Q、S95A、S95K、L101M、L101V、L101R、L101P、L101F、L101H、L101A、L101G、L101N、L101K、L101C、T102N、T102S、T102C、T102R、T102A、T102I、T102M、T102W、T102E、T102P、T102F、T103A、T103S、T103G、T103D、T103I、T103E、T103V、T103N、S134V、S134I、S134M、S134P、S134L、S134A、S134C、L137S、L137D、L137W、L137G、L137R、L137A、L137I、L137T、T139A、T139N、T139S、T139G、T139D、T139H、T139R、N142K、N142E、N142Q、N142R、N142G、N142H、N142W、N142A、L145S、L145W、L145N、L145C、L145V、L145R、L145D、S146V、S146G、S146L、S146T、S146A、S146C、S146P、S146F、S146R、S146W、N147K、N147E、N147S、N147F、N147T、N147I、N147D、N147P、N147Y、N147H、N147L、Y152V、Y152E、Y152L、Y152I、Y152A、Y152M、Y152R、Y152F、Y152G、V153R、V153Y、V153C、T154R、T154G、T154L、T154S、T154A、T154M、T154P、S155R、S155G、S155L、S155A、S155H、S155W、S155C、S155I、S155P、S155M、S155N、S155T、L157P、L157Q、L157V、L157M、L157R、W158R、W158E、W158C、W158K、W158L、W158G、P159S、P159R、P159V、P159Q、P159T、P159D、P159A、P159L、P159G、I160T、I160A、I160V、I160D、I160G、I160S、I160L、I160Y、I160N、I160F、Q162L、Q162K、Q162R、Q162S、Q162H、Q162P、Q162I、Q162V、N163D、N163G、N163R、N163T、N163I、N163Q、N163Y、N163K、N163H、N163W、N163A、N163S、S170A、S175W、S175R、S175T、S175C、T176S、T176R、T176L、T176A、T176W、T176I、Y177S、Y177T、Y177D、Y177V、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、R199K、R199V、R199A、R199M、R199N、R199W、R199T、R199E、A202S、A202T、A202Q、A202L、A202E、A202P、A202V、A202F、A202W、A202G、A203Q、A203K、A203W、A203R、A203V、A203L、A203M、A203T、A203E、A203G、A203S、A203P、T206I、T206S、T206W、T206V、T206A、T206P、T206G、T206R、Q210D、Q210R、Q210G、Q210A、Q210L、Q210H、Q210P、Q210V、Q210I、Q210C、T211P、T211R、T211S、T211D、T211Q、T211H、T211A、T211L、T211G、T211W、S212V、S212K、S212D、S212T、S212H、S212L、S212P、S212E、S212C、S212A、S212M、Q213Y、Q213D、Q213R、Q213N、Q213S、Q213W、Q213K、Q213L、Q213C、Q213P、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、Q220L、Q220P、Q220K、Q220R、Q220H、Q220E、A221V、A221T、A221E、A221G、A221P、D222E、D222M、D222A、D222G、D222N、D222V、D222H、N223K、N223R、L224V、F227A、F227V、F227L、F227S、F227Y、F227E、F227G、P234A、P234L、P234Q、P234S、S235C、S235R、S235W、S235G、S235K、Y238C、Y238L、Y238E、Y238W、Y238A、Y238S、Y238G、T240L、T240C、T240G、T240W、T240V、T240R、T240S、T240A、T240E、T243S、T243Q、T243M、T243G、T243L、T243V、T243E、T243P、T243R、T243W、G244W、G244D、G244Y、G244A、G244S、G244R、G245M、G245N、G245S、G245T、G245V、G245D、G245I、G246V、G246W、G246M、G246E、G246N、G246Q、G246S、G246D、G246R、S248E、S248L、S248C、S248G、S248P、S248F、S248T、A252S、A252T、A252V、A252P、A252G、T254A、T254S、T254G、T254P、L255V、L255A、L255P、L255I、L255C、A270W、A270T、A270E、A270C、A270M、A270S、A270L、A270G、A270R、A270Y、A270V、A271R、A271P、A271L、A271W、A271G、A271T、K279V、K279W、K279A、K279L、K279R、K279E、K279Y、K279P、K279G、K279S、S282G、S282T、S282L、S282V、S282F、S282R、S282A、S282I、S282W、L284V、L284G、L284S、L284M、L284T、Y295K、Y295H、Y295Q、Y295W、Y295M、Y295F、Y295C、Y295E、Y295V、S296A、S296T、S296K、S296N、S296Y、S296F、S296Q、S296P、S296L、S296D、I297L、I297V、I297H、I297R、I297W、I297K、I297T、I297F、I297G、I297Q、N298M、N298D、N298S、N298R、N298K、N298A、N298V、N298E、N298G、N298L、S299L、S299G、S299V、S299A、S299R、S299Q、S299M、S299I、S299P、S299T、G300A、G300N、G300D、G300R、G300L、G300F、G300C、G300P、G300W、G300T、G300S、A302L、A302R、A302P、A302V、A302K、A302M、A302Y、A302S、A302T、A302G、S303P、S303K、S303R、S303C、S303A、S303F、S303W、S303L、S303Q、N304V、N304G、N304P、N304W、N304F、N304E、N304T、N304D、N304R、N304S、N304A、N304I、N304M、N304K、S316T、S316C、S316A、S316R、S316P、S316H、S316K、S316F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ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.1的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1R、Q1L、Q1T、Q1G、Q1P、Q1K、Q1M、Q1F、Q1S、Q1A、Q1W、V3G、V3L、V3I、V3A、V3E、D4R、D4C、D4S、D4G、D4N、D4V、D4W、D4F、D4A、S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S8A、S8W、S8R、S8L、S8Y、S8G、S8M、S8H、S8P、S8Q、S8V、S8C、S8E、S8K、S8T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、I13L、I13A、I13Q、I13S、I13D、I13R、I13M、I13V、I13G、I13Y、I13E、A16L、A16V、A16G、A16E、A16S、A16T、A16K、A16G、V18A、V18R、V18M、V18T、V18L、V18Q、V18I、S27A、S27W、S27H、S27V、S27T、S27C、S27G、S27E、S27L、S27F、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、A32D、A32E、A32S、A32V、A32R、A32G、A32M、A32T、A32C、A32K、A32W、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、S44R、S44W、S44L、S44T、S44C、S44A、S44V、S44P、S44E、S57G、S57T、S57H、S57P、S57A、V59T、V59E、V59Q、V59L、V59R、F60S、F60V、F60A、F60I、Y67C、Y67N、Y67A、Y67G、Y67T、Y67V、Y67D、Y67H、Y67R、Y67F、Y67L、Y67P、Y67S、Y67M、I71T、I71M、I71V、I71S、I71N、I71F、I71D、I71P、I71R、I71L、I71K、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、T74S、T74E、T74P、T74N、T74F、T74P、T74M、T74R、T74C、S75G、S75N、S75P、S75E、S75C、S75R、S75L、S75K、S75I、S75T、L77S、L77Y、L77E、L77P、R78W、R78G、R78K、R78Q、R78T、R78A、R78C、R78M、R78E、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、T86C、T86R、T86G、T86W、T86D、T86V、T86S、T86A、Q93L、Q93M、Q93C、Q93H、Q93G、Q93R、Q93W、Q93D、Q93A、Q93N、Q93K、S95V、S95R、S95D、S95Y、S95G、S95Q、S95A、S95K、L101M、L101V、L101R、L101P、L101F、L101H、L101A、L101G、L101N、L101K、L101C、T102N、T102S、T102C、T102R、T102A、T102I、T102M、T102W、T102E、T102P、T102F、T103A、T103S、T103G、T103D、T103I、T103E、T103V、T103N、L137S、L137D、L137W、L137G、L137R、L137A、L137I、L137T、N142K、N142E、N142Q、N142R、N142G、N142H、N142W、N142A、N147K、N147E、N147S、N147F、N147T、N147I、N147D、N147P、N147Y、N147H、N147L、Y152V、Y152E、Y152L、Y152I、Y152A、Y152M、Y152R、Y152F、Y152G、V153R、V153Y、V153C、L157P、L157Q、L157V、L157M、L157R、W158R、W158E、W158C、W158K、W158L、W158G、N163D、N163G、N163R、N163T、N163I、N163Q、N163Y、N163K、N163H、N163W、N163A、N163S、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、R199K、R199V、R199A、R199M、R199N、R199W、R199T、R199E、Q210D、Q210R、Q210G、Q210A、Q210L、Q210H、Q210P、Q210V、Q210I、Q210C、T211P、T211R、T211S、T211D、T211Q、T211H、T211A、T211L、T211G、T211W、S212V、S212K、S212D、S212T、S212H、S212L、S212P、S212E、S212C、S212A、S212M、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、N223K、N223R、L224V、P234A、P234L、P234Q、P234S、S235C、S235R、S235W、S235G、S235K、T240L、T240C、T240G、T240W、T240V、T240R、T240S、T240A、T240E、T243S、T243Q、T243M、T243G、T243L、T243V、T243E、T243P、T243R、T243W、T254A、T254S、T254G、T254P、K279V、K279W、K279A、K279L、K279R、K279E、K279Y、K279P、K279G、K279S、S282G、S282T、S282L、S282V、S282F、S282R、S282A、S282I、S282W、I297L、I297V、I297H、I297R、I297W、I297K、I297T、I297F、I297G、I297Q、N298M、N298D、N298S、N298R、N298K、N298A、N298V、N298E、N298G、N298L、S299L、S299G、S299V、S299A、S299R、S299Q、S299M、S299I、S299P、S299T、G300A、G300N、G300D、G300R、G300L、G300F、G300C、G300P、G300W、G300T、G300S、S303P、S303K、S303R、S303C、S303A、S303F、S303W、S303L、S303Q、E342L、E342K、E342T、E342M、E342R、E342V、E342H、E342G、E342Q、E342S、E342F、E342A、E342W、S343A、S343W、S343G、S343P、S343Q、S343T、S343E、S343R、S343L、Q344L、Q344V、Q344T、Q344D、Q344A、Q344H、Q344K、Q344R、Q344P、Q344E、E348C、E348G、E348V、E348M、E348N、E348A、E348I、E348D、E348L、E348K、E348R、G363C、G363H、G363D、G363W、G363R、G363Q、G363S、G363A、G363T、G363P、A366R、A366L、A366I、A366Q、A366P、A366T、A366S、A366E、A366G、A366D、A366W、A366H、S381E、S381Y、S381D、S381N、S381R、S381G、S381V、S381A、S381T、S381P、S381W、S381Q、S381C、S381I、A392V、A392R、A392T、A392S、A392E、A392L、A392G、A392P、A392F、A392M、A392I、A392Q、Q439A、Q439R、Q439G、Q439W、Q439P、Q439C、Q439M、Q439Y、Q439D、V474R、V474F、V474Y、V474I、V474M、V474W、V474E、V474Q、V474L、V474G、V474A、V474K、V474T、V474H、W475P、W475S、W475L、W475C、W475Q、W475G、W475R、W475T、D486I、D486G、D486R、D486E、D486S、D486A、D486T、D486K、D486F、D486M、D486Q、D486C、D486L、D486Y、D486P、A487M、A493G、A493S、A493Y、A493V、A493T、A493E、A493Q、A493R、A502W、A502V、A502S、A502G、A502D、A502E、A502T、A502M、A502Y、A502H、T510R、T510I、T510A、T510H、T510S、T510Y、T510V、T510L、T510K、T510E、T510P、T510F、T510M、A518G、A518P、A518W、A518V、A518R、A518L、A518M、A518F、A518Y、A518S、I519L、I519C、I519G、I519W、I519S、I519Y、I519N、I519A、I519V、I519Q、I519T、I519H、I519M、A530R、A530C、A530S、A530G、A530F、A530Y、A530W、A530T、A530V、E534M、E534A、E534V、E534W、E534C、E534R、E534T、E534L、E534G、E534F、E534S、E534Q、E534K、N538G、N538V、N538R、N538A、N538W、N538D、N538M、N538S、N538I、N538Y、S546E、S546C、S546G、S546N和S546V、G547S、G547V、G547L、G547D、G547R、G547C、G547M，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.2的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1R、Q1L、Q1T、Q1G、Q1P、Q1K、Q1M、Q1F、Q1S、Q1A、Q1W、S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、I13L、I13A、I13Q、I13S、I13D、I13R、I13M、I13V、I13G、I13Y、I13E、V18A、V18R、V18M、V18T、V18L、V18Q、V18I、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、V59T、V59E、V59Q、V59L、V59R、I71T、I71M、I71V、I71S、I71N、I71F、I71D、I71P、I71R、I71L、I71K、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、T74S、T74E、T74P、T74N、T74F、T74P、T74M、T74R、T74C、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、Q93L、Q93M、Q93C、Q93H、Q93G、Q93R、Q93W、Q93D、Q93A、Q93N、Q93K、L137S、L137D、L137W、L137G、L137R、L137A、L137I、L137T、N142K、N142E、N142Q、N142R、N142G、N142H、N142W、N142A、W158R、W158E、W158C、W158K、W158L、W158G、N163D、N163G、N163R、N163T、N163I、N163Q、N163Y、N163K、N163H、N163W、N163A、N163S、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、N223K、N223R、P234A、P234L、P234Q、P234S、S235C、S235R、S235W、S235G、S235K、S299L、S299G、S299V、S299A、S299R、S299Q、S299M、S299I、S299P、S299T、E348C、E348G、E348V、E348M、E348N、E348A、E348I、E348D、E348L、E348K、E348R、Q439A、Q439R、Q439G、Q439W、Q439P、Q439C、Q439M、Q439Y、Q439D、D486I、D486G、D486R、D486E、D486S、D486A、D486T、D486K、D486F、D486M、D486Q、D486C、D486L、D486Y、D486P、A493G、A493S、A493Y、A493V、A493T、A493E、A493Q、A493R、E534M、E534A、E534V、E534W、E534C、E534R、E534T、E534L、E534G、E534F、E534S、E534Q、E534K、S546E、S546C、S546G、S546N和S546V，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.3的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：4、5、13、15、18、85，具体地是选自以下的取代：D4R、S5V、I13S、K15R、V18M、V85G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置，并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比具有作为改进因子(IF)测量的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
根据本发明的葡糖淀粉酶变体可以优选地进一步包含对应于S95P和A121P、尤其是S95P+A121P的取代。
在另一个实施例中，本发明的葡糖淀粉酶变体进一步包含选自以下取代的特定组合：S95P+A121P+Y295W、或S95P+A121P+Y295W+Q318Y。
更具体地，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，所述变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：
T43K；
D4R；
S5V；
I13S；
K15R；
V18M；
V85G；
S95P+A121P+Y295W+T43K；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
D4R+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
S5V+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
I13S+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W；
并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比，具有作为改进因子(IF)测量的、增加至少1.1的比活性，和/或通过TSA测量的增加至少2℃、具体地至少3℃的解链温度。
在另一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：
T43K；
D4R；
S5V；
I13S；
K15R；
V18M；
V85G；
并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比，具有增加至少1.1的比活性，和/或通过TSA测量的增加至少2℃、具体地至少3℃的解链温度。
在另一个具体的实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：
S95P+A121P+Y295W+T43K；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
D4R+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
S5V+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
I13S+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W；
并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比或与具有S95P+A121P+Y295W或S95P+A121P+Y295W+Q318Y的SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比，具有通过TSA测量的增加至少2℃、具体地至少3℃的解链温度。
所述变体可以进一步包含在一个或多个(例如，若干个)其他位置处的一个或多个另外的改变。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质]，Academic Press[学术出版社]，New York[纽约]中进行了描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸变化具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸变化可改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等。
可根据本领域中已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单一丙氨酸突变，并且测试所得的突变型分子的葡糖淀粉酶活性以鉴别对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如通过这样的技术确定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有增加的比活性。增加的比活性可以被确定为通过本文实例中所述的阿卡波糖测定确定的相对比活性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有增加的热稳定性。如本文实例中所述，可以通过TSA测定来确定热稳定性。
亲本葡糖淀粉酶
在一个实施例中，所述亲本葡糖淀粉酶源自褐褶菌属(Gloeophyllum)，具体地是篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)。该亲本葡糖淀粉酶可以是(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％序列一致性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少85％序列一致性。
在一个方面，该亲本与SEQ ID NO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，所述多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ IDNO:3的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在另一个方面，该亲本包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或者由其组成。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:3的多肽的等位基因变体。
在另一个方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)或(i)的全长互补体杂交(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第二版，Cold Spring Harbor,New York[冷泉港，纽约])。
SEQ ID NO：1的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO：3的多肽或其片段可以用于设计核酸探针以根据本领域中熟知的方法从不同属或物种的品系鉴别和克隆编码亲本的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。可以使用DNA和RNA探针两者。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以筛选由这样的其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下各项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(v)其子序列。杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸52至1719。在另一个方面，核酸探针是编码以下各项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一个方面，核酸探针是SEQ IDNO:1。
在另一个实施例中，该亲本是由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一个多肽区域的N-末端或C-末端。
该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽融合在本发明的多肽的N-末端或C-末端。融合多肽通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合而产生。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于一个或多个相同启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，在该内含肽技术中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人，1993，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；以及Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989，Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能和遗传学]6:240-248；以及(Stevens，2003，Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
该亲本可以是真菌性葡糖淀粉酶。例如，该亲本可以是粘褶菌属或栓菌属葡糖淀粉酶。
在另一个方面,该亲本是密粘褶菌、篱边粘褶菌、或瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
在另一个方面，该亲本是篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，例如SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶或如SEQ ID NO:3披露的成熟多肽。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用上文提及的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，见上文)。
变体的制备
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人，1990，Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人，2001，Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino，1996，FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在许多可以用于制备变体的可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004，Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中个体氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，然而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术在本领域是熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列还可为启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
该控制序列还可以是前导序列，对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端，并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可以含有对于编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。
控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以例如从以下各项的基因获得：嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在这样的位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，这样使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有一个或多个选择性标记，所述标记容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标记是这样的基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
优选用于曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因。
载体优选地含有允许载体整合入宿主细胞基因组中或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组的染色体中的精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列一致性以增强同源重组的可能性。这些整合元件可为与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可为非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO 00/24883)。可根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989(见上文))。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如真核细胞。
宿主细胞可以是真核生物，如真菌细胞。
如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人所定义的，在：Ainsworth and Bisby’s Dictionary ofThe Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典]，第8版，1995，国际CAB，University Press[大学出版社]，剑桥，英国)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Skinner、Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)所描述那样定义。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，见上文)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，且碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰刀菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域已知的程序，在适合营养培养基中发生，所述培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可以从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
变体可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从营养培养基中回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦和尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版社],纽约,1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
组合物
本发明还涉及包括本发明的多肽的组合物。优选地，该组合物还包括一种运载体和/或一种赋形剂。更优选地，这些组合物富含这样一种多肽。术语“富集”表示，组合物的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如富集因子为至少1.1。优选地，配制这些组合物以提供所希望的特性，例如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性。
组合物可以包括本发明的葡糖淀粉酶变体作为主要的酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包括多种酶活性，如氨肽酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
在一个具体的实施例中，该组合物包括α淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个实施例中，该组合物包括异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个实施例中，该组合物包括α淀粉酶、异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。
在另一个方面，该组合物包括与支链淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个方面，该组合物包括与支链淀粉酶、和异淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个方面，该组合物包括与支链淀粉酶、和α-淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。
在一个具体实施例中,该组合物进一步包括蛋白酶。
可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且这些多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可处于颗粒或微粒的形式。包括在该组合物中的多肽可以根据本领域中已知的方法稳定化。
以下给出了本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
以上组合物适合在液化、糖化、和/或发酵过程中使用，优选在淀粉转化中使用，尤其是用于产生糖浆和发酵产物，例如乙醇。
以下给出了本发明的多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
使用本发明所述的变体葡糖淀粉酶的方法-工业应用
本发明所述的的变体葡糖淀粉酶具有允许各种工业应用的有价值特性。具体而言，该葡糖淀粉酶可以用于乙醇生产以及淀粉转化过程中。
变体葡糖淀粉酶可用于淀粉过程，尤其是淀粉转化、特别是淀粉液化(参见例如，美国专利号3,912,590、EP 252730以及EP 063909、WO 99/19467以及WO 96/28567，这些专利全部通过引用结合在此)。还考虑了用于淀粉转化目的的组合物，除了本发明的葡糖淀粉酶以外，这些组合物还包括α-淀粉酶、普鲁兰酶和/或蛋白酶。
此外，本发明所述的葡糖淀粉酶特别适用于从淀粉或全谷粒中生产甜味剂以及乙醇(参见，例如，美国专利号5,231,017，该专利通过引用结合在此)，如燃料乙醇、饮用乙醇以及工业乙醇。
在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的葡糖淀粉酶用于由含淀粉的材料生产糖浆和/或发酵产物的用途。在一个实施例中，该淀粉材料可以是经糊化的。在另一个实施例中，该淀粉材料是未经糊化的。
淀粉加工
天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在这一“糊化”过程中，粘度有显著的增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为含更粗糙的淀粉的材料，这些材料包括(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包含非淀粉部分，如胚芽残留物和纤维。该原材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中众所周知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。用于减少该含淀粉的材料的粒度的方法为本领域的普通技术人员所已知。
由于典型工业过程中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业实践中，这种粘度的降低主要通过酶促降解来实现。
在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在一个实施例中，在液化过程中还存在植酸酶。在一个实施例中，在液化期间，还存在降低粘度的酶例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
在液化过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及线性的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆料方法进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，例如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。
在一个实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是5分钟左右。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5下，典型地在5与6之间的pH下进行喷射蒸煮过程。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。
在70℃-95℃之间，例如80℃-90℃，例如85℃左右，将液化过程进行约10分钟至5小时，典型地是1-2小时。pH在4与7之间，例如在5.5与6.2之间。为了确保这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉将典型地具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。
通常，液化和液化条件在本领域是熟知的。
在下面的“α-淀粉酶”部分中披露了α-淀粉酶的实例。
可以使用本领域熟知的条件，用产碳水化合物源的酶，具体是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地去分支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时。然而，常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF)中，在发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地60℃左右)下，并且在约4与5之间的pH下，一般在约pH 4.5下进行糖化。
糖化步骤和发酵步骤可以依序或同时进行。在一个实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“SSF”)。然而，通常，在30至65℃、典型地约60℃的温度下执行一个预糖化步骤约30分钟至2小时(例如，30至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵期间进行一个完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，例如，pH4.5。在同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而实际上是，酵母和酶是一起添加的。
在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及去分支酶，如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或普鲁兰酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此过程减少了称为“潘糖前体”的短低聚糖的形成，这种短低聚糖不能通过去分支酶来适当水解。正常地，约0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由普鲁兰酶降解。如果糖化过程中仍然存在来自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。
其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度下发酵。
可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。
在具体实施例中，本发明的方法在将含淀粉的材料转化为糖/糊精之前进一步包含以下步骤：
(x)减少该含淀粉的材料的粒度；以及
(y)形成一种包含该含淀粉的材料和水的浆料。
在实施例中，将该含淀粉的材料碾磨，以减少粒度。在实施例中，该粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉的材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。
该水性浆料可以包含含淀粉的材料的从10wt.％-55wt.％干固体(DS)，优选25wt.％-45wt.％干固体(DS)，更优选30wt.％-40wt.％干固体(DS)。
常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于例如美国专利号3,912,590、EP252730以及EP 063909中，这些专利通过引用结合在此。
在实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，该方法包括一个脱支步骤。
当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所希望的最终产物，任选的异构化过程。
当所需的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可被转化为果糖。糖化过程之后，将pH值增加至6-8范围内的值，例如pH 7.5，并且通过离子交换除去钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。
发酵产物的生产
可发酵的糖类(例如，糊精类、单糖类，尤其是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖类可进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可在微生物发酵过程中用作发酵进料来产生最终产物，如醇(例如，乙醇以及丁醇)、有机酸(例如，丁二酸，3-HP以及乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。
在一个实施例中，将液化工艺步骤期间获得的可发酵的糖用于产生醇，并且尤其是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶以及发酵生物(例如，酵母)一起添加，并且然后在30℃-40℃温度下执行。
发酵中所使用的生物取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物。在一些优选实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且尤其是酵母属如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括(但不局限于)FALI(弗莱希曼酵母公司(Fleischmann's Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司食品配料部(DSM Specialties))、REDSTAR(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国(China))。这些方法中所使用的起始酵母的量是在合适时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞总体上以约104至约1012、并且优选地从约107至约1010活酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是从pH 3-6，例如，约pH 4-5。
除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可包括营养物以及额外酶，这些额外酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。
在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所希望的最终产物时，可以使用乳酸杆菌属种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所希望的最终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸是所希望的最终产物时，柠檬泛菌可以用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。
用于由含未经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
本发明涉及在含淀粉的材料没有糊化(即，没有蒸煮)的情况下从含淀粉的材料生产发酵产物的方法(通常被称为“粗淀粉水解”方法)。可在不使包含含淀粉的材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉的材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)、优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。
因此，在一个方面，本发明涉及从含淀粉的材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：使用产生碳水化合物源的酶以及发酵生物，在低于所述含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下将含淀粉的材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一个方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中使用本发明所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(i)。
在一个实施例中，在步骤(i)中添加α-淀粉酶。在另一个实施例中，步骤(i)和(ii)同时进行。
在一个实施例中，还存在蛋白酶。蛋白酶可以是任何酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。发酵之后，可以任选地例如通过蒸馏来回收发酵产物(例如乙醇)。典型地，在发酵期间存在一种或多种淀粉酶如葡糖淀粉酶、和/或其他产碳水化合物源的酶、和/或一种或多种α-淀粉酶。葡糖淀粉酶以及其他产碳水化合物源的酶的实例包括使原料淀粉水解的葡糖淀粉酶。一种或多种α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母，例如，酿酒酵母的菌株。术语“初始糊化温度”指淀粉的糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉的材料的初始糊化温度是使用Gorinstein和Lii，1992，Starch/[淀粉]44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。在开始该方法之前，可以制备具有10-55w/w％干固体(DS)、优选25-45w/w％干固体、更优选30-40w/w％干固体的含淀粉的材料(例如颗粒状淀粉)的浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。由于本发明的方法是在低于该初始糊化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在一个实施例中，水性浆料包含从约1至约70vol.％、优选地15-60vol.％、尤其是从约30至50vol.％的水和/或工艺用水，例如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提塔的水、或来自其他发酵产物设备的工艺用水、或其组合等。含淀粉的材料可以优选地通过干式或湿式碾磨来将粒度降低至0.05至3.0mm，优选地0.1-0.5mm而制备。在经受本发明的方法之后，含淀粉的材料中至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选地至少99％的干固体被转化成可溶的淀粉水解产物。本发明此方面中的方法是在低于初始糊化温度的温度下进行的，意味着温度典型地在30℃-75℃之间、优选地在45℃-60℃之间的范围内。在一个实施例中，该方法在从25℃至40℃，如从28℃至35℃，如从30℃至34℃，优选地约32℃的温度下进行。在一个实施例中，执行该方法以使得糖水平、如葡萄糖水平保持在低水平，如低于6w/w％、如低于约3w/w％、如低于约2w/w％、如低于约1w/w％、如低于约0.5w/w％、或低于0.25w/w％、如低于约0.1w/w％。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物就可以实现这样的低水平的糖。本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持低于约0.5w/w％，如低于约0.2w/w％。本发明的方法可以在从约3与7之间、优选地从pH 3.5到6、或更优选地从pH 4到5的pH下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，尤其进行24至96小时。
由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
在这个方面，本发明涉及由含淀粉的材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉的材料生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉的材料液化；
(b)使用本发明的葡糖淀粉酶对步骤(a)中获得的液化材料进行糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中在根据本发明所述的葡糖淀粉酶的存在下进行步骤(a)和/或步骤(b)。
在一个实施例中，在液化之前、期间和/或之后，添加蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施例中，金属蛋白酶来自嗜热子囊菌属(Thermoascus)菌株，例如，橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670。在另一个实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，特别是来源于热球菌属的菌株的蛋白酶，更特别是来自披露于US 6,358,726中的激烈热球菌。
可以添加另外的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，另外的葡糖淀粉酶来源于曲霉属的菌株，例如，黑曲霉或泡盛曲霉；踝节菌属的菌株，尤其是埃默森踝节菌；或阿太菌属的菌株，尤其是罗氏阿太菌；栓菌属的菌株，例如，瓣环栓菌；粘褶菌属的菌株，例如，篱边黏褶菌或密粘褶菌；或其混合物。糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可依次或同时进行。当该方法作为依次糖化和发酵过程来进行时，普鲁兰酶和/或蛋白酶可在糖化和/或发酵期间添加，并且当步骤(b)与(c)同时进行时(SSF过程)，在发酵之前或期间添加。普鲁兰酶和/或蛋白酶还可有利地在液化之前(预液化处理)(即在步骤(a)之前或期间)和/或在液化之后(液化后处理)(即在步骤(a)之后添加)。普鲁兰酶最有利地是在液化之前或期间(即在步骤(a)之前或期间)添加。发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物优选地是酵母，优选地是酿酒酵母菌株。在具体的实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：
x)优选地通过研磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉的材料的粒径；
y)形成一种包含该含淀粉的材料和水的浆料。
在一个实施例中，粒度是小于#7筛，例如#6筛。#7筛通常用于常规现有技术过程中。水性浆料可包含从10-55、例如25-45和30-40的w/w％干固体(DS)的含淀粉的材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，该浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以进行喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。在一个实施例中，液化可作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6、优选地4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选地70℃-90℃之间、如优选地80℃-85℃之间，并且任选地连同普鲁兰酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，然后，可将浆料在95℃-140℃、优选地100℃-135℃、如105℃-125℃之间的温度下喷射蒸煮约1-15分钟、优选地约3-10分钟、尤其是约5分钟。浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多α-淀粉酶以及任选地普鲁兰酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在pH 4.0-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，全部糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在介于30℃到65℃之间的温度下，典型地约60℃下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度下并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度下执行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，尤其进行24至96小时。
含淀粉的材料
可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉的材料还可以是蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。在优选的实施例中，该含淀粉的材料是玉米。在优选的实施例中，该含淀粉的材料是小麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产品。发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。在优选的实施例中，该发酵产物是乙醇。
在以下编号的段落中进一步描述本发明：
段落[1].一种葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S2、V3、D4、S5、S8、S9、I13、K15、V18、L19、N25、S27、K28、S30、V36、V37、T43、D45、S57、V59、F60、I71、S73、T74、L77、D82、D83、V85、T86、E88、L91、S95、P97、T103、D114、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、S155、N156、L157、W158、P159、I160、Q162、V169、S170、S175、T176、Y177、D184、S186、R199、A202、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、Y231、P234、S235、Y238、T240、T243、G244、G245、G246、R247、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A270、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、A302、S303、N304、T309、E314、S316、Q318、G319、T326、V330、N339、E342、S343、E348、S351、T352、Q359、S362、G363、V364、T365、A366、S371、S372、T378、S381、I383、N385、F386、A392、N394、K396、Y408、K410、D412、S414、S417、V419、A426、S427、E433、A434、N436、N437、T438、Q439、G442、A446、L448、V450、N470、E472、V474、W475、N478、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、S501、A502、T506、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、N528、A530、E534、D536、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、S548、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[2].根据段落1所述的葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1K、Q1R、S2E、S2K、S2L、S2P、S2R、V3L、V3G、V3R、D4R、D4S、D4G、D4A、D4W、S5L、S5V、S5G、S5C、S5R、S8Q、S8H、S8A、S8Y、S9C、S9Q、S9M、S9W、S9D、S9G、I13V、I13R、I13S、I13L、I13E、K15G、K15R、V18M、V18Q、L19G、L19F、N25S、N25A、S27A、S27L、S27G、S27V、S27C、K28C、K28R、S30Q、S30A、S30K、S30T、S30L、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、D45L、D45P、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59T、V59S、V59E、F60S、I71M、I71S、I71T、I71V、S73H、S73R、S73N、S73V、S73G、T74V、L77S、L77P、L77R、D82N、D82R、D82V、D82G、D83L、D83C、D83W、V85Q、V85G、V85P、T86R、T86V、E88Q、E88R、E88G、L91S、L91P、L91G、S95A、S95T、S95V、P97T、P97I、P97R、T103Y、T103A、T103G、D114G、D114N、D114M、D114R、D114C、S134P、S134A、S134V、S134W、S134D、S134H、S134L、S134G、L137W、L137S、L137A、L137V、L137G、L137D、L137R、L137P、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、S155C、S155P、S155R、S155G、S155A、N156I、N156A、N156V、N156R、N156T、N156K、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、I160A、I160G、I160N、I160T、I160R、I160V、Q162L、Q162V、Q162H、Q162P、Q162R、V169A、V169L、V169W、V169S、V169D、V169R、V169E、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、Y177H、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A202R、A202W、A202E、A202S、A202V、A203M、A203W、A203P、A203L、T206C、T206P、T206G、T206A、T206R、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、S212D、S212E、S212L、S212P、S212T、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、F227G、F227W、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、S235C、S235R、S235N、S235G、S235W、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、T243V、T243S、T243L、T243R、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、R247E、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A270L、A270M、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、S299P、S299C、S299M、S299L、S299T、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、A302G、A302L、A302C、A302R、A302V、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、S316T、S316L、S316G、S316F、S316R、S316P、S316V、S316Q、Q318L、Q318R、G319R、G319Q、G319P、G319A、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、V330S、V330L、V330P、V330R、V330A、V330G、N339P、N339A、N339T、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、E348W、E348F、E348P、E348V、E348G、E348M、S351P、S351C、S351G、S351R、S351L、S351W、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、S362P、S262R、S262G、S262M、G363R、G363T、G363P、V364A、V364C、V364E、V364S、V364G、V364L、T365S、T365G、T365W、T365L、T365H、A366D、A366T、A366P、A366R、A366H、S371A、S371G、S372A、S372E、S372C、S372L、S372R、T378G、T378L、T378D、T378H、T378A、T378P、S381K、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、N385R、N385W、N385S、N385G、N385D、F386S、F386W、F386Q、F386V、F386I、F386G、F386C、F386A、F386T、F386L、A392V、A392L、A392E、A392G、N394D、N394R、N394Y、N394W、N394E、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、Y408V、Y408E、Y408P、Y408S、Y408K、Y408L、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S414C、S414R、S414G、S414V、S414W、S414H、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、E433C、A434Q、A434G、N436S、N436P、N436D、N437K、N437R、N437T、N437P、T438E、T438G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、G442V、G442D、G442C、G442A、G442L、G442W、G442E、G442M、G442R、A446G、A446D、A446R、A446E、A446I、L448G、L448P、L448E、V450P、V450S、V450C、V450E、V450L、V450N、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、E472I、V474W、V474C、V474A、V474L、V474G、W475P、W475A、W475R、N478L、N478I、N478P、N478R、N478W、N478S、N478G、N478K、N478A、S484G、S484Y、S484P、S484A、S484N、V485A、V485W、V485K、V485G、V485R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、A487S、A487V、A487L、A487G、A487C、A487K、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、S501R、S501L、S501M、S501K、S501W、A502C、A502Q、A502W、A502G、A502V、T506A、T506P、T506V、I509E、I509D、I509S、I509F、I509W、I509R、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、N512Q、N512K、N512H、N512R、N512V、S516R、S516W、S516P、S516K、S516Y、S516C、A518D、A518G、A518Y、A518V、A518R、A518L、A518T、I519W、I519L、I519R、I519F、I519K、N527T、N527K、N527P、N527L、N528D、N528G、N528K、N528V、N528E、N528L、A530R、A530C、A530G、A530V、A530S、A530T、E534W、E534Q、E534C、E534V、E534G、E534R、E534F、E534K、D536G、D536R、D536W、D536H、D536K、D536N、D536M、D536C、D536V、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、N539M、N539R、N539P、N539A、I541A、I541T、I541V、I541G、I541N、A545R、A545T、A545V、A545L、S546P、S546G、S546C、S546E、S546N、G547D、G547S、G547V、S548P、S548W、S548L、S548G、S548T、N552V、N552E、N552F、N552A、N552R、N552G和T554Q、T554G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[3].根据段落1-2所述的葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S2、V3、D4、S8、S9、I13、V18、L19、S27、K28、S30、V36、V37、T43、S57、V59、S73、T74、L77、D82、V85、T86、L91、S95、P97、D114、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、S155、N156、L157、W158、P159、I160、Q162、S170、S175、T176、Y177、D184、S186、R199、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、Y231、P234、S235、Y238、T240、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、S303、N304、T309、E314、S316、Q318、G319、T326、V330、N339、E342、S343、E348、T352、Q359、G363、V364、A366、S371、S372、T378、S381、I383、N385、F386、A392、N394、K396、Y408、K410、D412、S414、S417、V419、A426、S427、A434、N436、T438、Q439、G442、L448、V450、N470、E472、V474、W475、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、A502、T506、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、N528、A530、E534、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、S548、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.7摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[4].根据段落1-3所述的葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S2、S8、V18、K28、V36、V37、T43、S57、V59、S73、T74、T86、S95、P97、D114、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、S155、L157、W158、P159、I160、Q162、S170、S175、T176、Y177、D184、S186、R199、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、Y231、P234、Y238、T240、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、G300、S303、N304、T309、E314、Q318、T326、V330、E342、S343、E348、T352、Q359、S371、T378、I383、F386、N394、K396、Y408、K410、D412、S417、V419、A426、S427、A434、Q439、G442、L448、N470、E472、W475、V485、D486、S492、A493、D494、N495、I509、T510、I519、N527、P537、N538、S546、G547和T554，其中所述位置对应于在SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少0.9摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[5].根据段落1-4所述的葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：V18、K28、V36、V37、T43、S57、V59、S73、T86、S95、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、L157、W158、P159、S170、S175、T176、D184、S186、R199、A203、Q210、T211、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、Y231、P234、Y238、T240、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、G300、S303、N304、T309、E314、T326、E342、S343、T352、Q359、I383、K396、K410、D412、S417、V419、A426、S427、A434、Q439、N470、W475、D486、S492、A493、D494、N495、T510、P537、N538、G547和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少1.1摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[6].根据段落1-5所述的葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：K28、T43、S57、S73、S95、T139、L145、N149、Y152、V153、L157、W158、P159、S175、D184、S186、R199、A203、Q210、T211、Q213、V214、Y217、T218、T219、A221、D222、L224、Y231、P234、Y238、T240、G244、G246、S248、A252、T254、L255、Y262、A271、K279、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、N304、S343、T352、K410、D412、V419、S427、N470、W475、S492、A493和P537，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少1.5摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[7].根据段落1-6所述的葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：K28、T43、S57、S95、T139、L145、N149、V153、L157、P159、S186、R199、A203、T211、V214、Y217、Y231、P234、Y238、T240、G244、G246、S248、T254、L255、A271、L284、V294、Y295、S296、K410、S492和A493，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了葡糖淀粉酶变体，该变体具有通过TSA测量的至少2.0摄氏度的解链温度的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[8].一种葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S2、V3、D4、S5、S8、S9、G11、I13、K15、A16、V18、L19、N25、S27、S30、A32、A34、V36、V37、S44、S57、V59、F60、Y67、T68、I71、D72、S73、T74、S75、S76、L77、R78、D82、D83、F84、V85、T86、N90、L91、Q93、S95、L101、T102、T103、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、Y152、V153、T154、S155、L157、W158、P159、I160、Q162、N163、S170、S175、T176、Y177、S186、R199、A202、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、S215、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、P234、S235、Y238、T240、T243、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、A270、A271、K279、S282、L284、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、A302、S303、N304、S316、G319、T326、V330、N339、E342、S343、Q344、E348、S351、Q359、S362、G363、T365、A366、S371、S372、T378、S381、I383、F386、A392、N394、K396、N401、K410、D412、S414、S417、V419、D420、E433、N437、T438、Q439、F440、G442、A446、N470、E472、V474、W475、N478、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、S501、A502、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、A530、E534、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.1的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[9].如段落8所述的葡糖淀粉酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1R、Q1L、Q1T、Q1G、Q1P、Q1K、Q1M、Q1F、Q1S、Q1A、Q1W、S2V、S2Q、S2E、S2D、S2P、S2A、S2T、S2L、S2R、S2K、S2W、S2G、V3G、V3L、V3I、V3A、V3E、D4R、D4C、D4S、D4G、D4N、D4V、D4W、D4F、D4A、S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S8A、S8W、S8R、S8L、S8Y、S8G、S8M、S8H、S8P、S8Q、S8V、S8C、S8E、S8K、S8T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、G11D、I13L、I13A、I13Q、I13S、I13D、I13R、I13M、I13V、I13G、I13Y、I13E、K15V、K15R、K15I、K15M、K15A、K15F、K15L、K15S、K15E、K15W、K15G、K15D、A16L、A16V、A16G、A16E、A16S、A16T、A16K、A16G、V18A、V18R、V18M、V18T、V18L、V18Q、V18I、L19S、L19A、L19K、L19V、L19C、L19H、L19W、L19F、L19R、N25W、N25Y、N25D、N25F、N25G、N25R、N25V、N25L、N25A、N25S、N25E、N25C、N25Q、S27A、S27W、S27H、S27V、S27T、S27C、S27G、S27E、S27L、S27F、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、A32D、A32E、A32S、A32V、A32R、A32G、A32M、A32T、A32C、A32K、A32W、A34W、A34R、A34L、A34Q、A34G、A34C、A34F、A34V、A34E、A34T、A34I、A34P、V36I、V36R、V36A、V36G、V36L、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、S44R、S44W、S44L、S44T、S44C、S44A、S44V、S44P、S44E、S57G、S57T、S57H、S57P、S57A、V59T、V59E、V59Q、V59L、V59R、、F60S、F60V、F60A、F60I、Y67C、Y67N、Y67A、Y67G、Y67T、Y67V、Y67D、Y67H、Y67R、Y67F、Y67L、Y67P、Y67S、Y67M、T68K、T68C、T68A、T68P、T68R、T68Q、I71T、I71M、I71V、I71S、I71N、I71F、I71D、I71P、I71R、I71L、I71K、D72L、D72G、D72N、D72R、D72K、D72E、D72W、D72A、D72C、D72Y、D72S、D72Q、D72T、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、T74S、T74E、T74P、T74N、T74F、T74P、T74M、T74R、T74C、S75G、S75N、S75P、S75E、S75C、S75R、S75L、S75K、S75I、S75T、S76H、S76P、S76Q、S76E、L77S、L77Y、L77E、L77P、R78W、R78G、R78K、R78Q、R78T、R78A、R78C、R78M、R78E、D82V、D82G、D82R、D82N、D82E、D82C、D83L、D83C、D83W、D83A、D83R、D83G、D83V、D83S、D83E、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、T86C、T86R、T86G、T86W、T86D、T86V、T86S、T86A、N90G、N90E、N90T、N90P、N90C、L91H、L91P、L91F、L91V、L91R、Q93L、Q93M、Q93C、Q93H、Q93G、Q93R、Q93W、Q93D、Q93A、Q93N、Q93K、S95V、S95R、S95D、S95Y、S95G、S95Q、S95A、S95K、L101M、L101V、L101R、L101P、L101F、L101H、L101A、L101G、L101N、L101K、L101C、T102N、T102S、T102C、T102R、T102A、T102I、T102M、T102W、T102E、T102P、T102F、T103A、T103S、T103G、T103D、T103I、T103E、T103V、T103N、S134V、S134I、S134M、S134P、S134L、S134A、S134C、L137S、L137D、L137W、L137G、L137R、L137A、L137I、L137T、T139A、T139N、T139S、T139G、T139D、T139H、T139R、N142K、N142E、N142Q、N142R、N142G、N142H、N142W、N142A、L145S、L145W、L145N、L145C、L145V、L145R、L145D、S146V、S146G、S146L、S146T、S146A、S146C、S146P、S146F、S146R、S146W、N147K、N147E、N147S、N147F、N147T、N147I、N147D、N147P、N147Y、N147H、N147L、Y152V、Y152E、Y152L、Y152I、Y152A、Y152M、Y152R、Y152F、Y152G、V153R、V153Y、V153C、T154R、T154G、T154L、T154S、T154A、T154M、T154P、S155R、S155G、S155L、S155A、S155H、S155W、S155C、S155I、S155P、S155M、S155N、S155T、L157P、L157Q、L157V、L157M、L157R、W158R、W158E、W158C、W158K、W158L、W158G、P159S、P159R、P159V、P159Q、P159T、P159D、P159A、P159L、P159G、I160T、I160A、I160V、I160D、I160G、I160S、I160L、I160Y、I160N、I160F、Q162L、Q162K、Q162R、Q162S、Q162H、Q162P、Q162I、Q162V、N163D、N163G、N163R、N163T、N163I、N163Q、N163Y、N163K、N163H、N163W、N163A、N163S、S170A、S175W、S175R、S175T、S175C、T176S、T176R、T176L、T176A、T176W、T176I、Y177S、Y177T、Y177D、Y177V、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、R199K、R199V、R199A、R199M、R199N、R199W、R199T、R199E、A202S、A202T、A202Q、A202L、A202E、A202P、A202V、A202F、A202W、A202G、A203Q、A203K、A203W、A203R、A203V、A203L、A203M、A203T、A203E、A203G、A203S、A203P、T206I、T206S、T206W、T206V、T206A、T206P、T206G、T206R、Q210D、Q210R、Q210G、Q210A、Q210L、Q210H、Q210P、Q210V、Q210I、Q210C、T211P、T211R、T211S、T211D、T211Q、T211H、T211A、T211L、T211G、T211W、S212V、S212K、S212D、S212T、S212H、S212L、S212P、S212E、S212C、S212A、S212M、Q213Y、Q213D、Q213R、Q213N、Q213S、Q213W、Q213K、Q213L、Q213C、Q213P、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、Q220L、Q220P、Q220K、Q220R、Q220H、Q220E、A221V、A221T、A221E、A221G、A221P、D222E、D222M、D222A、D222G、D222N、D222V、D222H、N223K、N223R、L224V、F227A、F227V、F227L、F227S、F227Y、F227E、F227G、P234A、P234L、P234Q、P234S、S235C、S235R、S235W、S235G、S235K、Y238C、Y238L、Y238E、Y238W、Y238A、Y238S、Y238G、T240L、T240C、T240G、T240W、T240V、T240R、T240S、T240A、T240E、T243S、T243Q、T243M、T243G、T243L、T243V、T243E、T243P、T243R、T243W、G244W、G244D、G244Y、G244A、G244S、G244R、G245M、G245N、G245S、G245T、G245V、G245D、G245I、G246V、G246W、G246M、G246E、G246N、G246Q、G246S、G246D、G246R、S248E、S248L、S248C、S248G、S248P、S248F、S248T、A252S、A252T、A252V、A252P、A252G、T254A、T254S、T254G、T254P、L255V、L255A、L255P、L255I、L255C、A270W、A270T、A270E、A270C、A270M、A270S、A270L、A270G、A270R、A270Y、A270V、A271R、A271P、A271L、A271W、A271G、A271T、K279V、K279W、K279A、K279L、K279R、K279E、K279Y、K279P、K279G、K279S、S282G、S282T、S282L、S282V、S282F、S282R、S282A、S282I、S282W、L284V、L284G、L284S、L284M、L284T、Y295K、Y295H、Y295Q、Y295W、Y295M、Y295F、Y295C、Y295E、Y295V、S296A、S296T、S296K、S296N、S296Y、S296F、S296Q、S296P、S296L、S296D、I297L、I297V、I297H、I297R、I297W、I297K、I297T、I297F、I297G、I297Q、N298M、N298D、N298S、N298R、N298K、N298A、N298V、N298E、N298G、N298L、S299L、S299G、S299V、S299A、S299R、S299Q、S299M、S299I、S299P、S299T、G300A、G300N、G300D、G300R、G300L、G300F、G300C、G300P、G300W、G300T、G300S、A302L、A302R、A302P、A302V、A302K、A302M、A302Y、A302S、A302T、A302G、S303P、S303K、S303R、S303C、S303A、S303F、S303W、S303L、S303Q、N304V、N304G、N304P、N304W、N304F、N304E、N304T、N304D、N304R、N304S、N304A、N304I、N304M、N304K、S316T、S316C、S316A、S316R、S316P、S316H、S316K、S316F、S316G、S316Q、S316N、S316M、S316L、S316V、G319T、G319R、G319W、G319S、G319Q、G319A、G319D、T326S、T326G、T326A、T326C、T326Y、T326P、T326I、T326E、T326Q、V330M、V330G、V330I、V330D、V330P、V330L、V330Y、V330S、V330A、N339T、N339R、N339S、N339A、N339Q、N339P、E342L、E342K、E342T、E342M、E342R、E342V、E342H、E342G、E342Q、E342S、E342F、E342A、E342W、S343A、S343W、S343G、S343P、S343Q、S343T、S343E、S343R、S343L、Q344L、Q344V、Q344T、Q344D、Q344A、Q344H、Q344K、Q344R、Q344P、Q344E、E348C、E348G、E348V、E348M、E348N、E348A、E348I、E348D、E348L、E348K、E348R、S351Y、S351G、S351R、S351C、S351N、S351L、S351K、S351V、S351F、S351T、S351A、S351P、S351W、Q359A、Q359V、Q359T、Q359R、Q359G、Q359L、Q359K、Q359S、Q359P、Q359W、S362V、S362P、S362R、S362G、S362H、S362E、S362M、S362D、S362Y、S362C、S362F、S362A、S362Q、G363C、G363H、G363D、G363W、G363R、G363Q、G363S、G363A、G363T、G363P、T365R、T365W、T365G、T365L、T365C、T365Q、T365I、T365V、T365Y、T365S、T365E、A366R、A366L、A366I、A366Q、A366P、A366T、A366S、A366E、A366G、A366D、A366W、A366H、S371V、S371R、S371A、S371T、S371G、S371C、S371E、S371P、S372P、S372E、S372R、S372A、S372Q、S372N、S372G、S372R、S372L、S372V、S372M、S372C、S372W、T378P、T378A、T378K、T378W、T378M、T378Q、T378G、T378V、T378E、T378S、T378R、T378L、T378C、T378I、T378D、S381E、S381Y、S381D、S381N、S381R、S381G、S381V、S381A、S381T、S381P、S381W、S381Q、S381C、S381I、I383F、I383N、I383G、I383C、I383E、I383L、I383M、I383V、I383A、I383T、I383R、I383S、F386L、F386Y、F386R、F386S、F386G、F386M、F386C、F386W、F386A、A392V、A392R、A392T、A392S、A392E、A392L、A392G、A392P、A392F、A392M、A392I、A392Q、N394A、N394S、N394T、N394R、N394H、N394G、N394C、N394E、N394W、N394P、N394L、N394V、N394F、N394Q、N394K、K396S、K396P、K396M、K396F、K396Q、K396E、K396D、K396W、K396L、K396A、K396I、K396R、K396G、K396C、K396V、N401Q、N401V、N401F、N401S、N401T、N401G、N401R、N401C、N401A、N401D、N401K、N401E、N401Y、N401W、N401P、N401L、K410S、K410T、K410L、K410D、K410M、K410V、K410P、K410N、K410C、K410G、K410E、K410W、K410R、D412R、D412Q、D412S、D412P、D412E、D412N、D412G、D412V、D412L、D412W、D412A、D412K、D412M、D412T、S414P、S414A、S414W、S414G、S414L、S414R、S414E、S414N、S414T、S414Q、S417R、S417G、S417K、S417Y、S417A、S417N、V419D、V419E、V419A、V419G、V419M、V419L、V419I、D420V、D420A、E433W、E433P、E433M、E433Y、E433S、E433C、E433G、E433A、E433R、E433Q、E433K、N437V、N437E、N437D、N437M、N437T、N437A、N437S、N437W、N437L、N437P、N437Y、N437G、N437Q、N437K、N437R、T438R、T438A、T438K、T438W、Q439A、Q439R、Q439G、Q439W、Q439P、Q439C、Q439M、Q439Y、Q439D、F440T、F440L、F440W、F440E、F440S、G442V、G442L、G442D、G442A、G442C、G442S、G442F、G442M、G442I、G442Y、G442W、A446L、A446R、A446F、A446G、A446S、A446M、A446Q、A446W、A446V、A446P、A446D、N470W、N470G、N470L、N470S、N470P、N470Y、N470A、N470E、N470D、N470H、N470K、N470T、N470M、E472W、E472S、E472L、E472G、E472R、E472P、E472V、E472T、E472K、V474R、V474F、V474Y、V474I、V474M、V474W、V474E、V474Q、V474L、V474G、V474A、V474K、V474T、V474H、W475P、W475S、W475L、W475C、W475Q、W475G、W475R、W475T、N478V、N478A、N478S、N478T、N478R、N478K、N478G、N478L、N478M、N478I、N478D、N478W、N478E、S484Q、S484T、S484E、S484F、S484A、S484G、S484D、S484L、S484W、S484V、S484R、S484Y、S484P、S484M、V485L、V485T、V485A、V485S、V485R、V485G、V485I、V485E、V485D、V485F、V485K、D486I、D486G、D486R、D486E、D486S、D486A、D486T、D486K、D486F、D486M、D486Q、D486C、D486L、D486Y、D486P、A487M、A487E、A487V、A487S、A487C、A487G、S492L、S492P、S492V、S492R、S492Y、S492M、S492H、S492T、S492K、S492W、A493G、A493S、A493Y、A493V、A493T、A493E、A493Q、A493R、D494A、D494S、D494E、D494Q、D494Y、D494G、D494R、D494T、D494W、D494N、D494H、D494L、D494M、D494V、D494P、N495S、N495L、N495F、N495C、N495W、N495R、N495G、S501P、S501T、S501L、S501G、S501M、S501R、S501K、S501V、S501E、S501A、S501C、A502W、A502V、A502S、A502G、A502D、A502E、A502T、A502M、A502Y、A502H、I509G、I509R、I509W、I509A、I509V、I509L、I509S、I509P、I509T、I509E、I509H、I509N、T510R、T510I、T510A、T510H、T510S、T510Y、T510V、T510L、T510K、T510E、T510P、T510F、T510M、N512S、N512Q、N512L、N512G、N512W、N512I、N512M、N512Y、N512K、N512V、N512H、N512F、N512T、N512R、N512D、S516Y、S516R、S516P、S516T、S516G、S516V、S516N、S516L、S516F、S516M、S516A、S516W、S516C、S516K、A518G、A518P、A518W、A518V、A518R、A518L、A518M、A518F、A518Y、A518S、I519L、I519C、I519G、I519W、I519S、I519Y、I519N、I519A、I519V、I519Q、I519T、I519H、I519M、N527S、N527L、N527V、N527G、N527W、N527H、N527R、N527K、A530R、A530C、A530S、A530G、A530F、A530Y、A530W、A530T、A530V、E534M、E534A、E534V、E534W、E534C、E534R、E534T、E534L、E534G、E534F、E534S、E534Q、E534K、P537R、P537T、P537H、P537M、P537G、P537A、P537S、P537E、P537Y、P537L、P537V、N538G、N538V、N538R、N538A、N538W、N538D、N538M、N538S、N538I、N538Y、N539L、N539S、N539A、N539I、N539V、I541A、I541G、I541T、I541W、I541K、I541V、I541N、I541F、A545L、A545W、A545V、A545S、A545G、A545R、A545T、A545P、S546E、S546C、S546G、S546N、S546V、G547S、G547V、G547L、G547D、G547R、G547C、G547M、N552V、N552E、N552D、N552G和T554A、T554G、T554E、T554D、T554C，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.1的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[10].如段落8-9所述的变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、V3、D4、S5、S8、S9、I13、A16、V18、S27、S30、A32、V37、S44、S57、V59、F60、Y67、I71、S73、T74、S75、L77、R78、F84、V85、T86、Q93、S95、L101、T102、T103、L137、N142、N147、Y152、V153、L157、W158、N163、S186、R199、Q210、T211、S212、S215、N223、L224、P234、S235、T240、T243、T254、K279、S282、I297、N298、S299、G300、S303、E342、S343、Q344、E348、G363、A366、S381、A392、Q439、V474、W475、D486、A493、A502、T510、A518、I519、A530、E534、N538、S546和G547，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.2的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[11].如段落8-10所述的变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S5、S9、I13、V18、S30、V37、V59、I71、S73、T74、F84、V85、Q93、L137、N142、W158、N163、S186、S215、N223、P234、S235、S299、E348、Q439、D486、A493、E534和S546，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.3的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[12].如段落8-11所述的变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S5、S9、S30、V37、S73、F84、V85、S186、S215、Q439、D486、E534和S546，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.5的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[13].如段落8-12中任一段所述的变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、S73A、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、Q439A、Q439R、Q439G、Q439W、Q439P、Q439C、Q439M、Q439Y、Q439D、D486I、D486G、D486R、D486E、D486S、D486A、D486T、D486K、D486F、D486M、D486Q、D486C、D486L、D486Y、D486P、E534M、E534A、E534V、E534W、E534C、E534R、E534T、E534L、E534G、E534F、E534S、E534Q、E534K、S546E、S546C、S546G、S546N和S546V，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供葡糖淀粉酶变体，该变体具有作为改进因子IF测量的至少1.5的比活性的增加，并且进一步地其中所述变体与具有SEQID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[14].如段落1-7中任一段所述的变体，该变体包含对应于位置43的取代，具体地T43K并且其中与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶的解链温度相比，所述解链温度的增加是至少2℃、例如至少3℃。
段落[15].如段落1-13中任一段所述的变体，该变体包含对应于选自下组的一个位置的取代，该组由以下组成：位置4、5、13、15、18、85，具体地是选自以下的取代：D4R、S5V、I13S、K15R、V18M、V85G，其中该变体与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比具有改进的比活性。
段落[16].如段落1-15中任一段所述的变体，其中所述变体进一步包含对应于S95P和A121P、尤其是S95P+A121P的取代。
段落[17].如段落1-16中任一段所述的变体，其中所述变体进一步包含对应于S95P+A121P+Y295W或S95P+A121P+Y295W+Q318Y的取代。
段落[18].如前述段落中任一段所述的变体，其中所述变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：
T43K；
D4R；
S5V；
I13S；
K15R；
V18M；
V85G；
S95P+A121P+Y295W+T43K；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
D4R+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
S5V+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
I13S+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W；
并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比具有增加的比活性、和/或通过TSA测量的增加至少2℃、具体地至少3℃的解链温度。
段落[19].如段落1-18中任一段所述的变体，该变体与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
段落[20].如段落1-19中任一段所述的变体，其中改变的数目是1-20、例如1-10和1-5、如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
段落[21].一种组合物，其包含如段落1-19中任一段所述的葡糖淀粉酶变体。
段落[22].根据段落21所述的组合物，其进一步包含普鲁兰酶。
段落[23].根据段落21所述的组合物，其进一步包含α-淀粉酶。
段落[24].如段落1-19中任一段所述的多肽用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。
段落[25].一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉的材料液化；(b)使该液化的材料糖化；和(c)用发酵生物进行发酵；其中使用如段落1-19中任一段所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(b)。
段落[26].根据段落25所述的方法，其中步骤(b)和步骤(c)同时进行。
段落[27].一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在低于含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉的材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵，
其中使用根据段落1-19中任一段所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(a)。
段落[28].一种由含淀粉的材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉的材料液化；(b)在如段落1-19中任一段所述的变体葡糖淀粉酶的存在下，使该液化的材料糖化。
段落[29].一种从含淀粉的材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：在如段落1-19中任一段所述的变体葡糖淀粉酶的存在下，在低于含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下，使该含淀粉的材料糖化。
段落[30].一种多核苷酸，其编码如段落1-19中任一段所述的变体。
段落[31].一种核酸构建体，其包含如段落30所述的多核苷酸。
段落[32].一种表达载体，其包含如段落30所述的多核苷酸。
段落[33].一种宿主细胞，该宿主细胞包含如段落30所述的多核苷酸、或如段落31所述的核酸构建体或如段落32所述的表达载体。
段落[34].根据段落33所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母细胞，特别是酵母属，例如酿酒酵母。
段落[35].如段落25-27中任一段所述的方法，其中如段落34所述的宿主细胞在发酵步骤中作为发酵生物应用并且该发酵产物是乙醇。
段落[36].如段落25-27中任一段所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。
段落[37].一种产生如段落1-19中任一段所述的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括：在适合于表达该变体的条件下培养如段落33所述的宿主细胞；以及任选地回收该变体。
本发明进一步通过以下实例进行描述。
实例
实例1：
可以按单位AGU来测量葡糖淀粉酶活性。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间：6分钟，如以下葡糖淀粉酶孵育中所说明的)每分钟水解1微摩尔麦芽糖由此产生葡萄糖的酶的量。
通过3个反应步骤描述分析原理：
步骤1是一个酶反应：
葡糖淀粉酶(AMG)EC 3.2.1.3(外切-α-1,4-葡聚糖-葡糖淀粉酶)水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。
步骤2和步骤3引起终点反应。
在由己糖激酶催化的反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。可以使用自动分析仪系统例如Konelab 30分析仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))。
用于测定方案的试剂：
通过将44.4g三水合乙酸钠(默克公司(Merck)目录号61751805001730)和37.5ml乙酸(飞世尔公司(Fisher)目录号11007)溶解在Milli Q水中来制备1M乙酸钠缓冲液的储备溶液。将pH调节至4.3并且将缓冲液的最终体积补充至1000ml。将这一缓冲储备溶液保存在4℃下直到使用。通过将100ml的1M储备溶液添加至900ml的Milli Q水中制备100mM工作溶液。
通过将100mg的4-硝基苯基-α-D-葡萄吡喃糖苷(西格玛公司(Sigma)目录号N1377)溶解在100ml的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)中制备新鲜的0.1％的4-硝基苯基-α-D-葡萄吡喃糖苷(pNPG)的底物溶液。
通过将38.1g的硼砂(飞世尔公司(Fisher)目录号27965)溶解在1000ml的Milli Q水中来制备0.1M硼砂(四硼酸二钠)终止溶液的储备溶液。将这一终止溶液储存在室温下直到使用。
通过将1g麦芽糖(西格玛公司(Sigma)目录号M5885)溶解在100ml的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)中制备新鲜的1％麦芽糖的底物溶液。
通过将64.6mg的阿卡波糖(西格玛公司(Sigma)目录号A8980)溶解在100ml的Milli Q水中制备1000μM阿卡波糖溶液的储备溶液。将这一储备溶液储存在4℃下直到使用。通过将336μl的1000μM储备溶液添加至59.66ml的Milli Q水中制备5.6μM工作溶液。
比活性(SA)的确定：
使用阿卡波糖测定方法用于确定在培养上清液中的比活性。该方法使用已知浓度的阿卡波糖，导致50％的蛋白质活性抑制。基于相对淀粉葡糖苷酶活性计算(RAG)将培养上清液的活性归一化，并确定已知浓度的阿卡波糖的抑制。然后将所得残余活性用于计算培养上清液中淀粉葡糖苷酶的比活性。比活性使用以下等式计算。
Vsa＝Vm x(1-Va/Vdw)
Vm＝使用麦芽糖底物的变体的A505
Va＝使用阿卡波糖的变体的A400
Vdw＝不使用阿卡波糖的变体的A400
葡糖淀粉酶比活性(SA)
通过由Konelab仪器确定的AGU测定来确定纯化的蛋白质的比活性。
相对淀粉葡糖苷酶(RAG)活性的确定
通过相对淀粉葡糖苷酶单位(RAG)测定来确定变体和对照的培养上清液的RAG/ml。
在384-孔微量滴定板(能肯公司(Nunc)目录号262160)中制备用于RAG测定的反应混合物。将未加工的上清液(5μl)样品添加到15μl的100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)中。将40μl的0.1％pNPG底物添加到该板中并且将其在室温(25℃)下孵育15分钟。通过添加30μl的终止溶液来终止反应并且使用Infinite M1000读取仪(TECAN，瑞士)测量在400nm下的吸光度。
使用以下等式计算每个样品的RAG/ml活性：
RAG/ml＝((S-B)x F x AGs)/Ss-Bs
S＝样品值
B＝培养基空白值
Ss＝蛋白质标准品(0.6AGU/ml)值
Bs＝缓冲液空白值
F＝稀释因子
AGs＝蛋白质标准品的GU/ml(0.6AGU/ml)
培养上清液的归一化
基于样品的初始RAG/ml，将每个未加工的上清液样品用100mM乙酸钠缓冲液(pH4.3)归一化至0.6RAG/ml，最终体积为220μl。计算单个样品未加工上清液和缓冲液的所需体积以将其归一化至0.6RAG/ml。为了归一化，将100mM乙酸钠缓冲液(pH 4.3)的计算的体积添加至96孔微量滴定板(能肯公司(Nunc)目录号260836)上。将未加工的上清液样品添加至同一个96孔微量滴定板中并充分混合。
麦芽糖测定
关于归一化样品对麦芽糖的活性，将10μl的归一化样品与90μl的1％麦芽糖底物在96孔拜力(Abgene)PCR板(赛默科技公司(Thermo Scientific)目录号AB0800)中混合并且在可编程热循环仪(T-ROBOT)中在45℃下孵育12分钟。孵育后，将10μl的反应混合物与200μl的Wako溶液(LabAssay葡萄糖，和光公司(WAKO)目录号298-65701)在96-孔微量滴定板(能肯公司(Nunc)目录号260836)中混合并且在室温下孵育(25℃)15分钟。使用InfiniteM1000读取仪(TECAN，瑞士)在505nm处测量吸光度。
阿卡波糖抑制
在使用和不使用阿卡波糖(0.7μM)的情况下通过归一化样品的葡糖淀粉酶(AMG)活性确定阿卡波糖抑制。将70μl的归一化样品用10μl的5.6μM阿卡波糖在96孔微量滴定板(能肯公司(Nunc)目录号260836)中在25℃下孵育10分钟。通过使用pNPG作为底物测量在使用阿卡波糖和不使用阿卡波糖的情况下孵育的归一化样品的AMG活性。将20μl的样品转移到384孔微量滴定板(能肯公司(Nunc)目录号262160)上并且与40μl的0.1％pNPG底物混合。在25℃下孵育1小时后，通过添加30μl的0.1M硼砂终止反应。使用Infinite M1000读取仪(TECAN，瑞士)在400nm处读取吸光度。
将从麦芽糖和阿卡波糖抑制获得的这些吸光度值拟合在上述用于确定比活性的等式中。
用于确定热稳定性的热转移测定：
通过使用荧光蛋白结合染料(宝石橙(SYPRO Orange)；西格玛公司(SIGMA)S5692)测量蛋白质的热稳定性来确定热改变(Tm)。宝石橙(SYPRO Orange)非特异地结合疏水表面。当蛋白质展开时，暴露的疏水表面结合染料，导致荧光增加。通过逐渐增加温度来展开蛋白质并且测量在各点上的荧光来获得稳定性曲线和其中点值(解链温度，Tm)。
将5-10μl的培养上清液(GsAMG)与17.5μl的缓冲液(50mM乙酸钠，pH 4.5)和2.5μl的2.5X TAMRA染料(含有连接至报道基因的宝石橙(SYPRO Orange))混合。将总反应体积保持在约30uL并在室温下制备。最后将平板离心并且用应用生物系统公司(AppliedBiosystems)微AMP光学粘附膜(目录号4311971)覆盖。可以在将样品温度控制和染料荧光检测组合的仪器(7500快速实时PCR，应用生物系统公司(Applied Biosystems))上，进行基于荧光的热转移测定。该仪器将在缓冲液50mM乙酸钠(pH 4.5)中的样品从45℃加热至78℃。
在96孔应用生物系统公司(Applied Biosystems)微AMP快速光学反应板(43669320)中制备反应混合物。使用由TSA确定的每种变体的解链温度(Tm)作为热稳定性的指标。相对于平板上4种野生型的平均值(＝Tm个体变体/平均Tm野生型)计算热稳定性的改进因子(IF)。Tm值取自荧光图的拐点(通过蛋白质热改变软件(Protein Thermal ShiftSoftware)(Boltzmann方法)(应用生物系统公司(Applied Biosystem))计算)。将当与野生型Tm比较时挑选出具有更高的热稳定性的变体。
实例2：比活性和解链温度的确定
产生了根据本发明的变体，并且其改进被测量为通过上文所述的阿卡波糖测定确定的增加的比活性和/或通过热转移测定(TSA)确定的增加的解链温度。结果披露在下表中。
表1.披露了作为解链温度增加而测量的增加的热稳定性的变体。对于每个位置都披露了观察到的最大增加。
表2.披露了作为改进因子(IF)增加而测量的增加的比活性的变体对于每个位置都披露了观察到的最大增加。
实例3.对选择的变体的进一步评估
最小纯化和比活性确定
通过阿卡波糖滴定选择的54名候选者经受半纯化和比活性确定。通过摇瓶培养菌株(附录1)，并将1ml培养上清液在96深孔板中用100mM乙酸盐缓冲液(pH 4.0)吸附到α-CD琼脂糖凝胶上。将AMG吸附的树脂用100mM乙酸盐缓冲液(pH 4.0)通过离心洗涤，并且将AMG用在100mM乙酸盐缓冲液(pH 4.0)中的10mMβ-CD洗脱。通过用AGU测定确定AMG活性(如下文附录2中所述确定的)和通过280nm吸光度确定的蛋白质的量计算，确定与Gs-WT AMG相比的相对比活性。在所测试的54个样品中，特别是6个样品(D4R、S5V、I13S、K15R、V18M和V85G)显示出比活性的改进。
所选择的的变体的比活性确定
对表达6种候选者(D4R、S5V、I13S、K15R、V18M和V85G)和Gs-AMG(篱边粘褶菌葡糖淀粉酶)野生型的菌株进行SF培养用于样品制备。用0.2μm灭菌过滤器过滤的培养上清液用α-CD偶联的琼脂糖凝胶通过亲和层析进行纯化。附录1中描述了培养和纯化程序的细节。通过AGU测定确定的AMG活性(附录2)和通过280nm的吸光度确定的蛋白质的量来计算纯化样品的比活性。根据附录2的方法计算的改进因子的值不能直接与实例1和2中计算的IF值进行比较。
组合变体的表征
结合在WO 2016/062875和WO 2014/177546中披露的先前描述的密粘褶菌葡糖淀粉酶的变体，引入来自实例2的选择的变体和来自上述实例3的一些进一步确认的变体(T43K、V18M、D4R和S5V)。
将所测试的取代组合引入SEQ ID NO:3的Gs-AMG wt葡糖淀粉酶中。通过PCR的点突变构建每种表达质粒，并将构建的质粒用于黑曲霉宿主菌株的转化。通过SF培养所获得的转化体并对培养上清液进行纯化和表征以通过热改变测定(附录3)确定比活性(SA)和变性温度(Td)。
将表征结果汇总在下表中。
附录1
SF培养
将菌株接种到COVE-N-gly平板上，并将它们在30℃下培养1周。然后将1cm2的菌丝接种到500ml摇瓶中的100ml MSS中，并在30℃、200rpm下将其培养3天。然后将10ml种子培养物接种到500ml摇瓶中的100ml MU-1中，并在30℃、200rpm下将其培养6天。
阿卡波糖亲和层析
样品制备
如有必要，通过添加2M乙酸钠缓冲液至50mM，将样品的pH调节至pH4-5。
加载柱之前，使用0.22μm PES膜过滤样品。加载之前，将样品保持在4℃下。
层析法
层析条件
系统：配备有空气传感器的Akta explorer 10S
柱：α-CD偶联的琼脂糖凝胶、35ml柱体积(CV)，装填在玻璃柱(GE医疗集团(GEhealthcare)，26mm内径(id)x可变高度，有防护罩)中
平衡缓冲液(缓冲液A)：50mM NaOAc，150mM NaCl，pH 4.5
洗脱缓冲液(缓冲液B)：50mM NaOAc，150mM NaCl，10mMβ-环糊精，pH 4.5
#缓冲液通过0.22μm PES膜过滤，并在使用前通过应用超声波的真空吸引器进行脱气。
流速：5ml/min
级分尺寸：10ml
样品体积：5ml–1000ml
程序
1.用缓冲液A平衡，3CV
2.经由采样泵加载样品，5ml-1000ml
3.用缓冲液A洗涤柱，3CV
4.用缓冲液B洗脱，3CV
(用于多个样品)
5.用0.1M NaOH再生柱，3CV
合并级分
优选地在洗脱步骤中只观察到一个AMG峰。根据A280峰收集级分。
缓冲交换
使用MWCO:12000透析管通过在4℃下对10L缓冲液过夜透析将合并的级分缓冲交换至20mM乙酸钠pH 4.5中，并使用超滤膜(例如，配备有MWCO 5000膜的Vivacel 250(不建议使用10000)或Amicon Ultra YM-15MWCO 12000)将样品浓缩至适当体积。
附录2
通过3个反应步骤描述分析原理：
步骤1是一个酶反应：
淀粉葡糖苷酶(AMG)EC 3.2.1.3(外切-α-1,4-葡聚糖-葡糖水解酶)水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。
步骤2和步骤3引起一个终点反应：
在由己糖激酶催化的反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。
测定程序
将100μl底物(100mM麦芽糖在pH 4.3的100mM乙酸盐缓冲液中)在37℃下孵育8分钟，并将20μl样品添加到预孵育的底物中，并将混合物孵育6分钟。通过添加20μl NaOH终止反应。添加110μl的GHK试剂(来自Thermo Fisher Scientific[赛默飞世尔科技公司]的KonelabTM System葡萄糖试剂，目录号981304)至反应混合物中并孵育7分钟。然后，确定340nm的吸光度。
附录3
通过热转移测定(TSA)测量变性温度(Td)
纯化的酶用去离子水稀释至0.25mg/ml，并且将宝石橙(SYPRO Orange)荧光染料(英杰公司(Invitrogen))用去离子水稀释1666倍。将稀释的酶和稀释的染料以1:1混合，并将30μl混合物转移到96孔白色PCR板的孔中。将温度从37℃线性增加至96℃，通过实时PCR设备(LightCycler480，罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))监测每孔中荧光的变化。运行参数示于下表中。将所获得的曲线(信号相对于温度)进行归一化使得信号的局部最小值和局部最大值分别为0和1，并且将给出0.5的归一化信号的温度定义为变性温度(Td)。
| 温度缓变率： | 0.02℃/秒 |
| 温度扫描范围： | 36.9℃至95.9℃ |
| 信号整合时间： | 0.25秒 |
| 激发WL： | 465nm |
| 发射WL： | 580nm |
序列表
<110> 诺维信公司
<120> 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸
<130> 13323-WO-PCT
<160> 3
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1722
<212> DNA
<213> 篱边粘褶菌（Gloeophyllum sepiarium）
<400> 1
atgtaccgct tccttgtctg tgcgctgggg cttgcggcat cagttctcgc ccagtcggtc 60
gacagctatg ttagcagcga aggtcccata gccaaggcgg gcgtccttgc taacattggg 120
ccgaacggct ccaaggcctc tggcgcatcc gctggtgttg tggtcgcgag ccctagcacg 180
tcggaccccg actattggta cacttggacg cgtgactcgt ccctcgtatt caagtcactt 240
attgaccagt acaccaccgg catcgacagc acgagctctc tgaggactct catcgacgat 300
ttcgtaactg ccgaggctaa tctccagcaa gtctctaacc ctagtggtac cctcaccacc 360
ggtggcttgg gagagcccaa gttcaacgtc gacgaaactg catttactgg tgcatggggt 420
cgaccccaac gcgacggacc tgccctccgc tcgactgcat tgatcacgta cggtaactgg 480
ctgttgtcca acggaaatac gagctatgtt acgagcaatc tgtggccgat catccagaac 540
gaccttggtt atgtcgtgtc atactggaac cagtctacct acgacctctg ggaggaagta 600
gactcgtcat cgttcttcac tactgcagta cagcaccgtg ctctccgtga aggtgcggcc 660
ttcgctaccg ccatcggtca gacttcgcag gtcagcagct atacgactca ggcggacaat 720
cttctgtgct tcttgcagtc ttactggaac ccgagcggtg gttacatcac tgctaacact 780
ggcggcggcc gttccggcaa ggatgccaac acacttctgg catccattca cacgtacgac 840
cccagcgcgg gctgcgacgc tgcgactttc cagccctgct ctgacaaggc actgtcgaac 900
ctgaaggtct acgtcgactc tttccgctcg gtctactcca tcaacagtgg tgtcgcctct 960
aacgctgccg tcgccacggg tcgttatccc gaggatagct accagggtgg aaacccttgg 1020
tacctcacca catttgcggt cgccgagcaa ctctatgatg ctctcaatgt ctgggagtcg 1080
cagggttccc tcgaggtcac ctccacctcc cttgccttct tccagcagtt ctcatccggc 1140
gtcactgctg gcacctactc ttctagctcc agcacataca gcaccctcac gtctgccatc 1200
aagaactttg ccgatggatt tgtcgctatc aatgctaagt acacgccatc caacggtggc 1260
ctggcggaac aatacagcaa gagcgacggt tctcccctta gcgcggtgga cttgacgtgg 1320
agctacgctt cggctttgac ggcgtttgaa gcaaggaaca atactcagtt cgccggctgg 1380
ggcgctgcag gcctgactgt gccttcctct tgctccggca actctggtgg gccgaccgtt 1440
gctgtcacat tcaacgtgaa cgccgagact gtgtggggag agaacatcta tcttactggt 1500
tccgtcgatg ctctggagaa ctggtcggcc gacaatgccc tcctgctctc atcggctaat 1560
tacccgacct ggagtatcac cgtcaacttg ccggcgagca ctgctattga gtacaagtac 1620
atccgcaaaa ataatggggc cgttacctgg gagtcagacc ccaacaatag catcactact 1680
ccggccagcg gctcgacgac cgagaatgac acttggcgtt ga 1722
<210> 2
<211> 573
<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌
<400> 2
Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys
20 25 30
Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp
50 55 60
Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr
85 90 95
Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser
100 105 110
Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe
115 120 125
Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro
165 170 175
Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser
180 185 190
Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala
210 215 220
Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn
225 230 235 240
Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu
260 265 270
Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala
275 280 285
Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser
305 310 315 320
Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly
325 330 335
Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser
355 360 365
Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile
385 390 395 400
Lys Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro
405 410 415
Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro
420 425 430
Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala
435 440 445
Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly
450 455 460
Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val
465 470 475 480
Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile
485 490 495
Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn
500 505 510
Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val
515 520 525
Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn
530 535 540
Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr
545 550 555 560
Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
565 570
<210> 3
<211> 556
<212> PRT
<213> 篱边粘褶菌
<400> 3
Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala
20 25 30
Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp Tyr
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile
50 55 60
Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr Leu
65 70 75 80
Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser Asn
85 90 95
Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn
100 105 110
Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp
115 120 125
Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro Ile
145 150 155 160
Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser Thr
165 170 175
Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala
180 185 190
Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala Ile
195 200 205
Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu
210 215 220
Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr
260 265 270
Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val
275 280 285
Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser Asn
290 295 300
Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly
305 310 315 320
Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser Thr
340 345 350
Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly Thr
355 360 365
Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys
370 375 380
Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro Leu
405 410 415
Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe
420 425 430
Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly Leu
435 440 445
Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val Ala
450 455 460
Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn Ala
485 490 495
Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn
500 505 510
Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn Asn
515 520 525
Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr Pro
530 535 540
Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg
545 550 555
Claims (24)
1.一种葡糖淀粉酶变体，所述变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S2、V3、D4、S5、S8、S9、I13、K15、V18、L19、N25、S27、K28、S30、V36、V37、T43、D45、S57、V59、F60、I71、S73、T74、L77、D82、D83、V85、T86、E88、L91、S95、P97、T103、D114、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、N149、Y152、V153、T154、S155、N156、L157、W158、P159、I160、Q162、V169、S170、S175、T176、Y177、D184、S186、R199、A202、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、V214、S215、Y217、T218、T219、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、Y231、P234、S235、Y238、T240、T243、G244、G245、G246、R247、S248、A252、T254、L255、Y262、S265、G267、A270、A271、K279、S282、L284、V294、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、A302、S303、N304、T309、E314、S316、Q318、G319、T326、V330、N339、E342、S343、E348、S351、T352、Q359、S362、G363、V364、T365、A366、S371、S372、T378、S381、I383、N385、F386、A392、N394、K396、Y408、K410、D412、S414、S417、V419、A426、S427、E433、A434、N436、N437、T438、Q439、G442、A446、L448、V450、N470、E472、V474、W475、N478、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、S501、A502、T506、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、N528、A530、E534、D536、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、S548、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了具有通过TSA测量的至少0.5摄氏度解链温度的增加的葡糖淀粉酶变体，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
2.根据权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体，所述变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1K、Q1R、S2E、S2K、S2L、S2P、S2R、V3L、V3G、V3R、D4R、D4S、D4G、D4A、D4W、S5L、S5V、S5G、S5C、S5R、S8Q、S8H、S8A、S8Y、S9C、S9Q、S9M、S9W、S9D、S9G、I13V、I13R、I13S、I13L、I13E、K15G、K15R、V18M、V18Q、L19G、L19F、N25S、N25A、S27A、S27L、S27G、S27V、S27C、K28C、K28R、S30Q、S30A、S30K、S30T、S30L、V36K、V36G、V36W、V36A、V36I、V37R、V37K、V37G、V37C、V37M、V37S、V37T、V37D、T43K、D45L、D45P、S57P、S57L、S57G、S57F、S57R、S57T、S57A、V59T、V59S、V59E、F60S、I71M、I71S、I71T、I71V、S73H、S73R、S73N、S73V、S73G、T74V、L77S、L77P、L77R、D82N、D82R、D82V、D82G、D83L、D83C、D83W、V85Q、V85G、V85P、T86R、T86V、E88Q、E88R、E88G、L91S、L91P、L91G、S95A、S95T、S95V、P97T、P97I、P97R、T103Y、T103A、T103G、D114G、D114N、D114M、D114R、D114C、S134P、S134A、S134V、S134W、S134D、S134H、S134L、S134G、L137W、L137S、L137A、L137V、L137G、L137D、L137R、L137P、T139D、T139P、T139V、N142Y、N142H、N142C、L145C、L145D、L145G、L145V、L145S、S146W、S146L、S146R、S146G、S146P、N147Q、N147V、N147L、N147K、L147D、L147Y、L147H、L147S、N149H、N149T、N149R、N149K、N149S、Y152S、Y152A、Y152R、Y152L、Y152K、Y152E、Y152P、Y152V、Y152I、Y152C、Y152W、V153E、V153S、V153G、V153W、V153Y、T154N、T154R、T154K、T154P、T154V、S155C、S155P、S155R、S155G、S155A、N156I、N156A、N156V、N156R、N156T、N156K、L157P、L157R、L157A、L157G、L157W、W158T、W158A、W158M、W158V、W158R、W158P、P159S、P159G、P159L、P159V、P159A、P159R、P159Q、P159E、I160A、I160G、I160N、I160T、I160R、I160V、Q162L、Q162V、Q162H、Q162P、Q162R、V169A、V169L、V169W、V169S、V169D、V169R、V169E、S170A、S170P、S170R、S170M、S175L、S175C、S175W、T176R、T176L、T176N、T176A、T176S、T176I、Y177H、D184P、D184W、D184S、D184Y、D184G、S186A、S186R、S186W、R199F、R199E、R199L、R199C、R199K、A202R、A202W、A202E、A202S、A202V、A203M、A203W、A203P、A203L、T206C、T206P、T206G、T206A、T206R、Q210C、Q210G、Q210S、Q210R、Q210L、Q210P、Q210V、T211R、T211A、T211H、T211K、T211Q、T211G、T211W、T211E、T211I、T211V、T211P、T211L、T211D、S212D、S212E、S212L、S212P、S212T、Q213W、Q213V、Q213D、Q213A、Q213T、Q213R、Q213G、Q213S、V214G、V214R、V214W、V214A、V214I、S215R、S215G、S215L、S215Y、S215P、S215E、S215W、Y217G、Y217C、Y217A、Y217S、Y217T、Y217F、T218H、T218C、T218A、T218M、T218Q、T218G、T219R、T219D、T219S、T219G、T219C、Q220R、Q220V、Q220D、Q220S、Q220L、A221V、A221T、A221L、A221P、A221R、A221E、D222V、D222W、D222T、D222G、D222L、D222R、D222N、D222F、D222M、N223A、N223S、N223R、N223F、N223P、N223G、N223L、L224G、L224D、L224K、L224V、L224R、F227G、F227W、Y231S、Y231T、Y231R、Y231L、Y231A、Y231V、Y231N、P234D、P234L、P234S、P234V、S235C、S235R、S235N、S235G、S235W、Y238R、Y238A、Y238Q、Y238C、Y238E、T240C、T240I、T240L、T240S、T243V、T243S、T243L、T243R、G244R、G244C、G244P、G244D、G244W、G245R、G245S、G245V、G245W、G245M、G246L、G246E、G246S、G246R、G246K、G246W、G246D、R247E、S248Y、S248P、S248V、S248L、S248F、S248A、S248E、S248W、S248K、S248T、A252E、A252T、A252Y、A252V、A252L、T254D、T254W、T254V、T254G、T254A、L255R、L255Q、L255P、L255G、Y262C、Y262Q、Y262S、Y262G、Y262V、Y262A、Y262W、S265C、S265P、S265G、S265L、G267W、G267C、A270L、A270M、A271W、A271Y、A271L、K279R、K279W、K279E、K279P、K279G、K279F、S282W、S282T、S282K、S282R、L284N、L284Q、L284T、L284S、L284R、L284G、L284V、V294G、V294W、V294E、V294S、Y295V、Y295R、S296F、S296L、S296W、S296K、I297S、I297P、I297K、I297F、I297R、I297W、N298W、N298G、N298C、N298V、N298L、N298A、S299P、S299C、S299M、S299L、S299T、G300S、G300A、G300P、G300L、G300W、A302G、A302L、A302C、A302R、A302V、S303P、S303V、S303C、S303A、S303R、N304T、N304R、N304Q、N304L、N304V、T309G、T309I、T309R、T309M、E314Y、E314T、E314V、E314G、E314S、E314L、E314A、S316T、S316L、S316G、S316F、S316R、S316P、S316V、S316Q、Q318L、Q318R、G319R、G319Q、G319P、G319A、T326V、T326G、T326W、T326N、T326A、V330S、V330L、V330P、V330R、V330A、V330G、N339P、N339A、N339T、E342M、E342W、E342N、E342L、E342R、S343R、S343C、E348W、E348F、E348P、E348V、E348G、E348M、S351P、S351C、S351G、S351R、S351L、S351W、T352P、T352L、T352G、T352Q、T352Y、Q359K、Q359P、Q359R、Q359S、Q359A、S362P、S262R、S262G、S262M、G363R、G363T、G363P、V364A、V364C、V364E、V364S、V364G、V364L、T365S、T365G、T365W、T365L、T365H、A366D、A366T、A366P、A366R、A366H、S371A、S371G、S372A、S372E、S372C、S372L、S372R、T378G、T378L、T378D、T378H、T378A、T378P、S381K、I383A、I383G、I383C、I383L、I383T、I383M、N385R、N385W、N385S、N385G、N385D、F386S、F386W、F386Q、F386V、F386I、F386G、F386C、F386A、F386T、F386L、A392V、A392L、A392E、A392G、N394D、N394R、N394Y、N394W、N394E、K396I、K396W、K396P、K396Y、K396F、Y408V、Y408E、Y408P、Y408S、Y408K、Y408L、K410S、K410R、D412M、D412S、D412N、D412W、D412L、D412R、S414C、S414R、S414G、S414V、S414W、S414H、S417Y、V419S、V419G、V419C、V419A、V419K、V419R、V419T、A426M、A426N、A426K、A426R、S427G、S427A、S427P、S427N、S427D、S427L、E433C、A434Q、A434G、N436S、N436P、N436D、N437K、N437R、N437T、N437P、T438E、T438G、Q439W、Q439S、Q439G、Q439C、Q439R、Q439Y、G442V、G442D、G442C、G442A、G442L、G442W、G442E、G442M、G442R、A446G、A446D、A446R、A446E、A446I、L448G、L448P、L448E、V450P、V450S、V450C、V450E、V450L、V450N、N470H、N470D、N470K、N470V、N470L、E472I、V474W、V474C、V474A、V474L、V474G、W475P、W475A、W475R、N478L、N478I、N478P、N478R、N478W、N478S、N478G、N478K、N478A、S484G、S484Y、S484P、S484A、S484N、V485A、V485W、V485K、V485G、V485R、D486I、D486K、D486Y、D486S、D486A、D486W、D486L、A487S、A487V、A487L、A487G、A487C、A487K、S492L、S492R、S492T、S492W、S492P、S492C、A493V、A493R、A493D、A493W、D494N、D494R、D494G、D494L、D494E、D494Q、N495L、N495W、N495G、N495R、N495C、S501R、S501L、S501M、S501K、S501W、A502C、A502Q、A502W、A502G、A502V、T506A、T506P、T506V、I509E、I509D、I509S、I509F、I509W、I509R、T510F、T510E、T510R、T510P、T510V、T510A、T510L、N512Q、N512K、N512H、N512R、N512V、S516R、S516W、S516P、S516K、S516Y、S516C、A518D、A518G、A518Y、A518V、A518R、A518L、A518T、I519W、I519L、I519R、I519F、I519K、N527T、N527K、N527P、N527L、N528D、N528G、N528K、N528V、N528E、N528L、A530R、A530C、A530G、A530V、A530S、A530T、E534W、E534Q、E534C、E534V、E534G、E534R、E534F、E534K、D536G、D536R、D536W、D536H、D536K、D536N、D536M、D536C、D536V、P537D、P537M、P537W、P537G、P537E、N538D、N538S、N538W、N538Y、N538A、N539M、N539R、N539P、N539A、I541A、I541T、I541V、I541G、I541N、A545R、A545T、A545V、A545L、S546P、S546G、S546C、S546E、S546N、G547D、G547S、G547V、S548P、S548W、S548L、S548G、S548T、N552V、N552E、N552F、N552A、N552R、N552G和T554Q、T554G，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了具有通过TSA测量的至少0.5摄氏度解链温度的增加的葡糖淀粉酶变体，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
3.一种葡糖淀粉酶变体，所述变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1、S2、V3、D4、S5、S8、S9、G11、I13、K15、A16、V18、L19、N25、S27、S30、A32、A34、V36、V37、S44、S57、V59、F60、Y67、T68、I71、D72、S73、T74、S75、S76、L77、R78、D82、D83、F84、V85、T86、N90、L91、Q93、S95、L101、T102、T103、S134、L137、T139、N142、L145、S146、N147、Y152、V153、T154、S155、L157、W158、P159、I160、Q162、N163、S170、S175、T176、Y177、S186、R199、A202、A203、T206、Q210、T211、S212、Q213、S215、Q220、A221、D222、N223、L224、F227、P234、S235、Y238、T240、T243、G244、G245、G246、S248、A252、T254、L255、A270、A271、K279、S282、L284、Y295、S296、I297、N298、S299、G300、A302、S303、N304、S316、G319、T326、V330、N339、E342、S343、Q344、E348、S351、Q359、S362、G363、T365、A366、S371、S372、T378、S381、I383、F386、A392、N394、K396、N401、K410、D412、S414、S417、V419、D420、E433、N437、T438、Q439、F440、G442、A446、N470、E472、V474、W475、N478、S484、V485、D486、A487、S492、A493、D494、N495、S501、A502、I509、T510、N512、S516、A518、I519、N527、A530、E534、P537、N538、N539、I541、A545、S546、G547、N552和T554，其中所述位置对应于在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子IF测量的至少1.1的比活性的增加的葡糖淀粉酶变体，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
4.如权利要求3所述的葡糖淀粉酶变体，所述变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：Q1R、Q1L、Q1T、Q1G、Q1P、Q1K、Q1M、Q1F、Q1S、Q1A、Q1W、S2V、S2Q、S2E、S2D、S2P、S2A、S2T、S2L、S2R、S2K、S2W、S2G、V3G、V3L、V3I、V3A、V3E、D4R、D4C、D4S、D4G、D4N、D4V、D4W、D4F、D4A、S5V、S5R、S5P、S5L、S5G、S5C、S5N、S5Q、S5T、S8A、S8W、S8R、S8L、S8Y、S8G、S8M、S8H、S8P、S8Q、S8V、S8C、S8E、S8K、S8T、S9D、S9Q、S9R、S9G、S9A、S9N、S9E、S9K、S9L、S9T、S9M、G11D、I13L、I13A、I13Q、I13S、I13D、I13R、I13M、I13V、I13G、I13Y、I13E、K15V、K15R、K15I、K15M、K15A、K15F、K15L、K15S、K15E、K15W、K15G、K15D、A16L、A16V、A16G、A16E、A16S、A16T、A16K、A16G、V18A、V18R、V18M、V18T、V18L、V18Q、V18I、L19S、L19A、L19K、L19V、L19C、L19H、L19W、L19F、L19R、N25W、N25Y、N25D、N25F、N25G、N25R、N25V、N25L、N25A、N25S、N25E、N25C、N25Q、S27A、S27W、S27H、S27V、S27T、S27C、S27G、S27E、S27L、S27F、S30A、S30P、S30K、S30R、S30Q、S30Y、S30E、S30D、S30T、S30V、A32D、A32E、A32S、A32V、A32R、A32G、A32M、A32T、A32C、A32K、A32W、A34W、A34R、A34L、A34Q、A34G、A34C、A34F、A34V、A34E、A34T、A34I、A34P、V36I、V36R、V36A、V36G、V36L、V37C、V37G、V37R、V37A、V37M、S44R、S44W、S44L、S44T、S44C、S44A、S44V、S44P、S44E、S57G、S57T、S57H、S57P、S57A、V59T、V59E、V59Q、V59L、V59R、、F60S、F60V、F60A、F60I、Y67C、Y67N、Y67A、Y67G、Y67T、Y67V、Y67D、Y67H、Y67R、Y67F、Y67L、Y67P、Y67S、Y67M、T68K、T68C、T68A、T68P、T68R、T68Q、I71T、I71M、I71V、I71S、I71N、I71F、I71D、I71P、I71R、I71L、I71K、D72L、D72G、D72N、D72R、D72K、D72E、D72W、D72A、D72C、D72Y、D72S、D72Q、D72T、S73H、S73G、S73N、S73C、S73R、S73V、S73L、S73I、S73W、S73P、T74S、T74E、T74P、T74N、T74F、T74P、T74M、T74R、T74C、S75G、S75N、S75P、S75E、S75C、S75R、S75L、S75K、S75I、S75T、S76H、S76P、S76Q、S76E、L77S、L77Y、L77E、L77P、R78W、R78G、R78K、R78Q、R78T、R78A、R78C、R78M、R78E、D82V、D82G、D82R、D82N、D82E、D82C、D83L、D83C、D83W、D83A、D83R、D83G、D83V、D83S、D83E、F84Y、F84L、F84S、F84T、F84P、F84E、F84V、F84A、F84W、F84K、F84M、F84R、V85G、V85W、V85P、V85Q、V85E、V85H、V85R、V85T、T86C、T86R、T86G、T86W、T86D、T86V、T86S、T86A、N90G、N90E、N90T、N90P、N90C、L91H、L91P、L91F、L91V、L91R、Q93L、Q93M、Q93C、Q93H、Q93G、Q93R、Q93W、Q93D、Q93A、Q93N、Q93K、S95V、S95R、S95D、S95Y、S95G、S95Q、S95A、S95K、L101M、L101V、L101R、L101P、L101F、L101H、L101A、L101G、L101N、L101K、L101C、T102N、T102S、T102C、T102R、T102A、T102I、T102M、T102W、T102E、T102P、T102F、T103A、T103S、T103G、T103D、T103I、T103E、T103V、T103N、S134V、S134I、S134M、S134P、S134L、S134A、S134C、L137S、L137D、L137W、L137G、L137R、L137A、L137I、L137T、T139A、T139N、T139S、T139G、T139D、T139H、T139R、N142K、N142E、N142Q、N142R、N142G、N142H、N142W、N142A、L145S、L145W、L145N、L145C、L145V、L145R、L145D、S146V、S146G、S146L、S146T、S146A、S146C、S146P、S146F、S146R、S146W、N147K、N147E、N147S、N147F、N147T、N147I、N147D、N147P、N147Y、N147H、N147L、Y152V、Y152E、Y152L、Y152I、Y152A、Y152M、Y152R、Y152F、Y152G、V153R、V153Y、V153C、T154R、T154G、T154L、T154S、T154A、T154M、T154P、S155R、S155G、S155L、S155A、S155H、S155W、S155C、S155I、S155P、S155M、S155N、S155T、L157P、L157Q、L157V、L157M、L157R、W158R、W158E、W158C、W158K、W158L、W158G、P159S、P159R、P159V、P159Q、P159T、P159D、P159A、P159L、P159G、I160T、I160A、I160V、I160D、I160G、I160S、I160L、I160Y、I160N、I160F、Q162L、Q162K、Q162R、Q162S、Q162H、Q162P、Q162I、Q162V、N163D、N163G、N163R、N163T、N163I、N163Q、N163Y、N163K、N163H、N163W、N163A、N163S、S170A、S175W、S175R、S175T、S175C、T176S、T176R、T176L、T176A、T176W、T176I、Y177S、Y177T、Y177D、Y177V、S186V、S186R、S186E、S186L、S186D、S186C、S186A、S186Q、R199K、R199V、R199A、R199M、R199N、R199W、R199T、R199E、A202S、A202T、A202Q、A202L、A202E、A202P、A202V、A202F、A202W、A202G、A203Q、A203K、A203W、A203R、A203V、A203L、A203M、A203T、A203E、A203G、A203S、A203P、T206I、T206S、T206W、T206V、T206A、T206P、T206G、T206R、Q210D、Q210R、Q210G、Q210A、Q210L、Q210H、Q210P、Q210V、Q210I、Q210C、T211P、T211R、T211S、T211D、T211Q、T211H、T211A、T211L、T211G、T211W、S212V、S212K、S212D、S212T、S212H、S212L、S212P、S212E、S212C、S212A、S212M、Q213Y、Q213D、Q213R、Q213N、Q213S、Q213W、Q213K、Q213L、Q213C、Q213P、S215L、S215T、S215Q、S215R、S215V、S215G、S215N、S215C、Q220L、Q220P、Q220K、Q220R、Q220H、Q220E、A221V、A221T、A221E、A221G、A221P、D222E、D222M、D222A、D222G、D222N、D222V、D222H、N223K、N223R、L224V、F227A、F227V、F227L、F227S、F227Y、F227E、F227G、P234A、P234L、P234Q、P234S、S235C、S235R、S235W、S235G、S235K、Y238C、Y238L、Y238E、Y238W、Y238A、Y238S、Y238G、T240L、T240C、T240G、T240W、T240V、T240R、T240S、T240A、T240E、T243S、T243Q、T243M、T243G、T243L、T243V、T243E、T243P、T243R、T243W、G244W、G244D、G244Y、G244A、G244S、G244R、G245M、G245N、G245S、G245T、G245V、G245D、G245I、G246V、G246W、G246M、G246E、G246N、G246Q、G246S、G246D、G246R、S248E、S248L、S248C、S248G、S248P、S248F、S248T、A252S、A252T、A252V、A252P、A252G、T254A、T254S、T254G、T254P、L255V、L255A、L255P、L255I、L255C、A270W、A270T、A270E、A270C、A270M、A270S、A270L、A270G、A270R、A270Y、A270V、A271R、A271P、A271L、A271W、A271G、A271T、K279V、K279W、K279A、K279L、K279R、K279E、K279Y、K279P、K279G、K279S、S282G、S282T、S282L、S282V、S282F、S282R、S282A、S282I、S282W、L284V、L284G、L284S、L284M、L284T、Y295K、Y295H、Y295Q、Y295W、Y295M、Y295F、Y295C、Y295E、Y295V、S296A、S296T、S296K、S296N、S296Y、S296F、S296Q、S296P、S296L、S296D、I297L、I297V、I297H、I297R、I297W、I297K、I297T、I297F、I297G、I297Q、N298M、N298D、N298S、N298R、N298K、N298A、N298V、N298E、N298G、N298L、S299L、S299G、S299V、S299A、S299R、S299Q、S299M、S299I、S299P、S299T、G300A、G300N、G300D、G300R、G300L、G300F、G300C、G300P、G300W、G300T、G300S、A302L、A302R、A302P、A302V、A302K、A302M、A302Y、A302S、A302T、A302G、S303P、S303K、S303R、S303C、S303A、S303F、S303W、S303L、S303Q、N304V、N304G、N304P、N304W、N304F、N304E、N304T、N304D、N304R、N304S、N304A、N304I、N304M、N304K、S316T、S316C、S316A、S316R、S316P、S316H、S316K、S316F、S31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ID NO:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中所述在一个或多个位置处的取代提供了具有作为改进因子IF测量的至少1.1的比活性的增加的葡糖淀粉酶变体，并且进一步地其中所述变体与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，所述变体包含对应于位置43的取代，具体地是T43K并且其中与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶的解链温度相比，所述解链温度的增加是至少2℃、例如至少3℃。
6.如权利要求1-4中任一项所述的变体，所述变体包含对应于选自下组的一个位置的取代，该组由以下组成：位置4、5、13、15、18、85，具体地是选自以下的取代：D4R、S5V、I13S、K15R、V18M、V85G，其中所述变体与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比具有改进的比活性。
7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含对应于S95P和A121P的取代。
8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含对应于S95P+A121P+Y295W或S95P+A121P+Y295W+Q318Y的取代。
9.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：
T43K；
D4R；
S5V；
I13S；
K15R；
V18M；
V85G；
S95P+A121P+Y295W+T43K；
T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
D4R+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
S5V+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
I13S+T43K+S95P+A121P+Y295W+Q318Y；
V18M+T43K+S95P+A121P+Y295W；
并且其中所述变体具有葡糖淀粉酶活性并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的葡糖淀粉酶相比具有增加的比活性、和/或通过TSA测量的至少2℃、具体地至少3℃增加的解链温度。
10.如权利要求1-9中任一项所述的变体，其中改变的数目是1-20，例如1-10和1-5、如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
11.一种组合物，其包含如权利要求1-10中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。
12.一种如权利要求1-10中任一项所述的多肽用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。
13.一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉的材料液化；(b)使所述液化的材料糖化；和(c)用发酵生物进行发酵；其中使用如权利要求1-10中任一项所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(b)。
14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(b)和步骤(c)同时进行。
15.一种由含淀粉的材料生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在低于含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉的材料糖化；以及
(b)使用发酵生物进行发酵，
其中使用根据权利要求1-9中任一项所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤
(a)。
16.一种由含淀粉的材料生产糖浆产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉的材料液化；(b)在如权利要求1-9中任一项所述的变体葡糖淀粉酶的存在下使所述液化的材料糖化。
17.一种由含淀粉的材料生产糖浆产物的方法，所述方法包括以下步骤：在如权利要求1-10中任一项所述的变体葡糖淀粉酶的存在下，在低于含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下使所述含淀粉的材料糖化。
18.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-10中任一项所述的变体。
19.一种核酸构建体，其包含如权利要求18所述的多核苷酸。
20.一种表达载体，其包含如权利要求18所述的多核苷酸。
21.一种宿主细胞，其包含如权利要求18所述的多核苷酸、或如权利要求19所述的核酸构建体、或如权利要求20所述的表达载体。
22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞，具体地是酵母属，例如酿酒酵母。
23.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中如权利要求22所述的宿主细胞在所述发酵步骤中作为所述发酵生物应用。
24.一种产生如权利要求1-10中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的方法，所述方法包括：
在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求21所述的宿主细胞；以及任选地回收所述变体。
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