CN118662495A - Don在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了DON在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用，属于生物医药技术领域；本发明中首次提出DON对糖尿病合并脑缺血损伤具有保护作用：在高糖状态下，使用DON下调蛋白O‑GlcNAc糖基化修饰水平能有效减轻脑缺血损伤；所述DON在制备治疗糖尿病合并脑缺血损伤药物中具有很好的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及DON在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用。
背景技术
缺血性脑卒中是临床上常见的严重疾病之一，其在全球呈现高发生率、高死亡率及高致残率，是医学界亟待解决的问题之一。高血糖是卒中高发病率和高死亡率的重要独立危险因素。高血糖可显著导致急性缺血性卒中患者预后不良。高血糖在糖尿病患者中更常见，糖尿病患者患缺血性中风的风险比一般人群高4倍。并且，糖尿病还显著加重了出血性脑损伤，导致更高的死亡率。同时，在临床上，约40-50％无糖尿病的缺血性脑卒中患者在入院时被诊断为高血糖，称为卒中后高血糖(PSH)。高血糖可影响血管内皮的功能，加重脑缺血后出血性转化(HT)的风险，增加溶栓或机械取栓后颅内出血的发生率。动物实验也证实了链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病或葡萄糖注射诱导的小鼠高血糖比正常小鼠导致更严重的脑损伤。
现有技术研究表明，O-GlcNAc的调节失调与对人类健康构成严重威胁的复杂疾病有关，包括癌症、糖尿病和神经退行性疾病。机体在受到损伤时会激发内源性应激保护机制，在细胞暴露于各种应激(如热、渗透、氧化)以及在心脏病发作和缺血模型后O-乙酰葡糖胺糖基化修饰(O-GlcNAcylation，即O-GlcNAc糖基化修饰)迅速增加，在大多数情况下，O-GlcNAcylation的适度增加促进了应激耐受性和细胞存活，细胞内O-GlcNAc水平升高对缺血再灌注损伤具有保护性。蛋白O-GlcNAc糖基化的上调会减轻成年和老年动物的心肌缺血和脑缺血损伤，但是在糖尿病心肌病中，持续高水平的O-GlcNAc糖基化修饰显著抑制胰岛素转导信号的调节和对压力的敏感性，减少胰岛素对心脏缺血/再灌注损伤的保护作用，增加血管钙化的风险。因此，O-GlcNAc糖基化是一种抗应激的内源性保护机制，O-GlcNAc修饰水平的过度或持续上调则会产生不利的效应，因而降低O-GlcNAc的药理作用可能是脑缺血治疗上的一个靶点。实现这一目标最直接的方法是抑制可以直接修饰蛋白质的O-GlcNAc转移酶(OGT)。然而，OGT已被证明难以抑制。另一种策略是通过靶向HBP的酶使OGT缺乏其糖底物UDP-GlcNAc，果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)是脑中的限速酶，6-重氮-5-氧代亮氨酸(DON)是一种GFAT抑制剂。以往研究表明，DON下调缺血后的O-GlcNAcylation会增加缺血模型鼠运动缺陷和梗死面积。即DON无法减轻脑缺血损伤，而是加重缺血性脑卒中的脑缺血损伤。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了DON在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用。本发明中首次提出DON对糖尿病合并脑缺血损伤具有保护作用：在高糖状态下，使用DON下调蛋白O-GlcNAc糖基化修饰水平能有效减轻脑缺血损伤；所述DON在制备治疗糖尿病合并脑缺血损伤药物中具有很好的应用。
本发明提供了DON在制备治疗脑缺血损伤及由脑缺血损伤引起的病症或减轻其症状的药物中的应用。
优选地，所述脑缺血损伤包括在高糖环境下的脑缺血损伤。
优选地，所述高糖环境下的脑缺血损伤包括糖尿病合并脑缺血损伤和急性高血糖合并脑缺血损伤。
优选地，所述症状包括神经功能障碍和脑梗死体积变大。
本发明还提供了一种治疗脑缺血损伤及由脑缺血损伤引起的病症或减轻其症状的药物，所述药物的有效成分为DON。
优选地，所述药物能够降低高糖环境下的脑缺血损伤导致的死亡率。
优选地，所述药物还包含医药学或保健品学上可接受的辅料，所述药物为颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射剂、丸剂或口服液。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中首次发现DON对脑缺血损伤的新作用，DON在高糖环境中下调蛋白O-GlcNAc糖基化会显著减轻脑缺血损伤，发挥脑保护作用。所述DON能够为脑缺血损伤提供新的治疗分子靶点、更为可靠的药物作用靶点的发现。所述DON对临床上改进脑缺血后的治疗方案、改善预后具有重要的意义。
本发明构建了高血糖合并脑缺血的动物模型，阐明DON在高血糖加重脑缺血损伤中的脑保护作用,为治疗脑缺血损伤提供新的靶点。通过动物模型本发明发现DON能够减弱糖尿病合并脑缺血模型鼠的死亡率，减轻糖尿病合并脑缺血模型鼠的神经功能障碍，减少糖尿病合并脑缺血模型鼠的的脑梗死体积。此外，通过动物模型本发明还发现DON能够减弱急性高血糖合并脑缺血模型鼠的死亡率，减轻急性高血糖合并脑缺血模型鼠的神经功能障碍，减少急性高血糖合并脑缺血模型鼠的的脑梗死体积。
附图说明
图1为DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠的死亡率的影响情况图。
图2为DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠神经功能障碍的影响情况图；图中，a为局灶性神经功能损伤评分，b为一般神经功能损伤评分。
图3为DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠脑梗死体积的影响情况图；图中，a为TTC染色评估脑梗死图，b为脑梗死体积统计图。
图4为DON对急性高血糖合并脑缺血模型鼠的死亡率的影响情况图。
图5为DON对急性高血糖合并脑缺血模型鼠神经功能障碍的影响情况图；图中，a为局灶性神经功能损伤评分，b为一般神经功能损伤评分。
图6为DON对急性高血糖合并脑缺血模型鼠脑梗死体积的影响情况图；图中，a为TTC染色评估脑梗死图，b为脑梗死体积统计图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。下列实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。
以下实施例中，用于构建模型的实验动物为体重20-25g的雄性C57BL/6J小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
DON：购自sigma公司，用生理盐水溶解配置成所需浓度。
红四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)：购自中国医药集团上海化学试剂公司，F20060313)，用PBS配成1％浓度，避光保存。
STZ：购自Sigma-Aldrich,USA，使用时用pH值为4.3～4.5的柠檬酸钠缓冲液配置成所需浓度。
实施例1：DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠的影响
本实施例中先采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导慢性高血糖，进而建立糖尿病合并脑缺血模型，具体构建方法如下所示：
将30只5周龄C57BL/6小鼠放置在通风良好的房间里适应一周，然后向小鼠腹腔注射45mg/kgSTZ，连续注射5天诱导糖尿病，注射STZ后用FreeStyleOptiumNeo血糖仪(Yuwell，镇江，中国)测量血糖水平，空腹血糖值高于≥16.7mmol/L的小鼠定义为糖尿病状态，将其用于后续实验。造模过程中无小鼠死亡，连续喂养小鼠2周，定期观察并记录每只小鼠的体重、摄食量和饮水量，备用。
注射STZ4周后，将糖尿病状态的小鼠随机等分为3组，糖尿病假手术组、糖尿病合并脑缺血损伤组和DON治疗糖尿病合并脑缺血损伤组，分别采用下述方法构建得到：
糖尿病合并脑缺血损伤组(DM-MCAO)：将糖尿病小鼠采用颈内动脉线栓法稍加改进制备小鼠MCAO模型，进而得到糖尿病合并脑缺血损伤小鼠，具体步骤如下所示：
将糖尿病状态的小鼠以4％(质量体积分数)水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，沿颈中偏右作长约1cm切口。将小鼠移至体视显微镜下，分离右侧颈总动脉并穿丝线1根备用；再分离颈外动脉及颈内动脉，在颈外动脉接近颈总动脉分叉处放置一打好结的丝线，勿收紧线结，将颈外动脉远端结扎，电凝器熔断颈外动脉使其主干游离备用；夹闭颈总动脉和颈内动脉，以静脉留置针行颈外动脉穿刺后拔出针头，将线栓(DoccolCorporation,Redlands,USA，规格：6023)经针眼插入颈外动脉，稍收紧线结，撤去颈内动脉上动脉夹，将线栓缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进1cm左右感到阻力时即止，扎紧颈外动脉上线结，缝合皮肤。采用激光散斑对比成像(RFLSI III，RWD)监测脑血流(CBF)，将CBF中血流阻塞或再灌注失败的动物排除在进一步研究之外。阻断血流60min后，拔出线栓实现再灌注。整个手术过程中室温保持在22～25℃，使用加热垫将小鼠的体温保持在37℃。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒中，自由饮水、进食。
糖尿病假手术组(DM-sham)：糖尿病假手术组(DM-sham)中的小鼠除不插线外，其余步骤均与糖尿病合并脑缺血损伤组(DM-MCAO)相同。
DON治疗糖尿病合并脑缺血损伤组(DM-MCAO+DON)：采用糖尿病合并脑缺血损伤组(DM-MCAO)的方法处理小鼠，然后将小鼠麻醉并固定于立体定位仪，每只小鼠侧脑室注射4.0μL DON，注射的bregma坐标为:-1.0mm外侧，-0.3mm后，-2.5mm下，注射时间为5min，注射结束后针放置3min后取出。采用同样的方法对糖尿病合并脑缺血损伤组(DM-MCAO)和糖尿病假手术组(DM-sham)的小鼠注射4.0μL 0.9％生理盐水。
图1为DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠的死亡率的影响情况图，从图中可以看出，DM-sham小鼠死亡率为0％，DM-MCAO小鼠的死亡率为12.5％，DM-MCAO+DON小鼠死亡率为7.1％，这说明DON治疗后模型鼠的死亡率有下降的趋势。
本实施例在再灌注24h后测量上述3组小鼠的局灶性神经功能缺损和一般神经功能缺损来考察DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠的神经功能障碍的影响情况。其中，采用局灶性神经功能缺损评分来评估小鼠MCAO术后的对称性、步态、攀爬、循环和感觉反应，最终得分计算为三次重复试验的平均值，得分越高说明神经功能障碍越严重。评分标准如表1所示：
表1.局灶性神经功能缺损评分标准
图2a为DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠的局灶性神经功能缺损的评分结果，从图中可以看出，与DM-sham组相比，DM-MCAO小鼠局灶性神经功能缺损评分显著增加；而DM-MCAO-DON组小鼠与DM-MCAO小鼠相比，局灶性神经功能缺损评分显著降低。
本实施例中采用一般神经功能缺损评分来评估小鼠MCAO术后的毛发、耳朵、眼睛、姿势、自发性活动和癫痫行为，最终得分计算为三次重复试验的平均值，得分越高说明神经功能障碍越严重。具体评分标准如表2所示：
表2.神经功能缺损评分标准表
图2b为DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠的一般神经功能缺损的评分结果，从图中可以看出，与DM-sham组相比，DM-MCAO小鼠一般神经功能缺损评分显著增加；而DM-MCAO-DON组小鼠与DM-MCAO小鼠相比，一般神经功能缺损评分显著降低。结合图2a和2b可以看出，DON治疗能显著改善糖尿病合并脑缺血模型鼠的神经功能。
本实施例中还分别测定了上述四组小鼠的脑梗死体积，所述脑梗死体积的测定方法如下所示：
小鼠深度麻醉后处死取脑，将完整的脑组织至于-20℃冰箱中速冻15min左右，以利于切片。将脑组织每隔2mm切一片，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。将脑片放入1％TTC(m/v)溶液中，置于37℃水浴锅中，2-3min摇晃一次以均匀染色，当脑片染成桃红色终止水浴。将脑片转移至4％m/v多聚甲醛固定，在4℃、避光保存留待扫描分析，分析结果如图3所示。
图3为DON对糖尿病合并脑缺血模型鼠脑梗死体积的影响情况图，从图中可以看出，与DM-sham小鼠相比，DM-MCAO小鼠的脑梗死体积显著增加；与DM-MCAO小鼠相比，DM-MCAO+DON小鼠脑梗死体积显著降低。这说明DON治疗后显著减轻糖尿病合并脑缺血模型鼠的脑梗死体积。
综上，DON能够减轻糖尿病合并脑缺血损伤症状，降低由糖尿病合并脑缺血损伤导致的死亡率，在制备减轻糖尿病合并脑缺血损伤症状的药物中具有很好的应用。
实施例2：DON对急性高血糖合并脑缺血模型鼠的影响
本实施例中建立了急性高血糖合并脑缺血模型来模拟临床卒中后高血糖(poststroke hyperglycemia,PSH)，具体建立方法如下所示：
先将17只7周龄的C57BL/6小鼠进行驯化1周，然后将小鼠随机分为3组，分别建立急性高血糖假手术组(HG-sham)、急性高血糖合并脑缺血损伤组(HG-MCAO)和DON治疗急性高血糖合并脑缺血损伤组(HG-MCAO+DON)。
其中，急性高血糖合并脑缺血损伤组(HG-MCAO)的构建方法为：用FreeStyleOptium Neo血糖仪测量小鼠血糖水平，在正常血糖水平的小鼠腹腔内注射50％(质量体积分数)葡萄糖(6mL/kg)，注射葡萄糖5min后，采用实施例1中所述的方法构建小鼠MCAO模型，在阻断75min后，轻轻拔出线栓，再灌注2h。同时，在注射葡萄糖15min、45min、90min后用FreeStyle Optium Neo血糖仪测量血糖水平，当小鼠血糖水平迅速升高至30mmol/L，90min后下降至20mmol/L，说明成功诱导急性高血糖合并脑缺血小鼠模型。
急性高血糖假手术组(HG-sham)的构建方法为：假手术组小鼠除不插线外，其余步骤均与急性高血糖合并脑缺血组相同。
DON治疗急性高血糖合并脑缺血损伤组(HG-MCAO+DON)组的构建方法为：采用急性高血糖合并脑缺血损伤组(HG-MCAO)的方法处理小鼠，然后将小鼠麻醉并固定于立体定位仪，每只小鼠侧脑室注射4.0μl DON，注射的bregma坐标为:-1.0mm外侧，-0.3mm后，-2.5mm下，注射时间为5min，注射结束后针放置3min后取出采用同样的方法对急性高血糖合并脑缺血损伤组(HG-MCAO)和急性高血糖假手术组(HG-sham)的小鼠注射4.0μL 0.9％生理盐水。
图4为DON对急性高血糖合并脑缺血模型鼠的死亡率的影响情况图，从图中可以看出，与慢性高血糖缺血小鼠的结果相似，与HG-sham小鼠相比，HG-MCAO小鼠的死亡率呈上升趋势，而HG-MCAO+DON小鼠的死亡率呈现下降趋势。这说明DON治疗能降低急性高血糖合并脑缺血损伤模型鼠的死亡率。
采用实施例1中所述的方法分别对急性高血糖合并脑缺血模型鼠的神经功能障碍以及脑梗死体积的影响情况进行考察。
图5为DON对急性高血糖合并脑缺血模型鼠神经功能障碍的影响情况图，从图中可以看出，脑缺血损伤24h后，HG-MCAO小鼠神经功能评分明显低于HG-sham小鼠，而与HG-MCAO小鼠相比，经DON治疗的小鼠在神经系统评分明显减少。这说明，DON治疗能有效改善急性高血糖合并脑缺血模型鼠的神经功能。
图6为DON对急性高血糖合并脑缺血模型鼠脑梗死体积的影响情况图，从图中可以看出，脑缺血损伤24h后，HG-MCAO小鼠脑卒中梗死面积明显高于HG-sham小鼠，经DON治疗的小鼠脑梗死体积较HG-MCAO小鼠显著减小。这说明，DON治疗能有效减少急性高血糖合并脑缺血模型鼠的脑梗死体积。
综上，DON能够减轻急性高血糖合并脑缺血损伤症状，降低由急性高血糖合并脑缺血损伤导致的死亡率，在制备减轻急性高血糖合并脑缺血损伤症状的药物中具有很好的应用。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.DON在制备治疗脑缺血损伤及由脑缺血损伤引起的病症或减轻其症状的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑缺血损伤包括高糖环境下的脑缺血损伤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高糖环境下的脑缺血损伤包括糖尿病合并脑缺血损伤和急性高血糖合并脑缺血损伤。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述症状包括神经功能障碍和脑梗死体积变大。
5.一种治疗脑缺血损伤及由脑缺血损伤引起的病症或减轻其症状的药物，其特征在于，所述药物的有效成分为DON。
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