CN1191544A - 幽门螺杆菌抗原和疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子量为约29kDa,组成幽门螺杆菌表面暴露的抗原的重组多肽。本发明进一步提供了编码所述多肽的核酸分子,以及载体和包含该核酸分子的宿主细胞。所述重组多肽可用于诊断幽门螺杆菌感染和用于制备引发抗所述感染的保护性免疫应答的疫苗组合物,所述疫苗组合物适用于治疗和预防用途。
Description
技术领域
本发明提供组成幽门螺杆菌抗原的重组多肽,所述抗原在分裂(杆状)形式及静止(球状)形式的幽门螺杆菌的表面表达,并导致抗体的全身性和局部性(粘膜)的产生。本发明进一步提供编码所述多肽的核酸分子,以及载体和包含所述核酸分子的宿主细胞。所述重组多肽可用于诊断幽门螺杆菌感染以及用于生产引起抗所述感染的保护性免疫应答的疫苗组合物,所述疫苗组合物适宜于治疗和预防用途。
背景技术
革兰氏阴性菌幽门螺杆菌是一种参与多种胃十二指肠疾病的重要人类病原体。细菌在胃上皮的集群导致活性炎症和进行性慢性胃炎,并伴随有大大增加的进展为胃溃疡疾病的危险性。
为了在胃粘膜集群,幽门螺杆菌使用了许多毒性因子。这些毒性因子包括几种粘附素,通过它细菌与粘膜相联和/或与上皮细胞结合;脲酶,它帮助中和酸性环境;以及使粘膜变得更为流体化的蛋白水解酶。
尽管通过产生局部(粘膜)以及全身性抗体对幽门螺杆菌产生强而明显的宿主免疫应答,病原体仍存在于胃粘膜中,通常伴随宿主终生,它的原因可能是自发诱导的免疫应答不足或指向了抗原的错误表位。
为了弄清楚幽门螺杆菌感染的致病原因和免疫学,鉴定该细菌的抗原结构是非常重要的。尤其是,需要表征表面暴露(如粘附素)和分泌蛋白,它在许多细菌病原体中已被显示出组成主要的毒性因子,并它可用于诊断幽门螺杆菌和生产疫苗组合物。
Evans等(1993)细菌学杂志175,674-683公开了基因hpaA的克隆,该基因编码幽门螺杆菌的结合N-乙酰神经氨酸乳糖的原纤维血凝集素的20kDa受体结合亚基。
幽门螺杆菌的膜制品的单克隆抗体(MAbs)已被Blin等(1985)临床微生物学杂志33,381-384所公开。其中MAbs的一种,称为HP 30-1∶1∶6,与看来暴露于完整细菌表面并具有类似于粘附素性质的30kDa蛋白质反应。
当处于应激或危险状态时,幽门螺杆菌细胞从杆状转变为球状形式。为球状形式时,幽门螺杆菌细胞对抗生素和其它抗细菌试剂不敏感。环境证据表明幽门螺杆菌可能借助于水或直接接触以这种形式在各个体中传播。因此,有效的疫苗组合物应该引发针对球状和杆状幽门螺杆菌的免疫应答。由于全身性免疫可能仅在抗粘膜感染的保护中起有限的作用,因此增强胃局部的保护性免疫机制的疫苗组合物也是非常重要的。
本发明的目的
本发明的目的是提供一种抗原性幽门螺杆菌多肽,它可用于引发针对幽门螺杆菌感染的保护性免疫应答并用于诊断幽门螺杆菌感染,这一目的已通过重组克隆编码表面暴露蛋白的幽门螺杆菌基因而实现。这一基因的核酸序列类似于由Evans等(1993)在细菌学杂志卷175,674-683中所公开的hpaA基团。然而,虽然hpaA基因被报道编码20kDa蛋白质,但惊奇地发现根据本发明的DNA分子编码分子量为29kDa的多肽。
29kDa多肽被表明为一种在幽门螺杆菌所有菌株,同时也在球状细菌中表达的抗原性蛋白,并且它能在确定为产生抗体的宿主中引导粘膜及全身性免疫应答。29kDa多肽在所有试验的幽门螺杆菌菌株中表达,针对此蛋白产生的抗体不与其它种类的通常内源性人细菌或包括胃粘膜的被选择的人组织发生交叉反应。因此作为具有免疫原性特性的必需,非常保守的粘附素,29kDa多肽可用于检测幽门螺杆菌感染以及用于生产疫苗组合物,当该疫苗组合物以适宜的药物制剂的形式提供时,将引发针对所述感染的保护性或治疗性免疫应答。
因此下面的实验数据说明由于29kDa蛋白的单克隆抗体的结合导致小鼠中幽门螺杆菌集群的完全抑制,所以29kDa幽门螺杆菌蛋白对于幽门螺杆菌的感染和/或感染的持久性是非常重要的。而且,当它被用作口服免疫原时,29kDa幽门螺杆菌蛋白起免疫应答刺激剂的作用,其中免疫应答在免疫前1个月被幽门螺杆菌感染的小鼠中导致幽门螺杆菌集群的明显降低。
附图简述
图1:包含编码29kDa多肽的1.7kb幽门螺杆菌的1.7kb片段的质粒pAE1的限制酶图谱。阴影棒图表明结构基因的位置。T3和T7启动子序列的位置示于表明载体的黑色棒图的上面。
图2:pS860,pS861,pS862和pS863的质粒图谱。实心箭头:lac操纵子启动子(Plac)或噬菌体T7RNA聚合酶启动子(T7启动子)。灰色实心:PCR产生的29kDa基因的5′-末端和3′-末端。终止子:T7转录终止子。起点:pBR322质粒复制起点。
图3:单克隆抗体对幽门螺杆菌在BALB/c小鼠中的集群的作用。
图4:对幽门螺杆菌感染的BALB/c小鼠的治疗性口服免疫。
发明的公开
在本说明书全文,尤其是下面实施例中,术语“标准方案”和“标准方法”,当其被用在分子克隆技术的内容中,应理解为在常规实验室手册中可找到方案和方法,如:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港实验室出版,冷泉港,纽约。
在第一重要方面,本发明提供了一种重组多肽,该多肽具有与分子量为约29kDa的幽门螺杆菌表面暴露抗原相同或基本上相似的氨基酸序列。
根据本发明的所述表面暴露抗原尤其具有下面重要的特性:·它为一种粘附素,对于胃粘膜集群非常重要:·它在分裂(杆状)形式以及静止(球状)形式的幽门螺杆菌的表面表达;·它是一种强的导致全身性和局部(粘膜)抗体产生的抗原;·它在所有试验的幽门螺杆菌菌株中是保守的;·29kDa的抗体不与多种不同的非螺杆菌细菌或与选择的人组织,包括胃粘膜发生交叉反应;·29kDa多肽被进行了脂化和翻译后修饰。多肽的这一特点对于它的免疫原性和它的幽门螺杆菌表面的适当暴露可能是重要的。现有技术业已知脂化修饰对于细菌脂蛋白的免疫性质是必需(参见Weis,J.J.等(1994)感染和免疫,卷62,4632-4636)。·它被推测为毒性因子,其中术语“毒性因子”应理解为特定地参与幽门螺杆菌与胃粘膜上皮表面的粘附和/或幽门螺杆菌感染的建立和维持的分子。
在一个优选的形式中,所述多肽具有与序列表的SEQ ID NO:2或4中位置1-260或28-260一致的氨基酸序列。如在实验部分进一步描述的。认为SEQ ID NO:2和4中的位置1-260代表未被酶切的蛋白质,而位置1-27代表信号序列,位置28-260代表成熟多肽。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的唯一不同在于SEQ IDNO:2在位置222具有Ser残基,而SEQ ID NO:4在相同位置具有Arg残基。
然而,根据本发明的多肽不严格限制在具有与序列表中SEQ IDNO:2或4中的上述位置相同的氨基酸序列的多肽。而且本发明包括带有如取代,小的缺失,插入或倒位的修饰的多肽,该多肽尽管如此仍基本上具有根据本发明的29kDa多肽的性质。这些性质包括能在哺乳动物宿主中引发抗幽门螺杆菌和粘膜以及全身免疫应答,能起粘附素的作用;和该多肽存在于杆状和球状幽门螺杆菌中。
本发明因而包括多肽,其中该多肽的氨基酸与序列表中SEQ IDNO:2或4的位置1-260或位置28-260所示的氨基酸序列至少90%同源,优选至少95%同源,而且该多肽基本上具有根据本发明的29kDa的生物活性。
本发明还包括长度为至少5个氨基酸的肽,它包含根据本发明的29kDa多肽的免疫原性表位,并且保留了在哺乳动物宿主中引发抗幽门螺杆菌细菌的免疫应答的能力。该表位可单独出现或以融合蛋白形式出现,其中表位被融合到无活性或免疫活性载体多肽上。这些表位的鉴定是根据针对29kDa多肽的不同片段的宿主产生的抗体的存在来进行的。
获得关于29kDa多肽的表位的结构信息的一种方法是制备和表征与该多肽结合的单克隆抗体,接着通过如Pepscan分析对表位进行酶谱分析。可通过标准方法,如De St.Groth(1980)在免疫学方法杂志,卷35,1-21中描述的那些来制备单克隆抗体。
在另一个方面,本发明提供具有编码上面定义的多肽的核苷酸序列的分离和纯化的核酸分子。在本发明的一种优选形式中,所述核酸分子为具有与序列表中SEQ ID NO:1或3相同的核苷酸序列的DNA分子。然而,根据本发明的DNA分子不严格局限于SEQ ID NO:1或3所示序列。而且本发明还包括带有如取代,小的缺失,插入或倒位的修饰的DNA分子,尽管如此该DNA分子仍编码基本上具有根据本发明的29kDa多肽的生物活性的多肽。对于本领域技术人员来说,对于氨基酸序列没有影响的AG和TC的取代,在幽门螺杆菌中不是不常见的。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3之间唯一的不同在于SEQID NO:1在位置1458具有一个A残基,而SEQ ID NO:3在相同位置具有一个C残基。
本发明还包括由于遗传密码,其核苷酸序列被简并为SEQ IDNO:1或3所示核苷酸序列的DNA分子。由于存在64个可能的密码子,但只有20种天然氨基酸,因此,大多数氨基酸被多于1个的密码子所编码。在本领域中熟知遗传密码的这种天然的“简并性”或“丰余性”。因此应理解示于序列表中的DNA序列仅仅是编码上述多肽的大的但为确定的一组DNA序列中的一个实例。
因此,本发明包括选自下面的核酸分子:
(a)包含与序列表中的SEQ ID NO:1或3的位置796-1572或874-1572相同或基本上相似的核苷酸序列的核酸分子;
(b)包含能与(a)上定义的DNA分子的多肽编码区互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核酸分子,并且它编码根据本发明的多肽或其功能相当的修饰形式;和(c)包含由于遗传密码的原因,被简并为如(a)和(b)中所定义的核苷酸序列的核酸序列的核酸分子,并且它编码根据本发明的多肽或其功能相当的修饰形式。
本发明的另一方面是包含根据本发明的核酸分子的载体。该载体可优选为质粒载体pAE1(根据布达佩斯条约已保藏,保藏号为NCIMB40732)。
根据本发明的载体还可为可复制的表达载体,它带有并且能介导根据本发明的核酸分子的表达。在本文中,术语“可复制”指载体可在其被导入其中的给定类型的宿主细胞中复制。载体的实例为病毒,如噬菌体,粘粒,质粒和其它重组载体。通过本领域已知的标准方法将核酸分子插入到载体基因组中。根据本发明的表达载体可优选为pAL 30:1,pAL 30:2,pAL 30:3,pAL 30:4中的任何一种,较优选pS863。
本发明还包括含有根据本发明的载体的宿主细胞。该宿主细胞可为原核细胞,单细胞真核细胞或来自多细胞生物的细胞。宿主细胞可因此为,例如细菌细胞,如大肠杆菌细胞;来自啤酒糖酵母或巴斯德毕赤氏酵母的细胞或哺乳动物细胞。将载体导入宿主细胞所采用的方法为熟悉重组DNA分子的人员所熟知的标准方法。
在另一个方面,本发明提供一种制备上面所定义的多肽的方法,所述方法包括培养用上面所定义的表达载体转化的宿主细胞,在一定条件下产生所述多肽,并回收所述多肽。
用于培养细胞的培养基可为适宜于此目的的任何常规培养基。适宜载体可为上述任何载体,并且适宜宿主细胞可为上面所列举的任何细胞类型。构建载体并将其导入宿主细胞所采用的方法可为在重组DNA领域公知用于此目的的任何方法。取决于细胞的类型和载体的组成,细胞表达的重组多肽可被分泌出来,即通过细胞膜被排出。
如果重组宿主在细胞内产生多肽,即它不被细胞分泌,则它可通过标准方法来回收,这些方法包括通过机械方式进行细胞破裂,如超声处理或匀浆,或通过酶或化学方法,接着进行纯化。为了能被分泌出来,在编码多肽的DNA序列之前应有编码信号肽的序列,它的存在确保多肽从细胞中分泌,这样至少表达的大部分多肽被分泌到培养基中并被回收。
本发明的另一方面为根据本发明的多肽在治疗中的应用,在诊断哺乳动物,包括人类中的幽门螺杆菌感染中应用,以及在治疗或预防性疫苗中的应用。
本发明另一个重要方面是用于在哺乳动物,包括人类中诱导抗杆状和/或球状幽门螺杆菌的保护性免疫应答的疫苗组合物。该疫苗组合物包含免疫原性有效量的上述多肽,包括包含免疫原性表位的29kDa多肽的至少一部分,或保持诱导抗幽门螺杆菌感染的保护性免疫能力的修饰形式的所述多肽。术语“修饰形式”包括,但不局限于为翻译后修饰,例如脂化形式的多肽,已认为29kDa蛋白为脂化形式,参见下面实施例4。
疫苗组合物任选还包含药学上可接受的载体或稀释剂,或其它用于预防或治疗目的的免疫活性抗原。生理上可接受的载体和稀释剂为本领域技术人员所熟知,包括如磷酸缓冲生理盐水(PBS),或在为口服疫苗时,HCO3 -为基本组分的制剂或肠衣包被的粉剂。
该疫苗组合物任选包括或与酸分泌抑制剂,优选质子泵抑制剂(PPI),例如奥美拉唑一起服用。该疫苗可被配制在已知的运输系统中,例如脂质体,ISCOMs,螺旋体(cochleates)等中(参见如Rabinovich等(1994)科学265,1401-1404)或与具有可降解或不可降解性质的聚合物微球相连或包括在其中。抗原可与活的减毒细菌,病毒或噬菌体或与相同种类的被杀死的载体相连。
如下面实验部分所证实的,根据本发明的疫苗组合物可用于治疗和预防目的。根据本发明的疫苗组合物优选对哺乳动物的粘膜给药,例如颊,鼻,扁桃体,胃,肠(小和大肠),直肠和阴道粘膜。粘膜疫苗可与用于此目的的适宜的佐剂一起给药。疫苗还可通过皮下,皮内或肌肉内途径任选与适宜佐剂一起经胃肠外给药。
产生针对29kDa多肽的免疫应答的另一个方法是使用已知为“核酸接种”或“裸露DNA”接种的方法。现有技术已知将编码感兴趣抗原的质粒DNA注射到肌肉中可导致抗原的持续表达和免疫应答的产生(参见如Rabinovich等,上文)。几种给药途径是可能的,例如胃肠外,粘膜或借助于运送少量DNA被包被的金粒的“基因枪”(Fynan等(1993)美国国家科学院院刊,90,11478-11482)。
因此,根据本发明的核酸分子可在包含适宜真核启动子的质粒中表达,接着可将“裸露DNA”进行肌肉内注射或借助于“基因枪”进行真皮内给药。表达蛋白的表位通过细胞表面的MHC分子表达,并启动免疫应答。因此,本发明的另一个方面是前面段落公开的核酸分子和载体在治疗中的应用,尤其是作为疫苗的应用。本发明的另一个方面还有是该核酸分子和载体在制备用于治疗,预防或诊断幽门螺杆菌感染的组合物中的应用。
本发明的另一个方面是如上面所定义的多肽,或保持诱导抗幽门螺杆菌感染的保护性免疫能力的修饰形式的所述多肽在制备用于治疗,预防或诊断幽门螺杆菌感染的组合物中的应用。该组合物尤其包括引发抗杆状和/或球状形式的幽门螺杆菌的保护性免疫应答的疫苗组合物。本发明还包括在生产用于诊断幽门螺杆菌感染的诊断试剂盒中的应用。下面将进一步描述该诊断试剂盒。
在一个方面,本发明提供在哺乳动物,包括人类中引发抗幽门螺杆菌感染的保护性免疫应答的方法,所述方法包括对所述哺乳动物施用免疫有效量的上面定义的疫苗组合物。术语“免疫有效量”指引发显著的保护性幽门螺杆菌应答,除去被感染的哺乳动物中的幽门螺杆菌感染或预防易感哺乳动物感染的量。通常,对于口服给药,免疫有效量将包含约1μg-100mg,优选约10μg-10mg的幽门螺杆菌抗原,或对于胃肠外给药,约小于100μg。
在本发明的另一个方面是一种体外诊断幽门螺杆菌感染的方法,包括至少使用上面所定义的,包括29kDa多肽的一部分,其中该部分包含免疫原性表位的多肽这一步骤。可任选将多肽标记和/或偶联至固相载体上。诊断的方法可如包括步骤(a)将任选与固相载体结合的所述多肽与从哺乳动物提取的体液接触,和(b)检测来自所述体液,与所述多肽结合的抗体。优选的检测抗体的方法为现有技术中熟知的ELISA法(酶联免疫吸附测定)。
在另一方面,本发明提供用于检测哺乳动物,包括人类中的幽门螺杆菌感染的诊断试剂盒,该诊断试剂盒包含使得上面说明的诊断方法得以进行的组分。
实施例实施例1:来自幽门螺杆菌的29kDa多肽的克隆和表达1.1.细菌菌株,载体和生长条件
在微需氧的空气下,将幽门螺杆菌CCUG 17874(=NTCC 11637)培养在马血琼脂平板上。大肠杆菌菌株XL1-Blue MRF′和XLOLR(Stratagene,La Jolla,加利福尼亚)被用作克隆实验的宿主菌株,并且当被用于λ感染时,将其培养在Luria-Bertani肉汤(LB)或补充有0.2%麦芽糖和10mM MgSO4的NZY培养基中。从Stratagene获得λ表达载体ZAP ExpressTM和它的噬粒衍生物pBK-CMV。1.2.DNA技术
通过将来自保温48小时平板的细菌悬浮于50mM Tris-HCl,pH8.0,25%蔗糖,含有10mg/ml溶菌酶,和5ng/ml无DNA酶的RNA酶(Boehringer Mannheim Scandinavia AB,Bromma,瑞典)的50mMEDTA中从幽门螺杆菌制备染色体DNA。37℃下,将悬浮液保温10小时。加入等体积的溶菌缓冲液(在50mM Tris-HCl,pH8.0中0.4%Triton X100;和62.5mM EDTA),室温下保温悬浮液,直至产生显著的细菌溶胞。然后以三个步骤分别用缓冲的苯酚(pH8.0),苯酚/氯仿和氯仿抽提悬浮液。将DNA从水相中沉淀并溶解在TE缓冲液中(10mM Tris-HCl,pH8.0;和1mM EDTA)。
限制酶购自Boehringer Mannheim Scandinavia AB,并按照制造商说明来使用。
用Wizard盒(Promega,Madison,Wisconsin)纯化质粒和λNDA。使用Sequenase 2.0盒(Amersham,Sweden AB Solna,瑞典)进行序列测定。寡核苷酸购自Innovagen,Lund,瑞典。使用Taq DNA聚合酶(Boehringer-Mannheim Scandinavia AB)进行PCR。1.3.幽门螺杆菌基因组文库的构建
从部分Sau3A酶切的幽门螺杆菌17874 DNA纯化大小为2-12kb的染色体DNA片段,并如Stratagene方法中所描述的将其克隆至BamHI消化的ZAP ExpressTM载体中。体外包被后,通过感染菌株XL-1BlueMRF,并被接种到包含异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)的指示平板上来滴定文库。文库的效价为1.2×106PFU/ml,具有85%重组体。
通过根据标准方法,使用MAb HP30-1∶1∶6(Blin等(1995)临床微生物学33,381-384)的免疫筛选检测表达29kDa多肽的噬菌斑。分离阳性噬菌斑,重复接种和使用MAb的筛选,直至获得纯的噬菌斑。使用ExAssist方法(Stratagene)完成向噬菌体质粒嵌合体形式的ZAP表达克隆的转化。1.4.免疫印迹和斑点印迹试验
将包含具有图1描绘的来自幽门螺杆菌17874的克隆插入片段的质粒的大肠杆菌XLOLR的过夜培养物以1∶100稀释在5ml具有50mg/ml卡那霉素的LB培养基中。将培养物在37℃下保温,直至600nm的OD为0.7。加入IPTG至最终浓度为1mM,将细菌再培养2小时。类似地培养没有IPTG的培养物。离心培养物并重新悬浮于1/10的体积中。将10μl悬浮液与等体积的2×样品缓冲液混合,煮沸并用SDS-PAGE分析。将以相同方式,但没有卡那霉素培养的菌株XLOLR用作阴性对照。幽门螺杆菌17874在PBS中的悬浮液(OD=1.0,600nm)被用作阳性对照。
在固定分布于硝酸纤维素片上的蛋白后,如前所述(Blin等,1995)进行与以1∶10稀释的29kDa多肽特异性MAb HP30-1∶1∶6的反应,通过使用用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG检测结合的抗体。用过氧化氢底物和4-氯萘酚色素原(BioRad Svenska AB)使滤膜显色。
使用上述菌株的过夜培养物进行斑点印迹试验。将2μl悬浮液放在硝酸纤维素过滤器上,空气干燥并与以1∶10稀释的MAb HP30-1∶1∶6保温1小时。如免疫印迹所描述的进行后面的步骤。1.5.分子克隆
将来自幽门螺杆菌菌株17874的部分消化的染色体DNA克隆至λ表达载体中(ZAP ExpressTM)。在筛选24000个噬菌斑与29kDa多肽特异性MAb的反应后,检测到4个表达29kDa多肽的噬菌斑。纯化阳性噬菌斑,克隆片段的大小通过对DNA制备用XbaI和SalI进行消化来测定。插入片段的大小为3.7-1.78kb。在从4个阳性噬菌斑体内切除pBK-CMV噬菌体质粒嵌合体之后,构建限制性酶图谱并与λ载体中的插入片段比较。噬菌体质粒被发现包含与λ载体中的相同大小的重叠DNA片段。除开SmaI和NheI,试验的大多数限制酶不酶切克隆片段。
被进一步分析的最小的被克隆的1.7片段(pAE1)的限制图谱示于图1中。一种克隆插入片段与载体启动子的方向相反。当包含这些质粒的大肠杆菌菌株的全细胞提取物被用MAb HP30-1∶1∶6进行免疫印迹分析时,它们被发现均表达具有与幽门螺杆菌17874相同分子量的多肽。当载体启动子用IPTG诱导时,在29kDa多肽表达中未发现有不同。这表明该基因从它本身的启动子开始转录。构建三个包含图1说明的DNA片段的亚克隆并检测29kDa多肽的表达。没有克隆表达多肽。当XLOLR(pAE1)被在斑点印迹测定(Blin等,1995)中检测并与幽门螺杆菌进行比较时,发现为弱阳性,表明一些表达多肽可能暴露于表面。1.6.DNA序列分析
使用T3-和T7-特异性引物对pAE1的1.7kb插入片段的两条链和亚克隆进行序列测定,并当必要时,辅以特定引物以覆盖用标准引物不能得到的序列区。计算机分析表明序列(SEQ ID NO:1)一条链上包含覆盖用于亚克隆的限制性酶位点(图1)的780bp的开放读框(ORF)。可鉴定推测的核糖体结合位点(SEQ ID NO:1的位置782-785)。ORF编码分子量为29,126Da的多肽的260个氨基酸(SEQ ID NO:2)。氨基酸序列被发现包含27个氨基酸的可能的信号序列。序列Leu-Val-Gly-Cys(SEQ ID NO:2和4中的位置25-28)为选定为酶信号肽酶II的识别位点的一个共有序列(Leu-X-Y-Cys)。信号肽酶II酶切脂蛋白原中的半胱氨酸残基前的信号序列。信号肽的表征由于表明29kDa蛋白为脂蛋白,成熟蛋白包含氨基酸28-260。1.7.重组29kDa多肽在大肠杆菌中的表达
重组29kDa多肽在大肠杆菌N4830-1中,从表达载体构建物pAL30高浓度产生,其中该表达载体构建物包含29kDa多肽的全部基因(SEQ ID NO:1和3中的位置771-1667)。用于构建物的载体为包含强λPL的启动子的pML-LCTBλ7(从Michael Lebens获得,Gothenburg大学,瑞典)。载体还包含产生氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。插入在载体中λPL启动子和终止区之间的LCTB基因(编码霍乱毒素和它的信号肽)被通过用限制酶SmaI和HindIII酶切从载体中切除。
通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码29kDa多肽,包括其信号序列的结构基因。使用的引物为结合ATG起始密码子上游271bp的HP30N(GGC GTA GAA ATG GAA GCG C;对应于SEQ ID NO:1和3的位置522-540)和识别起始密码子下游855bp的DNA片段(对应于SEQ ID NO:1和3中的位置1648-1667)的HP30C(CCC AAGATT CAT CAG CCC TTA AAT ACA CG)。HP30C引物包含HindIII酶切位点,该位点通过PCR反应被加至29kDa多肽基因的序列中。产生的PCR产物为1.1kb。将该DNA片段用产生与载体片段(2.7kb)相连的0.9kb片段的SspI和HindIII酶切。通过电穿孔将现称为pAL30(3.6kb)的载体构建物转化到大肠杆菌N 4830-1中。找到4个阳性克隆(pAL30:1,2,3,4)。
为了诱导重组多肽的表达,在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的1×LB中,将包含pAL30:1-4的N 4830-1细胞在30℃培养过夜(在此温度下λcI阻遏物抑制转录)。将少部分这种过夜培养物接种在含有氨苄青霉素的5ml 1×LB中,30℃下培养细胞,直至600nm处的OD为约0.7。接着将温度升至+42℃,其中阻遏物失活,并再保温2小时。
在14%SDS-PAGE和通过使用对29kDa多肽特异性的单克隆抗体HP30-1∶1∶6的免疫印迹分析在保温前和后取样的样品。在诱导后,用于免疫印迹的三种被诱导克隆(pAL30:1,3和4)均表达大量的重组多肽。来自未诱导细胞的悬浮液仅包含少量的29kDa多肽。
选择克隆pAL30:1用于进一步分析。为了证实克隆确定包含编码29kDa多肽的基因,对插入载体中的片段的末端进行序列测定。证实插入到表达载体中的序列对应于克隆的PCR片段的预期序列。实施例2:在各种培养条件下,表达29kDa多肽的动力学
使用幽门螺杆菌的两个菌株,即CCUG 17874(实验室菌株)和Hel73(最近从患有十二指肠溃疡的病人中分离)。在血液琼脂平板以及补充有环状糊精的Brucella Broth中进行培养。将所有培养物保温在由5%O2,10%CO2和85%N2组成的微氧空气中。2、4和7天后收获细菌,在PBS中洗涤一次,并置于-20℃下用于后面的分析。通过采用如前所述的用于检测针对多肽的大肠杆菌表面抗原(Lopez-Vidal,Y和Svennerholm,A-M.,临床微生物学杂志28,1906-)的特异性的单克隆抗体的抑制ELISA来分析29kDa表面多肽的表达。这些抗体还用于免疫电镜中。
当CCUG 17874在血液琼脂平板以及brucella肉汤中培养7天时,约70%的细菌从球形转变为杆状。这种转变在Hel 73中在3天后即已发生。抑制ELISA显示在7天中,在来自平板和肉汤培养物的样品中具有相当恒定浓度的29kDa多肽。通过免疫电镜证实了多肽的存在。发现29kDa多肽被很好地保存在棒状形式的幽门螺杆菌中。发现29kDa多肽在Hel 73中多于CCUG 17874。实施例3:针对29kDa多肽的抗体应答
用来自患有十二指肠溃疡(n=19),无症状幽门螺杆菌携带者(n=18)和未感染年龄匹配的对照(n=20)中的血清和胃提出物测定针对29kDa多肽的抗体应答。
通过不同的ELISA方法用来自三组个体的胃提出物和血清检测针对29kDa多肽的抗体水平。与健康的对照个体相比,大多数感染个体在血清和胃提出物中具有明显较高水平的针对29kDa多肽的特异性抗体。无症状携带者的抗体效价与有症状的病人类似。实施例4:用[3H]棕榈酸标记多肽
由于29kDa多肽的氨基酸序列包含在脂蛋白中常见的可能的信号肽,研究了对蛋白用放射性棕榈酸标记。
30℃下,将缺少或带有pAL30:1的大肠杆菌N 4830-1培养在补充有50μg羧苄青霉素的LB肉汤中。在细胞密度为108细菌/ml时,加入[3H]棕榈酸(5mCi/ml;DuPont NEN,Boston,MA)直至最终浓度为50μCi/ml,将温度升至+42℃,并将培养物再培养12小时。离心收集细胞,并在SDS-PAGE溶菌缓冲液中溶菌。电穿孔后,通过将凝胶浸没在AmplifyTM(Amersham International,UK)30分钟加工用于flougraphy,在玻璃纸片间干燥,并在-70℃下,将凝胶对X-射线胶片曝光36小时。
结果表明29kDa多肽被脂化,从而被进行了翻译后修饰。实施例5:表达重组29kDa多肽的大肠杆菌的Triton X-114分配
在30℃下,将带有pAL30:1的大肠杆菌细胞培养在补充有50μg羧苄青霉素/ml的LB肉汤中。在细胞密度为108细菌/ml时,将温度升至42℃,并将培养物再保温3小时。离心(11,3000×g,10分钟,+4℃)收集细胞,并以每克细胞沉淀对应于25ml PBS的量重新悬浮于PBS中。冷冻悬浮液并随后在室温下融化,并加入25μl DNAse(10μg/μl)。室温下,通过倒转30分钟轻轻摇振样品,冷却至8-12℃,接着加入Triton X-114(最终浓度为0.3%)。在4℃,通过轻轻倒转保温3小时后,通过离心收集不溶物(18,900×g,10分钟,+25℃)。
通过SDS-PAGE分析各相体,29kDa多肽的鉴定通过使用MAbHP30-1∶1∶6的Western印迹来证实。结果表明29kDa多肽出现在去污剂相中,它被证实为脂蛋白。现有技术中已知通常在去污剂相中回收内在膜蛋白(Bordier,C.(1981)生物化学杂志,卷256,1604-1607)。
该实验还证实插入到大肠杆菌中的质粒可表达和产生29kDa蛋白。由于幽门螺杆菌生长不是太好或太快,这对于今后大规模生产疫苗是很重要的。实施例6:构建用于产生高水平的幽门螺杆菌29kDa蛋白的表达载体pS8636.1.pS860的制备
为了产生29kDa基因5′-末端的方便的限制性位点,合成了两个用于PCR扩增的合成寡核苷酸。质粒pS852(等于实施例1.7中描述的质粒pAL30:1)被用作PCR扩增的模板。这两个寡核苷酸的序列列在下面:
EcoRI NdeI5′-CGGAATTCCATATGAGAGCAAATAATCATTTTAAAG-3′
BamHI XmaI NheI5′-GCGGATCCCCCGGGGCTAGCTGGATGGTAATTCAATTTC-3′
进行PCR扩增,并将169bp扩增片段连接到TA载体中(Mead,D.A等(1991)生物/技术9,657-663)。构建的质粒称为pS860(图2)。构建的序列通过双脱氧序列测定来证实(Sanger等(1977),美国国家科学院院刊74,5463-5467)。6.2.pS861的制备
为了改变29kDa的3′-末端的限制性位点,合成了两个用于PCR扩增的合成寡核苷酸。质粒pS852(pAL30:1)被用作PCR扩增的模板。两个寡核苷酸的序列列于下面:
EcoRI XmaI5′-CGGAATTCCCCGGGTTATTATTCTCCACCGG-3′
PstI BamHI5′-CGCTGCAGGGATCCTTATTATCGGTTTCTTTTGCCTTTTAA-3′
进行PCR扩增,并用产生357bp片段的XmaI和BamHI消化扩增片段。将该片段克隆至pUC19中,构建的质粒称为pS861(图2)。通过双脱氧序列分析证实构建的序列(Sanger等(1977),美国国家科学院院刊74,5463-5467)。6.3.质粒pS862的制备
通过凝胶电泳,从质粒pS852(pAL30:1)中,以280bp NheI/XmaI片段分离编码29kDa中间部分的cDNA。将该片段与来自pS861的357bp XmaI/BamHI片段和来自pS861的4061bp NheI/BamHI片段连接在一起。产生的质粒作为pS862(图2)。6.4.质粒pS863的制备
此后,从pS862中分离795bp NdeI和BamHI限制性片段,并将其与来自T7载体pS637的4kb NdeI/BamHI片段相连(Studier,F.W.等(1990)酶学方法185,60-89)。产生的表达载体称为pS863(图2)。实施例7:重组幽门螺杆菌29kDa脂蛋白的纯化7.1.宿主菌株和细菌培养物
将表达载体pS863转化到下面大肠杆菌宿主菌株中;BL21(DE3);BL21(DE3)pLysS;和BL21(DE3)pLysE。基本上如Studier等描述的(酶学方法,185,60-89,1990)进行表达实验。将细胞培养在包含50μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中(Ausubel,F.M.等(编)现代分子生物学方法,John Wiley和Sons,New York,1992)。此外,当使用BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3)pLysS,在培养基中添加30μg/ml氯霉素。为了诱导T7表达系统,让培养物生长至OD600大约密度=0.5,并接着添加0.4mM IPTG用于诱导。诱导约180分钟后收获细胞。产生最高表达水平的宿主菌株为BL21(DE3)pLysS。7.2.幽门螺杆菌29kDa脂蛋白的纯化
如上所述培养用质粒pS863转化的大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS培养物,通过离心收集细胞,并重新悬浮于冷缓冲液中(500mM Tris-HCl,2mM EDTA,10mM NaCl,pH 8.0)。每克沉淀(湿重)加入35ml缓冲液。7.2.1.Triton X-114提取
为了提取脂蛋白,加入Triton X-114(TX-114)至最终浓度为1.5%(v/v),并在0℃下,将悬浮液搅拌1小时。通过以18,900×g离心10分钟沉淀不溶于Triton的物质。在一些情况下,用包含缓冲液的一半体积的TX-114将沉淀再提取一次。第二次TX-114提取后,弃去沉淀。
通过在+30℃下,伴随偶尔搅拌将它保温15分钟,获得来自TX-114提取的上清的相分配。收集下层的去污剂相,并用冷缓冲液(50mM Tris-HCl,2mM EDTA,10mM NaCl,pH 8.0)稀释至1%TX-114。7.2.2.Q-琼脂糖,pH 8.0
将稀释的TX-114-相上样至用缓冲液(50mM Tris-HCl,2mM EDTA,10mM NaCl,0.1%Triton X-100,pH 8.0)平衡的Q-琼脂糖柱上(Pharmacia)(20ml/3g细胞沉淀)。收集作为非结合级分的29kDa脂蛋白。通过30℃下,伴随偶尔搅拌将其保温直至溶液变为混浊,将该级分进行相分配。通过30℃下,以31,300×g离心30分钟分离两相。收集下层的去污剂相,并用冷缓冲液(10mMTris-HCl,2mM EDTA,pH 8.6)稀释至TX-114浓度为1%。7.2.3.Q-琼脂糖,pH 8.6
将稀释的TX-114-相上样至用缓冲液(10mM Tris-HCl,2mM EDTA,pH 8.6)平衡的100ml Q-琼脂糖柱上(Pharmacia)。未结合级分包含TX-114。将柱用缓冲液A(10mM Tris-HCl,2mM EDTA,0.1%Triton X-100,pH 8.6)洗涤。通过缓冲液B(10mM Tris-HCl,2mM EDTA,0.1%Triton X-100,1MNaCl,pH 8.6)的盐梯度来收集29kDa脂蛋白。梯度如下;0-50%B,40ml;50-100%B,100ml。在60-70%B之间洗脱29kDa脂蛋白。7.2.4.SDS-PAGE和蛋白质电泳印迹法
将来自不同纯化步骤的蛋白样品溶解在样品缓冲液中(50mMTris-HCl,pH 6.8,8%甘油,1.6%SDS,4%β-巯基乙醇,0.02%溴酚兰),并在Novex预制梯度凝胶(4-20%聚丙烯酰胺)或BioRad预制梯度凝胶(10-20%聚丙烯酰胺)上分离。电泳分离缓冲液包含25mM Tris,192mM甘氨酸,0.5%SDS,pH 8.3。将凝胶用0.1%考马斯亮兰R-250的40%甲醇,10%乙酸溶液染色,用10%甲醇,10%乙酸脱色。
将用于半干燥电泳印迹法的凝胶不被染色但浸泡于转移缓冲液中(48mM Tris,38mM甘氨酸,0.075%SDS,20%MeOH),并通MeOH过SemiDry电泳印迹装置(BioRad)将蛋白转移至PVDF膜上(Immobilon,Millipore,USA)。通过首先将PVDF膜在BSA为2%的TBS中(50mM Tris-HCl,2.5M NaCl,pH 8.2)封闭1小时,接着将膜与被其中BSA为1%的TBS以1∶10稀释的抗29kDa脂蛋白的特异性单克隆抗体(IgG1)一起保温1小时来完成免疫检测。在用TBS进行洗涤步骤之后,将膜与碱性磷酸酶结合的抗小鼠IgG抗体(Dakopatts,丹麦)一起保温1小时。再洗涤一次后,将膜用适宜底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)(Sigma)显色。7.2.5.蛋白质浓缩和热原性
通过二辛可宁酸方法(BCA蛋白质分析,Pierce化学公司,美国)测定总的蛋白浓度。
通过色素原鲎变形细胞溶解物(LAL)试验(LAL COAMATIC内毒素,Endosafe Inc美国)分析内毒素含量。
扫描染色的SDS-凝胶(RioRad Imager GS-)以确定在最终制备物中的蛋白污染物的相对量。制备物包含<10%蛋白污染物。实施例8:用作疫苗的幽门螺杆菌29kDa蛋白的分析8.1.材料和方法8.1.1.动物
雌性SPFBALB/c小鼠购自Bomholt饲养中心(丹麦)。将它们饲养在自由供给水和食物的普通聚碳酸酯笼子中。到达时动物为4-6周龄。8.1.2.感染
在适应环境最少一周后,将动物用一种类型的幽门螺杆菌的2个菌株(菌株244,最初从溃疡病人中分离)感染。该菌株已较早地被证实为是小鼠胃的良好的集群者。37℃下,在微氧空气中(10%CO2,5%O2),将细菌在补充有10%胎牛血清的Brucella肉汤中培养过夜。对动物施用口服剂量的奥美拉唑(400mmol/kg),并在3-5小时后口服接种幽门螺杆菌(约108cfu/动物)。接种2-3周后,检查对照动物中的感染。8.1.3.免疫
在34天期间将动物免疫4次(第1,15,25和35天)。以100μg/小鼠的剂量施用纯化的抗原,并以0.5mg/剂的剂量施用膜蛋白。膜蛋白通过在PBS超声破碎细菌来制备。通过4℃下,以2000rpm将超声破碎物离心5分钟除去碎片。将上清转移至一新的试管中,4℃下,以15,000rpm离心20分钟。回收沉淀并贮存于-70℃,直至使用。
作为佐剂,每次免疫时还可对动物施用10μg霍乱毒素(CT)/小鼠。作为保护抗原免受酸降解的方式,可在免疫前3-5小时给动物口服施用Omeprazole(400μmol/kg)。最后免疫4周后,将动物杀死。8.1.4.被动保护
为了分析单克隆抗体(MAbs)对幽门螺杆菌在小鼠胃集群的能力的影响,在如上所述的接种之前10分钟,将具有不同特异性的MAbs与幽门螺杆菌混合物。使用抗29kDa蛋白的单克隆抗体(HP30-1∶1∶6);抗脲酶的单克隆抗体(Ure8∶1);和抗大肠杆菌热稳定蛋白的单克隆抗体(ST1∶3)。用ELISA滴定MAbs以使得在实验中采用等量的各种单克隆抗体。107细菌/小鼠的量被用于接种。接种2周后,将动物杀死。8.1.5.感染的分析
用CO2和颈错位杀死小鼠。打开腹部,取出胃。在沿大弯切下胃之后,将其在生理盐水中漂洗。分别用外科解剖刀从25mm2面积的窦和胃体刮取粘膜。将粘膜的刮取物悬浮于Brucella肉汤中并接种到BloodSkirrow平板上。在微氧条件下将平板保温3-5天,计数集群的数量。通过脲酶和过氧化氢酶试验以及直接显微镜或革兰氏染色来确定幽门螺杆菌的同一性。8.2.结果8.2.1.被动保护
各组均有10只动物的三个组被施用幽门螺杆菌菌株244和MAb的混合物,一个组仅被施用幽门螺杆菌。在被接种至小鼠中之前,让MAb和细菌的混合物反应10分钟。在体外,采用的MAbs未对细菌产生任何明显的效果。接种2周后,将动物杀死,确定每组的感染比例(图3)。对照组所有的小鼠和接种了ST MAb的那些被感染。在脲酶MAb组,所有小鼠被感染,但与对照相比,程度明显较低。在接种了抗29kDa蛋白的MAb的组中,没有小鼠被感染。8.2.2.治疗免疫
在免疫前1个月,将本研究中的动物用幽门螺杆菌244感染。接着将10组小鼠用霍乱毒素(CT)或CT与膜蛋白,脲酶或29kDa蛋白一起免疫。对照动物接受仅(PBS)的溶液。最终免疫1个月后,将动物杀死并测定CFU(图4)。所有对照动物以及仅用CT免疫的那些均被感染。与对照相比,用脲酶和CT,或用29kDa蛋白和CT进行活性免疫的动物具有明显降低的CFU值。仅脲酶免疫组中的一个动物被完全治愈感染。8.3.结论
上面结果表明由于MAb与该结构的结合导致集群的完全抑制,所以29kDa幽门螺杆菌蛋白对于集群和/或感染的维持是非常重要的。
而且,当与作为口服佐剂的霍乱毒素结合被用作口服免疫原性,29kDa幽门螺杆菌蛋白起免疫应答刺激剂的作用,该免疫应答导致在所采用的动物模型中的幽门螺杆菌集群程度的显著降低。
总之,这些结果有力地支持了29kDa幽门螺杆菌蛋白在用于治疗和预防人类幽门螺杆菌感染的口服疫苗制剂中的应用。微生物的保藏
质粒pAE1根据布达佩斯条约保藏在National Collections ofIndustrial and Marine Bacteria(NCIMB),Aberdeen,苏格兰,英国,保藏号为NCIMB 40732。保藏日为1995年5月16日。
序列表(1)一般信息:(i)申请人:
(A)姓名:ASTRA AB
(B)街道:Vastra Malarehamnen 9
(C)城市:Sodertalje
(E)国家:瑞典
(F)邮编(邮区):S-15185
(G)电话:+46 8 553 260 00
(H)电传:+46 8 553 288 20
(I)电报:19237 astra s(ii)发明名称:细菌抗原和疫苗组合物(iii)序列数目:4(iv)计算机可读形式
(A)介质类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1信息:(i)序列特性
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Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp
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30 35 40CAT CCA GCT AGC GAG AAA GTT CAA GCG TTA GAT GAA AAG ATT TTG CTT 972His Pro Ala Ser Glu Lys Val Gln Ala Leu Asp Glu Lys Ile Leu Leu45 50 55 60TTA AGG CCA GCT TTC CAA TAT AGC GAT AAT ATC GCT AAA GAG TAT GAA 1020Leu Arg Pro Ala Phe Gln Tyr Ser Asp Asn Ile Ala Lys Glu Tyr Glu
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145 150 155GTT TTA ATC CCG GCT GGG TTT ATT AAG GTT ACC ATA CTA GAG CCT ATG 1308Val Leu Ile Pro Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu Glu Pro Met
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240 245 250GAA TTA AAA GGC AAA AGA AAC CGA TAA AAACAAATAA CGCATAAGAA 1595Glu Leu Lys Gly Lys Arg Asn Arg *
255 260AAGAACGCTT GAATAAACTG CTTAAAAAGG GTTTTTTAGC GTTCTTTTTG AGCGTGTATT 1655TAAGGGCTGA TGATC 1670(2)SEQ ID NO:4信息:(i)序列特性
(A)长度:261氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑学:线性(ii)分子类型:蛋白质(xi)序列描述:SEQ ID NO:4:Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp Lys Lys Cys Leu1 5 10 15Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys Ser Pro His Ile
20 25 30Ile Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr His Pro Ala Ser
35 40 45Glu Lys Val Gln Ala Leu Asp Glu Lys Ile Leu Leu Leu Arg Pro Ala
50 55 60Phe Gln Tyr Ser Asp Asn Ile Ala Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Lys65 70 75 80Asn Gln Thr Ala Leu Lys Val Glu Gln Ile Leu Gln Asn Gln Gly Tyr
85 90 95Lys Val Ile Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala
100 105 110Gln Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu Ile Val
115 120 125Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Glu Pro Gly
130 135 140Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu Ile Pro145 150 155 160Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu Glu Pro Met Ser Gly Glu Ser
165 170 175Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp Ile Gln Glu Lys
180 185 190Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr
195 200 205Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ile Lys Arg Ala Leu
210 215 220Asn Lys Ile Phe Ala Asn Ile Met Gln Glu Ile Asp Lys Lys Leu Thr225 230 235 240Gln Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gln Lys Asp Ala Lys Glu Leu Lys Gly
245 250 255Lys Arg Asn Arg *
260
Claims (25)
1.一种重组多肽,它具有与分子量约为29 kDa的幽门螺杆菌表面暴露抗原相同或基本上相似的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的多肽,它的氨基酸序列与序列表中的SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的位置1-260或28-260相同或基本上相似。
3.具有长度至少为5个氨基酸的肽,包含根据权利要求1的多肽的免疫原性表位。
4.一种分离的核酸分子,它具有编码根据权利要求1或2的多肽的核苷酸序列。
5.一种分离的核酸分子,选自:
(a)包含与序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的位置796-1572或874-1572相同或基本上相似的核苷酸序列的核酸分子;
(b)包含能与(a)中定义的核酸分子的多肽编码区互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核酸分子,并且它编码根据权利要求1或2的多肽,或其功能相当的修饰形式;和
(c)包含为如(a)或(b)中定义的核苷酸序列的遗传密码的简并结果的核酸序列的核酸分子,并且它编码根据权利要求1或2的多肽,或其功能相当的修饰形式。
6.一种载体,它包含根据权利要求4或5的核酸分子。
7.根据权利要求6的载体,它为质粒载体pAE1(NCIMB 40732)。
8.根据权利要求6的载体,它为能介导根据权利要求4或5的DNA分子的表达的表达载体。
9.根据权利要求8的载体,它为质粒载体pS 863。
10.含有根据权利要求6-9任一项的载体的宿主细胞。
11.一种制备为幽门螺杆菌表面暴露的29kDa抗原的多肽的方法,它包括在产生所述多肽的条件下培养用根据权利要求8或9的表达载体转化的宿主细胞,并回收所述多肽。
12.根据权利要求1-3任一项的多肽或肽在治疗中的应用。
13.根据权利要求1-3任一项的多肽或肽在诊断幽门螺杆菌感染中的应用。
14.根据权利要求1-3任一项的多肽或肽作为疫苗的应用。
15.一种用于诱导针对幽门螺杆菌感染的保护性免疫应答的疫苗组合物,包含免疫原性有效量的根据权利要求1-3任一项的多肽,或保持抗幽门螺杆菌感染的保护性免疫诱导能力的修饰形式的所述多肽,任选包含药学上可接受的载体或稀释剂。
16.根据权利要求15的疫苗组合物。在用作保护幽门螺杆菌感染的哺乳动物,包括人类的治疗性疫苗中的应用。
17.根据权利要求15的疫苗组合物在用作保护哺乳动物,包括人类免于幽门螺杆菌感染的预防性疫苗中的应用。
18.根据权利要求1-3任一项的多肽,或保持抗幽门螺杆菌感染的保护性免疫诱导能力的修饰形式的多肽抗原在制备用于治疗、预防或诊断幽门螺杆菌感染的组合物中的应用。
19.根据权利要求1-3任一次的多肽,或保持抗幽门螺杆菌感染的保护性免疫诱导能力的修饰形式的多肽在制备用于诊断幽门螺杆菌感染的诊断试剂盒中的应用。
20.根据权利要求1-3任一项的多肽,或保持抗幽门螺杆菌感染的保护性免疫诱导能力的修饰形式的所述多肽在制备用于引发抗幽门螺杆菌的保护性免疫应答的疫苗中的应用。
21.一种在哺乳动物中引发抗幽门螺杆菌感染的保护性免疫应答的方法,所述方法包括对所述哺乳动物施用免疫原性有效量的根据权利要求15-17任一项的疫苗组合物这一步骤。
22.根据权利要求21的方法,其中所述哺乳动物为人类。
23.一种在体外诊断幽门螺杆菌感染的方法,至少包括在其中使用任选被标记或偶联至固相载体上的根据权利要求1-3任一项的多肽这一步骤。
24.根据权利要求23的方法,包括步骤:(a)将任选与固体载体结合的所述多肽与从哺乳动物提取的体液接触;和(b)检测来自于所述体液,与所述多肽结合的抗体。
25.用于检测哺乳动物,包括人类幽门螺杆菌感染的诊断试剂盒,包含能使根据权利要求23或24的方法得以实现的组分。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |